用于SARS-COV-2感染的抗体疗法的制作方法

用于sars-cov-2感染的抗体疗法
1.关于序列表的陈述
2.与本技术相关的序列表以文本格式提供以代替纸质副本，并且特此通过引用并入本说明书中。包含序列表的文本文件的名称为930585_413wo_sequence_listing.txt。文本文件为327kb，创建于2021年6月10日，并且通过efs-web以电子方式提交。


背景技术：

3.截至2021年6月9日，全球已经确认大约1.74亿例感染此病毒(除了其它名称之外，称为sars-cov-2)的病例，并且已经导致大约370万人死亡。需要用于预防或治疗sars-cov-2感染和covid-19的疗法。
附图说明
4.图1示出了用于治疗轻度至中度covid-19疾病的重组单克隆igg1抗体索托维单抗(sotrovimab)(在本文中也称为例如s309 n55q ls)的临床研究的设计。
5.图2a-2d示出了用于治疗轻度至中度covid-19疾病的索托维单抗的临床研究的事件的时间线。
6.图3示出了用于治疗重度至危重covid-19疾病的索托维单抗的临床研究的研究设计。
7.图4示出了用于covid-19疾病的暴露后预防的索托维单抗的临床研究的研究设计。
8.图5示出了索托维单抗在sars-cov-2的刺突蛋白上的结合位点。示出了sars-cov-2受体结合结构域，其中ace2受体结合基序为绿色，并且索托维单抗表位为橙色。ace2表示血管紧张素转化酶2。
9.图6示出了使用本文所述的索托维单抗的临床研究的设计。r表示随机化。*患者按照年龄(≤70岁对》70岁)、症状持续时间(≤3天对4-5天)和身体部位进行分层。研究药剂师在相同的时间范围内重构并分配所有研究药物以维持盲法。
具体实施方式
10.本文提供了使用抗体、抗原结合片段或包含所述抗体、抗原结合片段的组合物治疗或预防例如患有covid-19或有发展为covid-19的风险的受试者的sars-cov-2感染的方法。用于在所述方法中使用的某些抗体和抗原结合片段识别sars-cov-2 s糖蛋白中的保守表位，并且在体外和体内有效中和sars-cov-2。抗体的非限制性实例包括s309和s309的经工程化的变体(例如，索托维单抗、vir-7832)。在一些实施例中，s309的变体包括vh区中的n55q取代。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包括fc多肽，所述fc多肽包括一个或多个氨基酸突变，所述一个或多个氨基酸突变例如可以延长抗体或抗原结合片段的体内半衰期和/或可以促进抗体或抗原结合片段的疫苗效果。
11.目前公开的方法包括预防sars-cov-2感染或传播，以及治疗患有sars-cov-2感染
的受试者。sars-cov-2感染(例如，引起covid-19)可以处于任何感染阶段和/或可以导致任何疾病阶段，例如，轻度、轻度至中度、重度或危重。例如，如本文进一步描述的，单剂量的本公开的抗体可以足以降低患有轻度至中度covid-19的受试者的住院或死亡。
12.抗体或抗原结合片段的施用可以使用任何方法，例如静脉内注射和肌内注射来进行。在一些情况下，向受试者施用单剂量的抗体或抗原结合片段(或包括所述抗体或抗原结合片段的组合物)。受试者可以根据一个或多个标准来表征，和/或可以拥有一个或多个特性，如本文所提供的。还提供了用于在治疗或预防sars-cov-2感染(或covid-19)的方法中以及在制备用于治疗(treatment/treating)或预防sars-cov-2感染的药物中使用的抗体、抗原结合片段和组合物。
13.在更加详细地阐述本公开之前，提供本文要使用的某些术语的定义可能有助于理解本公开。贯穿本公开阐述额外的定义。
14.如本文所使用的，“sars-cov-2”，最初也被称为“新型cov”或“ncov”或“2019ncov”或其变体，是谱系b的β冠状病毒(沙贝病毒(sarbecovirus))。sars cov-2感染可以导致称为covid-19的疾病；covid-19的症状包括发烧或发冷、干咳、呼吸困难、疲倦、身体酸痛、头痛、味觉或嗅觉的新丧失、咽喉痛、充血或流鼻涕、恶心或呕吐、腹泻、胸部持续压迫或疼痛、新的意识模糊、无法醒来或保持清醒以及嘴唇或面部发青。
15.seq id no:163中提供了sars-cov-2分离株wuhan-hu-1的基因组序列(还参见genbank mn908947.3，2020年1月23日)，并且seq id no:164中提供了基因组的氨基酸翻译(还参见genbank qhd43416.1，2020年1月23日)。像其它冠状病毒(例如，sars cov)一样，sars-cov-2包括包含受体结合结构域(rbd)的“刺突”或表面(“s”)i型跨膜糖蛋白。据信rbd通过与细胞表面受体血管紧张素转化酶2(ace2)结合来介导谱系b sars冠状病毒进入呼吸系统上皮细胞。具体地，据信病毒rbd中的受体结合基序(rbm)与ace2相互作用。
16.seq id no:165中提供了sars-cov-2wuhan-hu-1表面糖蛋白的氨基酸序列。seq id no:166中提供了sars-cov-2 rbd的氨基酸序列。sars-cov-2 s蛋白与sars-cov具有大约73％氨基酸序列同一性。seq id no:167中提供了sars-cov-2 rbm的氨基酸序列。sars-cov-2 rbd与sars冠状病毒rbd具有大约75％至77％氨基酸序列相似性，并且sars-cov-2 rbm与sars冠状病毒rbm具有大约50％氨基酸序列相似性。
17.除非本文另外指示，否则sars-cov-2wu-hu-1是指包括seq id no:164、165和166中的任一者或多者所示的氨基酸序列的病毒，任选地具有seq id no:163中所示的基因组序列。
18.已存在许多新出现的sars-cov-2变体。一些sars-cov-2变体包含n439k突变，所述突变增强了对人ace2受体的结合亲和力(thomson,e.c.等人,循环的sars-cov-2刺突变体n439k在避开抗体介导的免疫的同时维持健壮(the circulating sars-cov-2spike variant n439k maintains fitness while evading antibody-mediated immunity.)biorxiv,2020)。一些sars-cov-2变体包含n501y突变，所述突变与增加的传播性相关，包括分别在英国和南非发现的谱系b.1.1.7(也称为20i/501y.v1和voc 202012/01)和b.1.351(也称为20h/501y.v2)(tegally,h.等人,具有多个刺突突变的新的重度急性呼吸综合征相关冠状病毒2(sars-cov-2)谱系在南非的出现和快速传播(emergence and rapid spread of a new severe acute respiratory syndrome-related coronavirus 2(sars-cov-2)
lineage with multiple spike mutations in south africa.)medrxiv,2020:p.2020.12.21.20248640；leung,k.等人,2020年10月至11月英国对sars-cov-2的n501y突变体菌株的早期经验评估(early empirical assessment of the n501y mutant strains of sars-cov-2 in the united kingdom,october to november 2020.)medrxiv,2020:p.2020.12.20.20248581)。b.1.351还包括sars-cov2刺突蛋白的rbd结构域中的另外两个突变k417n和e484k(tegally,h.等人,具有多个刺突突变的新的严重急性呼吸综合征相关冠状病毒2(sars-cov-2)谱系在南非的出现和快速传播medrxiv,2020:p.2020.12.21.20248640)。其它sars-cov-2变体包括在巴西首次报道的谱系b.1.1.28；在日本首次报道的变体p.1，谱系b.1.1.28(也称为20j/501y.v3)；在美国加利福尼亚州首次报道的变体l452r(泛美卫生组织(pan american health organization),《流行病学更新：sars-cov-2变体在美洲的出现(epidemiological update:occurrence of variants of sars-cov-2in the americas)》,2021年1月20日,可从https://reliefweb.int/sites/reliefweb.int/files/resources/2021-jan-20-phe-epi-update-sars-cov-2.pdf获得)。其它sars-cov-2变体包括进化枝19a的sars cov-2；进化枝19b的sars cov-2；进化枝20a的sars cov-2；进化枝20b的sars cov-2；进化枝20c的sars cov-2；进化枝20d的sars cov-2；进化枝20e(eu1)的sars cov-2；进化枝20f的sars cov-2；进化枝20g的sars cov-2；和sars cov-2b1.1.207；以及在rambaut,a.等人,用于辅助基因组流行病学的sars-cov-2谱系的动态命名建议(a dynamic nomenclature proposal for sars-cov-2 lineages to assist genomic epidemiology.)《自然微生物学(nat microbiol)》5,1403
–
1407(2020)中描述的其它sars cov-2谱系。根据本公开的sars cov-2感染包括由上述sars-cov-2病毒和其变体中的任何一种或多种引起的感染。
19.在本说明书中，除非另外指示，否则任何浓度范围、百分比范围、比率范围或整数范围应理解为包括所述范围内的任何整数值并且适当时包括其分数(如整数的十分之一和百分之一)。而且，除非另外指示，否则本文所述的关于如聚合物亚基、大小或厚度等任何物理特征的任何数字范围被理解为包括所述范围内的任何整数。如本文所使用的，除非另外指示，否则术语“约”意指所指示的范围、值或结构的
±
20％。应当理解，如本文所使用的，术语“一种(a)”和“一种(an)”是指所列举的组分中的“一种或多种”。替代方案(例如，“或”)的使用应被理解为意指替代方案中的一个、两个或其任何组合。如本文所使用的，术语“包括(include)”、“具有(have)”和“包括(comprise)”是同义使用的，这些术语和其变体旨在被解释为非限制性的。
[0020]“任选的(optional)”或“任选地(optionally)”意指随后所描述的要素、组分、事件或情形可以发生或可以不发生，并且所述描述包括其中所述要素、组分、事件或情形发生的情况以及其中所述要素、组分、事件或情形不发生的情况。
[0021]
另外，应当理解，衍生自本文所述的结构和亚基的各种组合的单独构建体或构建体组由本技术公开，其公开程度与每个构建体或构建体组被单独阐述的程度相同。因此，特定结构或特定亚基的选择在本公开的范围内。
[0022]
术语“基本上由
…
组成(consisting essentially of)”不等效于“包括”，并且是指权利要求的指定材料或步骤，或指不会实质上影响所要求保护的主题的基本特性的材料或步骤。例如，当结构域、区、模块或蛋白质的氨基酸序列包括延伸、缺失、突变或其组合(例
如，在氨基末端或羧基末端或结构域之间的氨基酸)时，蛋白质结构域、区或模块(例如，结合结构域)或蛋白质“基本上由”特定氨基酸序列组成，所述延伸、缺失、突变或其组合总共占结构域、区、模块或蛋白质的长度的最多20％(例如，最多15％、10％、8％、6％、5％、4％、3％、2％或1％)并且基本上不影响(即，不会使活性降低超过50％，如不超过40％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)结构域、区、模块或蛋白质的活性(例如，结合蛋白的靶结合亲和力)。
[0023]“治疗(treat)”、“治疗(treatment)”或“改善(ameliorate)”是指对受试者(例如，人类或非人类哺乳动物，如灵长类动物、马、猫、狗、山羊、小鼠或大鼠)的疾病、病症或病状的医学管理。通常，包括本公开的抗体、抗原结合片段或组合物的适当剂量或治疗方案以足以引发治疗或预防益处的量施用。治疗或预防(prophylactic/preventive)益处包括例如，改善临床结果；减轻或缓解与疾病相关的症状；减少症状的发生；提高生活质量；更长的无病状态；减轻疾病的程度；稳定疾病状态；延缓或预防疾病进展；缓解；存活；延长存活率；或其任何组合。在某些实施例中，治疗或预防益处包括减少或预防因治疗sars-cov-2感染或covid-19而住院(即，以统计学显著的方式)。在某些实施例中，治疗或预防益处包括缩短因治疗sars-cov-2感染或covid-19而住院的持续时间(即，以统计学显著的方式)。在某些实施例中，治疗或预防益处包括减少或消除对呼吸系统干预，如插管和/或使用呼吸器装置的需要。在某些实施例中，治疗或预防益处包括逆转晚期疾病病理和/或降低死亡率。在某些实施例中，治疗和/或预防益处包括减少在例如来自受试者的呼吸系统样品(肺组织、鼻拭子、唾液等)中的病毒载量和/或病毒脱落。在某些实施例中，治疗和/或预防益处包括预防covid-19的进展，例如，从轻度至中度至重度，或从重度至危重，如本文所描述的。在某些实施例中，治疗和/或预防包括预防sars-cov-2感染(例如，其可以是有症状的或无症状的)的感染和/或传播。
