指/趾甲制剂和处理方案的制作方法

指/趾甲制剂和处理方案
发明领域
1.本发明涉及适合于表面应用到指/趾甲(nail)的包含蛋白质的水性组合物。本发明还涉及该组合物的美容用途和该组合物作为药物的用途，包括用于治疗真菌性指/趾甲感染。本发明还包括包含该组合物的装置，该装置协助将该组合物应用到指/趾甲；以及peg在包含蛋白质的指/趾甲组合物中作为成膜剂的用途。
2.发明背景
3.将蛋白质配制成可以容易地应用到指/趾甲并因此适合于表面(topical)应用并维持蛋白质的效力的液体组合物，是一个复杂的过程。
4.本发明提供了这样的组合物。
5.发明陈述
6.根据第一方面，提供了一种用于表面指/趾甲应用的水性组合物，所述组合物包含：
7.a)蛋白质；和
8.b)聚乙二醇(peg)500-peg 8000。
9.有利的是，使用包含这些分子量(mwt)的peg的水性组合物提供了一种这样的组合物，该组合物在应用到指/趾甲之后快速干燥，并允许在指/趾甲上形成膜，从而允许使用者观察到已经应用了产品的指/趾甲区域并作为屏障保护指/趾甲表面。因此，组合物是以peg作为成膜剂的成膜组合物。
10.peg可以具有1000至6000的平均分子量，例如1500至6000，诸如3000至6000，或4000至6000的平均分子量。组合物可以包含10％v/v和80％v/v之间的peg，例如40％v/v-60％v/v的peg。
11.蛋白质可以是胶原和/或角蛋白。组合物可以包含指/趾甲增强剂，例如生物素。
12.在另一方面，本发明包括用于处理指/趾甲的美容方法，该方法包括应用上述组合物。在应用之后，组合物可以在指/趾甲上形成膜。
13.蛋白质可以可选地是包含4-15个精氨酸、肽中经历0或1个取代的抗真菌环肽。即，该组合物是用于表面指/趾甲应用的抗真菌水性组合物。
14.抗真菌组合物可以另外包含以下的任一种或更多种：
15.a)蛋白酶抑制剂，任选地金属肽酶抑制剂；b)角蛋白；c)胶原或d)指/趾甲增强剂，例如生物素。
16.在另一方面，提供了一种水性组合物，其包含：
17.a)包含4-15个精氨酸、肽中经历0或1个取代的抗真菌环肽；和
18.b)蛋白酶抑制剂，任选地金属肽酶抑制剂。
19.金属肽酶抑制剂可以是内切蛋白酶抑制剂，任选地
20.a)真菌溶素(fungalysin)家族(m36)的抑制剂；或
21.b)乙二胺四乙酸(edta)。
22.环肽可以以组合物的约1％w/v至20％w/v存在。环肽可以包含5个至9个精氨酸残
基。抗真菌环肽可以是酸盐形式，任选地乙酸盐。
23.在另一方面，提供了包含上述任何抗真菌水性组合物的药物组合物。
24.在另一方面，提供了抗真菌组合物用于作为药物的用途。
25.该用途可以用于治疗或预防真菌性指/趾甲感染，其中组合物被表面应用。真菌性指/趾甲感染可以是由皮肤癣菌(dermatophyte)引起的。组合物可以每天应用，任选地在7-28天的时间段内每天应用。
26.在另一方面，提供了一种包含4-15个精氨酸、肽中经历0或1个取代的抗真菌环肽，用于在治疗或预防真菌性指/趾甲感染中使用，其中组合物在7-28天的时间段内每天应用。组合物可以在3分钟至35分钟的时间段内干燥至指/趾甲表面。组合物可以是以上提供的任何水性组合物。治疗可以每3-12个月被重复。抗真菌环肽可以是酸盐形式，任选地乙酸盐。肽可以以组合物的约1％w/v至20％w/v存在。用于使用的组合物可以是任何上述包含抗真菌环肽的组合物。
27.在另一方面，提供了一种适于应用任何所描述的组合物的装置。装置可以是指/趾甲笔。
28.在另一方面，提供了peg 500-8000在包含蛋白质的水性表面指/趾甲组合物中作为成膜剂的用途。
29.附图简述
30.现在将仅通过举例的方式参考附图来描述本发明，在附图中：
31.图1：暴露于roehm指/趾甲油1和peg4000制剂中的np213的红色毛癣菌(t.rubrum)ncpf0118的代谢活性。
32.图2：暴露于roehm指/趾甲油2和peg4000制剂中的np213的红色毛癣菌ncpf0118的代谢活性。
33.图3：暴露于roehm指/趾甲油3和peg4000制剂中的np213的红色毛癣菌ncpf0118的代谢活性。
34.图4：暴露于roehm指/趾甲油4和peg4000制剂中的np213的红色毛癣菌ncpf0118的代谢活性。
35.图5：暴露于roehm指/趾甲油5和peg4000制剂中的np213的红色毛癣菌ncpf0118的代谢活性。
36.图6：暴露于anacor指/趾甲油c和peg4000制剂中的np213的红色毛癣菌ncpf0118的代谢活性。
37.图7：暴露于2d指/趾甲油和peg4000制剂中的np213的红色毛癣菌ncpf0118的代谢活性。
38.图8示出了50％ peg浓度的不同mwt peg组合物与水和任选地与10％肽在离体(excised)趾甲上的平均干燥时间。每种情况使用3个重复。
39.图9：在红色毛癣菌ncpf0118在0.75％(w/v)人类趾甲上生长216h期间，金属蛋白酶抑制剂edta(100μm)对(np213)的抗真菌效力的影响。
40.图10：在趾间毛癣菌(t.interdigitale)ncpf0335在0.75％(w/v)人类趾甲上生长216h期间，金属蛋白酶抑制剂edta(100μm)对(np213)的抗真菌效力的影响。
41.图11：在168h孵育后，金属蛋白酶抑制剂edta对红色毛癣菌ncpf0118和趾间毛癣
菌ncpf0335的代谢活性的影响。
42.图12和13：将单个精氨酸残基取代为苯丙氨酸(f)或赖氨酸(k)残基对np213针对红色毛癣菌ncpf0118和趾间毛癣菌ncpf0335的活性的影响。
43.图14：由肽和peg组合物制成的膜的照片。
44.图15：np213浓度(％w/v)和时间(d)对np213针对红色毛癣菌ncpf0118的抗真菌效力的影响。
45.图16：指/趾甲应用器(applicator)装置的实例：指/趾甲瓶和刷。
46.图17：指/趾甲应用器装置的实例：指/趾甲笔。
47.详述
48.组合物
49.组合物是水性的，意指它包含水。组合物是溶液，即组合物是液体。组合物可以是无颗粒的，意指组合物中不存在肽的未溶解颗粒，例如未溶解晶体。技术人员将能够通过例如对溶液进行离心并目视检查离心管底部中的颗粒(例如肽的晶体)来确定溶液是否无颗粒。可选地，可以使用如实施例3中描述的目视检查。
50.组合物是表面用组合物。也就是说，组合物适合于表面应用。
51.蛋白质
52.蛋白质意指通过肽键连接在一起的多个氨基酸残基。术语蛋白质包括长度较长的氨基酸残基以及长度较短的氨基酸肽。
