用于治疗用途的单亚硝基化的和双亚硝基化的烷基多元醇的制作方法

1.本发明涉及单亚硝基化的和双亚硝基化的烷基多元醇以及包括其的组合物和调配物在用于治疗微生物感染的方法中的用途。


背景技术：

2.在本说明书中对明显先前公开的文件的列举或讨论不一定被认为是承认该文件是现有技术或公知常识的一部分。
3.据估计，由微生物感染引起的疾病每年导致超过1700万人死亡。最常见的致命感染包含肺炎、腹泻病、结核病、疟疾、肝炎、hiv/aids、麻疹、新生儿破伤风、百日咳和肠道蠕虫(who，《1996年世界卫生报告—战胜疾病，促进发展(the world health report 1996
–
fighting disease,fostering development)》)。通常，此类疾病是由寄生虫、细菌、真菌或病毒颗粒感染引起的。
4.细菌是属于原核生物领域的微小单细胞生物体。细菌的特征是缺乏细胞核，因为它们的dna在生物体内自由漂浮，被脂质膜和由肽聚糖组成的细胞壁包围。尽管某些细菌，如支原体，根本没有细胞壁，并且相反，一些细菌具有第三层，即最外层的保护层，被称为被膜。它们具有许多形状，包含球形、杆状和螺旋形，并且一些物种含有帮助它们移动的鞭毛。据估计，在地球上存在107至109种不同的细菌物种。动物与细菌以共生关系生活，并且在没有微生物(包含生活在肠道中的细菌)的情况下，许多功能如人类消化系统将无法工作。然而，存在大约100种细菌物种，它们对人类具有致病性并且导致严重疾病并且甚至死亡。细菌经常经由通过食物或水传染给人类，但人类或动物传染给人类也是可能的。
5.真菌是微小的真核生物，其特征是在其细胞壁中含有几丁质。与细菌不同，真菌含有膜结合的细胞器和清晰界定的细胞核。真菌生活在单细胞生物体(即酵母)或多细胞生物体(即霉菌或蘑菇)中。人类已经发现真菌在许多应用(如食品和药物)中是有用的，但像细菌一样，存在几种在人类中导致严重疾病和死亡的真菌。真菌疾病通常通过直接接触或吸入传播。大量的真菌感染在皮肤的上层中发展，并且一些进展到更深层。全身性真菌感染，如肺炎和体内其他感染，也可能通过吸入酵母或霉菌孢子而发生。
6.寄生虫是生活在对其造成危害的其他生物体(宿主生物体)上或体内的生物体。感染人类的寄生虫主要包含原虫、蠕虫和体外寄生虫。原生动物是以有机物为食的单细胞真核生物，包含单细胞真菌。蠕虫是大的大型寄生虫，并且通常可以通过人眼观察到。蠕虫的实例是生活在胃肠道中的肠道蠕虫和生活在其宿主的血管中的血吸虫。体外寄生虫包含主要生活在其宿主生物体的表面上的寄生虫。寄生虫通常通过直接接触、受污染的食物和水或通过中间宿主(如蚊子)感染人类。
7.已经表明，一氧化氮是由许多不同的细胞类型响应于细胞因子刺激而产生的，因此已经被发现在体外和动物模型中在针对不断增加的原生动物和蠕虫寄生虫的免疫介导的保护中起作用。其对寄生虫靶标作用的生化基础似乎主要涉及对能量代谢和生长至关重要的酶的失活，尽管它也具有其他生物活性。no不仅由通常与细胞介导的免疫反应的效应
臂相关联的巨噬细胞和巨噬细胞样细胞产生，而且还由通常被认为位于免疫网络之外的细胞(如肝细胞和内皮细胞)产生，这些细胞与许多寄生虫的生命周期密切相关。no的产生是由γ干扰素与肿瘤坏死因子α或其他二级激活信号联合刺激的，并受许多细胞因子(特别是白细胞介素-4、白细胞介素-10和转化生长因子β)和其他介质的调节以及通过其自身固有的抑制活性调节(james,《微生物学评论(microbiology rev.)》,1995年12月；59(4):533
–
547)。
8.病毒是包括能够感染生物生物体的遗传材料(dna或rna)的小的生物体。病毒侵入活细胞并且本身附着至活细胞，然后它繁殖以产生更多的病毒颗粒(病毒体)，这些病毒颗粒附着至易感细胞并进入易感细胞。病毒可以杀死细胞或改变其功能，导致感染其他细胞。这通常将导致所谓的病毒性疾病(或病毒感染)。一般而言，病毒可以通过各种方式传播，包含与受感染的个体或其身体分泌物、动物(如节肢动物)或无生命物体接触。病毒也可以通过吸入或吞咽传播。
9.在细菌、真菌、寄生虫或病毒感染后，生物体的免疫防御系统被触发。像淋巴细胞和单核细胞的白细胞试图攻击和破坏侵入性的微生物/病毒。这是身体的免疫应答的一部分，其经常会导致患者感到不适或疲劳。如果患者的免疫系统受到损害，或不足以有效防止感染的传播，就会出现严重的疾病，并且在一些情况下，会导致慢性发病率和/或死亡。然而，一些寄生虫具有通过产生和释放免疫调节产物来操纵其宿主的免疫应答的能力。
10.细菌感染通常通过抗生素来治疗，抗生素通常通过干扰细菌代谢过程来起作用。然而，细菌很容易突变，并且抗生素抗性菌株开始出现。这些抗性菌株导致相当高的死亡率和增加的患者护理费用。广义而言，与由易感菌株引起的类似感染相比，由抗性菌株引起的感染导致高达两倍高的不良结局率。这些不良结局可能是临床的(死亡或治疗失败)或经济的(护理费用、住院时间)，并且反映治疗延迟和抗生素治疗治愈感染的失败。随着疾病严重程度、菌株毒力或宿主脆弱性的增加，这些不良结局的幅度将更加明显。正是这些治疗延迟以及患者和医疗保健系统失败的成本构成了抗生素抗性的负面影响的基础(n.d.friedman,e.temkin,y.carmeli，“抗生素抗性的负面影响(the negative impact of antibiotic resistance)”，《临床微生物学与感染(clinical microbiology and infection)》，第22卷，第5期，2016，第416-422页)。
11.另一个问题是许多目前使用的抗生素的副作用，许多患者对广泛的抗生素组(即青霉素)如此敏感，以至于当使用某些种类的抗生素时，他们可能会因过敏反应而死亡(da silva af,benchimol jl.“疟疾和奎宁抗性:巴西和德国之间的医学和科学问题(malaria and quinine resistance:a medical and scientific issue between brazil and germany)”(1907-19)，《医学史(med hist.)》，2014；58(1):1)。
12.真菌疾病通常通过使真菌经受破坏细胞壁的物质来治疗。然而，正如存在抗生素抗性细菌一样，也存在药物抗性真菌。
13.市场上存在几种抗寄生虫药物，但寄生虫在生物学上非常多样，因此这些药物通常仅对有限数量的寄生虫起作用。一些抗真菌药物和抗生素对寄生虫也有效。然而，对于一些寄生虫感染，没有药物是有效的，并且对寄生虫的药物抗性也是主要问题。
14.虽然许多细菌和真菌感染可以用药物治疗，但存在很少的有效治疗病毒感染的药物。因此，病毒感染通常通过缓解症状来治疗，同时等待被感染的患者的免疫系统杀死病
essentially of)”和“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”将指根据相关测量(例如，按其重量计)，由指定物质的至少80％(例如，至少85％，至少90％，或至少95％，如至少99％)形成的相关组分。术语“基本上由......组成”和“基本上由......组成”可以分别用“由......组成(consists of)”和“由......组成(consisting of)”代替。
29.为了避免疑问，术语“包括”也将包含对“基本上由相关物质组成”(并且特别是“由相关物质组成”)的组分的提及。
30.如本文所使用的，术语“微生物感染”是指细菌、病毒、真菌或寄生虫感染。
31.医学用途
32.根据本发明的第一方面，提供了一种式(i)的化合物：
[0033][0034]
其中r1、r2和r3各自独立地表示h或-no，
[0035]
其中n是0或1；
[0036]
其中当n是0时，r1是h；并且
[0037]
其中当n是1时，r2是h，
[0038]
条件是r1、r2和r3中的至少一个表示-no，
[0039]
其用于在治疗微生物感染中使用。
[0040]
在本发明的可替代的第一方面中，提供了一种在受试者中治疗微生物感染的方法，该方法包括向有此类治疗需要的受试者施用治疗有效量的一种或多种式(i)的化合物：
[0041][0042]
其中r1、r2和r3各自独立地表示h或-no，
[0043]
其中n是0或1；
[0044]
其中当n是0时，r1是h；并且
[0045]
其中当n是1时，r2是h，
[0046]
条件是r1、r2和r3中的至少一个表示-no。
[0047]
在本发明的另外的可替代的第一方面中，还提供了式(i)的化合物的用途：
[0048][0049]
其中r1、r2和r3各自独立地表示h或-no，
[0050]
其中n是0或1；
[0051]
其中当n是0时，r1是h；并且
[0052]
其中当n是1时，r2是h，
[0053]
条件是r1、r2和r3中的至少一个表示-no，
[0054]
其用于制造用于治疗微生物感染的药物。
[0055]
为了避免疑问，提及微生物感染将包含允许相关技术人员(例如保健从业者)使用本领域技术人员已知的技术对其进行鉴定的程度或范围的感染。
[0056]
例如，可以通过从受试者/患者取得样本并提供其培养物在所述受试者/患者中诊断细菌或真菌感染。类似地，细菌、真菌和病毒感染可以通过使用常规技术对样本进行遗传和/或免疫分析来诊断。
[0057]
本领域技术人员将理解，提及治疗患有微生物感染的受试者/患者并不排除此类受试者/患者正在治疗多种类型的此类感染，如两种或三种此类类型的感染。例如，本发明的化合物可以用于同时治疗细菌和病毒感染，该治疗可以被称为细菌感染的治疗、病毒感染的治疗或两种感染的治疗。类似的推理将适用于提及治疗一般类型的感染，如病毒感染，这将包含提及治疗一种或多种特定类型的感染。此外，提及治疗并不排除施用其他抗微生物治疗，如抗生素，作为共治疗，或在施用式(i)的化合物之前或之后。
[0058]