[0024]
本公开的抗体、抗原结合片段或组合物的“治疗有效量”或“有效量”是指足以产生治疗效果的组合物或分子的量，所述治疗效果包括：改善的临床结果；减轻或缓解与疾病相关的症状；减少症状的发生；提高生活质量；更长的无病状态；减轻疾病的程度；稳定疾病状态；延缓疾病进展；缓解；存活；或以统计学显著的方式延长存活期。当提及单独施用的个别活性成分时，治疗有效量是指所述成分或单独表达所述成分的细胞的效果。当提及组合时，治疗有效量是指活性成分或组合的辅助活性成分与表达产生治疗效果的活性成分的细胞的组合量，无论连续、依序还是同时施用。组合可以包括例如与sars-cov-2抗原特异性结合的两种不同的抗体，在某些实施例中，所述抗原可以是相同或不同的sars-cov-2抗原，和/或可以包括相同或不同的表位。
[0025]
如本文所使用的，“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸，以及以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸以及稍后被修饰的那些氨基酸，例如，羟基脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和o-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢、羧基、氨基和r基团结合的α-碳，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的r基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但是保留了与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有与氨基酸的通式化学结构不同的结构，但是以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用的化学化合物。
[0026]
如本文所使用的，“突变”是指核酸分子或多肽分子序列分别与参考或野生型核酸分子或多肽分子相比的变化。突变可以引起序列的若干不同类型变化，包括核苷酸或氨基酸的取代、插入或缺失。
[0027]“保守取代”是指不显著影响或改变特定蛋白质的结合特性的氨基酸取代。通常，保守取代是其中经取代的氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的取代。保守取代包括在以下组之一中发现的取代：组1：丙氨酸(ala或a)、甘氨酸(gly或g)、丝氨酸(ser或s)、苏氨酸(thr或t)；组2：天冬氨酸(asp或d)、谷氨酸(glu或z)；组3：天冬酰胺(asn或n)、谷氨酰胺(gln或q)；组4：精氨酸(arg或r)、赖氨酸(lys或k)、组氨酸(his或h)；组5：异亮氨酸(ile或i)、亮氨酸(leu或l)、甲硫氨酸(met或m)、缬氨酸(val或v)；以及组6：苯丙氨酸(phe或f)、酪氨酸(tyr或y)、色氨酸(trp或w)。另外或可替代地，氨基酸可以根据相似功能、化学结构或组成(例如，酸性、碱性、脂肪族、芳香族或含硫)分成保守取代组。例如，出于取代的目的，脂肪族分组可以包括gly、ala、val、leu和ile。其它保守取代组包括：含硫：met和半胱氨酸(cys或c)；酸性：asp、glu、asn和gln；小脂肪族、非极性或略有极性的残基：ala、ser、thr、pro和gly；极性带负电荷的残基和其酰胺：asp、asn、glu和gln；极性带正电荷的残基：his、arg和lys；大脂肪族、非极性残基：met、leu、ile、val和cys；以及大芳香族残基：phe、tyr和trp。额外的信息可以在creighton(1984)《蛋白质(proteins)》,w.h.弗里曼出版社和公司(w.h.freeman and company)中找到。
[0028]
如本文所使用的，“蛋白质(protein)”或“多肽(polypeptide)”是指氨基酸残基的聚合物。蛋白质适用于天然存在的氨基酸聚合物，以及其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合物，和非天然存在的氨基酸聚合物。还考虑了本公开的蛋白质、肽和多肽的变体。在某些实施例中，变体蛋白、肽和多肽包括与如本文所述的定义或参考氨基酸序列的氨基酸序列至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同的氨基酸序列或由其组成。
[0029]“核酸分子”或“多核苷酸”或“多核酸”是指包括共价连接的核苷酸的聚合物化合物，其可以由天然亚基(例如，嘌呤或嘧啶碱基)或非天然亚基(例如，吗啉环)组成。嘌呤碱基包括腺嘌呤、鸟嘌呤、次黄嘌呤和黄嘌呤，并且嘧啶碱基包括尿嘧啶、胸腺嘧啶和胞嘧啶。核酸分子包括聚核糖核酸(rna)，其包括mrna、microrna、sirna、病毒基因组rna和合成rna，以及聚脱氧核糖核酸(dna)，其包括cdna、基因组dna和合成dna，其中的任一者可以是单链或双链的。如果是单链的，则核酸分子可以是编码链或非编码(反义)链。编码氨基酸序列的核酸分子包括编码同一氨基酸序列的所有核苷酸序列。核苷酸序列的一些版本还可以包括内含子，其程度使得内含子将通过共转录或转录后机制被去除。换句话说，由于遗传密码的冗余或简并，或通过剪接，不同的核苷酸序列可以编码相同的氨基酸序列。
[0030]
还考虑了本公开的核酸分子的变体。变体核酸分子与如本文所述的定义或参考多核苷酸的核酸分子至少70％、75％、80％、85％、90％，并且优选地95％、96％、97％、98％、99％或99.9％相同，或者在约65-68℃下的0.015m氯化钠、0.0015m柠檬酸钠或约42℃下的0.015m氯化钠、0.0015m柠檬酸钠和50％甲酰胺的严格杂交条件下与多核苷酸杂交。核酸分子变体保留编码其结合结构域的能力，所述结合结构域具有本文所述的功能，如与靶分子结合。
[0031]“序列同一性百分比”是指如通过比较序列所确定的两个或更多个序列之间的关系。确定序列同一性的优选方法被设计成给出所比较序列之间的最佳匹配。例如，出于最佳比较目的，将序列进行比对(例如，可以在第一氨基酸或核酸序列和第二氨基酸或核酸序列中的一者或两者中引入空位以进行最优比对)。另外，出于比较目的，可以忽略非同源序列。除非另外指示，否则通过参考序列的长度计算本文所提及的序列同一性百分比。用于确定序列同一性和相似性的方法可以在公开可用的计算机程序中找到。序列比对和同一性百分比计算可以使用blast程序(例如，blast 2.0、blastp、blastn或blastx)进行。blast程序中使用的数学算法可以在altschul等人,《核酸研究(nucleic acids res.)》25:3389-3402,1997中找到。在本公开的上下文中，应当理解，当使用序列分析软件进行分析时，分析的结果基于所参考程序的“默认值”。“默认值”意味着软件初次初始化时最初加载的值或参数的任何集合。
[0032]
术语“分离的(isolated)”意指将材料从其原始环境(例如，如果是天然存在的话，则为天然环境)中去除。例如，活动物中存在的天然存在的核酸或多肽不是分离的，但与天然系统中的一些或全部共存材料分离的相同核酸或多肽是分离的。此类核酸可以是载体的一部分和/或此类核酸或多肽可以是组合物(例如，细胞裂解物)的一部分，并且仍然是分离的，因为此类载体或组合物不是所述核酸或多肽的天然环境的一部分。
[0033]
术语“基因”意指参与产生多肽链的dna或rna区段；在某些情况下，所述基因包括编码区之前和之后的区(例如，5
′
未翻译区(utr)和3
′
utr)以及单独编码区段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
[0034]“功能变体”是指与本公开的亲本或参考化合物在结构上相似或基本结构上相似但在组成上略有不同(例如，一个碱基、原子或官能团不同、被添加或被去除)的多肽或多核苷酸，使得多肽或经编码的多肽能够以至少50％的效率，优选地至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的亲本多肽活性水平执行亲本多肽的至少一种功能。换句话说，当本公开的多肽或经编码的多肽的功能变体在所选的测定中与亲本或参考多肽相比显示出不超过50％的性能降低时，如用于测量结合亲和力的测定(例如，测量缔合(ka)或解离(kd)常数的或四聚体染色)，所述功能变体具有“相似结合”、“相似亲和力”或“相似活性”。
[0035]
如本文所使用的，“功能部分”或“功能片段”是指仅包括亲本或参考化合物的结构域、部分或片段的多肽或多核苷酸，并且多肽或经编码的多肽保留与亲本或参考化合物的结构域、部分或片段相关的至少50％的活性，优选地至少55％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.9％或100％的亲本多肽活性水平，或提供生物学益处(例如，效应子功能)。当本公开的多肽或经编码的多肽的“功能部分”或“功能片段”在所选的测定中与亲本或参考多肽相比显示出不超过50％的性能降低(优选地不超过20％或10％，或在亲和力方面与亲本或参考相比不超过对数差异)时，所述功能部分或功能片段具有“相似结合”或“相似活性”。
[0036]
如本文所使用的，术语“经工程化(engineered)”、“重组(recombinant)”或“非天然(non-natural)”是指包括至少一种遗传改变或已经通过引入外源或异源核酸分子修饰的生物体、微生物、细胞、核酸分子或载体，其中此类改变或修饰通过遗传工程(即，人为干预)引入。遗传改变包括例如引入编码功能rna、蛋白质、融合蛋白或酶的可表达的核酸分子
的修饰，或其它核酸分子添加、缺失、取代或细胞的遗传物质的其它功能破坏。额外的修饰包括例如非编码调节区，其中修饰改变多核苷酸、基因或操纵子的表达。
[0037]
如本文所使用的，“异源(heterologous)”或“非内源(non-endogenous)”或“外源(exogenous)”是指对宿主细胞或受试者而言不是天然的任何基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性，或对宿主细胞或受试者而言是已改变的任何天然的基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性。异源、非内源或外源包括已经突变或以其它方式改变的基因、蛋白质、化合物或核酸分子，使得结构、活性或两者在天然与改变的基因、蛋白质、化合物或核酸分子之间不同。在某些实施例中，异源、非内源或外源基因、蛋白质或核酸分子(例如，受体、配体等)对于宿主细胞或受试者而言可能不是内源的，而编码此类基因、蛋白质或核酸分子的核酸可能已经通过缀合、转化、转染、电穿孔等添加到宿主细胞中，其中添加的核酸分子可以整合到宿主细胞基因组中或者可以作为染色体外遗传物质存在(例如，作为质粒或其它自我复制载体)。术语“同源(homologous)”或“同源物(homolog)”是指发现于或源自宿主细胞、物种或菌株的基因、蛋白质、化合物、核酸分子或活性。例如，编码多肽的异源或外源多核苷酸或基因可以与天然多核苷酸或基因同源并且编码同源多肽或活性，但是多核苷酸或多肽可以具有改变的结构、序列、表达水平或其任何组合。非内源多核苷酸或基因以及经编码的多肽或活性可以来自相同物种、不同物种或其组合。
[0038]
在某些实施例中，如果对宿主细胞而言天然的核酸分子或其部分已经改变或突变，则其将被视为对宿主细胞来说是异源的，或者如果对宿主细胞而言是天然的核酸分子已经用异源表达控制序列改变或已经用通常不与对宿主细胞而言天然的核酸分子相关的内源表达控制序列改变，则其可以被视为是异源的。另外，术语“异源”可以指对于宿主细胞来说不同、改变或并非内源的生物活性。如本文所描述的，多于一种异源核酸分子可以作为独立的核酸分子、作为多个单独控制的基因、作为多顺反子核酸分子、作为编码融合蛋白的单个核酸分子或其任何组合引入到宿主细胞中。
[0039]
如本文所使用的，术语“内源”或“天然”是指通常存在于宿主细胞或受试者中的多核苷酸、基因、蛋白质、化合物、分子或活性。
[0040]
如本文所使用的，术语“表达”是指基于如基因等核酸分子的编码序列产生多肽的过程。过程可以包括转录、转录后控制、转录后修饰、翻译、翻译后控制、翻译后修饰或其任何组合。经表达的核酸分子通常与表达控制序列(例如，启动子)可操作地连接。