53.蛋白质可以是任何具有增强或改善指/趾甲外观效力的蛋白质。例如，强化指/趾甲的蛋白质。例如，蛋白质可以是角蛋白和/或胶原。这些蛋白质的氨基酸序列是已知的。蛋白质可以是全长蛋白质胶原或角蛋白。可选地，胶原或角蛋白可以是保留全长蛋白的全部或部分活性以增加指/趾甲强度的缩短或突变形式。
54.或者蛋白质可以具有用于对指/趾甲进行医学治疗的治疗活性。
55.美容方法
56.组合物可以在处理指/趾甲的美容方法中使用。美容意指改善指/趾甲外观的非医学处理。
57.肽
58.蛋白质可以是肽。例如，治疗活性肽。这包括肽的盐，即药学上可接受的盐。肽可以具有针对指/趾甲真菌感染的活性，即肽是抗真菌肽。
59.肽可以是环肽。用于肽骨架环化的方法是本领域已知的。环肽可以包含以下或由以下组成：4个至15个氨基酸，例如4个至14个氨基酸；4个至9个氨基酸、4个至8个或4个至7个氨基酸。肽可以包含以下或由以下组成：4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个氨基酸。肽可以由7个氨基酸组成。肽可以是聚精氨酸肽。例如，环状r-r-r-r-r-r-r。在以下实例中，这种环状精氨酸7-mer肽被称为np213。
60.环肽的一个残基可以被交换为另一个残基。当例如使用实施例6中解释的方法体外测试时，这样的变体可以具有对应的非变体肽的例如至少约10％、50％、60％、70％、80％、90％或等效的生物活性。通常使用保守的氨基酸，即具有相似化学和物理特性的氨基酸取代。因此，例如，保守的氨基酸取代可以包括将精氨酸交换为赖氨酸或异亮氨酸。组氨酸和其他阳离子氨基酸，包括非天然存在的阳离子氨基酸，也可以被取代。本发明人还显示
了将精氨酸交换为苯丙氨酸也产生具有抗真菌活性的肽。在引入取代之后，使用例如实施例6中解释的方法筛选变体的生物活性。
61.肽中的氨基酸可以是d氨基酸或l氨基酸。例如，肽中的氨基酸可以是90％或95％、98％或99％ l氨基酸。肽的活性是肽的阳离子电荷通过破坏和透化真菌细胞质膜而发挥作用的结果。
62.肽的定义还包括已知的异构体(结构异构体、立体异构体、构象异构体&构型异构体)、肽模拟物、上述氨基酸的结构类似物，以及天然修饰(例如翻译后修饰)或化学修饰(包括但不限于磷酸化、糖基化、磺酰化和/或羟基化)的那些。
63.肽的定义还包括肽的盐形式。例如，酸盐形式。这些包括乙酸盐、盐酸盐以及三氟乙酸盐(trifluoroacetate)/三氟乙酸(trifluoroacetic acid,tfa)盐形式。例如，np213(r-r-r-r-r-r-r-r)乙酸盐。还可以向组合物中添加另外的乙酸。
64.肽通常是合成肽。肽可以是分离的、纯化的肽或其变体，其可以被体外合成，例如通过固相肽合成方法，通过酶催化的肽合成或借助于重组dna技术。
65.组合物可以包含0.01％-20％的肽。例如1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％或20％。例如，5％-15％；或者8％-12％。百分比是重量与体积之比(w/v)。即，以克计的肽重量除以以毫升计的最终溶液体积乘以100。通常，通过首先将肽溶解在水中，并且然后将肽和水溶液在液化的peg中稀释至最终溶液中所需的浓度来制备肽。
66.示例性肽如下：
67.1)环状r-r-r-r-r-r-r
68.2)环状r-r-r-r-r-r-f
69.3)环状r-r-r-r-r-r-k。
70.peg
71.如本文所用，peg是聚乙二醇，环氧乙烷的聚合物。该聚合物的分子量通常用peg后面的数字表示，例如peg8000具有8000g/mol的分子量。
72.peg可以是peg 1000-6000。peg可以是peg 1000、peg 1500、peg 2000、peg 3000、peg 3350、peg 4000、peg 5000、peg 6000、peg 7000或peg 8000。其是分别具有4000g/mol或3000g/mol的平均分子量(mwt)的peg，或具有更高平均分子量的peg，诸如peg6000或peg8000。
73.peg的浓度为％(v/v)。如果是固体，则将peg熔化，并且然后作为溶液与溶解在h2o中的环肽混合。较低分子量的peg在室温是液体，例如低于peg1000。peg1000和分子量更大(heavier)的peg在室温(即《30℃)通常都是固体。
74.组合物可以包含10％-80％的任何上述peg。例如，组合物可以包含20％-70％ peg或30％-60％ peg或40％-60％ peg。例如20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％或80％v/v。例如，45％-50％ peg v/v。
75.组合物可以包含多达约60％v/v peg，例如约40％v/v至60％v/v peg。在一种实施
方案中，组合物包含40％v/v至55％v/v peg。在可选的实施方案中，组合物包含45％v/v至50％v/v peg。
76.组合物可以包含47.5％v/v至约55％v/v peg4000或约47.5％v/v至约60％v/v peg3000。peg可以包含约50％v/v peg4000。可选地，peg可以包含约52.5％v/v peg3000。
77.peg和肽的组合物
78.示例性组合物包含2％-20％肽(w/v)，例如具有最多1个取代的聚精氨酸7-mer，和40％-80％ peg 1000-peg 8000(v/v)。edta可以以至少15μm的浓度添加到该组合中。
79.组合物可以包含5％-10％肽(w/v)和40％-55％ peg 1000-8000(v/v)。
80.组合物可以包含5％-12.5％肽(w/v)和40％-55％ peg 1000-6000(v/v)。
81.组合物可以包含5％-15％肽(w/v)和40％-55％ peg 1000-3000(v/v)。
82.单元
83.作为如何制备制剂的实例：
84.为了制备在50％(v/v)peg4000中的10％(w/v)np213溶液，在开始配制工作之前在孵育器中将所有使用的材料预热至37℃，以确保和促进液化peg的准确分配。将np213制备为浓度为400mg/ml的在无菌去离子水(18mω纯度)中的水溶液，通过0.22μm注射器过滤器过滤以确保无菌，并预热至37℃，然后立即用于制剂制备。将20g peg4000(在室温为固体；熔点53℃-58℃)在微波炉中以低功率在玻璃烧杯中熔化，直到获得澄清溶液。在任何时候，peg4000的温度都不允许超过70℃。在液化后，将5ml peg4000转移到无菌玻璃通用瓶中，置于37℃孵育器中，并允许其平衡至37℃持续30-60min。向其中添加2.5ml np213(400mg/ml；40％(w/v))，并用预热的无菌去离子水(18mω纯度)将体积补足到10ml。将溶液在室温(18℃-20℃)黑暗中储存。