设想由于式i的化合物的广泛抗微生物作用，技术人员不需要在治疗前具体鉴定感染的类型，并且治疗涵盖其中确切的感染因子未知的情况。
[0059]
在特定的实施例中，治疗是对细菌、真菌或病毒感染的治疗。
[0060]
在另一实施例中，治疗是对寄生虫感染的治疗。
[0061]
在特定的实施例中，治疗是对细菌感染的治疗。
[0062]
在实施例中，细菌感染是由革兰氏阳性细菌或革兰氏阴性细菌引起的感染。
[0063]
在其中感染由革兰氏阳性细菌引起的实施例中，细菌可以选自厚壁菌门；例如，细菌可以选自杆菌纲，如细菌可以选自芽胞杆菌目。更具体地，细菌可以选自芽胞杆菌科(bacillaceae)和/或葡萄球菌科(staphylococcaceae)。
[0064]
在另外的实施例中，细菌选自芽孢杆菌属和/或葡萄球菌属，如其中细菌是枯草芽孢杆菌斯氏亚种(bacillus spizizenii)(枯草芽孢杆菌斯氏亚种(b.spizizenii))和/或金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)(金黄色葡萄球菌(s.aureus))。
[0065]
在其中感染由革兰氏阴性细菌引起的实施例中，细菌可以选自变形菌门(phylum proteobacteria)；如，细菌可以选自γ-变形菌纲(gammaproteobacteria)，如细菌可以选自假单胞菌(pseudomonadales)目。更具体地，细菌可以选自假单胞菌科。
[0066]
在实施例中，细菌选自假单胞菌属，如其中细菌是铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa)(铜绿假单胞菌(p.aeruginosa))。
[0067]
在实施例中，治疗是对由细菌感染引起的尿路感染(uti)的治疗。在特定的实施例中，治疗是导管相关尿路感染(cauti)的治疗。
[0068]
在特定的实施例中，治疗是对常规/现有治疗产生抗性的微生物的治疗，例如对金黄色葡萄球菌的抗性菌株，如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)的治疗。
[0069]
在实施例中，细菌选自放线菌属，如选自分枝杆菌科。在这一属中识别出超过190种物种。这一属包含已知在哺乳动物(包含人类)中引起严重疾病的病原体。希腊语前缀
myco-意指“真菌”，暗指已观察到分枝杆菌在培养物的表面以霉菌样的方式生长。它是抗酸的，并且不能用革兰氏染色程序染色。
[0070]
在另外的实施例中，治疗是对真菌感染的治疗。
[0071]
在特定的实施例中，真菌感染是由选自子囊菌门的真菌引起的，如其中真菌选自酵母菌(saccharomycetes)纲；例如其中真菌选自酵母菌目，任选地其中真菌选自酵母菌科，更具体地其中真菌选自念珠菌属，例如其中真菌是白色念珠菌(candida albicans)(白色念珠菌(c.albicans))。
[0072]
在其中真菌感染由选自子囊菌门的真菌引起的实施例中，所述真菌可以选自散囊菌纲(eurotiomycetes)，如其中真菌选自散囊菌目，例如其中真菌选自毛刷囊菌科，更具体地其中真菌选自曲霉属(aspergillus)，例如其中真菌是巴西曲霉(aspergillus brasiliensis)(巴西曲霉(a.brasiliensis))。
[0073]
在另外的实施例中，治疗是对病毒感染的治疗。
[0074]
在另一实施例中，治疗是对呼吸道病毒的治疗。
[0075]
在实施例中，病毒感染是由选自核糖病毒域的病毒引起的，如其中病毒选自螺旋藻门；如其中病毒选自套式病毒目，更具体地其中病毒选自冠状病毒科，如其中病毒选自β冠状病毒属，如其中病毒选自沙贝病毒(sarbecovirus)亚属。在可以提及的特定实施例中，感染由严重急性呼吸道综合征冠状病毒2(sars-cov-2)病毒引起。
[0076]
在另一实施例中，病毒选自负核糖病毒门(negarnaviricota)，例如其中病毒选自单负链病毒(monoegavirales)目，更具体地其中病毒选自副粘病毒科(paramyxoviridae)，如其中病毒选自正肺病毒(orthopneumovirus)属，如其中感染是由呼吸道合胞病毒(rsv)引起的，其通常也被称为人呼吸道合胞病毒(hrsv)和人正肺病毒。
[0077]
在治疗是对寄生虫感染的治疗的实施例中，寄生虫可以是单细胞原生动物寄生虫，例如来自疟原虫属的单细胞原生动物寄生虫，如其中寄生虫是恶性疟原虫(plasmodium falciparum)。
[0078]
在其中治疗是对寄生虫感染的的治疗的另外的实施例中，寄生虫可以是吸虫纲(trematoda)的寄生虫，如寄生扁虫(也通常被称为吸虫)，例如来自血吸虫属(schistosoma)的寄生扁虫。
[0079]
在本发明的所有方面，治疗包含治疗由微生物引起的患者的感染，其中患者被施用有效量(其可以被称为治疗有效量)的式(i)的化合物。
[0080]
本领域技术人员将理解，根据感染的性质和疾病的病理学，如本文所述的微生物感染可以表现为全身感染或局部感染。例如，真菌感染可能表现为局部感染，其中感染局限于特定的组织或器官(例如肺)。病毒和细菌感染本质上可能是全身性的(例如在血浆中可检测到)，但也可能表现出局部效应(例如在肺中)。
[0081]
本领域技术人员将理解，提及治疗病状，例如细菌、寄生虫、真菌或病毒感染(或类似地，治疗该病状)，采用其在医学领域中的正常含义。特别地，该术语可以指实现与该病状相关联的一种或多种体征和/或临床症状的严重程度的降低。
[0082]
例如，在病毒感染的情况下，该术语可以指实现已感染患者的病毒颗粒的数量(即病毒载量)的减少、感染患者的新病毒颗粒的数量的减少和/或在感染的患者中产生的新病毒颗粒的数量的减少，这进而导致症状如发烧、恶心、呼吸短促和咳嗽的严重程度的降低。
[0083]
类似地，在细菌感染的情况下，该术语可以指实现已感染患者的细菌细胞的数量的减少、感染患者的新细菌细胞的数量的减少和/或在患者体内细菌的繁殖的减少，这进而导致症状如发热、恶心、呼吸短促、咳嗽和本文所列的细菌感染的任何其他症状的严重程度的降低。
[0084]
同样在真菌感染的情况下，该术语可以指实现已感染患者的真菌细胞数量的减少、感染患者的新真菌细胞的数量的减少和/或在患者体内真菌细胞繁殖的减少，这进而导致症状如皮疹、瘙痒和皮肤肿胀的严重程度的降低。
[0085]
此外，在寄生虫感染的情况下，该术语可以指实现已经感染患者的寄生虫数量的减少、感染患者的新寄生虫的数量的减少和/或寄生虫在患者体内繁殖的减少。
[0086]
如本文所使用的，术语治疗有效量(和类似术语如有效量等)将是指化合物对有此需要的患者产生治疗效果(即导致患者的治疗)的量。治疗效果可以以客观的(即通过一些测试或标志物可测量的)或主观的(即受试者给出效果的指示和/或感觉到效果)的方式观察。特别地，可以使用如本领域技术人员已知的适当测试以客观的方式观察(例如测量)该效果。
[0087]
术语“病毒载量”是指取自患者的测试样本中特定病毒的量。对于covid-19(其是由sars-cov-2病毒引起的2019年冠状病毒)，这可以通过来自患者的鼻咽拭子进行检测。病毒载量反映了病毒在感染的人体内复制的情况。在样本中检测到的高病毒载量意味着在患者体内存在大量病毒颗粒。
[0088]
术语“细菌载量”是指取自患者的测试样本中特定细菌的量。测试样本可以取自血液、皮肤、尿液或任何其他受感染的身体部位。细菌载量通常通过微生物培养来确定，微生物培养是一种让微生物在实验室中在受控条件下繁殖的方法。细胞培养物用于确定已感染患者(从其采集样本)的微生物的数量和质量。细菌载量反映了细菌在感染的人体内复制的情况。在样本中检测到的高细菌载量意味着在患者体内存在大量细菌细胞。
[0089]
术语“真菌载量”是指取自患者的测试样本中特定真菌的量。测试样本可取自皮肤、身体排泄物或身体受感染的任何其他部位。如上所述，真菌载量通常通过微生物培养来确定。真菌载量反映了真菌在感染的人体内复制的情况。在样本中检测到的高真菌载量意味着在患者体内存在大量真菌细胞。
[0090]
如本文所使用的，提及受试者是指接受治疗的活体受试者，包含哺乳动物(例如人类)受试者。此类受试者也可以被称为患者。特别地，术语患者可以指人类受试者。受试者还可以包含动物(例如哺乳动物)，如家庭宠物(例如猫，以及特别是狗)、家畜(例如，牛、羊、鸭、鸡、猪等)和马。
[0091]
可以提及的患有微生物感染的患者的特定症状包含选自由以下组成的组的那些：发热、肌肉疼痛、头痛、咳嗽、疲劳、恶心、呕吐、腹泻、鼻塞、疼痛、疲劳、喉咙痛、呼吸短促、粘液生成增加、体重减轻和/或皮疹。
[0092]
技术人员将理解，微生物感染的治疗可以起到防止患者获得继发性疾病/并发症(或降低患者获得继发性疾病/并发症的可能性或风险)的作用。因此，还治疗继发性疾病/并发症，其可以是额外的微生物感染、器官的炎症、坏死和败血症。此外，原发性感染的治疗可以包括预防一种或多种继发性感染(即通过治疗原发性感染来预防继发性感染。
[0093]
优选的是将式(i)的化合物施用于患有一种或多种潜在医学病状的患者，该病状
kg-1
min-1
的范围内。
[0105]
在实施例中，在鼻内施用的情况下，式(i)的化合物的剂量在约1nmol kg-1
至约30,000nmol kg-1
，如约100nmol kg-1
至约3000nmol kg-1的范围内。
[0106]
在实施例中，在舌下施用的情况下，式(i)的化合物的剂量在约1nmol kg-1
至约30,000nmol kg-1
，如约100nmol kg-1
至约3000nmol kg-1
的范围内。
[0107]
在实施例中，在经皮施用的情况下，式(i)的化合物的剂量在约1nmol kg-1
至约50,000nmol kg-1
，例如约50nmol kg-1