[0041]
术语“可操作地连接”是指单个核酸片段上两个或更多个核酸分子的缔合，使得一者的功能受另一者影响。例如，当启动子能够影响编码序列的表达(即，编码序列在启动子的转录控制之下)时，所述启动子与所述编码序列可操作地连接。“未连接(unlinked)”意指相关遗传元件彼此不紧密相关并且一者的功能不受另一者影响。
[0042]
如本文所描述的，多于一种异源核酸分子可以作为独立的核酸分子、作为多个单独控制的基因、作为多顺反子核酸分子、作为编码蛋白质(例如，抗体的重链)的单个核酸分子或其任何组合引入宿主细胞中。当两种或更多种异源核酸分子引入宿主细胞中时，应当理解，两种或更多种异源核酸分子可以作为单个核酸分子(例如，在单个载体上)引入、在独立的载体上引入、在单个位点或多个位点处整合到宿主染色体中或其任何组合。所引用的异源核酸分子或蛋白质活性的数量是指编码核酸分子的数量或蛋白质活性的数量，而非引入宿主细胞中的独立的核酸分子的数量。
raven publishers,philadelphia),1996)。
[0048]“逆转录病毒(retrovirus)”是具有rna基因组的病毒，所述rna基因组使用逆转录酶逆转录成dna，随后经逆转录的dna并入宿主细胞基因组中。“γ逆转录病毒(gammaretrovirus)”是指逆转录病毒科的一个属。γ逆转录病毒的实例包括小鼠干细胞病毒、鼠类白血病病毒、猫科白血病病毒、猫科肉瘤病毒和禽网状内皮组织增生病毒。
[0049]“慢病毒载体(lentiviral vector)”包括用于基因递送的基于hiv的慢病毒载体，其可以为整合或非整合的，具有相对大的包装容量，并且可以转导一系列不同细胞类型。慢病毒载体通常在将三种(包装、包膜和转移)或更多种质粒瞬时转染到生产细胞中之后产生。类似于hiv，慢病毒载体通过病毒表面糖蛋白与细胞表面上受体的相互作用进入靶细胞。在进入时，病毒rna经历逆转录，其由病毒逆转录酶复合物介导。逆转录的产物是双链线性病毒dna，其是病毒整合到受感染细胞dna中的底物。
[0050]
在某些实施例中，病毒载体可以是γ逆转录病毒，例如，莫洛尼鼠类白血病病毒(moloney murine leukemia virus，mlv)衍生的载体。在其它实施例中，病毒载体可以是更复杂的逆转录病毒衍生的载体，例如，慢病毒衍生的载体。hiv-1衍生的载体属于此类别。其它实例包括衍生自hiv-2、fiv、马传染性贫血病毒、siv和梅迪-维斯纳病毒(maedi-visna virus)(绵羊慢病毒)的慢病毒载体。使用逆转录病毒和慢病毒载体以及包装细胞来用包含转基因的病毒颗粒转导哺乳动物宿主细胞的方法是本领域已知的并且已经在例如以下文献中描述：美国专利8,119,772；walchli等人,《公共科学图书馆
·
综合(plos one)》6:327930,2011；zhao等人,《免疫学杂志(j.immunol.)》174:4415,2005；engels等人,《人类基因疗法(hum.gene ther.)》14:1155,2003；frecha等人,《分子疗法》18:1748,2010；以及verhoeyen等人,《分子生物学方法(methods mol.biol.)》506:97,2009。逆转录病毒和慢病毒载体构建体和表达系统也是可商购获得的。其它病毒载体也可以用于多核苷酸递送，包括dna病毒载体，包括例如基于腺病毒的载体和基于腺相关病毒(aav)的载体；衍生自单纯疱疹病毒(hsv)的载体，包括扩增子载体、复制缺陷型hsv和减毒hsv(krisky等人,《基因疗法(gene ther.)》5:1517,1998)。
[0051]
可以与本公开的组合物和方法一起使用的其它载体包括衍生自杆状病毒和α-病毒的载体。(jolly,d j.1999.新兴病毒载体(emerging viral vectors.)第209-40页,friedmann t.编辑,《人类基因疗法的发展(the development of human gene therapy.)》纽约：冷泉港实验室(new york:cold spring harbor lab)，或质粒载体(如睡美人或其它转座子载体)。
[0052]
当病毒载体基因组包括要在宿主细胞中作为独立的转录物表达的多种多核苷酸时，病毒载体还可以包括两种(或更多种)转录物之间的额外的序列，从而允许双顺反子或多顺反子表达。用于病毒载体的此类序列的实例包括内部核糖体进入位点(ires)、弗林蛋白酶切割位点、病毒2a肽或其任何组合。
[0053]
本文进一步描述质粒载体，包括用于直接向受试者施用的基于dna的抗体或抗原结合片段编码质粒载体。
[0054]
如本文所使用的，术语“宿主(host)”是指用异源核酸分子进行遗传修饰以产生所关注多肽(例如，本公开的抗体)的靶标的细胞或微生物。
[0055]
宿主细胞可以包括可以接受载体或核酸并入或表达蛋白质的任何单独细胞或细
胞培养物。术语还涵盖宿主细胞的后代，无论在遗传或表型上相同还是不同。合适的宿主细胞可以取决于载体并且可以包括哺乳动物细胞、动物细胞、人类细胞、猴细胞、昆虫细胞、酵母细胞和细菌细胞。这些细胞可以通过使用病毒载体、通过磷酸钙沉淀转化、deae-葡聚糖、电穿孔、显微注射或其它方法诱导以并入载体或其它材料。参见例如sambrook等人,《分子克隆：实验室手册(molecular cloning:alaboratory manual)》第2版(冷泉港实验室,1989)。
[0056]
在sars-cov-2感染的情况下，“宿主”是指感染sars-cov-2的细胞或受试者。
[0057]
如本文所使用的，“抗原”或“ag”是指引起免疫应答的免疫原性分子。这种免疫应答可能涉及抗体产生、特定免疫活性细胞的激活、补体的激活、抗体依赖性细胞毒性或其任何组合。抗原(免疫原性分子)可以是例如肽、糖肽、多肽、糖聚肽、多核苷酸、多糖、脂质等。显而易见，抗原可以合成、重组产生或衍生自生物样品。可以包含一种或多种抗原的示例性生物样品包括组织样品、粪便样品、细胞、生物流体或其组合。抗原可以由已经修饰或基因工程化以表达抗原的细胞产生。抗原还可以存在于sars-cov-2(例如，表面糖蛋白或其部分)中，如存在于病毒粒子中，或在受sars-cov-2感染的细胞表面上表达或呈现。
[0058]
术语“表位(epitope)”或“抗原表位(antigenic epitope)”包括由同源结合分子，如免疫球蛋白或其它结合分子、结构域或蛋白质识别且特异性结合的任何分子、结构、氨基酸序列或蛋白质决定簇。表位决定簇通常包含如氨基酸或糖侧链等分子的化学活性表面分组，并且可以具有特定的三维结构特性以及特定的电荷特性。在抗原是或包括肽或蛋白质时，表位可以包括连续氨基酸(例如，线性表位)，或者可以包括来自通过蛋白质折叠而接近的蛋白质的不同部分或区的氨基酸(例如，不连续或构象表位)，或者与蛋白质折叠无关紧密接近的非连续氨基酸。
[0059]
抗体、抗原结合片段和组合物
[0060]
某些目前公开的方法和用途包括向受试者施用抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)并且能够与(例如，如在宿主细胞的细胞表面上和/或在sars-cov-2病毒粒子上表达的)sars-cov-2的表面糖蛋白结合，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3。
[0061]
在本文进一步描述的某些优选实施例中，在方法中使用的抗体或其抗原结合片段包括seq id no:106、121、108、169、170和171中分别所示的或seq id no:106、107、108、169、170和171中分别所示的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。在某些实施例中，在方法中使用的抗体或其抗原结合片段包括seq id no:113或105中所示的vh氨基酸序列和seq id no:168中所示的vl氨基酸序列。
[0062]
在某些实施例中，在方法中使用的抗体或抗原结合片段与sars-cov-2表面糖蛋白表位或包括所述表位的抗原缔合或联合，而不与样品中的任何其它分子或组分显著缔合或联合。
[0063]
在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段与sars-cov-2表面糖蛋白表位缔合或联合(例如，结合)，并且还可以与来自样品中存在的另一冠状病毒(例如，sars cov)的表位缔合或联合，但不与样品中的任何其它分子或组分显著缔合或联合。换句话说，在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段对sars-cov-2和一种或多种额外的冠状病毒具有交叉反应性。
[0064]
在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段与sars-cov-2表面糖蛋白特异性结合。如本文所使用的，“特异性结合(specifically binds)”是指抗体或抗原结合片段与抗原缔合或联合，其中亲和力或ka(即，特定结合相互作用的平衡缔合常数，单位为1/m)等于或大于105m-1
(其等于此缔合反应的缔合速率[k
on
]与解离速率[k
off
]的比率)，而不与样品中的其它分子或组分显著缔合或联合。可替代地，亲和力可以被定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(kd)，单位为m(例如，10-5
m至10-13
m)。抗体可以分类为“高亲和力”抗体或“低亲和力”抗体。“高亲和力”抗体是指那些ka为至少107m-1
、至少108m-1
、至少109m-1
、至少10
10
m-1
、至少10
11
m-1
、至少10
12
m-1
或至少10
13
m-1
的抗体。“低亲和力”抗体是指那些ka为至多107m-1
、至多106m-1
、至多105m-1
的抗体。可替代地，亲和力可以被定义为特定结合相互作用的平衡解离常数(kd)，单位为m(例如，10-5
m至10-13
m)。
[0065]
已知多种测定用于鉴定与特定靶标结合的本公开的抗体，以及确定结合结构域或结合蛋白亲和力，如蛋白质印迹、elisa(例如，直接、间接或夹心)、分析超速离心、光谱法和表面等离子体共振分析(参见例如scatchard等人,《美国纽约科学院年报(ann.n.y.acad.sci.)》51:660,1949；wilson,《科学(science)》295:2103,2002；wolff等人,《癌症研究(cancer res.)》53:2560,1993；以及美国专利第5,283,173号、第5,468,614号或等效物)。还已知用于评估亲和力或表观亲和力或相对亲和力的测定。
[0066]
可以通过例如在宿主细胞中重组表达sars-cov-2抗原(例如，通过转染)并用抗体对(例如，固定的或固定的且透化的)宿主细胞进行免疫染色并通过流式细胞术(例如，使用ze5细胞分析仪和flowjo软件(treestar))进行分析结合来确定结合。在一些实施例中，可以通过表达sars-cov-2的细胞与对照(例如，模拟)细胞的差异性抗体染色来定义阳性结合。
[0067]
在一些实施例中，如使用生物层干涉测量法所测量的，本公开的抗体或抗原结合片段与sars-cov-2 s蛋白结合。在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段以小于约4.5x10-9
m、小于约5x10-9
m、小于约1x10-10
m、小于约5x10-10
m、小于约1x10-11
m、小于约5x10-11
m、小于约1x10-12
m或小于约5x10-12
m的kd与sars-cov-2 s蛋白结合。在一些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段以小于约4.5x10-9
m、小于约5x10-9
m、小于约1x10-10
m、小于约5x10-10
m、小于约1x10-11
m、小于约5x10-11
m、小于约1x10-12
m或小于约5x10-12
m的kd与sars-cov-2 s蛋白rbd结合。在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段以如本文所示的kd、ka和/或kd与sars-cov-2 s蛋白(例如，糖基化或去糖基化s蛋白rbd)结合。在特定实施例中，抗体或抗原结合片段能够以约0.35nm、约0.36nm、约0.37nm、约0.38nm、约0.39nm、约0.40nm、约0.41nm、约0.42nm、约0.43nm、约0.44nm或约0.45nm的kd，约8.5e4 1/ms的ka和/或约3.3e-51/s的kd与糖基化s蛋白rbd结合。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段能够以约0.95nm、约0.96nm、约0.97nm、约0.98nm、约0.99nm、约1.0nm、约1.1nm、约1.2nm、约1.3nm、约1.4nm、约1.5nm或约1.6nm的kd，约3.1e5 1/ms的ka和/或约3.2e-4 1/s的kd与去糖基化s蛋白rbd结合。