85.蛋白酶抑制剂
86.组合物可以包含蛋白酶抑制剂，任选地金属肽酶抑制剂。蛋白酶抑制剂意指抑制蛋白酶(即真菌蛋白酶)活性的化合物。
87.蛋白酶抑制剂可以是半胱氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂或天冬氨酰蛋白酶抑制剂。半胱氨酸蛋白酶抑制剂的实例包括抗痛素二盐酸盐(antipain dihydrochloride)、抑糜蛋白酶素(chymostatin)、n-乙基马来酰亚胺、亮抑蛋白酶肽、α2-巨球蛋白。e-64和苯甲磺酰氟(pmsf)。丝氨酸蛋白酶抑制剂的实例包括4-(2-氨基乙基)苯磺酰氟(aebsf/pefabloc)、抑蛋白酶多肽、亮抑蛋白酶肽、丝氨酸蛋白酶抑制物(serpin)和苯甲磺酰氟(pmsf)。天冬氨酰蛋白酶抑制剂的实例包括胃蛋白酶抑制剂(pepstatin)、α2-巨球蛋白、利托那韦(ritonavir)、茚地那韦(indinavir)、占吉仑(zankiren)、阿利吉仑(aliskiren)和ly-450139。
88.蛋白酶抑制剂的浓度可以是0.5μm-500μm。例如15μm-500μm。例如，50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm或这些浓度间的任何范围。
89.金属肽酶抑制剂可以是内切蛋白酶抑制剂，例如真菌溶素家族(m36)的抑制剂。例如，金属肽酶抑制剂的组包括：氮杂肽抑制剂、含羟肟酸抑制剂、含硼抑制剂、含羧酸抑制剂、小分子抑制剂、螯合抑制剂、肽抑制剂、重氮抑制剂、dna适配体抑制剂、rna适配体抑制剂、含磷抑制剂、卤代酮抑制剂、金属肽酶的多酚抑制剂、酮亚甲基抑制剂、硫醇抑制剂、硫杂丙环(thiirane)抑制剂、基质金属蛋白酶(mmp)抑制剂、含硒抑制剂和硅烷二醇抑制剂或
其任何组合。
90.这些组内的个体实例包括以下：
91.edta (乙二胺四乙酸)、egta(乙二醇-双(β-氨基乙基醚)-n,n,n',n'-四乙酸)、贝他定(bestatin)、2,2'-联吡啶基1,10-菲咯啉一水合物、磷酰二肽二钠盐、盐酸多西环素、马立马司他(marimastat)、巴马司他(batimastat)、galardin、alatrioprilat、槚如酸(anacardic acid)、依布硒(ebselen)、glycoprilat、4-甲基-1-(s)-({5-[(3-氧代-3,4-二氢-2h-苯并[1,4]噁嗪-6-基甲基)-氨基甲酰基]-吡唑并[1,5-a]嘧啶-7-羰基}-氨基)-二氢茚-5-羧酸、namalide、红紫素(purpurin)、regasepin1、regasepin2、丹酚酸b、雷公藤甲素(triptolide)、2-苄基-4-氧代-5,5,5-三氟戊酸，对-碘-d-苯丙氨酸羟肟酸酯、4,4'-磷酸亚基二(丁烷-1,3-二羧酸)、α-硫辛酸、l-丁硼酸、乙醇酸、硫藤黄素(thiolutin)、2-苄基-4-氧代-5,5,5-三氟戊酸、表没食子儿茶素-3-没食子酸酯、杨梅素(myricetin)、扁柏黄酮(hinokiflavone)和硫柳汞。
[0092]
组合物中金属肽酶抑制剂的浓度可以是至少15μm。例如15μm-500μm。例如，50μm、100μm、150μm、200μm、250μm、300μm、350μm、400μm、450μm或500μm或这些浓度间的任何范围。
[0093]
抑制剂可以是edta或egta，并且edta的浓度可以是至少15μm。例如，15-150μm。组合物中edta或egta的浓度可以是至少50μm。例如100μm。
[0094]
指/趾甲增强剂和其他另外的化合物
[0095]
其他化合物也可以添加到组合物中。例如，增强蛋白质和肽渗透到指/趾甲中的其他化合物。可选地，可以添加增强指/趾甲外观的化合物(称为指/趾甲增强剂)。指/趾甲增强剂可以是生物素或光学光亮剂。组合物还可以包含颜料和/或香料。
[0096]
组合物可以不包含尿素或有机溶剂。
[0097]
药物组合物
[0098]
组合物具有治疗效用。因此，组合物可以是还包含一种或更多种药学上可接受的载体、辅料、赋形剂、稀释剂、填充剂、缓冲剂、稳定剂、防腐剂、润滑剂或本领域技术人员熟知的其他材料和任选地其他治疗剂的药物组合物。
[0099]
真菌感染
[0100]
本文描述的组合物具有作为药物的效用，特别是针对真菌性指/趾甲感染。
[0101]
如本文所用，真菌感染是由真菌(通常是致病性真菌物种，诸如皮肤癣菌)引起的感染。例如，属于毛癣菌(trichophyton)属，小孢癣菌(microsporum)属或表皮癣菌(epidermophyton)属，诸如红色毛癣菌(trichophyton rubrum)。
[0102]
所述真菌通常是皮肤癣菌，诸如从癣(tinea)感染，诸如甲癣(tinea unguium)、体癣(tinea corporis)、头癣(tinea capitis)、股癣(tinea cruris)、面癣(tinea faciae)以及足癣(tinea pedis)感染分离的那些。皮肤癣菌可以是毛癣菌属物种(trichophyton spp.)的分离物。皮肤癣菌可以是来自以下属的分离物：毛癣菌属物种、节皮菌属物种(arthroderma spp.)、小孢癣菌属物种(microsporum spp.)、鸡冠癣菌属物种(lophophyton spp.)、南尼兹癣菌属物种(nannizzia spp.)、表皮癣菌属物种(epidermophyton spp.)、副癣菌属物种(paraphyton spp.)、瓜罗癣菌属物种(guarromyces spp.)或者栉霉属物种(ctenomyces spp.)。皮肤癣菌可以来自以下的物种：本哈米毛癣菌(t.benhamiae)、t.bullosum、同心性毛癣菌(t.concentricum)、马毛癣菌