至约30,000nmol kg-1
，如约100nmol kg-1
至约3000nmol kg-1
的范围内。
[0108]
在实施例中，式(i)的化合物以约1μm至约10,000μm，如约1μm至约1000μm(例如约1μm至约750μm，例如约1μm至约500μm，如约1μm至约250μm，例如约1μm至约100μm，或约1μm至约50μm)的量施用。
[0109]
活性成分的施用可以是连续的或间歇的。施用模式也可能由施用的时间和频率决定，但也取决于该病状的严重程度或以其他方式取决于治疗的需要。
[0110]
优选地，式(i)的化合物作为基本上非水性的组合物施用，该组合物进一步包括式(i)但其中r1、r2和r3表示h的化合物。
[0111]
组合物中活性成分的量将取决于细菌、寄生虫、真菌或病毒感染的严重程度，以及待治疗的受试者。
[0112]
在任何情况下，医师或其他技术人员将能够常规地确定最适合于个体患者的实际剂量。本文提及的剂量是平均情况的示例；当然，可以存在其中需要更高或更低剂量范围的单独的情况，并且这在本发明的范围内。
[0113]
本领域技术人员将理解，在治疗中施用式(i)的化合物的温度(即施用于受试者的温度)可以是其中施用发生的环境温度(即室温)或者可以被控制。例如，此类调配物可以在室温或降低的温度(即低于室温的温度)下形成和/或施用，如约-10℃至约25℃，如约-5℃至约25℃，例如约0℃至约25℃。
[0114]
不希望受理论的束缚，据信在施用于患者后，式(i)的化合物被水解以释放一氧化氮，该一氧化氮单独以及与丙二醇(其也单独作为抗微生物剂起作用)组合提供了发明人发现的令人惊讶的协同抗微生物效果。
[0115]
在本发明的所有方面，治疗减少或抑制微生物在患者中的复制，防止微生物对患者的感染，杀死患者中的微生物和/或积极地影响患者的免疫系统。
[0116]
在实施例中，治疗减少或抑制细菌、真菌和/或病毒在患者中的复制，防止细菌、真菌和/或病毒对患者的感染，杀死患者中的细菌、真菌和/或病毒和/或积极地影响患者的免疫系统。
[0117]
在另一实施例中，治疗减少或抑制寄生虫在患者体内的复制和/或防止患者被寄生虫感染。
[0118]
本发明的第一方面的特定化合物是根据式(ii)的化合物
[0119]
[0120]
其中r2和r3各自独立地表示h或-no，条件是r2和r3中的至少一个表示-no。
[0121]
存在根据式(ii)的化合物的两种对映异构体，为如下所述的r和s形式：
[0122][0123][0124]
式(i)的化合物可以含有如上所述的不对称碳原子，因此将表现出光学异构性。
[0125]
根据式(i)的化合物的所有立体异构体及其混合物都包含在本发明的范围内。
[0126]
本发明的第一方面的另外的特定化合物是根据式(iii)的化合物：
[0127][0128]
其中r1和r3各自独立地表示h或-no，条件是r1和r3中的至少一个表示-no。
[0129]
本发明的第一方面的另外的特定化合物是根据式(iv)的化合物：
[0130][0131]
其中r4和r5各自独立地表示h或-no，条件是r4和r5中的至少一个表示-no。
[0132]
如上所述，在实施例中，式(i)的化合物作为基本上非水性的组合物施用，该组合物进一步包括式(i)但其中r1、r2和r3表示h的化合物。
[0133]
如本文所使用的，提及“基本上非水性的”将指包括按重量计小于1％(如小于0.5％或小于0.1％，例如小于0.05％，小于0.01％)的水的组分。
[0134]
可以提及的本发明的特定的基本上非水性的组合物包含那些其中组合物包括按重量计约0.01％至约9％(例如约0.01％至约5％，如约3％至约5％，或约5％至约7％)的一种或多种本发明的化合物(即式i的化合物)的组合物。
[0135]
可以提及的本发明的特定的基本上非水性的组合物包含那些其中组合物包括约1mm至约1000mm(例如约5mm至约750mm，如约5mm至约500mm，或约10mm至约203mm)的一种或多种本发明的化合物(即式i的化合物)的组合物。
[0136]
可以提及的本发明的另外的基本上非水性的组合物
[0137]
包含其中组合物包括约1μm至约10,000μm，如约1μm至约1000μm(例如约1μm至约750μm，例如约1μm至约500μm，如约1μm至约250μm，例如约1μm至约100μm，或约1μm至约50μm)的那些。
[0138]
为了避免疑问，单位mm是指以10-3
mol/l计的非水性的组合物中式(i)的化合物的浓度，并且在组合物包括式i的化合物的混合物的情况下，是基于组合物中式i的化合物的
平均分子量。
[0139]
为了避免疑问，单位μm是指以10-6
mol/l计的非水性的组合物中式(i)的化合物的浓度，并且在组合物包括式i的化合物的混合物的情况下，是基于组合物中式i的化合物的平均分子量。
[0140]
可以提及的本发明的特定的基本上非水性的组合物包含那些其中组合物包括根据式(ii)的化合物的组合物。优选地，根据式(ii)的化合物是s形式。
[0141]
根据式(ii)的化合物的s形式是优选的，因为它比r形式具有更高的代谢速率。此外，s形式具有不同的代谢降解途径，这导致代谢物的毒性低于r形式。
[0142]
可以提及的本发明的特定的基本上非水性的组合物包含那些其中组合物包括根据式(iii)的化合物的组合物。
[0143]
优选地，根据式(ii)的化合物是s形式，尽管设想产物是式(ii)的s和r形式的混合物，其中s形式优选地以对映体过量(ee)存在。
[0144]
在特定的实施例中，根据式(ii)的化合物可以是对映体过量的化合物的s形式。也就是说，大于50ee％的产物是s形式，如大于或等于60ee％、70ee％、80ee％、90ee％、95ee％或98ee％的产物是s形式。
[0145]
在其中产物是根据式(ii)的单亚硝基化的化合物的实施例中，大于50重量％的产物在2位被亚硝基化(即r2为-no)，如约55重量％至约80重量％在2位被亚硝基化，例如约55重量％至75重量％。
[0146]
可以提及的特定的基本上非水性的组合物包含其中所述组合物基本上由一种或多种式i的化合物和相应的式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物(即1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇)组成。
[0147]
其他特定的基本上非水性的组合物可以包括一种或多种式ii的化合物和1,2-丙二醇(或者特别地，基本上由一种或多种式ii的化合物和1,2-丙二醇组成，或者更特别地，由一种或多种式ii的化合物和1,2-丙二醇组成)。
[0148]
同样，另外的基本上非水性的组合物可以包括一种或多种式iii的化合物和1,3-丙二醇(或者特别地，基本上由一种或多种式iii的化合物和1,3-丙二醇组成，或者更特别地，由一种或多种式iii的化合物和1,3-丙二醇组成)。
[0149]
术语“基本上由
……
组成”意指存在至少90重量％的限定的特征，如存在至少95重量％、96重量％、97重量％、98重量％或99重量％的限定的特征。
[0150]
此外，可以提及的特定的基本上非水性的组合物包含那些其中组合物包括一种或多种式(ii)和(iii)的化合物以及1,2-丙二醇和1,3-丙二醇(或者特别地，基本上由一种或多种式(ii)和(iii)的化合物以及1,2-丙二醇和1,3-丙二醇组成，或者更特别地，由一种或多种式(ii)和(iii)的化合物以及1,2-丙二醇和1,3-丙二醇组成)的组合物。
[0151]
可以提及的特定的基本上非水性的组合物包含那些其中组合物基本上不含溶解的一氧化氮的组合物。
[0152]
术语“基本上不含”意指本发明的非水性的组合物包括小于5重量％、4重量％、3重量％、2重量％或1重量％的溶解的一氧化氮，如小于0.5重量％或0.1重量％。
[0153]
此外，特定的基本上非水性的组合物可以包括：
[0154]
(a)一种或多种式iv的化合物
[0155][0156]
其中r4和r5各自独立地表示h或-no，条件是r4和r5中的至少一个表示-no；和
[0157]
(b)1,2-丙二醇。
[0158]
基本上非水性的组合物可以单独施用，或者可以通过已知的药物组合物/调配物施用。
[0159]
因此，基本上非水性的组合物可以包括在药物调配物中，任选地其中药物调配物包括一种或多种药学上可接受的赋形剂。
[0160]
本领域技术人员将理解，本文提及的药物调配物在本文中是指药物调配物形式的基本上非水性的组合物，并且将包含对其所有实施例和特定形式的提及。
[0161]
如本文所使用的，术语药学上可接受的赋形剂包含对载体、佐剂、载剂、稀释剂、ph调节剂和缓冲剂、张力调节剂、稳定剂、渗透增强剂、湿润剂等的提及。特别地，此类赋形剂可以包含佐剂、稀释剂或载剂。
[0162]
可以提及的特定药物调配物包含那些其中药物调配物包括至少一种药学上可接受的赋形剂的药物调配物。
[0163]
可以提及的特定药物调配物包含其中一种或多种药学上可接受的赋形剂是基本上非水性的那些。
[0164]
为了避免疑问，本文提及的用于特定用途的式(i)的化合物也可以适用于包括本发明的化合物的组合物和药物调配物，如本文所述。
[0165]
在可替代的实施例中，式(i)的化合物作为水性组合物施用，该水性组合物进一步包括式(i)但其中r1、r2和r3表示h的化合物。可以提及的特定水性组合物包含其中组合物包括式(i)的化合物和1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇的那些，其中式(i)的化合物和1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇以0.1体积％至1体积％，如0.3体积％至0.8体积％，例如0.5体积％的浓度存在于组合物中。