[0068]
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段能够中和由sars-cov-2引起的感染。如本文所使用的，“中和抗体(neutralizing antibody)”是可以中和，即预防、抑制、减少、阻碍或干扰病原体在宿主中引发和/或永存感染的能力的抗体。术语“中和抗体”和“中和的抗体(an antibody that neutralizes)”或“中和的抗体(antibodies that neutralize)”在本
文中可互换使用。在当前公开的实施例中的任何实施例中，抗体或抗原结合片段能够在体外感染模型和/或在体内感染动物模型和/或人体内预防和/或中和sars-cov-2感染。在一些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段能够以约16至约20μg/ml的ic50中和sars-cov-2感染。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段能够以约0.3μg/ml至约0.4μg/ml的ic50中和sars-cov-2感染或用sars-cov-2假型化的病毒。在一些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段或包括两种或更多种抗体或抗原结合片段的组合物能够以约0.07μg/ml至约0.08μg/ml的ic50中和sars-cov-2感染或用sars-cov-2假型化的病毒。
[0069]
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段(i)识别sars-cov-2的ace2受体结合基序(rbm，seq id no:167)中的表位；(ii)能够阻断sars-cov-2与ace2之间的相互作用；(ii)能够以高于与sars冠状病毒s蛋白结合的亲合力的亲合力与sars-cov-2 s蛋白结合；(iv)当抗体或抗原结合片段以10μg/ml存在时，能够对样品中约30％、约35％、约40％、约50％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％或更多的表达sars-cov-2表面糖蛋白的靶细胞进行染色(例如，如通过流式细胞术elisa测定的染色)，所述样品包括在大约100μl中约50000个所述靶细胞(例如，expicho细胞)；(v)识别在sars-cov-2的ace2 rbm和sars冠状病毒的ace2 rbm中保守的表位；(vi)针对sars-cov-2和sars冠状病毒具有交叉反应性；(vii)识别sars-cov-2表面糖蛋白中不在ace2 rbm中的表位；或(viii)(i)至(vii)的任何组合。
[0070]
除非在本文中明确地以不同方式定义，否则抗体技术领域的技术人员所理解的术语各自被赋予本领域中获得的含义。例如，术语“抗体”是指包括通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的完整抗体，以及完整抗体的任何抗原结合部分或片段，所述抗原结合部分或片段具有或保留与由完整抗体识别的抗原靶分子结合的能力，如scfv、fab或fab
′
2片段。因此，术语“抗体”在本文中以最广泛的意义使用并且包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和其功能(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(fab)片段、f(ab
′
)2片段、fab
′
片段、fv片段、重组igg(rigg)片段、单链抗体片段，包括单链可变片段(scfv)和单结构域抗体(例如，sdab、sdfv、纳米抗体)片段。所述术语涵盖基因工程化和/或其它方式修饰的免疫球蛋白形式，如胞内抗体、肽体、嵌合抗体、完全人抗体、人源化抗体和异缀合抗体、多特异性(例如，双特异性)抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、串联双scfv和串联三scfv。除非另有说明，否则术语“抗体”应被理解为涵盖其功能抗体片段。所述术语还涵盖完整或全长抗体，包括任何类别或亚类的抗体，包括igg和其亚类(igg1、igg2、igg3、igg4)、igm、ige、iga和igd。
[0071]
术语“v
l”或“vl”和“v
h”或“vh”是指分别来自抗体轻链和抗体重链的可变结合区。在某些实施例中，vl为κ(kappa)类(在本文中也称为“vk”)。在某些实施例中，vl为λ(lambda)类。可变结合区包括被称为“互补决定区”(cdr)和“框架区”(fr)的离散、明确定义的子区。术语“互补决定区”和“cdr”与“高变区”或“hvr”同义，并且是指抗体可变区内的氨基酸序列，通常，其共同将抗原特异性和/或结合亲和力赋予抗体，其中连续cdr(即，cdr1和cdr2、cdr2和cdr3)在一级结构中由框架区彼此分隔。每个可变区有三个cdr(hcdr1、hcdr2、hcdr3；lcdr1、lcdr2、lcdr3；也分别被称为cdrh和cdrl)。在某些实施例中，抗体vh包括如下四个fr和三个cdr：fr1-hcdr1-fr2-hcdr2-fr3-hcdr3-fr4；并且抗体vl包括如下四个fr和三个cdr：fr1-lcdr1-fr2-lcdr2-fr3-lcdr3-fr4。通常，vh和vl通过其相应cdr共同形成抗原结合位点。
[0072]
如本文所使用的，cdr的“变体”是指cdr序列的具有至多1-3个氨基酸取代(例如，保守或非保守取代)、缺失或其组合的功能变体。
[0073]
cdr和框架区的编号可以根据任何已知的方法或方案，如kabat、chothia、eu、imgt和aho编号方案(参见例如，kabat等人,《免疫学所关注的蛋白质序列(sequences of proteins of immunological interest)》,美国健康与人类服务部(us dept.health and human services),美国国立卫生研究院公共卫生服务(public health service national institutes of health),1991,第5版；chothia和lesk,《分子生物学杂志(j.mol.biol.)》196:901-917(1987))；lefranc等人,《发展竞争免疫学(dev.comp.immunol.)》27:55,2003；honegger和pl
ü
ckthun,《分子生物学杂志》309:657-670(2001))。可以使用抗原受体编号和受体分类(antigen receptor numbering and receptor classification，anarci)软件工具(2016,《生物信息学(bioinformatics)》15:298-300)标注等效残基位置并且用于比较不同分子。
[0074]
因此，根据一种编号方案鉴定如本文所提供的示例性可变结构域(vh或vl)序列的cdr不排除包括如使用不同编号方案确定的相同可变结构域的cdr的抗体。在某些实施例中，提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括在根据以下中的任一个的vh序列中鉴定的cdr：seq id no:1、9-15、23、24、27、28-46、55、63、79、87、95、103、105、113-120、129-146、155、172、176-178、194、196、198、200、202和239，以及在根据以下中的任一个的vl序列中鉴定的cdr：seq id no:5、47-50、59、67、71-72、75、76、83、91、99、109、147-150、159、168、182、190、234和243，如使用任何已知的cdr编号方法，包括kabat、chothia、eu、imgt、martin(增强型chothia)、contact和aho编号方法所确定的。在某些实施例中，cdr根据imgt编号方法。在某些实施例中，cdr根据由化学计算组(ccg)开发的抗体编号方法；例如，使用分子操作环境(moe)软件。
[0075]
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包括分别根据seq id no:106、121或107、108、169、170和171的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0076]
在一些实施例中，提供了一种抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中：(i)所述cdrh1包括根据以下中的任一个的氨基酸序列或由其组成：seq id no:2、56、64、80、88、96、106、156、179、195或240，或者包括所述序列的序列变体或由其组成，所述序列变体包括一个、两个或三个酸取代，所述取代中的一个或多个取代任选地是保守取代和/或种系编码的氨基酸的取代；(ii)所述cdrh2包括根据以下中的任一个的氨基酸序列或由其组成：seq id no:3、16-22、57、65、81、89、97、107、121-126、157、180、197、199或241，或者包括所述序列的序列变体或由其组成，所述序列变体包括一个、两个或三个氨基酸取代，所述取代中的一个或多个取代任选地是保守取代和/或种系编码的氨基酸的取代；(iii)所述cdrh3包括根据以下中的任一个的氨基酸序列或由其组成：seq id no:4、25、26、58、66、82、90、98、104、108、127、128、158、181、201、203或242，或者包括所述序列的序列变体或由其组成，所述序列变体包括一个、两个或三个氨基酸取代，所述取代中的一个或多个取代任选地是保守取代和/或种系编码的氨基酸的取代；(iv)所述cdrl1包括根据序列中的任一个的氨基酸序列或由其组成：seq id no:6、51-54、60、68、73、74、84、92、100、110、160、169、183、235或244，或者包括所述序列的序列变体或由其组成，所
述序列变体包括一个、两个或三个氨基酸取代，所述取代中的一个或多个取代任选地是保守取代和/或种系编码的氨基酸的取代；(v)所述cdrl2包括根据以下中的任一个的氨基酸序列或由其组成：seq id no:7、61、69、85、93、101、111、161、170、184、236或245，或者包括所述序列的序列变体或由其组成，所述序列变体包括一个、两个或三个氨基酸取代，所述取代中的一个或多个取代任选地是保守取代和/或种系编码的氨基酸的取代；和/或(vi)所述cdrl3包括根据以下中的任一个的氨基酸序列或由其组成：seq id no:8、62、70、77、78、86、94、102、112、151、152、153、154、162、171、185、237或246，或者包括所述序列的序列变体或由其组成，所述序列变体包括一个、两个或三个氨基酸取代，所述取代中的一个或多个取代任选地是保守取代和/或种系编码的氨基酸的取代，其中所述抗体或抗原结合片段能够与在宿主细胞的细胞表面上表达的sars-cov-2的表面糖蛋白结合。
[0077]
在当前公开的实施例中的任何实施例中，抗体或抗原结合片段能够在体外感染模型和/或在体内感染动物模型和/或人体内预防和/或中和sars-cov-2感染。
[0078]
术语“cl”是指“免疫球蛋白轻链恒定区”或“轻链恒定区”，即来自抗体轻链的恒定区。术语“ch”是指“免疫球蛋白重链恒定区”或“重链恒定区”，取决于抗体同种型，其可以进一步分为ch1、ch2和ch3(iga、igd、igg)或ch1、ch2、ch3和ch4结构域(ige、igm)。本文进一步描述抗体重链的fc区。在当前公开的实施例中的任何实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段包括cl、ch1、ch2和ch3中的任一者或多者。在某些实施例中，cl包括与seq id no:174或seq id no:193的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。在某些实施例中，ch1-ch2-ch3包括与seq id no:173或seq id no:175的氨基酸序列具有90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0079]
应当理解的是，例如，在哺乳动物细胞系中的产生可以去除抗体重链的一个或多个c末端赖氨酸(参见例如，liu等人,《单克隆抗体(mabs)》6(5):1145-1154(2014))。因此，本公开的抗体或抗原结合片段可以包括重链、ch1-ch3、ch3或fc多肽，其中存在或不存在c末端赖氨酸残基；换句话说，涵盖重链、ch1-ch3或fc多肽的c末端残基不是赖氨酸的实施例，以及赖氨酸是c末端残基的实施例。seq id no:265和266中提供了缺乏c末端赖氨酸的ch1-ch3氨基酸序列的实例。