(t.equinum)、t.eriotrephon、刺猬毛癣菌(t.erinacei)、趾间毛癣菌(t.interdigitale)、须癣毛癣菌(t.mentagrophytes)、t.quickeanum、红色毛癣菌、许兰氏毛癣菌(t.schoenleinii)、猴毛癣菌(t.simii)、苏丹毛癣菌(t.soudanense)、断发毛癣菌(t.tonsurans)、疣状毛癣菌(t.verrucosum)、紫色毛癣菌(t.violaceum)、絮状表皮癣菌(e.floccosum)、n.aenygmaticum、n.corniculate、n.duboisii、n.fulva、n.gypsea、n.incurvata、n.nana、n.persicolor、n.praecox、p.cookei、p.cookiellum、奇异副癣菌(p.mirabile)、l.gallinae、头癣小孢癣菌(m.audouinii)、犬小孢癣菌(m.canis)、铁锈色小孢癣菌(m.ferrugineum)、a.amazonicum、a.ciferrii、a.cuniculi、克列依节皮菌(a.curreyi)、a.erboreum、a.flavescens、a.gertleri、a.gloriae、a.insigulare,a.lenticulare、a.melis、a.multifidum、a.onychocola、a.phaseoliforme、a.quadrifidum、a.redellii、a.silverae、a.thuringiensis、a.tuberculatum、a.unicatum或a.verpertilii。
[0103]
可选地，所述真菌可以是酵母，诸如念珠菌属物种(candida spp.)，典型地白色念珠菌(candida albicans)、克柔念珠菌(candida krusei)、光滑念珠菌(c.glabrata)、季也蒙念珠菌(c.guillermondii)、c.famata、近平滑念珠菌(c.parapsilosis)，热带念珠菌(c.tropicalis)、清酒念珠菌(c.sake)、糠秕马拉色菌(malassezia furfur)以及丝孢酵母属物种(trichosporon spp.)。
[0104]
根据本发明的另一方面，所述真菌可以是非皮肤癣菌霉菌，诸如顶孢霉属物种(acremonium spp)(例如粉灰顶孢霉(a.roseogriseum))、交链孢霉属物种(alternaria spp.)、卡拉节纹菌(arthrographis kalrae)、曲霉属物种(aspergillus spp.)(包括黄曲霉(a.flavus)、烟曲霉(a.fumigatus)、土曲霉(a.terreus)、焦曲霉(a.ustus)、聚多曲霉(a.sydowii)、杂色曲霉(a.versicolor))、平脐蠕孢属物种(bipolaris spp.)、botryodiplodia theobromae、毡状金孢霉(chrysosporium(geomyces)pannorum)、枝孢霉属物种(cladosporium spp.)、镰刀菌属物种(fusarium spp.)(包括尖孢镰刀菌(f.oxysporum)、层出镰刀菌(f.proliferatum)、腐皮镰孢菌(f.solani))、白地霉(geotrichium candidum)、那特斯拉菌属物种(nattrassia spp.)、加拿大甲霉(onychocola canadensis)、拟青霉属物种(paecilomyces spp.)、青霉属物种(penicillium spp.)、phyllostricta sydowii、pyrenochaeta unguis-hominis、短帚霉(scopulariopsis brevicaulis)、柱霉属物种(scytalidium spp.)(包括双间柱霉(s.didmidiatum)、透明柱霉(s.hyalinum))、总状共头霉(synchephalastrum racemosum)、木霉属物种(trichoderma spp.)和单格孢属物种(ulocladium spp.)。
[0105]
治疗
[0106]
组合物可用于治疗真菌性指/趾甲感染诸如甲癣，所述组合物包含含有4-15个精氨酸、肽中经历0或1个取代的抗真菌环肽。任选地，该组合物是包含上述peg和/或蛋白酶抑制剂和/或其他添加剂的水性组合物。
[0107]
提供了治疗指/趾甲感染的方法，包括以下步骤：将治疗有效量的本文描述的组合物应用到怀疑感染的指/趾甲，将组合物铺展在指/趾甲表面上，等待组合物干燥，并任选地例如约24小时后重复该应用，即治疗至少每天一次。治疗也可以应用2次或3次/天。
[0108]
通常，指/趾甲治疗需要使用长达48周或更长时间之后才能得到改善，即指/趾甲
外观的改善和指/趾甲内真菌负担的减少。相比之下，上述环肽组合物仅需要7-11天后就能观察到改善。因此，治疗可以每天应用持续7-11天或更长时间，例如7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天或16天。可选地，对于严重感染，治疗可以持续长达17天、18天、19天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天或28天。然后治疗可以停止。为了防止感染复发，治疗可以每3个月或每6个月或每9个月或每12个月应用。例如，治疗可以每3个月或每6个月或每9个月或每12个月进行7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天、15天或16天。或者治疗可以每3个、6个、9个或12个月进行17天、18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天或28天。
[0109]
例如，治疗可以是每3-6个月，每天治疗持续21天。治疗也可以每9个月或每12个月应用。
[0110]
剂量可以是相对较高的剂量以在第一次治疗中消除感染。例如，8-10％持续7-11天或持续上述任何治疗时间段。
[0111]
可以以较低剂量预防再感染。例如，每3-6个月，每天1-7％持续上述任何治疗时间段，例如7-11天。预防也可以通过每9个或12个月进行治疗来继续。
[0112]
可选地，可以以2％w/v的肽进行所有给药。例如，第一次治疗可以每天至少应用一次2％w/v的肽。该治疗可以持续7-28天。然后，对于后续应用，预防也可以通过每3-6个月(或每9-12个月)进行，每天施用2％w/v，持续7-28天。
[0113]
可选地，该给药可以是3％-9％，例如，3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％。
[0114]
治疗是表面的，意指应用到指/趾甲表面和周围的皮肤。治疗的表面应用意指组合物直接应用到指/趾甲的可接近侧(即远离甲床的暴露侧)，并且可以任选地应用到指/趾甲的游离边缘(游离边缘是指/趾甲延伸超过甲床的部分)。
[0115]
由于peg的存在，peg制剂除了快速干燥之外，还允许患者观察到在指/趾甲上的溶液膜。这使得患者意识到任何遗漏的区域，并且然后患者可以重新应用以确保覆盖指/趾甲的整个表面。也就是说，制剂是成膜性制剂。组合物还用作屏障保护指/趾甲表面，防止再感染并以肽封闭。
[0116]
膜意指在指/趾甲表面形成的薄的、可见的、没有粘性的层。下文的干燥时间与形成该膜所需的时间有关。膜的实例在图14中提供。