[0166]
用于制备式(i)的化合物的工艺
[0167]
本文还描述了一种用于制备包括式i的一种或多种化合物的组合物的工艺
[0168][0169]
其中：
[0170]
r1、r2和r3各自独立地表示h或-no；
[0171]
n是0或1；
[0172]
其中当n是0时，则r1是h；并且其中当n是1时，r2是h；
[0173]
条件是r1、r2和r3中的至少一个表示-no，
[0174]
所述工艺包括以下步骤：
丙二醇和/或1,3-丙二醇起始材料)和任选地其他化合物的组合物。
[0189]
在某些实施例中，该工艺可以是用于制备基本上由一种或多种式i的化合物和一种或多种相应的式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物(即1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇，例如作为其混合物)组成的组合物的工艺。
[0190]
本领域技术人员将理解，术语“反应”将指以使得发生化学反应的方式(例如，在合适的状态和介质中)将相关组分集合在一起。特别地，提及起始材料(即1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇)与亚硝酸盐的来源反应将指起始材料和亚硝酸盐(即由亚硝酸盐源提供的亚硝酸盐)之间的化学反应。
[0191]
本领域技术人员将理解，提及“亚硝酸盐的来源”可以替代地简单地指“亚硝酸盐”，因为正是由亚硝酸盐的来源提供的亚硝酸盐经历了化学反应。因此，提及亚硝酸盐的来源将被理解为是指为反应提供亚硝酸盐部分的化合物(其可以以离子键合或共价键合的形式存在，取决于存在的亚硝酸盐源)。因此，亚硝酸盐的来源可以被称为反应性(或可反应性)亚硝酸盐(或亚硝酸盐部分)的来源。为了避免疑问，亚硝酸盐的来源可能是无机亚硝酸盐或有机亚硝酸酯。
[0192]
如本文所述，当亚硝酸盐的来源是有机亚硝酸酯时，步骤(i)在合适的有机溶剂中进行。
[0193]
技术人员将理解，各种有机腈可以用于本发明的工艺中，如烷基腈。
[0194]
可以提及的特定的亚硝酸烷基酯包含亚硝酸乙酯、硝酸丙酯、硝酸丁酯和硝酸戊酯。在特定的实施例中，亚硝酸烷基酯是亚硝酸正丁酯、亚硝酸异丁酯或亚硝酸叔丁酯，如亚硝酸叔丁酯。
[0195]
在亚硝酸盐的来源是有机亚硝酸酯的情况下，技术人员将能够选择合适的溶剂。例如，合适的溶剂可以包含本文中被称为两相溶剂系统的合适有机组分的那些溶剂，以及其混合物。
[0196]
为了避免疑问，除非另有说明，否则提及在合适的有机溶剂中进行本发明的工艺并不表示可能存在其他非有机溶剂，如水。
[0197]
在特定的实施例中，在该工艺在合适的有机溶剂中进行的情况下，该溶剂可以基本上是不含水(其可以被称为“不含水”或“干燥的”)，这可以表示该溶剂含有小于约1重量％(例如小于约0.1重量％，如小于约0.01重量％)的水。
[0198]
术语“约”在本文中被定义为意指所定义的值可以偏离
±
10％，如偏离
±
5％，例如偏离
±
4％、
±
3％、
±
2％或
±
1％。在不脱离本发明的教导的情况下，可以从整个说明书中去除术语“约”。
[0199]
如本文所述，当亚硝酸盐的来源是无机亚硝酸盐时，步骤(i)在包括水相和非水相的两相溶剂混合物中进行。
[0200]
本领域技术人员将理解，如本文所使用的术语“两相溶剂混合物”将指由两种溶剂或溶剂混合物组成的体系，这两种溶剂或溶剂混合物不会混合以形成单一的溶剂相，而是以两种不同的(即非混合的)相存在。
[0201]
在此类溶剂混合物包括水和有机溶剂(或有机溶剂的混合物)的情况下，此类溶剂体系可以被称为包括“水相”和“有机相”。为了避免疑问，术语两相不表示除了溶剂体系之外，还可以存在形成其他相的物质，如形成固相的物质(也就是说，也可以存在其他相)。
[0202]
可以提及的无机亚硝酸盐的特定来源包含金属亚硝酸盐，如碱金属亚硝酸盐和碱土金属亚硝酸盐。离子液体也可以是无机亚硝酸盐的合适来源。
[0203]
为了避免疑问，术语碱金属采取其在本领域中的通常含义，即指iupac第1族元素和阳离子，包含锂、钠、钾、铷、铯和钫。
[0204]
为了避免疑问，术语碱土金属采取其在本领域中的通常含义，即指iupac第2族元素和阳离子，包含铍、镁、钙、锶、钡和镭。
[0205]
可以提及的更特定的无机亚硝酸盐包含碱金属亚硝酸盐，如亚硝酸锂、亚硝酸钠和亚硝酸钾。在特定的实施例中，亚硝酸盐的来源是亚硝酸钠。
[0206]
可替代地，金属亚硝酸盐可以是碱土金属亚硝酸盐，如亚硝酸锂、亚硝酸镁或亚硝酸钙。
[0207]
为了避免疑问，本领域技术人员将理解，两相溶剂体系中的非水相可以是有机溶剂，其因此可以被称为有机相。
[0208]
技术人员将能够基于水相的性质选择合适的非水性(即有机)溶剂。例如，在水相具有一定水平的溶解在其中的物质(例如，离子固体，如盐)的情况下，可以选择宽范围的有机溶剂以边形成两相溶剂体系。
[0209]
在特定的实施例中，非水相由水不混溶的有机溶剂组成。在更特定的实施例中，水不混溶的有机溶剂是非质子有机溶剂。
[0210]
可以提及的水不混溶的特定有机溶剂(即形成非水相的特定溶剂)包含醚(例如叔丁基甲基醚、环戊基甲基醚、甲基四氢呋喃、乙醚、二异丙醚)和二氯甲烷(dcm)。
[0211]
可以提及的更特定的水不混溶的有机溶剂(即形成非水相的特定溶剂)包含二氯甲烷、乙醚和叔丁基甲基醚。在更特定的实施例中，水不混溶的有机溶剂是叔丁基甲基醚。
[0212]
在可以提及的某些实施例中，溶剂混合物可以包括过量的式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物(即1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇)。为了避免疑问，在此类情况下，1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇(即式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物)可以作为溶剂(例如溶剂混合物的组分)和试剂两者存在。因此，在特定的实施例中，该工艺是用于制备在相应的式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物，即1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇(例如，适当时以包括1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇的混合物的形式)中的溶液形式的式i的化合物的工艺。在某些实施例中，当亚硝酸盐的来源是有机亚硝酸酯时，溶剂可以基本上由式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物(即1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇)组成。也就是说，式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物既可以充当溶剂又可以充当反应物。
[0213]
在可替代的实施例中，当亚硝酸盐的来源是无机亚硝酸盐时，步骤(i)可以在单一溶剂中进行，其中溶剂可以基本上由式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物(即1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇)组成。也就是说，式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物既可以充当溶剂又可以充当反应物。
[0214]
在可替代的实施例中，本发明的工艺可以在相对于式i但其中r1、r2和r3表示h的起始材料(即1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇)过量的亚硝酸盐的情况下进行。
[0215]
如本文所使用的，术语“过量”将采取其在本领域中的通常含义，即表示对于其中它是试剂的反应，该组分以大于化学计量的量存在。
[0216]
如本文所述，该工艺(特别是，组分之间的反应)任选地在合适的酸的存在下进行。
[0217]
可以提及的特定的工艺包含其中使起始材料(即1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇)与亚硝酸盐的来源反应的步骤在合适的酸的存在下进行的那些工艺。
[0218]
可以作为合适的酸提及的特定酸包含布朗斯台德酸(即质子供体酸)，更具体地，其中此类酸可以被称为强酸。
[0219]
为了避免疑问，术语“强酸”采取其在本领域中的通常含义，是指在平衡时在水溶液中其解离基本上完全的布朗斯台德酸。特别地，提及强酸可以指pka(在水中)小于约5(例如，小于约4.8)的布朗斯台德酸。为了避免疑问，对于多质子酸，如硫酸，术语强酸是指第一个质子的解离。
[0220]
可以提及的某些强酸包含pka(在水中)小于约1，如小于约0(例如小于约-1或-2)的那些强酸。例如，可以提及的强酸包含pka(在水中)为约-3的那些强酸。本领域技术人员将理解，合适的酸可以包含非亲核酸，如本领域技术人员已知的。
[0221]
可以提及的特别合适的酸包含硫酸、磷酸、三氟乙酸和乙酸。
[0222]
可以提及的更特别合适的酸包含无机酸(例如强无机酸)，如硫酸。
[0223]