[0080]
在某些实施例中，组合物包含多种本公开的抗体和/或抗原结合片段，其中一种或多种抗体或抗原结合片段不包括重链、ch1-ch3或fc多肽的c末端处的赖氨酸残基，并且其中一种或多种抗体或抗原结合片段包括重链、ch1-ch3或fc多肽的c末端处的赖氨酸残基。
[0081]“fab”(片段抗原结合)是与抗原结合的抗体的部分并且包括通过链间二硫键与轻链连接的重链的可变区和ch1。每个fab片段关于抗原结合是单价的，即，其具有单个抗原结合位点。抗体的胃蛋白酶处理产生单个大f(ab
′
)2片段，其大致对应于具有二价抗原结合活性的两个二硫键连接的fab片段并且仍然能够交联抗原。fab和f(ab
′
)2两者均为“抗原结合片段”的实例。fab
′
片段与fab片段的不同之处在于在ch1结构域的羧基末端处具有额外的少量残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸的。fab
′‑
sh在本文中是对其中恒定结构域的半胱氨酸残基带有游离硫醇基团的fab
′
的名称。f(ab
′
)2抗体片段最初是作为其间具有铰链半胱氨酸的fab
′
片段对产生的。抗体片段的其它化学偶联也是已知的。
[0082]
fab片段可以例如通过肽接头连接以形成单链fab，在本文中也称为“scfab”。在这
些实施例中，天然fab中存在的链间二硫键可能不存在，并且接头完全或部分用于在单个多肽链中连接(link/connect)fab片段。重链衍生的fab片段(例如，包括vh+ch1或“fd”、由其组成或基本上由其组成)和轻链衍生的fab片段(例如，包括vl+cl、由其组成或基本上由其组成)可以以任何排列连接以形成scfab。例如，可以根据(重链fab片段-接头-轻链fab片段)或(轻链fab片段-接头-重链fab片段)以n末端到c末端的方向排列scfab。本文中进一步详细论述用于scfab的肽接头和示例性接头序列。
[0083]
scfab可以包括本文所公开的vh和vl序列的任何组合，或cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3序列的任何组合。在某些实施例中，scfab包括如seq id no:105或seq id no:113中所提供的vh序列和如seq id no:168中所提供的vl序列。在某些实施例中，scfab包括如seq id no:106中所提供的cdrh1序列，如seq id no:107或121中所提供的cdrh2序列，如seq id no:108中所提供的cdrh3序列，如seq id no:169中所提供的cdrl1序列，如seq id no:170中所提供的cdrl2序列，以及如seq id no:171中所提供的cdrl3序列。在某些实施例中，scfab包括与seq id no:218-219或226-227中的任一个中所提供的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。
[0084]“fv”是包含完整抗原识别和抗原结合位点的小抗体片段。这一片段通常由紧密地非共价缔合的一个重链可变区结构域和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。然而，即使单个可变结构域(或包括仅三个对抗原具有特异性的cdr的fv的一半)也具有识别并结合抗原的能力，但典型地亲和力低于完整结合位点。
[0085]“单链fv”也缩写为“sfv”或“scfv”，是包括连接成单个多肽链的vh抗体结构域和v
l
抗体结构域的抗体片段。在一些实施例中，scfv多肽包括安置于vh结构域与v
l
结构域之间并且连接所述结构域的多肽接头，所述多肽接头使scfv能够保留或形成抗原结合的期望结构。此类肽接头可以使用本领域众所周知的标准技术并入到融合多肽中。关于scfv的综述，参见《单克隆抗体药理学(the pharmacology of monoclonal antibodies)》中的pluckthun,第113卷,rosenburg和moore编辑,纽约的斯普林格出版社(springer-verlag,new york),第269-315页(1994)；borrebaeck 1995,参见下文。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包括scfv，所述scfv包括vh结构域、vl结构域和将vh结构域与vl结构域连接的肽接头。在特定实施例中，scfv包括通过肽接头与vl结构域连接的vh结构域，所述vh结构域可以处于vh-接头-vl朝向或处于vl-接头-vh朝向。本公开的任何scfv可以被工程化，使得vl结构域的c末端通过短肽序列连接到vh结构域的n末端，反之亦然(即，(n)vl(c)-接头-(n)vh(c)或(n)vh(c)-接头-(n)vl(c))。可替代地，在一些实施例中，接头可以与vh结构域、vl结构域或两者的n末端部分或末端连接。
[0086]
可以例如基于以下来选择肽接头序列：(1)其能够采用灵活的扩展构象；(2)其不能或缺乏采用可以与第一多肽和第二多肽上和/或靶分子上的功能表位相互作用的次级结构的能力；和/或(3)缺乏或相对缺乏可能与多肽和/或靶分子反应的疏水残基或带电残基。关于接头设计(例如，长度)的其它考虑因素可以包括vh和vl可以形成功能抗原结合位点的构象或构象范围。在某些实施例中，肽接头序列包含例如gly、asn和ser残基。其它近中性氨基酸，如thr和ala，也可以包括在接头序列中。可以有效地用作接头的其它氨基酸序列包括以下文献中公开的氨基酸序列：maratea等人,《基因(gene)》40:39 46(1985)；murphy等人,
《美国国家科学院院刊(proc.natl.acad.sci.usa)》83:8258 8262(1986)；美国专利第4,935,233号和美国专利第4,751,180号。接头的其它说明性和非限制性实例可以包括例如glu-gly-lys-ser-ser-gly-ser-gly-ser-glu-ser-lys-val-asp(seq id no:215)(chaudhary等人,《美国国家科学院院刊》87:1066-1070(1990))和lys-glu-ser-gly-ser-val-ser-ser-glu-gln-leu-ala-gln-phe-arg-ser-leu-asp(seq id no:216)(bird等人,《科学》242:423-426,(1988))和以单次迭代或者重复1至5次或更多次或更多出现的五聚体gly-gly-gly-gly-ser(seq id no:217)，参见例如seq id no:213。可以使用任何合适的接头，并且通常长度可以为约3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、15个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个氨基酸，或者长度少于约200个氨基，并且将优选地包括柔性结构(可以为由接头连接的两个区、结构域、基序、片段或模块之间的构象移动提供柔性和空间)，并且将优选地在人中是生物惰性的和/或具有低免疫原性风险。示例性接头包括包含以下中的任一个或多个所示的氨基酸序列或由其组成的接头：seq id no:206-217。在某些实施例中，接头包括与以下中的任一个所示的氨基酸序列具有至少75％(即，至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多)同一性的氨基酸序列或由其组成：seq id no:206-217。
[0087]
可以使用本文所公开的vh和vl序列的任何组合或者cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3序列的任何组合来构建scfv。在某些实施例中，scfv包括seq id no:105或seq id no:113中所提供的vh序列和seq id no:168中所提供的vl序列。在某些实施例中，scfab包括如seq id no:106中所提供的cdrh1序列，如seq id no:107或121中所提供的cdrh2序列，如seq id no:108中所提供的cdrh3序列，如seq id no:169中所提供的cdrl1序列，如seq id no:170中所提供的cdrl2序列，以及如seq id no:171中所提供的cdrl3序列。在某些实施例中，scfv可以包括如seq id no:220-221或seq id no:228-229中所提供的氨基酸序列。
[0088]
在一些实施例中，例如当第一多肽和第二多肽具有可以用于将功能结构域分开并防止空间干扰的非必需n末端氨基酸区时，不需要接头序列。
[0089]
本文还提供了与当前公开的(“亲本”)抗体相比，在可变区(例如，vh、vl、框架或cdr)中包括一个或多个氨基酸改变的变体抗体，其中变体抗体能够与sars-cov-2抗原结合。
[0090]
在某些实施例中，vh包括与根据以下中的任一个的氨基酸序列具有至少85％(即，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列或由其组成：seq id no:1、9-15、23、24、27、28-46、55、63、79、87、95、103、105、113-120、129-146、155、172、176-178、194、196、198、200、202和239，其中变异任选地限于一个或多个框架区和/或变异包括一个或多个种系编码的氨基酸的取代；和/或(ii)vl包括与根据以下中的任一个的氨基酸序列具有至少85％(即，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列或由其组成：seq id no:5、47-50、59、67、71-72、75、76、83、91、99、109、147-150、159、168、182、190、234和243，其中变异任选地限于一个或多个框架区和/或变异包括一个或多个种系编码的氨基酸的取代。
[0091]
在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括根据seq id no:105的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括根据seq id no:168的氨基酸序列或由其组成。在另外的实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括根据seq id no:105的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括根据seq id no:168的氨基酸序列或由其组成，并且所述抗体或抗原结合片段以小于约4.5x10-9 m、小于约5x10-9 m、小于约1x10-10 m、小于约5x10-10 m、小于约1x10-11 m、小于约5x10-11 m、小于约1x10-12 m或小于约5x10-12 m的kd与sars-cov-2 s蛋白结合。在另外的实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括根据seq id no:105的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括根据seq id no:168的氨基酸序列或由其组成，并且所述抗体或抗原结合片段能够以约0.3μg/ml至约0.4μg/ml的ic50中和sars-cov-2感染或用sars-cov-2假型化的病毒。
[0092]
在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括根据seq id no:105的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括根据seq id no:168的氨基酸序列或由其组成，并且所述抗体或抗原结合片段以约11ng/ml至约25ng/ml的ec50与sars-cov-2蛋白rbd结合。在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括根据seq id no:113的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括根据seq id no:168的氨基酸序列或由其组成，并且所述抗体或抗原结合片段以约9ng/ml至约23ng/ml的ec50与sars-cov-2 s蛋白rbd结合。在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括根据seq id no:129的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括根据seq id no:168的氨基酸序列或由其组成，并且所述抗体或抗原结合片段以约8ng/ml至约22ng/ml的ec50与sars-cov-2 s蛋白rbd结合。在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括根据seq id no:119的序列或由其组成，所述vl包括seq id no:168的序列或由其组成，并且所述抗体或抗原结合片段以约8ng/ml至约22ng/ml的ec50与sars-cov-2 s蛋白rbd结合。在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括根据seq id no:172的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括根据seq id no:168的氨基酸序列或由其组成，并且所述抗体或抗原结合片段以约7ng/ml至约19ng/ml的ec50与sars-cov-2 s蛋白rbd结合。