[0117]
装置
[0118]
通常，使用应用器诸如滴管、移液管、海绵或刷来应用表面应用。
[0119]
可以使用装置将组合物应用到指/趾甲。装置可以例如是指/趾甲笔(图17)或带有刷应用器的瓶(图16)。
[0120]
用于应用处理的应用器可以是海绵或刷。有利地，使用应用器允许将受控量的组合物涂到(lay down)指/趾甲上。还有利的是，使用海绵或刷允许组合物均匀地或大致均匀地铺展在指/趾甲表面上。
[0121]
干燥时间
[0122]
如本文所用的干燥时间或“一段时间内的干燥”意指预定量的组合物在指/趾甲上干燥并形成膜所需的平均时间。干燥组合物是触摸是干燥的，即触摸不保持粘性的组合物。一般来说，当戴着腈手套时，如果指/趾甲干燥，手套不会粘到指/趾甲上。
[0123]
干燥时间受许多因素影响，包括但不限于应用时的室温、应用的量、指/趾甲尺寸、
指/趾甲的温度(由使用者的体表温度决定)、组合物在指/趾甲上的分布程度。干燥时间通常在约19℃-22℃的室温评估。
[0124]
如本文所用，相对低的干燥时间意指预定量的组合物在应用后少于约35分钟内触摸是干燥的。例如，在3分钟到35分钟之间的时间段内。
[0125]
如本文所用的预定量意指约10μl或更少。即，约每1mm2指/趾甲0.1μl或更少。
[0126]
组合物的量
[0127]
作为实例，患者可以使用10％(w/v)np213溶液，每天一次将组合物涂在指/趾甲上，持续28天。如果每个指/趾甲使用10μl，计算如下：
[0128]
10％＝100mg/ml＝10μl中1mg，这相当于在上述28天的治疗过程内每个指/趾甲28mg。
[0129]
对于较大的趾甲，可以使用更多的组合物，例如多达150μl/天。
[0130]
用途
[0131]
已经发现peg 500-8000可用作用于指/趾甲组合物的成膜剂。因此，提供了peg 500-8000在水性表面指/趾甲组合物中作为成膜剂的用途。这种成膜剂对于含蛋白质的指/趾甲组合物特别有用。这是因为用于形成膜的普通指/趾甲油不适合用于蛋白质，因为它们含有有机溶剂。而通过使用peg，蛋白质保持其效力。另外，peg不会像典型的有机溶剂那样损害指/趾甲。因此，使用peg的有利效果是：1)用于含有蛋白质的组合物的更好的载体；2)形成快速干燥的膜的能力；以及3)避免损害指/趾甲的有机溶剂。
[0132]
在本说明书的上下文中，“包含(comprising)”应解释为“包括(including)”。
[0133]
包括某些要素的本发明的方面还旨在扩展到“由相关要素组成”或“基本上由相关要素组成”的可选的实施方案。
[0134]
在技术上合适的情况下，可以组合本发明的实施方案。
[0135]
诸如专利和申请的技术参考通过引用并入本文。
[0136]
本文具体和明确叙述的任何实施方案可以单独或与一个或更多个另外的实施方案组合形成免责声明的基础。
实施例
[0137]
实施例1：在基于传统溶剂的指/趾甲油中的肽制剂对比在peg中的肽制剂
[0138]
本发明人试图找到一种肽制剂，其允许使用者观察到肽被应用到何处；并保持了肽的效力。
[0139]
在先前与用于治疗甲癣的其他表面抗真菌剂(由anacor和roehm制造的那些)一起使用的选择的指/趾甲油中测试np213(环状精氨酸7-mer肽：环状r-r-r-r-r-r-r，作为已知具有抗真菌活性的4-15mer的代表，参见实施例5)的活性。这些指/趾甲油是成膜性的，允许使用者观察到哪些区域已经被抗真菌处理所覆盖。然而，np213在已知的指/趾甲油中无效。
[0140]
然后，本发明人放弃了这些传统的指/趾甲油，并测试了np213的不同制剂。发现peg保持了环肽的效力，并允许在应用时形成膜。如以上解释的，这有效地允许使用者观察到哪些区域已经用肽处理过。
[0141]
在目前用于表面处理的指/趾甲油与peg之间进行了比较。
[0142]
将np213(5％和10％w/v)配制在50％(v/v)peg4000中。
[0143]
替代地，将np213以0％、5％或10％(w/v)的浓度溶解/悬浮在指/趾甲油制剂中。将10μl的每种指/趾甲油一式三孔地应用到平底96孔板中的孔底部，并允许其干燥90min。
[0144]
在1 x rpmi-1640液体培养基中制备3
×
103cfu红色毛癣菌ncpf0118的接种物，并向所有含指/趾甲油的孔和不含指/趾甲油的对照孔(生长对照)中添加200μl。含有200μl rpmi-1640液体培养基而不含接种物的另外3个孔/板用作无菌对照。
[0145]
向每个孔中添加最小体积的阿尔玛蓝(alamar blue)溶液(0.0025％(w/v)终浓度)。基于代谢活性的变化(根据对细胞活力指示剂阿尔玛蓝的代谢)来确定抗真菌活性。每24h通过荧光(ex 530nm/em 590nm)监测代谢活性，持续168h。
[0146]
指/趾甲油的组成如下：
[0147][0148]
结果：
[0149]
当与被制备在50％(v/v)peg4000中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213的活性相比时，被制备在roehm指/趾甲油1中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213针对红色毛癣菌ncpf0118的抗真菌活性较低(由较高的代谢活性证明)(图1)。
[0150]
当与被制备在50％(v/v)peg4000中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213的活性相比时，被制备在roehm指/趾甲油2中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213针对红色毛癣菌ncpf0118的抗真菌活性较低(由较高的代谢活性证明)(图2)。
[0151]
当与被制备在50％(v/v)peg4000中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213的活性相
比时，被制备在roehm指/趾甲油3中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213针对红色毛癣菌ncpf0118的抗真菌活性较低(由较高的代谢活性证明)(图3)。
[0152]
当与被制备在50％(v/v)peg4000中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213的活性相比时，被制备在roehm指/趾甲油4中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213针对红色毛癣菌ncpf0118的抗真菌活性较低(由较高的代谢活性证明)(图4)。