技术人员将能够在本文教导的范围内选择合适量的试剂用于该工艺。例如，相应的式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物与亚硝酸盐与酸(在存在的情况下)的比率(即摩尔比)可以是约1:约1至约5:约0.5至约3.5，例如约1:约1至约3:约0.5至约2(如约1:4:2.7，或约1:2:0.95，或约1:2:1)。为了避免疑问，在不存在合适的酸的情况下，相应的式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物和亚硝酸盐之间的比率仍然可以适用。
[0224]
在特定的实施例中，工艺步骤(i)在约-30℃至约5℃，如约-30℃至约0℃，例如约-30℃至约-10℃，优选地约-25℃至约-15℃的温度下进行。
[0225]
在特定的实施例中，工艺步骤(i)在惰性气氛，如氮气或氩气气氛，优选地氩气气氛下进行。此外，在特定的实施例中，该工艺的任何步骤可以在惰性气氛，如氮气或氩气气氛，优选地氩气气氛下进行。
[0226]
可以提及的特定工艺，尤其是其中使用两相溶剂体系的工艺，包含其中该工艺在步骤(i)之后(例如直接在步骤(i)后)进一步包括以下步骤的工艺：
[0227]
(ii)从溶剂混合物中除去基本上所有的水相(即除去基本上所有的水)。
[0228]
技术人员将理解，可以通过任何合适的工艺和使用如本领域已知的任何合适的设备(例如，通过使用分液漏斗或类似设备)从溶剂混合物中除去水相。
[0229]
如本文所使用的，除非另有说明，否则术语“基本上全部”将指根据相关测量(例如，按其重量计)指定物质的至少80％(例如，至少85％，至少90％，或至少95％，如至少99％)。
[0230]
技术人员还将理解，提及“从溶剂混合物中基本上除去所有的水相”可以被提及“从溶剂混合物中除去一些或所有的水相”或简单地“从溶剂混合物中除去水相”替换。
[0231]
为了避免疑问，在其去除的上下文中，术语水相将指由水和溶解在其中的组分形成的(单独的)相。
[0232]
可以提及的特定工艺，特别是其中使用两相溶剂体系的工艺，包含其中该工艺在步骤(i)之后(例如直接在步骤(i)之后)进一步包括以下步骤(以所示顺序)的那些工艺：
[0233]
(ii)除去一些或所有(例如基本上所有)水相(即水)；
[0234]
(iii)用一种或多种另外的水相洗涤剩余的有机相；
[0235]
(iv)任选地重复步骤(ii)和(iii)一次或多次。
[0236]
可以提及的另外的工艺，特别是其中使用两相溶剂体系的工艺，包含其中该工艺在步骤(i)之后(例如直接在步骤(i)之后)进一步包括以下步骤(以所示顺序)的那些工艺：
[0237]
(ii)除去一些或所有(例如基本上所有)水相(即水)；
[0238]
(iii)用一种或多种另外的水相洗涤剩余的有机相；
[0239]
(iv)任选地重复步骤(ii)和(iii)一次或多次；
[0240]
(v)任选地减少有机相(即减少有机相的量/体积)，如通过除去一些或基本上所有的水不混溶的有机溶剂(例如除1,2丙二醇和/或1,3-丙二醇之外的有机溶剂)，和
[0241]
(vi)任选地干燥产物，
[0242]
其中步骤(ii)至(vi)可以以任何顺序进行，条件是步骤(ii)至(iv)在步骤(v)和(vi)之前进行。
[0243]
在特定的实施例中，工艺步骤(ii)至(iv)可以在约-20℃至约5℃如约-10℃至约5℃的温度下进行。
[0244]
在特定的实施例中，工艺步骤(v)可以在约0℃至约30℃，如约10℃至约30℃，例如约15℃至约30℃的温度下进行。
[0245]
在特定的实施例中，工艺步骤(v)进行不超过6小时，例如不超过5小时，优选地不超过4小时。
[0246]
在特定的实施例中，执行步骤(ii)至(vi)中的每一个，如其中这些步骤以所示的顺序执行。
[0247]
为了避免疑问，本领域技术人员将理解，用一种或多种另外的水相洗涤剩余的有机相将指包括以下的步骤：加入另外一部分的水性溶剂(例如水)；与(单独的)有机相混合(例如通过一起搅拌和/或摇动)；和除去基本上所有的水相，并任选地重复所述步骤一次或多次。
[0248]
技术人员将理解，步骤(iii)可以通过任何合适的工艺和使用本领域已知的任何合适的设备(例如，使用分液漏斗)来进行。
[0249]
技术人员将理解，步骤(v)可以通过任何合适的工艺和使用本领域已知的任何合适的设备(例如，通过在减压下蒸发)来进行。
[0250]
在步骤(v)的上下文中，提及除去一些有机相可以特别地是指除去基本上所有的水不混溶的有机溶剂，如本文所定义的。更具体地，去除水不混溶的有机溶剂可以指去除按重量计至少99％(如至少99.5％、99.9％或特别是99.99％)的水不混溶的有机溶剂。
[0251]
此类水不混溶的有机溶剂的去除也可以指这样的去除，使得在此类去除之后的产物含有按重量计小于1％(如小于0.5％，0.1％，例如小于0.05％，小于0.01％)的水不混溶的有机溶剂。
[0252]
为了避免疑问，在步骤(v)的上下文中，提及除去有机相，如水不混溶的有机溶剂，将指除去如本文定义的任何此类溶剂(例如除去二氯甲烷或叔丁基甲基醚)。在存在另外的有机溶剂的情况下(如不是水不混溶的那些，例如充当溶剂的过量的1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇)，也可以除去一部分此类溶剂(例如，与水不混溶的有机溶剂一起)。
[0253]
在步骤(vi)的上下文中，提及干燥产物将指在前面的步骤之后从剩余的材料中除去水。此类水的去除可以指去除使得在此类干燥之后的产物含有按重量计小于1％(如小于
0.5％或小于0.1％，例如小于0.05％或小于0.01％)的水。
[0254]
技术人员将理解，步骤(vi)可以通过任何合适的工艺和使用本领域已知的任何合适的设备来进行(例如，通过使剩余的有机相与合适的干燥剂如无水硫酸钠、无水硫酸镁和/或分子筛接触)。
[0255]
可以提及的特定工艺包含其中该工艺进一步包括添加另外量的相应的式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物(即1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇)的步骤(例如，在步骤(i)和(如果存在的话)如本文所述的其他步骤之后)，使得一种或多种式i的化合物和相应的式i但其中r1、r2和r3表示h的化合物(即1,2-丙二醇和/或1,3-丙二醇)的组合的混合物占本发明的一种或多种化合物的按重量计约0.01％至约9％(例如约0.01％至约5％，如约3％至约5％，或约5％至约7％)。
[0256]
如上所述，在不脱离本工艺的公开的情况下，本工艺的所有实施例和本文提到的特定特征可以与本文提到的任何其他实施例和/或特定特征(因此描述了如本文公开的更多特定实施例和特定特征)相分离或结合。
[0257]
例如：在约-30℃至约5℃的温度下进行的工艺步骤(i)可以与工艺步骤(ii)至(iv)的特征相结合，工艺步骤(ii)至(iv)可以在约-20℃至约5℃的温度下进行；工艺步骤(v)的特征是在约0℃至约30℃的温度下进行；和/或工艺步骤(v)的特征进行不超过6小时。
[0258]
可以提及的更特定的工艺包含其中指定的参数与本文提供的实例一致的工艺。
[0259]
该工艺的特定产物是根据式(ii)的化合物
[0260][0261]
其中r2和r3各自独立地表示h或-no，条件是r2和r3中的至少一个表示-no，其中所述工艺包括在如本文所述的条件下(包含其所有实施例)使1,2-丙二醇(即起始材料)与亚硝酸盐的来源反应的步骤。
[0262]
存在根据式(ii)的化合物的两种对映异构体，为如下所述的r和s形式：
[0263][0264][0265]
该工艺的另外的特定产物是如下所述的根据式(iii)的化合物：
[0266][0267]
其中r1和r3各自独立地表示h或-no，条件是r1和r3中的至少一个表示-no，其中该
工艺包括使1,3-丙二醇与亚硝酸盐的来源反应的步骤。
[0268]
上面描述的用于生产根据式(ii)和(iii)的化合物的两种特定工艺可以一起或彼此独立地进行。
[0269]
基于反应混合物的发生的两相性质，任选的加入相转移催化剂(ptc)可以支持产物的形成。常见的ptc是例如但不限于四烷基铵离子如me4n+、et4n+、bu4n+或bu3(n+)ch2phcl，其带有抗衡离子如＝cl-、br-、hso
4-，或其他类型的烷基铵ptc如336，其化学计量的量《1当量，例如但不仅仅在约0.05mol％至约40mol％，如约0.1mol％至约30mol％，例如约0.1mol％至约20mol％的范围内。
[0270]
该工艺的另外的特定产物是如下所述的根据式(iv)的化合物
[0271][0272]
其中r4和r5各自独立地表示h或-no，条件是r4和r5中的至少一个表示-no。
[0273]
因此，特定的工艺是用于制备包括一种或多种式(iv)的化合物的组合物
[0274][0275]
其中r4和r5各自独立地表示h或-no，条件是r4和r5中的至少一个表示-no，
[0276]
所述工艺包括以下步骤：
[0277]
(i)任选地在合适的酸的存在下，使1,2-丙二醇与亚硝酸盐源反应，
[0278]
其中：
[0279]
(a)当亚硝酸盐源是有机亚硝酸酯时，步骤(i)在合适的有机溶剂中进行；和
[0280]
(b)当亚硝酸盐源是无机亚硝酸盐时，步骤(i)在包括水相和非水相的两相溶剂混合物中进行。
[0281]
本文概述的工艺步骤中的任何一个可以与上文关于式(iv)描述的特定工艺组合，并且特定的实施例在下面概述。
[0282]
在特定的工艺中，无机亚硝酸盐是金属亚硝酸盐，任选地，其中金属亚硝酸盐是碱金属亚硝酸盐或碱土金属亚硝酸盐，优选地碱金属亚硝酸盐。
[0283]
在特定的实施例中，碱金属亚硝酸盐是亚硝酸钠。
[0284]
在另外的特定实施例中，有机亚硝酸酯是亚硝酸烷基酯，如亚硝酸叔丁酯。