[0093]
在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段是单特异性的(例如，与单一表位结合)或多特异性的(例如，与多个表位和/或靶分子结合)。抗体和抗原结合片段可以以各种形式构建。在spiess等人,《分子免疫学(mol.immunol.)》67(2):95(2015)以及brinkmann和kontermann,《单克隆抗体》9(2):182-212(2017)中公开了示例性抗体形式，所述形式和其制备方法通过引用并入本文并且包括例如双特异性t细胞衔接子(bite)、dart、杵臼(knobs-into-holes，kih)组装体、scfv-ch3-kih组装体、kih普通轻链抗体、tandab、三链抗体(triple body)、tribi微抗体、fab-scfv、scfv-ch-cl-scfv、f(ab
′
)2-scfv2、四价hcab、胞内抗体、crossmab、双重作用fab(daf)(二合一或四合一)、dutamab、dt-igg、电荷对(charge pair)、fab臂交换(fab-arm exchange)、seed体、triomab、luz-y组装体、fcab、κλ体、正交fab、dvd-ig(例如，美国专利第8,258,268号，所述形式通过引用整体并入本文)、igg(h)-scfv、scfv-(h)igg、igg(l)-scfv、scfv-(l)igg、igg(l,h)-fv、igg(h)-v、v(h)-igg、igg(l)-v、v(l)-igg、kih igg-scfab、2scfv-igg、igg-2scfv、scfv4-ig、zybody和dvi-igg(四合一)、以及所谓的fit-ig(例如，pct公开第wo 2015/103072号，所述形式通过引用整体并入本文)、所谓的wuxibody形式(例如，pct公开第wo 2019/057122号，所述形式通过
引用整体并入本文)以及所谓的弯管内插入ig形式(in-elbow-insert ig format，iei-ig；pct公开第wo 2019/024979号和第wo 2019/025391号，所述形式通过引用整体并入本文)。
[0094]
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包括两个或更多个vh结构域、两个或更多个vl结构域或两者(即，两个或更多个vh结构域和两个或更多个vl结构域)。在特定实施例中，抗原结合片段包括形式(n末端到c末端方向)vh-接头-vl-接头-vh-接头-vl，其中两个vh序列可以相同或不同并且两个vl序列可以相同或不同。此类连接的scfv可以包括被布置成与给定靶标结合的vh和vl结构域的任何组合，并且在包括两个或更多个vh和/或两个或更多个vl的形式中，可以结合一种、两种或更多种不同表位或抗原。应当理解，并入多个抗原结合结构域的形式可以包括呈任何组合或朝向的vh和/或vl序列。例如，抗原结合片段可以包括形式vl-接头-vh-接头-vl-接头-vh、vh-接头-vl-接头-vl-接头-vh或vl-接头-vh-接头-vh-接头-vl。
[0095]
所构建的本公开的单特异性或多特异性抗体或抗原结合片段包括本文公开的vh和vl序列的任何组合和/或cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3序列的任何组合。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包括seq id no:105或seq id no:113中所提供的vh序列和seq id no:168中所提供的vl序列。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包括如seq id no:106中所提供的cdrh1序列，如seq id no:107或121中所提供的cdrh2序列，如seq id no:108中所提供的cdrh3序列，如seq id no:169中所提供的cdrl1序列，如seq id no:170中所提供的cdrl2序列，以及如seq id no:171中所提供的cdrl3序列。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包括如seq id no:222-225或seq id no:230-233中所提供的氨基酸序列。在一些实施例中，双特异性或多特异性抗体或抗原结合片段可以包括本公开的一个、两个或更多个抗原结合结构域(例如，vh和vl)。可能存在与相同或不同sars-cov-2表位结合的两个或更多个结合结构域，并且在一些实施例中，如本文所提供的双特异性或多特异性抗体或抗原结合片段包括另外的sars-cov-2结合结构域和/或可以包括与不同抗原或病原体结合的结合结构域。
[0096]
在当前公开的实施例中的任何实施例中，所述抗体或抗原结合片段可以是多特异性的；例如，双特异性的、三特异性的等。
[0097]
在某些实施例中，所述抗体或抗原结合片段包括：(i)第一vh和第一vl；以及(ii)第二vh和第二vl，其中所述第一vh和所述第二vh不同并且各自独立地包括与以下中的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％(即，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列：seq id no:1、9-15、23、24、27-46、55、63、79、87、95、103、105、113-120、129-146、155、172、176-178、194、196、198、200、202和239，并且其中所述第一vl和所述第二vl不同并且各自独立地包括与以下中的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％(即，85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)同一性的氨基酸序列：seq id no:5、47-50、59、67、71、72、75、76、83、91、99、109、147-150、159、168、182、190、234和243，并且其中所述第一vh和所述第一vl共同形成第一抗原结合位点，并且其中所述第二vh和所述第二vl共同形成第二抗原结合位点。
[0098]
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包括fc多肽或其片段。“fc”片段或fc多肽包括通过二硫键保持在一起的两个抗体h链的羧基末端部分(即，igg的ch2结构域和ch3结
构域)。抗体“效应子功能”是指可归因于抗体fc区(天然序列fc区或氨基酸序列变体fc区)的生物活性，并随抗体同种型而变化。抗体效应子功能的实例包括：c1q结合和补体依赖性细胞毒性；fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，b细胞受体)的下调；以及b细胞激活。如本文所讨论的，可以对fc结构域进行修饰(例如，氨基酸取代)以便修饰(例如，改良、减少或消除)含fc的多肽(例如，本公开的抗体)的一种或多种功能。此类功能包括例如fc受体(fcr)结合、抗体半衰期调节(例如，通过与fcrn结合)、adcc功能、蛋白a结合、蛋白g结合和补体结合。修饰(例如，改良、减少或消除)fc功能的氨基酸修饰包括例如t250q/m428l、m252y/s254t/t256e、h433k/n434f、m428l/n434s、e233p/l234v/l235a/g236+a327g/a330s/p331s、e333a、s239d/a330l/i332e、p257i/q311、k326w/e333s、s239d/i332e/g236a、n297q、k322a、s228p、l235e+e318a/k320a/k322a、l234a/l235a(在本文中也称为“lala”)和l234a/l235a/p329g突变，这些突变在invivogen公司(2011)出版的《经工程化的fc区(engineered fc regions)》中进行了总结和注释并且可以在invivogen.com/pdf/review/review-engineered-fc-regions-invivogen.pdf？utm_source＝review&utm_medium＝pdf&utm_campaign＝review&utm_content＝engineered-fc-regions在线获取，并且通过引用并入本文。
[0099]
例如，为了激活补体级联，当免疫球蛋白分子附着于抗原靶标时，c1q蛋白复合物可以与至少两个igg1分子或一个igm分子结合(ward,e.s.和ghetie,v.,《治疗免疫学(ther.immunol.)》2(1995)77-94)。burton,d.r.(《分子免疫学》22(1985)161-206)描述了包括氨基酸残基318至337的重链区参与补体固定。duncan,a.r.和winter,g.(《自然(nature)》332(1988)738-740)使用定点诱变报道，glu318、lys320和lys322形成与c1q的结合位点。glu318、lys320和lys 322残基在c1q结合中的作用通过包含这些残基的短合成肽抑制补体介导的裂解的能力进行证实。
[0100]
例如，fcr结合可以通过(抗体的)fc部分与fc受体(fcr)的相互作用介导，fcr是包括造血细胞的细胞上的特化细胞表面受体。fc受体属于免疫球蛋白超家族，并且示出介导通过免疫复合物的吞噬作用去除抗体涂覆的病原体以及通过抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc；van de winkel,j.g.和anderson,c.l.,《白细胞生物学杂志(j.leukoc.biol.)》49(1991)511-524)裂解涂覆有对应抗体的红细胞和各种其它细胞靶标(例如，肿瘤细胞)两者。fcr由其对免疫球蛋白类别的特异性定义；igg抗体的fc受体被称为fcγr，ige抗体的fc受体被称为fcεr，iga抗体的fc受体被称为fcαr等，并且新生儿fc受体被称为fcrn。例如，在ravetch,j.v.和kinet,j.p.,《免疫学年度评论(annu.rev.immunol.)》9(1991)457-492；capel,p.j.等人,《免疫方法(immunomethods)》4(1994)25-34；de haas,m.等人,《实验与临床医学杂志(j lab.clin.med.)》126(1995)330-341；以及gessner,j.e.等人,《血液学年鉴(ann.hematol.)》76(1998)231-248中描述了fc受体结合。
[0101]
天然igg抗体(fcγr)的fc结构域与受体的交联触发了多种效应子功能，包括吞噬作用、抗体依赖性细胞毒性和炎性介体释放以及免疫复合物清除和抗体产生调节。本文考虑了提供受体(例如，fcγr)交联的fc部分。在人类中，迄今为止已对以下三类fcγr进行表征：(i)fcγri(cd64)，其以高亲和力与单体igg结合，并在巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞上表达；(ii)fcγrii(cd32)，其以中到低亲和力与复合igg结合，广泛表达(特别是在白细胞上)，被认为是抗体介导免疫的核心参与者，并且可以分为fcγriia、fcγ
riib和fcγriic，在免疫系统中发挥不同的功能，但以相似的低亲和力与igg-fc结合，并且这些受体的胞外域高度同源；以及(iii)fcγriii(cd16)，其以中到低亲和力与igg结合，并且已发现其有两种形式：fcγriiia，其已在nk细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞以及一些单核细胞和t细胞上发现，并且被认为介导adcc；以及fcγriiib，其在中性粒细胞上高度表达。