[0153]
当与被制备在50％(v/v)peg4000中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213的活性相比时，被制备在roehm指/趾甲油5中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213针对红色毛癣菌ncpf0118的抗真菌活性较低(由较高的代谢活性证明)(图5)。
[0154]
当与被制备在50％(v/v)peg4000中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213的活性相比时，被制备在anacor指/趾甲油c中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213针对红色毛癣菌ncpf0118的抗真菌活性较低(由较高的代谢活性证明)(图6)。
[0155]
当与被制备在50％(v/v)peg4000中的5％(w/v)np213和10％(w/v)np213的活性相比时，被制备在2d指/趾甲油中的10％(w/v)np213针对红色毛癣菌ncpf0118的抗真菌活性较低(由较高的代谢活性证明)(图7)。
[0156]
结果总结：
[0157]
发现水和peg在维持肽效力方面是更佳的制剂。
[0158]
当评估5％(w/v)或10％(w/v)np213针对红色毛癣菌ncpf0118的抗真菌活性时，没有一种测试的指/趾甲油制剂优于水和50％ peg4000的制剂。
[0159]
除了治疗真菌感染以外，peg组合物还使指/趾甲补充水分(hydrate)并改善其状况，这意味着指/趾甲更有可能从感染或创伤中恢复。这与目前使用的对指/趾甲不利的有机溶剂指/趾甲油形成对比。
[0160]
实施例2：各种peg溶液提供适合于表面指/趾甲应用的短的干燥时间
[0161]
用水将肽np213(7mer环状聚精氨酸)制成高达至40％重量体积比的溶液。然后在安全柜中使用sdh2o将该40％溶液稀释成20％溶液。使用了各种mwt peg溶液。peg在微波炉中熔化，如下：
[0162]
peg400-已是液体(sigma目录号p3265批次054k0063)
[0163]
peg1500-薄片(fluka目录号86101批次1164516)
[0164]
peg2000-薄片(sigma目录号84797批次bcbd7108v)
[0165]
peg3000-薄片(sigma目录号81227批次bcbb2865)
[0166]
peg4000-薄片(fluka目录号95904批次1206119)
[0167]
添加250μl peg和250μl 20％肽以在2ml微量离心管(圆底)中立即提供50％ peg、10％肽、40％水的溶液。使用在孵育器中温热到30℃的修整过的吸头，向微量离心管中添加250μl peg，然后添加250μl 20％肽。在冷却和随后通过倒置溶液而混合时记录溶液外观。
[0168]
对于peg+水(无肽)，在2ml冷冻瓶中配制50％溶液(0.5ml peg和0.5ml sdh2o)并留置过夜以检查peg是否从溶液中析出。记录结果。
[0169]
·
peg400
‑‑
留在溶液中
[0170]
·
peg1500
‑‑
留在溶液中
[0171]
·
peg2000
‑‑
留在溶液中
[0172]
·
peg3000
‑‑
留在溶液中
[0173]
·
peg4000-大部分留在溶液中
[0174]
由足病医生获得的趾甲被彻底清洗并切成4个尺寸大致相等的趾甲。趾甲被放入在安全柜中的小培养皿中。将10μl每种溶液添加到趾甲，并记录在22℃在工作台上的干燥时间。结果在下表1和图8中示出。
[0175]
表1
[0176][0177]
结果总结：
[0178]
含有peg的肽制剂显示出适合于表面指/趾甲应用的干燥时间。干燥时间全都与形成膜所需的时间有关。如以上解释的，膜是合意的，因为它允许使用者观察到产品已经被应用的位置。传统指/趾甲油提供这种膜，但与肽不相容，因为它们抑制抗真菌活性。本发明人发现peg产生成膜组合物，并且重要的是其与环肽相容，即肽的抗真菌活性在peg中得以维持。
[0179]
实施例3各种peg和肽制剂的长期稳定性
[0180]
材料
[0181]
评估了一系列peg类型、浓度和肽浓度：
[0182]
[0183][0184]
制剂在透明、带刻度的、螺旋盖玻璃小瓶中制备，并每天/每周评估物理外观。
[0185]
peg1000：thermo-fisher；目录号10752621；批次号a0369980
[0186]
peg1500：sigma-aldrich；目录号86101；批次号1164516
[0187]
peg2000：sigma-aldrich；目录号84797；批次号bcbd7108v
[0188]
peg3000：sigma-aldrich；目录号81227；批次号bcbb2865
[0189]
peg4000：sigma-aldrich；目录号95904；批次号1206119
[0190]
peg8000：melford laboratories ltd；目录号p0808；批次号19659
[0191]
novexatin(上文也称为np213，7mer环状聚精氨酸)：polypeptide laboratories；批次号gap 10149；97.93％纯度；65.10％肽
[0192]
带刻度的螺旋盖小瓶(实心盖/teflon内衬)：sigma-aldrich；目录号27505-u；批次号78573。
[0193]
方法：
[0194]
在开始配制工作之前将所有玻璃和塑料器皿预加热到37℃，以确保并促进peg溶液的准确分配。
[0195]
在sdh2o(18mω)中制备浓度为400g/l的np213的溶液，并预热至37℃，然后立即用于制剂制备。
[0196]
固体peg薄片/晶体在微波炉中以低功率在玻璃通用瓶中熔化，直到获得澄清溶液。立即将适当体积的peg转移到2ml玻璃小瓶中，并用预热的sdh2o(18mω)和/或浓缩的肽溶液将最终体积补足到1ml。通过倒置混合制剂以确保均匀性。
[0197]
将制剂储存在室温(18℃-20℃)黑暗中，并在2h后进行评估，并在最初几周内每天进行评估，并且然后无限期地每周进行评估。将制剂外观和环境温度记录在microsoft excel中。
[0198]
结果：
[0199]
0％(w/v)肽：
[0200]
47.5％、50.0％、52.5％&55.0％(v/v)peg1000
[0201]