[0285]
在特定的工艺中，合适的酸是强酸，如强无机酸(例如硫酸)。
[0286]
在特定的实施例中，非水相包括水不混溶的有机溶剂，如水不混溶的非质子有机溶剂。
[0287]
在实施例中，水不混溶的有机溶剂是二氯甲烷。
[0288]
在特定的工艺中，溶剂混合物进一步包括过量的1,2-丙二醇。
[0289]
在另外的特定工艺中，在步骤(i)之后，该工艺进一步包括以下步骤：
[0290]
(ii)从溶剂混合物中除去基本上所有的水相。
[0291]
在实施例中，在步骤(i)之后，该工艺进一步包括以下步骤：
[0292]
(ii)除去一些或所有(例如基本上所有)水相(即水)；
[0293]
(iii)用一种或多种另外的水相洗涤剩余的有机相；
[0294]
(iv)任选地重复步骤(ii)和(iii)一次或多次。
[0295]
(v)任选地减少有机相(即减少有机相的量/体积)，和
[0296]
(vi)任选地干燥产物，
[0297]
其中步骤(ii)至(vi)可以以任何顺序进行，条件是步骤(ii)至(iv)
[0298]
在步骤(v)和(vi)之前进行。
[0299]
在特定的实施例中，该工艺进一步包括添加另外量的1,2-丙二醇的步骤，使得一种或多种式i的化合物和1,2-丙二醇的组合的混合物包括约0.01重量％至约9重量％的一种或多种式iv的化合物。
[0300]
在如本文所述的本发明的所有方面的特定的实施例(包含所有实施例及其实施例的组合)中，使用如本文所述的工艺(包含其所有实施例)制备本发明的化合物(例如式(i)的化合物)。例如，在本发明的第一方面的特定的实施例中，式(i)的化合物通过以上定义的工艺中的任何一种制备。
[0301]
如上详述的用于制备式(i)的化合物的工艺提供了在溶液中相对高浓度的本发明的化合物，从而提供了处理的便利性并使储存体积和运输成本最小化。此外，该工艺不导致溶解的一氧化氮气体或无机亚硝酸盐，从而使突然和自发分解的风险最小化，并降低了当该工艺的产物用于疗法时的潜在副作用。该工艺还导致仅产生非常低水平的其他杂质。
[0302]
此外，该工艺可以递送包括这些化合物的化学稳定的非水性的组合物和调配物，这可以允许在治疗使用前方便地运输和储存。
[0303]
在制备化合物的过程中，可以通过使用常规技术，例如分级结晶或hplc技术，分离化合物的外消旋混合物或其他混合物来分离各种立体异构体。可替代地，期望的光学异构体可以通过以下来制备：使合适的光学活性起始材料在不会引起外消旋化的条件下的反应(即“手性池”方法)，通过合适的起始材料与“手性助剂”(其随后可以在合适的阶段通过衍生化(即拆分，包含动态拆分)除去)的反应；例如与同手性酸的反应，然后通过常规手段如色谱法分离非对映体衍生物，或通过在技术人员已知的条件下与合适的手性试剂或手性催化剂的反应。
[0304]
实例
[0305]
通过以下实例来说明本发明，这些实例不旨在限制本发明的一般范围。
[0306]
合成实例
[0307]
缩写词
[0308]
aq
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
水性
[0309]
conc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
浓度
[0310]
gc
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
气相色谱法
[0311]
nmr
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
核磁共振
[0312]
equiv.
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
当量
[0313]
rel.vol.
ꢀꢀꢀꢀ
相对体积
[0314]
为了避免疑问，式(i)的化合物在本文中也可以被称为本发明的化合物，并且可以
被称为首字母缩略词pdno，这将表明此类化合物，包含其所有实施例和特定特征，用于如关于本发明所述的方法和用途中。此外，当描述也含有pd的pdno的组合物时，pd是指对应于式(i)的化合物的丙二醇，也就是说pd是根据式(i)但其中但其中r1、r2和r3表示h的相同化合物。
[0315]
然而，在以下实例的上下文中，术语“pdno”具体是指根据式(ii)或(iv)的化合物。与此相关，术语“pd”具体是指1,2-丙二醇，它是制备pdno的起始材料。
[0316]
一般程序
[0317]
以下所述制剂中规定的起始材料和化学试剂可从许多供应商如sigma aldrich处商业上获得。
[0318]
所有nmr实验均在298k下在配备有具有z梯度的qnp探头的bruker 500mhz avi仪器上使用bruker topspin 2.1软件进行。除非另有说明，否则信号参考在7.27ppm下的残余chcl3。
[0319]
稳定性测定
[0320]
通过gc/fid在以下条件下对稳定性样本进行测定。1,4-二噁烷用作内标(is；在ch3cn中的约0.50mg/ml)。
[0321]
gc柱：rxi-5sil ms，20m
×
0.18mm，0.72μm
[0322]
载气：氦
[0323]
入口：200℃，分流比率30:1
[0324]
恒定流速：1.0ml/分钟
[0325]
烘箱温度概况：40℃(3分钟)，10℃/分钟，250℃(3分钟)
[0326]
fid：温度300℃；h2流速30ml/分钟，空气流速400ml/分钟，补给流速(n2)25ml/分钟
[0327]
合成实例1-用亚硝酸钠制备1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇、2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇和1,2-双(亚硝基氧基)丙烷
[0328]
向500ml三颈圆底烧瓶中加入1,2-丙二醇(15ml，205mmol)、水(100ml)、二氯甲烷(200ml)和亚硝酸钠(57g，826mmol)。用冰浴将混合物冷却至0℃。向滴液漏斗中加入浓硫酸(30ml，546mmol)和水(30ml)，并在冰箱中冷却至5℃。使漏斗适应圆底烧瓶，并在两小时期间将酸加入到亚硝酸盐混合物中。用磁体将混合物搅拌20分钟，然后与更多的二氯甲烷(100ml)和水(100ml)一起倒入分液漏斗中。分离有机相并用硫酸钠干燥，并在旋转蒸发仪上浓缩，以得到1,2-丙二醇(3重量％)、1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇(23重量％)、2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇(13重量％)和1,2-双(亚硝基氧基)丙烷(57重量％)的混合物。
[0329]
合成实例2-用亚硝酸钠制备1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇、2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇和1,2-双(亚硝基氧基)丙烷
[0330]
将1,2-丙二醇(20ml，273.4mmol)、水(60ml)、二氯甲烷(120ml)和亚硝酸钠(37.72g，546.7mmol)加入到装有搅拌器的0.5反应器中，并用氮气冲洗，并在随后的反应过程期间保持在氮气下。通过将罩冷却至0℃将混合物冷却至低于5℃。将浓硫酸(26.3g，260.1mmol)和水加入到滴液漏斗中。将漏斗连接到反应器上，并在33分钟期间将酸加入到亚硝酸盐混合物中。将混合物搅拌54分钟，然后倒入含有饱和碳酸氢钠水溶液(100ml)的烧瓶中。将混合物转移到分液漏斗中，并且洗涤有机相。弃去水相，并用额外的饱和碳酸氢钠水溶液(100ml)洗涤有机相。用硫酸镁干燥有机相，然后与1,2-丙二醇(120ml，1640mmol)一
起转移到1l圆底烧瓶中。溶液在旋转蒸发仪上在减压下浓缩，直到除去二氯甲烷。通过nmr监测二氯甲烷的去除。获得含有1,2-丙二醇(82.8重量％)、1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇(10.4重量％)、2-亚硝基氧基)-丙-1-醇(6重量％)和1,2-双(亚硝基氧基)丙烷(0.8重量％)的澄清溶液(134g)。
[0331]1h-nmr,δppm:5.61(br s 1h),4.75-5.58(m,2h),4.11(br s,1h),3.90-3.87(m,1h),3.83-3.69(m,2h),3.60(dd,j＝3.0,11.2hz,1h),3.38(dd,j＝7.9,11.2hz,1h),1.47(d,j＝6.6hz,3h),1.39(d,j＝6.4hz,3h),1.26(d,j＝6.4hz,3h),1.15(d,j＝6.3hz,3h)，1,2-双(亚硝基氧基)丙烷的ch和ch2的信号低于检测极限。
[0332]
合成实例3-用亚硝酸叔丁酯制备1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇、2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇和1,2-双(亚硝基氧基)丙烷
[0333]
将亚硝酸叔丁酯(2ml，15.1mmol)加入到具有1,2-丙二醇(11ml，150.3mmol)的圆底烧瓶中，并将获得的溶液在环境温度下搅拌。然后将1ml的反应溶液与7.5ml的1,2-丙二醇混合。
[0334]
合成实例4-1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇、2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇和1,2-丙二醇的非水性混合物的稳定性