[0102]
fcγriia发现于许多参与杀伤的细胞(例如，巨噬细胞、单核细胞、中性粒细胞)上，并且似乎能够激活杀伤过程。fcγriib似乎在抑制过程中发挥作用，并且发现于b细胞、巨噬细胞以及肥大细胞和嗜酸性粒细胞上。重要的是，已经表明所有fcγriib中的75％在肝脏中发现(ganesan,l.p.等人,2012:“肝窦内皮上的fcγriib清除小免疫复合物(fcγriib on liver sinusoidal endothelium clears small immune complexes)”,《免疫学杂志》189:4981-4988)。fcγriib在被称为lsec的肝窦内皮上和肝脏中的kupffer细胞中大量表达，并且lsec是清除小免疫复合物的主要位点(ganesan,l.p.等人,2012:肝窦内皮上的fcγriib清除小免疫复合物《免疫学杂志》189:4981-4988)。
[0103]
在一些实施例中，本文公开的抗体和其抗原结合片段包括用于与fcγriib，特别是fc区，例如igg型抗体结合的fc多肽或其片段。此外，可以通过引入突变s267e和l328f来工程化fc部分以增强fcγriib结合，如chu,s.y.等人,2008:通过cd19和fcγriib与经fc工程化的抗体的共接合抑制b细胞受体介导的原代人b细胞激活(inhibition of b cell receptor-mediated activation of primary human b cells by coengagement of cd19 and fcgammariib with fc-engineered antibodies.)《分子免疫学》45,3926
–
3933所描述的。由此，可以增强免疫复合物的清除(chu,s.等人,2014:黑猩猩中ige的加速清除由xmab7195(一种经fc工程化的抗体)介导，对抑制性受体fcγriib具有增强的亲和力(accelerated clearance of ige in chimpanzees is mediated by xmab7195,an fc-engineered antibody with enhanced affinity for inhibitory receptor fcγriib.)《美国呼吸和危重病医学杂志(am j respir crit)》,美国胸科学会国际会议摘要(american thoracic society international conference abstracts))。在一些实施例中，本公开的抗体或其抗原结合片段包括具有突变s267e和l328f的经工程化的fc部分，特别是如chu,s.y.等人,2008:通过cd19和fcγriib与经fc工程化的抗体的共接合抑制b细胞受体介导的原代人b细胞激活《分子免疫学》45,3926
–
3933所描述的。
[0104]
在b细胞上，fcγriib可能起到抑制免疫球蛋白进一步产生和同种型转换为例如ige类的作用。在巨噬细胞上，fcγriib被认为抑制通过fcγriia介导的吞噬作用。在嗜酸性粒细胞和肥大细胞上，b形式可以通过ige与其独立的受体结合帮助抑止这些细胞的激活。
[0105]
关于fcγri结合，e233-g236、p238、d265、n297、a327和p329中的至少一者的天然igg中的修饰降低与fcγri的结合。被取代为对应位置igg1和igg4的位置233-236处的igg2残基将igg1和igg4与fcγri的结合减少103倍并消除人单核细胞对抗体致敏红细胞的应答(armour,k.l.等人,《欧洲免疫学杂志(eur.j.immunol.)》29(1999)2613-2624)。
[0106]
关于fcγrii结合，发现对fcγriia的结合降低，例如，对于e233-g236、p238、d265、n297、a327、p329、d270、q295、a327、r292和k414中的至少一者的igg突变。
[0107]
人fcγriia的两种等位基因形式是以高亲和力与igg1 fc结合的“h131”变体以及以低亲和力与igg1 fc结合的“r131”变体。参见例如bruhns等人,《血液(blood)》113:3716-3725(2009)。
[0108]
关于fcγriii结合，发现与fcγriiia的结合降低，例如，对于e233-g236、p238、d265、n297、a327、p329、d270、q295、a327、s239、e269、e293、y296、v303、a327、k338和d376中的至少一者的突变。人igg1上fc受体结合位点的作图、上述突变位点以及用于测量与fcγri和fcγriia结合的方法描述于shields,r.l.等人,《生物化学杂志(j.biol.chem.)》276(2001)6591-6604中。
[0109]
人fcγriiia的两种等位基因形式是以低亲和力与igg1 fc结合的“f158”变体以及以高亲和力与igg1 fc结合的“v158”变体。参见例如bruhns等人,《血液》113:3716-3725(2009)。
[0110]
关于与fcγrii的结合，天然igg fc的两个区似乎参与了fcγrii与igg之间的相互作用，即(i)igg fc的下铰链位点，特别是氨基酸残基l、l、g、g(234
–
237，eu编号)，和(ii)igg fc的ch2结构域的相邻区，特别是与下铰链区相邻的上ch2结构域中的环和链，例如在p331的区中(wines,b.d.等人,《免疫学杂志》2000；164:5313
–
5318)。此外，fcγri似乎与igg fc上的相同位点结合，而fcrn和蛋白a与igg fc上的不同位点结合，所述位点似乎位于ch2-ch3界面(wines,b.d.等人,《免疫学杂志》2000；164:5313
–
5318)。
[0111]
还考虑了增加本公开的fc多肽或其片段与(即，一种或多种)fcγ受体的结合亲和力的突变(例如，与参考fc多肽或其片段或包含不包括突变的参考fc多肽或其片段相比)。参见例如delillo和ravetch,《细胞(cell)》161(5):1035-1045(2015)和ahmed等人,《结构生物学杂志(j.struc.biol.)》194(1):78(2016)，其fc突变和技术通过引用并入本文。
[0112]
在本文公开的任何实施例中，抗体或抗原结合片段可以包括fc多肽或其片段，所述fc多肽或其片段包括选自以下的突变：g236a；s239d；a330l和i332e；或包括其任意两种或更多种的组合；例如s239d/i332e；s239d/a330l/i332e；g236a/s239d/i332e；g236a/a330l/i332e(本文也称为“gaalie”)；或g236a/s239d/a330l/i332e。在一些实施例中，fc多肽或其片段不包括s239d。
[0113]
在某些实施例中，fc多肽或其片段可以包括参与结合fcrn结合的fc多肽或其片段的至少一部分或由其组成。在某些实施例中，fc多肽或其片段包括一种或多种氨基酸修饰，其改良对fcrn的结合亲和力(例如，增强与fcrn的结合)(例如，在约6.0的ph下)，并且在一些实施例中，从而延长包括fc多肽或其片段的分子的体内半衰期(例如，与在其它方面相同但不包括修饰的参考fc多肽或其片段或抗体相比)。在某些实施例中，fc多肽或其片段包括或衍生自igg fc并且半衰期延长突变包括以下中的任何一者或多者：m428l；n434s；n434h；n434a；n434s；m252y；s254t；t256e；t250q；p257i；q311i；d376v；t307a；e380a(eu编号)。在某些实施例中，半衰期延长突变包括m428l/n434s(在本文中也被称为“mlns”)。在某些实施例中，半衰期延长突变包括m252y/s254t/t256e。在某些实施例中，半衰期延长突变包括t250q/m428l。在某些实施例中，半衰期延长突变包括p257i/q311i。在某些实施例中，半衰期延长突变包括p257i/n434h。在某些实施例中，半衰期延长突变包括d376v/n434h。在某些实施例中，半衰期延长突变包括t307a/e380a/n434a。
[0114]
在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包括fc部分，所述fc部分包括取代突变m428l/n434s。在一些实施例中，抗体或抗原结合片段包括fc多肽或其片段，所述fc多肽或其片段包括取代突变g236a/a330l/i332e。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包括(例如，igg)fc部分，所述fc部分包括g236a突变、a330l突变和i332e突变(gaalie)，并且不包括
s239d突变(例如，在位置239处包括天然s)。在特定实施例中，抗体或抗原结合片段包括fc多肽或其片段，所述fc多肽或其片段包括取代突变：m428l/n434s和g236a/a330l/i332e，并且任选地不包括s239d。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包括fc多肽或其片段，所述fc多肽或其片段包括取代突变：m428l/n434s和g236a/s239d/a330l/i332e。
[0115]
在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包括改变糖基化的突变，其中改变糖基化的突变包括n297a、n297q或n297g，和/或抗体或抗原结合片段是部分或完全去糖基化的和/或部分或完全去岩藻糖基化的。制备部分或完全去糖基化的或部分或完全去岩藻糖基化的抗体和抗原结合片段的宿主细胞系和方法是已知的(参见例如pct公开第wo 2016/181357号；suzuki等人,《临床癌症研究(clin.cancer res.)》13(6):1875-82(2007)；huang等人,《单克隆抗体》6:1-12(2018))。
[0116]
在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段能够在受试者体内引发持续保护，即使是在受试者中无法发现可检测水平的抗体或抗原结合片段后(即，当抗体或抗原结合片段在施用之后已经从受试者中清除时)。此类保护在本文中被称为疫苗效应。在不希望受理论束缚的情况下，据信树突状细胞可以内化抗体与抗原的复合物并且其后诱导或促成针对抗原的内源免疫应答。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段包括一种或多种修饰，例如，包括g236a、a330l和i332e的fc中的突变，所述突变能够激活可以诱导例如对抗原的t细胞免疫的树突状细胞。
[0117]
在当前公开的任何实施例中，抗体或抗原结合片段包括fc多肽或其片段，所述fc多肽或其片段包括ch2(或其片段)、ch3(或其片段)或ch2和ch3，其中ch2、ch3或两者可以是任何同种型，并且与对应的野生型ch2或ch3相比，可以分别包括氨基酸取代或其它修饰。在某些实施例中，本公开的fc多肽包括缔合以形成二聚体的两个ch2-ch3多肽。
[0118]
在当前公开的任何实施例中，所述抗体或抗原结合片段可以是单克隆的。如本文所使用的，术语“单克隆抗体(mab)”是指从基本上均质抗体群体中获得的抗体，即包括所述群体的单独抗体除了可以在一些情况下少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原位点。此外，相较于包括针对不同表位的不同抗体的多克隆抗体制剂，每个单克隆抗体针对抗原的单个表位。除了其特异性之外，单克隆抗体的有利之处还在于，可以合成这些抗体，而不受其它抗体污染。术语“单克隆(monoclonal)”不应被解释为需要通过任何特定方法产生抗体。例如，适用于本发明的单克隆抗体可以通过kohler等人,《自然》256:495(1975)首次描述的杂交瘤方法制备，或者可以使用重组dna方法在细菌、真核动物或植物细胞中制备(参见例如美国专利第4,816,567号)。例如，单克隆抗体也可以使用在clackson等人,《自然》352:624-628(1991)和marks等人,《分子生物学杂志》222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中分离。还可以使用pct公开第wo 2004/076677a2号中公开的方法获得单克隆抗体。
[0119]
本公开的抗体和抗原结合片段包括“嵌合抗体”，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的一个或多个对应序列相同或同源，而链的其余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体连同此类抗体的片段中的对应序列相同或同源，只要它们表现出预期的生物活性即可(参见美国专利第4,816,567号；第5,530,101号和第7,498,415号；和morrison等人,《美国国家科学院院刊》,81:6851-6855(1984))。例如，嵌合抗体可以包括人和非人残基。此外，嵌合抗体可以包括在接受者抗体或