47.5％、50.0％、52.5％&55.0％(v/v)peg1500
[0202]
47.5％、50.0％、52.5％&55.0％(v/v)peg2000
[0203]
47.5％、50.0％、52.5％&55.0％(v/v)peg3000
[0204]
47.5％、50.0％、52.5％&55.0％(v/v)peg4000
[0205]
47.5％、50.0％、52.5％&55.0％(v/v)peg8000
[0206]
peg1000、peg1500和peg2000溶液保持澄清和非黏性长达33周。peg3000溶液最初是澄清且非黏性的，但在8-9天后变得有黏性，并保持不变至少33周。peg4000和peg8000溶液在≥48周内保持澄清并有黏性。该实验在48周后终止。
[0207]
novexatin结果：
[0208]
在peg1000、peg4000和peg8000溶液中以5.0％、7.5％、10.0％、12.5％和15.0％(w/v)的肽制备novexatin(np213)制剂。
[0209]
对于15.0％(w/v)np213，peg1000/novexatin制剂保持为澄清、非黏性溶液至少34周，并且对于所有其他np213浓度，peg1000/novexatin制剂保持为澄清、非黏性溶液至少37周。
[0210]
含有5.0％和7.5％(w/v)np213的peg4000/novexatin制剂保持为澄清、有黏性溶液至少31周。除了含有52.5％(v/v)peg的溶液之外，含有10.0％和12.5％(w/v)np213的peg4000/novexatin制剂保持为澄清、有黏性溶液至少31周。含有10.0％和12.5％(w/v)np213并含有52.5％(v/v)peg的peg4000/novexatin制剂在刚制备时含有小的白色晶体(np213，不是peg)，但在室温孵育24h后，晶体溶解形成澄清、有黏性的溶液，并保持这样至少31周。含有15.0％(w/v)np213并含有52.5％(v/v)peg的peg4000/novexatin制剂在刚制备时含有小的白色晶体(np213，不是peg)，但在室温孵育48h后，晶体溶解形成50.0％和52.5％(v/v)peg的澄清、有黏性溶液，并保持这样至少28周。
[0211]
含有5.0％和7.5％(w/v)np213的peg8000/novexatin制剂保持为澄清、有黏性溶液至少31周。除了含有52.55％和55.0％(v/v)peg的溶液之外，含有10.0％ np213的peg8000/novexatin溶液保持为澄清、有黏性的溶液至少31周。含有10.0％(w/v)np213和52.5％或55.0％(v/v)peg的peg8000/novexatin制剂在刚制备时含有小的白色晶体(np213，不是peg)，但在室温孵育24h后，晶体溶解形成澄清、有黏性的溶液，并保持这样至少31周。含有12.5％ np213和47.5％(v/v)peg8000的peg8000/novexatin溶液保持为澄清、有黏性溶液至少31周。含有12.5％ np213和50.0％或52.5％(v/v)peg的peg8000/novexatin溶液在刚制备时含有小的白色晶体(np213，不是peg)，但在室温孵育24h后，晶体溶解形成澄清、有黏性的溶液，并保持这样至少31周。
[0212]
含有15.0％ np213和47.5％或50.0％(v/v)peg8000的peg8000/novexatin溶液保持为澄清、有黏性的溶液至少32周。含有52.5％(v/v)peg和15.0％(w/v)np213的peg8000/novexatin溶液在刚制备时含有小的白色晶体(np213，不是peg)，并保持37天，随后溶解，得到澄清、有黏性的溶液，保持至少再24周。
[0213]
总结：
[0214]
所有制备的没有溶解肽的peg制剂保持为澄清溶液至少48周。含有peg1000(47.5％-55.0％(v/v))和novexatin(5.0％-15.0％(w/v))的所有peg制剂都是澄清、非黏性的溶液，并保持这样至少32-34周。
[0215]
含有peg4000(47.5％-55.0％(v/v))和novexatin(5.0％-15.0％(w/v))的所有peg制剂都是澄清溶液，并保持这样至少19周。
[0216]-含有peg8000(47.5％-55.0％(v/v))和novexatin(5.0％-15.0％(w/v))的所有peg制剂都是澄清溶液，并保持这样至少19周。
[0217]
实施例4：edta和其他蛋白酶抑制剂同样具有针对各种指/趾甲真菌病原体的抗真菌活性：蛋白酶抑制剂对np213(环状聚精氨酸肽，即环状r-r-r-r-r-r-r)的最小抑制浓度(mic)和最小杀真菌浓度(mfc)的影响
[0218]
确定mic的抗真菌易感性测试通过用于丝状真菌的肉汤微量稀释程序(m38-a2)(clinical&laboratory standards institute(clsi).2008.reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi；批准的标准
–
第二版(m38-a2)进行.clinical and laboratory standards institute,wayne,pa)。本实验一式三份地进行，每个实验中三份样品。在存在以下蛋白酶抑制剂的情况下，通过如以上描述确定针对红色毛癣菌ncpf0118和趾间毛癣菌ncpf0335的np213 mic来评估np213的蛋白水解稳定性：丝氨酸蛋白酶(1mm苯甲磺酰氟；pmsf)、金属蛋白酶(100μm乙二胺四乙酸；edta)、天冬氨酰蛋白酶(1mg/l胃蛋白酶抑制剂a)和半胱氨酸蛋白酶(10μm反式-环氧琥珀基-l-亮氨酰氨基(4-胍基)丁烷；e-64)。这些浓度的蛋白酶抑制剂对红色毛癣菌ncpf0118或趾间毛癣菌ncpf0335的生长都没有影响。
[0219]
修改的抗真菌易感性测试程序
[0220]
如以上描述进行抗真菌易感性测试，但有以下修改。将rpmi-1640培养基取代为在10mm磷酸钠缓冲液ph 7.0中的0.5％(w/v)粉状趾甲、皮肤角蛋白或绵羊的羊毛角蛋白悬浮液，其含有0.0025％(w/v)alamarblue
tm
(thermofisher scientific,uk)。人类趾甲是从nhs足病医生(nhs grampian)获得的，经过适当的伦理批准(rec参考：05/s0801/115)，来自因趾甲向内生长导致趾甲撕脱后的供体。基于足病医生的诊断，所有趾甲均无疾病。将趾甲切成小片段，并在研钵中用研杵在液氮中研磨成细粉。随后，使粉状趾甲通过细网筛，并将过筛的趾甲粉末用于制备在20mm磷酸钠缓冲液ph 7.0中的悬浮液。趾甲粉末悬浮液通过在121℃高压灭菌20min而灭菌。绵羊的羊毛和人类皮肤角蛋白从abcr gmbh获得。