[0335]
制备在1,2-丙二醇中的三种不同浓度的1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇和2(亚硝基氧基)丙-1-醇，并储存在冰箱(5℃)和冰柜(-20℃)中。定期取每种溶液的等分试样，并通过gc分析，以确定1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇和2(亚硝基氧基)丙-1-醇的浓度。
[0336]
gc分析的结果在下表中示出(柱：rxi-5sil ms，20m x 0.18mm，0.36膜厚度；载剂：he；入口：250℃，分流比率100:1；恒定流速：1.0ml/分钟；烘箱温度概况：40℃(3分钟)，10℃/分钟，80℃(0分钟)，30℃/分钟，250℃(3分钟)；fid:300℃，h2流速30ml/分钟，空气流速400ml/分钟，补给流速(n2)25ml/分钟；内标：1,1,1,3,5,5,5-七甲基三硅氧烷)：
[0337]
[0338]
注意：针对任何样本，没有观察到压力的累积。
[0339]
合成实例5-用亚硝酸钠无溶剂制备1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇、2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇和1,2-双(亚硝基氧基)丙烷
[0340]
将水(30ml)和亚硝酸钠(19.01g，272.8mmol)加入到100ml三颈圆底烧瓶中，用氮气冲洗，并在用外部冷却器冷却的水浴上冷却至1℃。加入1,2-丙二醇(10ml，136.7mmol)。将浓硫酸(7ml，127.4mmol)和水(20ml)预冷至室温，并在1小时期间经由滴液漏斗逐滴加入。在添加期间，水层形成厚的浆料，并形成绿色的第二层。在酸添加完成之前(剩余5ml)，将烧瓶从冷却浴中取出，并将绿色层倾析到分液漏斗中，并用2倍饱和nahco3水溶液洗涤。绿色层褪色为黄色，并且在分离后用na2so4干燥并通过注射器过滤器(13mm，0.45μm)过滤，以得到约0.25/0.1/1的1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇/2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇/1,2-双(亚硝基氧基)丙烷的1.1g混合物。在nmr灵敏度的极限内没有检测到起始材料1,2-丙二醇。
[0341]1h-nmr,δppm:5.81-5.76(m,br,1.0h),5.63(br,0.1h),4.93(br,2.08h),4.73-4.65(br,m,0.47h),4.14(br,0.19h),3.84-3.77(br,m,0.22h),1.49
–
1.48(br,m,3.21h),1.43(br,0.51h),1.28(br,0.72h)。
[0342]
合成实例6-(2s)-1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇、(2s)-2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇和(2s)-1,2-双(亚硝基氧基)丙烷的制备
[0343]
将(s)-1,2-丙二醇(5ml，66.97mmol)、水(15ml)、二氯甲烷(30ml)和亚硝酸钠(9.34g，134mmol)加入到100ml三颈圆底烧瓶中，用氮气冲洗，并在用外部冷却器冷却的水浴上冷却至1℃。将浓硫酸(3.5ml，63.69mmol)和水(10ml)预冷至室温，并在1小时期间经由注射泵逐滴加入。在加入后，将混合物搅拌额外的60分钟。在分离两层后，用额外的dcm(15ml)稀释dcm层，并用饱和nahco3水溶液(15ml)洗涤，然后用盐水(15ml)洗涤，然后用na2so4干燥，用烧结的玻璃过滤器过滤并在真空中浓缩。将残余物再次溶解在30ml的dcm中，用1.4％w/w的碳酸氢盐水溶液洗涤，然后用na2so4干燥，用烧结的玻璃过滤器过滤，并在真空中浓缩，以得到1g的产物混合物。基于nmr，混合物由(2s)-1,2-丙二醇(3％)、(2s)-1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇(23％)、(2s)-2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇(14％)和(2s)-1,2-双(亚硝基氧基)丙烷(60％)组成。
[0344]1h-nmr,δppm:5.83-5.74(m,1.0h),5.66-5.57(br,0.22h),4.99-4.85(br,1.98h),4.76-4.59(br,0.77h),4.17-4.07(br,0.38h),3.86-3.73(br,0.40h),1.8-1.6(br,0.97h),1.48(d,j＝6.7hz,3.12h),1.40(d,j＝6.6hz,0.63h),1.28(d,j＝6.5hz,1.15h)。
[0345]
合成实例7-(2r)-1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇、(2r)-2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇和(2r)-1,2-双(亚硝基氧基)丙烷的制备
[0346]
将(r)-1,2-丙二醇(5ml，66.97mmol)、水(15ml)、二氯甲烷(30ml)和亚硝酸钠(9.34g，134mmol)加入到100ml三颈圆底烧瓶中，用氮气冲洗，并在用外部冷却器冷却的水浴上冷却至1℃。将浓硫酸(3.5ml，63.69mmol)和水(10ml)预冷至室温，并在1小时期间经由注射泵逐滴加入。在加入后，将混合物搅拌额外的55分钟。在分离两层后，用额外的dcm(10ml)稀释dcm层，并用饱和nahco3水溶液(20ml)洗涤，然后用na2so4干燥，用烧结的玻璃过滤器过滤并在真空中浓缩。基于nmr，混合物由(2r)-1,2-丙二醇(17％)、(2r)-1-(亚硝基氧
基)-丙-2-醇(16％)、(2r)-2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇(7％)和(2r)-1,2-双(亚硝基氧基)丙烷(59％)组成。
[0347]1h-nmr,δppm:5.83-5.74(m,1.0h),5.66-5.57(br,0.12h),4.99-4.85(br,2.10h),4.76-4.59(br,0.53h),4.17-4.07(br,0.24h),3.86-3.73(br,0.28h),2.4-2.1(br,0.38h),1.48(d,j＝6.8hz,3.20h),1.40(br,0.56h),1.28(br(d),0.88h)。
[0348]
合成实例8-1-(亚硝基氧基)丙-3-醇和1,3-双(亚硝基氧基)丙烷的制备
[0349]
将1,3-丙二醇(2.5g，32.86mmol)、水(7ml)、二氯甲烷(15ml)和亚硝酸钠(4.53g，65.7mmol)加入到100ml圆底烧瓶中，用氮气冲洗，并在用外部冷却器冷却的水浴上冷却至0℃持续15分钟。将浓硫酸(1.7ml，31.2mmol)和水(5ml)预冷至室温，并滴加5分钟。在加入后，将混合物在0℃下搅拌额外的60分钟。然后分离两层，用额外的dcm(10ml)稀释有机相，用饱和nahco3水溶液(2x 25ml)洗涤，用mgso4干燥，用烧结的玻璃过滤器过滤。最后，向有机相中加入1,3-丙二醇(16.4g 216mmol)，然后在真空中除去dcm。基于nmr，混合物(18.1g)含有1,3-丙二醇(86.9重量％)、1-(亚硝基氧基)-丙-3-醇(11.8重量％)和1,3-双(亚硝基氧基)丙烷(1.3重量％)。
[0350]
1h-nmr,δ4.76-4.88(m,2h),3.83(t,j＝5.7hz,2h),3.73(t,j＝6.1hz,2h),2.79(s,1h),2.18(五重态,j＝6.3hz,2h),1.99(五重态,j＝6.2hz,2h),1.80(五重态,j＝5.7hz,2h)。
[0351]
合成实例9-用亚硝酸钠制备1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇、2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇和1,2-双(亚硝基氧基)丙烷的放大工艺
[0352]
9.1使用的化学品
[0353]
起始材料从下表中的供应商列表中购买。除非另有说明，否则化学品按接收到的使用而无需进一步纯化。
[0354][0355]
9.2使用dcm作为溶剂合成pdno的一般程序(原始工艺)
[0356]
圆底烧瓶配备有搅拌器和滴液漏斗。加入水(3.0当量)并将亚硝酸钠(2.0当量)加入烧瓶中。将溶液冷却(0℃)并加入pd(1.0当量)和dcm(6相对体积)。在另外的冷却期间，制备硫酸溶液(1.0当量的h2so4，2.0相对体积的水)。将硫酸溶液进一步滴加到反应混合物中，同时保持反应混合物在0℃和5℃之间。在完全加入酸之后，将溶液进一步搅拌1小时以完成反应。
[0357]
然后，用饱和nahco3溶液(6.0相对体积)猝灭反应。分离各相，并且有机层进一步用nahco3溶液(6.0相对体积)洗涤。有机相用mgso4干燥，过滤，用pd稀释，并且使用旋转蒸发器(水浴温度40℃)在减压下浓缩。
[0358]
产物作为微黄色液体获得。
[0359]
9.3使用tbme作为溶剂的pdno的一般合成
[0360]
圆底烧瓶装配有搅拌器和滴液漏斗。氩气冲洗了几分钟。预先制备稀释的硫酸溶液(1.0当量的h2so4，2.0相对体积的水)并预冷却(-30℃)。向烧瓶中加入水(3.0相对体积)。将亚硝酸钠(2.0当量)加入到水中。加入tbme(7.5相对体积)。加入丙二醇(1.0当量)并将反应混合物冷却(-20℃)，用氩气不断冲洗。充分搅拌反应混合物，同时滴加预冷却的硫酸。在加入酸的整个过程期间监控反应温度。在加入后，在低温(-20℃)下进一步搅拌反应混合物(30-60分钟)。然后，允许反应混合物升温(-5℃)。通过用饱和nahco3溶液(6.0相对体积)猝灭来停止反应。分离各相。用饱和nahco3溶液进一步洗涤有机层，直到获得7-8的ph值。然后用mgso4干燥有机相。粗pdno溶液(是包括1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇、2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇和1,2-双(亚硝基氧基)丙烷的混合物的产物)用pd(3相对体积)(pd是丙二醇起始材料)稀释并在环境温度(25℃)下在减压下进一步浓缩。
[0361]
使用垂直管式蒸发设备进一步纯化粗pdno溶液。
[0362]
pdno作为微黄色液体获得。
[0363]
9.4使用tbme作为溶剂详细合成pdno
[0364]
该工艺被设计成通过一次合成(一次“运行”)产生约7.5l的7％ pdno溶液。合成进行几次，以得到期望的批量。每次运行都使用gc分析以用于纯度确定。在有机相关化合物的规格内的运行可以混合在一起，以形成一个批次。然后将整个粗pdno批次纯化。在纯化后，用pd进一步稀释强pdno溶液，以得到期望的浓度(通常为7％的pdno溶液)。
[0365]
合适的双壁反应器(60l)装备有特定的“杯型搅拌器”、滴液漏斗和氩气附件。用恒定的氩气流冲洗反应器5分钟至10分钟。向反应器中加入水(3.0l)。通过反应器加入亚硝酸钠(2.0当量，1886g)。进一步搅拌反应，直到所有的盐溶解。加入1,2-丙二醇(1.0当量，1040g，1l)，然后加入叔丁基甲基醚(7.5相对体积，7.5l)。然后，在
–
20℃的内部反应温度下，通过连续搅拌和氩气流冷却反应混合物。同时，用水(2.0l)稀释硫酸(1.0当量，1340g，728ml)，并在
–
30℃下冷却。在达到-20℃的内部反应温度后，在剧烈搅拌的同时，将稀释的酸逐滴加入到反应混合物中。
[0366]
在加入酸期间，搅拌速度是变化的。从约350rpm开始，到反应结束时搅拌速度减慢(约180rpm)。搅拌速度的这种变化是由于两相反应体系以及随着反应的进一步进行硫酸钠缓慢沉淀(由于加入了越来越多的硫酸)。
[0367]
在硫酸的整个加入期间，监测反应温度。温度期望地应当在(-20
±
3)℃范围内。此外，反应在(-20
±
3)℃下搅拌30-60分钟。
[0368]
允许反应升温至
–
5℃至0℃。通过添加饱和nahco3溶液(6.0相对体积6.0l)，然后加入水(10l)来停止反应。分离各相，并且将有机层转移到单独的双壁反应器中，并在0℃至-5℃下冷却。用饱和nahco3溶液(4.0相对体积，4.0l)洗涤有机层几次(约2-3次)。在每个洗涤步骤后监测水相的ph值。ph值为约7-8。水相被丢弃。有机层用mgso4干燥，并用whatman滤纸过滤。
[0369]
粗pdno(在tbme中的溶液)通过加入另外的pd(3.0相对体积，3.0l)稀释。将该粗pdno转移到旋转蒸发器中，并在减压下浓缩。蒸发期间的水浴温度保持在25℃的最高温度。在1.5小时至2.0小时的时间范围内除去主要量的tbme的蒸发。
[0370]
然后可以使用高真空泵在(0
±
2)℃的水浴温度下继续蒸发有机溶剂几小时(在开发期间，在这些条件下监测pdno纯度，并且在6小时的时间段内，产物纯度不受影响)。
[0371]
9.5粗pdno溶液的进一步纯化
[0372]
pdno溶液的最终纯化是通过垂直管蒸发完成的。在0℃下，在高真空下用连续的薄pdno蒸汽蒸馏pdno溶液。在0℃下冷却“粗”pdno溶液的储罐。在0℃下进行整个蒸馏。用于“纯化的”pdno的储罐也在-10℃至0℃下冷却。在整个pdno批次的每次蒸发运行后，可以经由gc检查残余的有机溶剂(tbme)。继续这种蒸发，直到实现期望的残余溶剂极限。在pdno的情况下，残余溶剂的极限是1000ppm。
[0373]
9.6最终稀释液的制备
[0374]
纯化后，pdno被进一步稀释，以达到理想的浓度。第一步是经由whatman过滤器将pdno溶液过滤到干净的玻璃瓶中。此外，经由q-nmr确定pdno溶液的测定。可以计算用于稀释的pd的量。pd首先通过whatman过滤器过滤。最终稀释可以在环境温度下进行。将计算量的pd加入到pdno溶液中(或者反过来)。将所得的混合物摇动几分钟以获得均匀的溶液。将最终的pdno溶液填充到产物瓶中。
[0375]
pdno(7.5kg；7％溶液)作为微黄色液体获得。
[0376]
实例10-pdno的抗微生物性质的体外研究
[0377]
在细菌枯草芽孢杆菌斯氏亚种、金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌以及真菌白色念珠菌和巴西曲霉上测试了pdno(即如上所述制备的包括1-(亚硝基氧基)-丙-2-醇、2-(亚硝基氧基)-丙-1-醇和1,2-双(亚硝基氧基)丙烷中的一种或混合物的产物)的抗微生物性质。
[0378]
测试在含有100ml的pdno和600ml的nacl-蛋白胨(ph在6至8之间)的溶液中进行。加入100μl稀释的微生物悬浮液(10-100cfu)。将溶液通过pall(gn-6 metricel膜，0.45μm)过滤，并用100ml nacl-蛋白胨溶液洗涤三次。
[0379]
将过滤器转移到琼脂平板(用于枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌和金黄色葡萄球菌的tsa/caso，和用于白色念珠菌和巴西曲霉的sabouraud葡萄糖琼脂)上，并且对于细菌在35℃下温育至少三天，并且对于酵母在25℃下温育至少五天。表1示出了每种细菌/酵母的掺入和回收率。
[0380]
表1.
[0381]
菌株掺入[cfu]回收率[cfu]回收率[％]金黄色葡萄球菌4712.1枯草芽孢杆菌4712.1铜绿假单胞菌8900巴西曲霉7300白色念珠菌5100
[0382]
结果表明，pdno具有强有力的抗微生物性质，因为所有微生物的回收率《2.1％。
[0383]
实例11-pdno的抗病毒性质的体外研究
[0384]
在病毒sars-cov-2上测试了pdno的抗病毒性质。
life technologies)、5％人血清和5％albumax(gibco life technologies)的rpmi 1640培养基(usbiological)生长无性阶段的寄生虫。培养物保持在恒定的微需氧组成(1％ o2、5％co2和94％n2)下，并在37℃下使用轨道振荡器(50转/分钟)保持悬浮。培养物在进行药物测定之前通过用5％山梨醇处理进行定期阶段同步化。
[0399]
使用pdno的9点2倍稀释系列进行抑制浓度(ic
50
和ic
90
)的确定，其中最高浓度设定为100μm。在pd中进行稀释，以确保对于所有pdno浓度(包含未处理的对照)存在相同量的pd，并且pd的总量为总培养物体积的0.1％。当寄生虫处于裂殖体阶段(侵入后36+/-4小时)时，在每种药物稀释液的三个孔中将pdno组合物(或单独的pd)添加一次。此后，寄生虫生长24小时，然后用sybr green和mitotracker深红色标记，并通过流式细胞术测定。使用流式细胞术(bd facsverse)确定寄生虫血症，并使用flowjo
tm
(版本10.6.2)分析数据。使用graphpad prism(版本8.4.2)通过三参数非线性回归获得的剂量应答曲线计算ic
50
和ic
90
值。
[0400]
如图4所示，对处于裂殖体阶段的dd2寄生虫品系一次性施用pdno揭示了寄生虫对pdno敏感。对寄生虫存活率的最终抑制浓度被确定为ic50＝24.2μm和ic90＝41.2μm。
[0401]
结论是pdno对分裂期恶性疟原虫是有效的。通过在培养中使用的所有pdno浓度下保持pd量恒定来确定结果来自no而不是pd。
[0402]
实例13-呼吸道合胞病毒-a-long病毒对pdno敏感性的确定
[0403]
3d人类支气管上皮mucilair
tm
组织来自epithelix s
à
rl(瑞士日内瓦(geneva,swiss))。按照制造商的说明保存组织，直到感染和治疗日。在第0天，用呼吸道合胞体病毒a-long(rsv-a-long病毒)感染组织达1.5小时。抽吸病毒，然后立即将组织基底外侧暴露于化合物pdno(200μm)和溶剂对照pd。感染的、未暴露的组织作为病毒对照被包含。在第2、4和7天重复化合物治疗。每天洗涤组织，并且收集顶端清洗液(250μl)用于rt-qpcr分析，以确定病毒载量。
[0404]
如图5所示，在感染后第4天mucilair组织中的rsv log10病毒载量(拷贝/ml)，以及在第0天和第2天用pd(溶剂对照)和200μm的pdno或病毒对照(无化合物处理)进行基底外侧区室处理。显示了一项独立实验的结果，并以2个(溶剂对照)、3个(200μm的pdno)和4个(病毒对照)技术复制品的方框图和须图形式给出。p值由学生的t检验(不成对，不等方差)确定。
[0405]
结论：在实验方案的第4天，与病毒对照和溶剂对照(pd)处理的组织相比，对于用200μm的pdno处理的组织观察到rsv病毒载量的显著抑制。