[0221]
每24h通过荧光(ex 530nm/em 590nm)监测代谢活性，持续长达216h或直到在不存在任何抗真菌剂的情况下在接种的对照中观察到高代谢活性(100000u)。作为对照，在rpmi-1640培养基中进行抗微生物易感性测试，并通过测量光密度和代谢活性两者来确定mic。单独的磷酸钠缓冲液ph 7.0不支持皮肤癣菌生长(数据未示出)。本实验一式三份地进行，每个实验中三份样品。
[0222]
结果
[0223]
数据在图9-图11和下表2中示出。
[0224]
表2
[0225][0226]
表3：其他蛋白酶抑制剂对np213针对rpmi-1640液体培养基中的皮肤癣菌红色毛癣菌ncpf0118和趾间毛癣菌ncpf0335的抗真菌活性的影响。mic通过肉汤微量稀释程序(clsi,2008)。金属蛋白酶抑制剂-100μmedta；丝氨酸蛋白酶抑制剂-1mg/l pmsf；半胱氨酸蛋白酶抑制剂-10μme64；天冬氨酰蛋白酶抑制剂-1mg/l胃蛋白酶抑制剂。在测试的浓度，蛋白酶抑制剂不抑制rpmi-1640液体培养基中任一分离物的生长。
[0227][0228][0229]
结果总结
[0230]
金属蛋白酶抑制剂(包括edta和贝他定)增强了环肽的抗真菌作用。
[0231]
实施例5：所要求的氨基酸范围的肽具有抗真菌活性
[0232]
抗真菌易感性测试通过如clsi批准的标准m38-a2中描述的肉汤微量稀释程序进行。将所有肽溶解在无菌去离子水(40mg/ml)中并储存在-20℃直到需要。所有实验一式三份地进行，每个实验中三份样品。
[0233]
表4：环状精氨酸肽针对红色毛癣菌ncpf0118和趾间毛癣菌ncpf0335的抗真菌活性。
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结果总结
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所要求保护的范围内的环肽显示出对不同种类真菌的抗真菌活性。
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实施例6：取代保留了抗真菌活性
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抗真菌易感性测试通过如clsi批准的标准m38-a2中描述的肉汤微量稀释程序进行。将所有肽溶解在无菌去离子水中(40mg/ml)并储存在-20℃直到需要。所有实验一式三份地进行，每个实验中三份样品。
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结果总结
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结果在图12和13中示出。r和f的取代不会对环肽的活性产生不利影响。
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实施例7：用环肽的治疗比目前使用的抗真菌治疗更快
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测试了环肽提供抗真菌效果所需的时间。
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优化了皮肤癣菌趾甲感染的实验模型，以在实验室条件下模拟甲癣，并测试np213的抗真菌效力。作为惰性支持物并为了提供潮湿的气氛，在90-mm培养皿中制备无菌水琼脂板(1.5％(w/v)琼脂在无菌去离子水中)。将培养皿分成三个部分，并且将个体无菌硅橡胶管段(1-cm直径；3-mm高度)放置在每个部分中，允许研究三个趾甲片段/板。这阻止了趾甲和琼脂表面或培养皿盖之间的直接接触。这样的设置是必要的，因为琼脂含有可以与阳离子肽(包括np213)结合的成分，抑制它们的扩散并降低活性。硅管对氧气和二氧化碳是可渗透的，并且它的使用确保了支持真菌生长的氧气通道。它的直径足够小，以稳定地支持趾甲片段。未感染的人类趾甲(在伦理批准下获得)在切割成一定尺寸之前清除所有残留的皮肤和残渣(从成年男性大拇趾趾甲获得大约四个片段)，并使用千分尺确定它们的表面积和厚度。将趾甲片段浸入10ml去离子水中，并通过在134℃高压灭菌20min来灭菌。然后将样品的腹侧(甲床侧，凹面)表面朝上安装在硅管环上。分配趾甲样品以便为每个处理提供相似平均尺寸和厚度的趾甲。将趾甲留置干燥，并在30℃的潮湿气氛中孵育7天以确保无菌。在每个趾甲片段的腹侧表面接种无菌0.15m nacl中含有大约2
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107个毛癣菌属物种孢子的孢子悬浮液(0.01ml孢子悬浮液/趾甲表面积)。实验一用红色毛癣菌ncpf0118进行。实验二用红色毛癣菌atcc-mya-4438进行。实验三用红色毛癣菌s52d0进行。培养皿在含有无菌去离子水储器的密封塑料盒内(以避免脱水)在30℃孵育14天，此时在趾甲片段的整个表面上的菌丝生长清晰可见。同一培养皿中的趾甲总是暴露于相同的真菌接种物和处理，降低了交叉污染的风险。
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通过将np213或对照应用到趾甲背侧来处理所有趾甲片段。趾甲的背侧(凸面)方面通常暴露于环境。每天应用抗真菌剂(0.01ml/cm2趾甲表面积)，并用无菌指/趾甲油刷应用器分布在趾甲区域的表面。在每天用np213处理7天、14天或28天之后，将趾甲片段转移到无菌的2.0-ml微量离心管中，该管含有1ml含有6％(w/v)聚茴香磺酸(pasa)的sab肉汤以中
和残留的np213，并含有100mg无菌的0.5-mm-直径玻璃珠。使用珠磨式研磨器(bead-beater)将管的内容物彻底混合1min，以从趾甲基质中释放真菌细胞用于计数，并在含有3％(w/v)pasa的sabouraud右旋糖肉汤中制备10倍的逐步稀释液。将样品铺在马铃薯右旋糖琼脂上，并在30℃孵育14天，并对菌落计数。
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结果总结
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结果在图15中示出。这些结果表明，在开始治疗的11天内可以观察到抗真菌效果。这与目前的抗真菌治疗(通常需要至少48周治疗之后才能观察到趾甲的任何改善)形成对比。