供体抗体中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善抗体性能。对于另外的细节，参见jones等人,《自然》,321:522-525(1986)；reichmann等人,《自然》,332:323-329(1988)；和presta,《当代结构生物学评论(curr.op.struct.biol.)》2:593-596(1992)。嵌合抗体还包括灵长类化和人源化抗体。
[0120]“人源化抗体”一般被视为具有从非人源引入其中的一个或多个氨基酸残基的人抗体。这些非人氨基酸残基典型地取自可变结构域。人源化可以按照winter和合作者的方法(jones等人,《自然》,321:522-525(1986)；reichmann等人,《自然》,332:323-327(1988)；verhoeyen等人,《科学》,239:1534-1536(1988))通过用非人可变序列取代人抗体的对应序列来进行。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利第4,816,567号；第5,530,101号和第7,498,415号)，其中基本上少于完整的人可变结构域已经被来自非人物种的对应序列取代。在一些情况下，“人源化”抗体是由非人细胞或动物产生并且包括人序列(例如，hc结构域)的抗体。
[0121]“人抗体”是仅包含存在于由人产生的抗体中的序列的抗体。然而，如本文所使用的，人抗体可以包括在天然存在的人抗体(例如，从人分离的抗体)中未发现的残基或修饰，包括本文所描述的那些修饰和变体序列。典型地进行这些以进一步改善或增强抗体性能。在一些情况下，人抗体由转基因动物产生。例如，参见美国专利第5,770,429号；第6,596,541号和第7,049,426号。在某些实施例中，本公开的抗体或抗原结合片段是嵌合、人源化或人的。
[0122]
本公开的示例性抗体包括s309、索托维单抗和vir-7832。s309是从sars-cov存活者的b细胞获得的人单克隆抗体。s309包括seq id no:105的vh氨基酸序列和seq id no:168的vl氨基酸序列。索托维单抗(igg1*01g1m17；seq id no:113的vh，m428l和n434s fc突变；seq id no:168的vl(κ轻链igkc*01k1m3))和vir-7832((igg1*01g1m17；seq id no:113的vh，g236a、a330l、i332e、m428l和n434s fc突变；seq id no:168的vl(κ轻链igkc*01k1m3))是衍生自s309的经工程化的人单克隆抗体。
[0123]
多核苷酸、载体和宿主细胞
[0124]
当前公开的抗体和抗原结合片段(和其部分；例如，cdr、vh、vl、重链或轻链)可以由多核苷酸编码。多核苷酸可以包括脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)。rna可以包括信使rna(mrna)。多核苷酸可以被密码子优化以在宿主细胞中表达。一旦已知或鉴定了编码序列，可以使用已知的技术和工具进行密码子优化，例如使用 optimiumgene
tm
工具；还参见scholten等人,《临床免疫学(clin.immunol.)》119:135,2006)。密码子优化的序列包括部分密码子优化的序列(即，一个或多个密码子被优化用于在宿主细胞中表达)和完全密码子优化的序列。还应该理解的是，编码本公开的抗体和抗原结合片段的多核苷酸可以具有不同核苷酸序列，同时归因于例如遗传密码的简并、剪接等而仍编码相同抗体或抗原结合片段。应当理解，编码抗体或抗原结合片段的多核苷酸可以包括在包括其它序列和/或特征的多核苷酸中，例如用于在宿主细胞中表达抗体或抗原结合片段。示例性特征包括启动子序列、聚腺苷酸化序列、编码信号肽的序列(例如，定位于表达的抗体重链或轻链的n端处)等。
[0125]
多核苷酸可以包括或包含在载体中。载体可以包括本文公开的载体中的任一者或多者。载体可以包括例如，编码抗体或抗原结合片段或其部分的dna质粒构建体(例如，所谓
的“dmab”；参见例如muthumani等人,《传染病杂志(j infect dis.)》214(3):369-378(2016)；muthumani等人,《人类疫苗和免疫疗法(hum vaccin immunother)》9:2253-2262(2013))；flingai等人,《科学报告(sci rep.)》5:12616(2015)；以及elliott等人,《npj疫苗(npj vaccines)》18(2017)，所述抗体编码dna构建体和相关的使用方法，包括其施用，通过引用并入本文)。dna质粒构建体可以包括编码抗体或抗原结合片段的重链和轻链(或vh和vl)的单个开放阅读框，其中编码重链的序列和编码轻链的序列任选地由编码蛋白酶切割位点的多核苷酸和/或由编码自切割肽的多核苷酸分开。抗体或抗原结合片段的取代组分可以包括在单个质粒中的多核苷酸编码。可替代地，抗体或抗原结合片段的取代组分可以由包括在两个或更多个质粒中的多核苷酸(例如，第一质粒包括编码重链、vh或vh+ch的多核苷酸，并且第二质粒包括编码同源轻链、vl或vl+cl的多核苷酸)编码。单个质粒可以包括编码来自本公开的两种或更多种抗体或抗原结合片段的重链和/或轻链的多核苷酸。示例性表达载体是可从获得的pvax1。本公开的dna质粒可以通过例如电穿孔(例如，肌内电穿孔)或用适当调配物(例如，透明质酸酶)递送到受试者。载体可以包括编码信号肽的核苷酸序列。信号肽可以存在或可以不存在于(例如，可以从其酶促切割)成熟抗体或抗原结合片段上。编码信号肽的核酸序列包括seq id no:252或seq id no:263中所示的核苷酸序列。信号肽可以包括seq id no:256或seq id no:264所示的氨基酸序列或由其组成。载体可以包括聚腺苷酸化信号序列。聚腺苷酸化信号序列的实例包括如seq id no:253中所示的核苷酸序列或由其组成。
[0126]
载体可以包括cmv启动子(例如，包括如seq id no:251中所示的核苷酸序列或由其组成)。
[0127]
可以用于表达当前公开的抗原或抗原结合片段细胞的宿主细胞的实例包括但不限于真核细胞，例如酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞；以及原核细胞，包括大肠杆菌(e.coli)。在一些实施例中，细胞是哺乳动物细胞。细胞包括哺乳动物细胞系，如cho细胞(例如，dhfr-cho细胞(urlaub等人,《美国国家科学院院刊(pnas)》77:4216(1980))、人胚肾细胞(例如，hek293t细胞)、per.c6细胞、y0细胞、sp2/0细胞。ns0细胞、人肝细胞，例如hepa rg细胞、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。哺乳动物宿主细胞系的其它实例包括小鼠支持细胞(例如，tm4细胞)；由sv40(cos-7)转化的猴肾cv1系；幼仓鼠肾细胞(bhk)；非洲绿猴肾细胞(vero-76)；猴肾细胞(cv1)；人宫颈癌细胞(hela)；人肺细胞(w138)；人肝细胞(hep g2)；犬肾细胞(mdck)；布法罗大鼠肝细胞(brl 3a)；小鼠乳腺肿瘤(mmt 060562)；tri细胞；mrc 5细胞；和fs4细胞。适用于抗体产生的哺乳动物宿主细胞系还包括在例如yazaki和wu,《分子生物学方法(methods in molecular biology)》,第248卷(b.k.c.lo编辑，新泽西州托托瓦的胡玛纳出版社(humana press,totowa,n.j.),第255-268页(2003))中描述的哺乳动物宿主细胞系。
[0128]
宿主细胞还包括原核细胞，如大肠杆菌。肽在如大肠杆菌等原核细胞中的表达是公认的(参见例如pluckthun,a.《生物/技术(bio/technology)》9:545-551(1991))。例如，抗体可以在细菌中产生，具体地在不需要糖基化和fc效应子功能时。对于抗体片段和多肽在细菌中的表达，参见例如，美国专利第5,648,237号；第5,789,199号和第5,840,523号。可以用根据本说明书的载体与表达载体转染细胞。术语“转染”是指将核酸分子如dna或rna(例如，mrna)分子引入到如真核细胞等细胞中。在本说明书的上下文中，术语“转染”涵盖技
术人员已知的用于将核酸分子引入到细胞(如真核细胞，包括哺乳动物细胞)中的任何方法。此类方法涵盖例如电穿孔、脂转染(例如，基于阳离子脂质和/或脂质体)、磷酸钙沉淀、基于纳米颗粒的转染、基于病毒的转染或基于阳离子聚合物(如deae-葡聚糖或聚乙烯亚胺等)的转染。在某些实施例中，引入是非病毒的。
[0129]
此外，可以用载体稳定或瞬时转染宿主细胞，例如，用于表达抗体或其抗原结合片段。可以用载体稳定转染细胞。可替代地，可以用编码抗体或抗原结合片段的载体瞬时转染细胞。
[0130]
抗体或抗原结合片段(或编码所述抗体或抗原结合片段的多核苷酸)对于宿主细胞可以是异源的。例如，细胞可以属于与完全或部分获得抗体的物种不同的物种(例如，表达人抗体或经工程化的人抗体的cho细胞)。宿主细胞的细胞类型可以在自然界中不表达抗体或抗原结合片段。此外，宿主细胞可以对不存在于抗体或抗原结合片段的天然状态(或不存在于工程化或衍生抗体或抗原结合片段的亲本抗体的天然状态)的抗体或抗原结合片段赋予翻译后修饰(ptm；例如糖基化或岩藻糖基化)。此类ptm可能引起功能差异(例如，降低的免疫原性)。因此，由如本文公开的宿主细胞产生的本公开的抗体或抗原结合片段可以包括一种或多种翻译后修饰，其不同于呈原生状态的抗体(或亲本抗体)(例如，由cho细胞产生的人抗体可以包括一种或多种翻译后修饰，其不同于从人分离和/或由原生人b细胞或浆细胞产生的抗体)。
[0131]
可用于表达本公开的结合蛋白的昆虫细胞是本领域已知的，并且包括例如草地贪夜蛾sf9细胞(spodoptera frugipera sf9 cell)、粉纹夜蛾bti-tn5b1-4细胞(trichoplusia ni bti-tn5b1-4 cell)和草地贪夜蛾sfswt01“mimic
tm”细胞(spodoptera frugipera sfswt01“mimic
tm”cell)。参见例如palmberger等人,《生物技术杂志(j.biotechnol.)》153(3-4):160-166(2011)。已鉴定出许多杆状病毒株，所述杆状病毒株可以与昆虫细胞结合使用，具体地是用于草地贪夜蛾细胞的转染。
[0132]
真核微生物(如丝状真菌或酵母)也是用于克隆或表达蛋白质编码载体的合适宿主，并且包括具有“人源化”糖基化路径的真菌和酵母菌株，从而产生具有部分或完全人糖基化型态的抗体。参见gerngross,《自然生物技术(nat.biotech.)》22:1409-1414(2004)；li等人,《自然生物技术》24:210-215(2006)。
[0133]
植物细胞也可以用作表达本公开的结合蛋白的宿主。例如，plantibodiestm技术(在例如美国专利第5,959,177号；第6,040,498号；第6,420,548号；第7,125,978号和第6,417,429号中描述)采用转基因植物来产生抗体。
[0134]
哺乳动物宿主细胞包括例如cho细胞、hek293细胞、per.c6细胞、y0细胞、sp2/0细胞、ns0细胞、人肝细胞、骨髓瘤细胞或杂交瘤细胞。
[0135]
用于产生抗体或抗原结合片段的方法可以包括在足以产生抗体或抗原结合片段的条件下培养宿主细胞，并且持续足以产生抗体或抗原结合片段的时间。举例来说，适用于分离和纯化重组产生的抗体的方法可以包括从将重组抗体分泌到培养基中的合适宿主细胞/载体系统获得上清液，并且随后使用可商购获得的过滤器浓缩培养基。在浓缩之后，可以将浓缩物施加到单个合适纯化基质或一系列合适基质，如亲和基质或离子交换树脂。可以采用一个或多个反相hplc步骤来进一步纯化重组多肽。当将免疫原从其天然环境中分离时，也可以采用这些纯化方法。用于大规模产生本文所描述的一种或多种分离/重组抗体的
方法包括分批细胞培养，所述分批细胞培养被监测和控制以维持适当培养条件。可溶性抗体的纯化可以根据本文所描述和本领域中已知，并且符合国内外管理机构的法律和指南的方法进行。
[0136]
药物组合物
[0137]
本文还提供了组合物，所述组合物包含当前公开的抗体或抗原结合片段中的任一者或多者，并且可以进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。本文中进一步详细地论述载体、赋形剂和稀释剂。
[0138]
在某些实施例中，组合物包含两种或更多种不同的根据本公开的抗体或抗原结合片段。在某些实施例中，用于组合中的抗体或抗原结合片段各自独立地具有以下特性中的一种或多种：中和天然存在的sars-cov-2变体；不相互竞争与刺突蛋白结合；与不同刺突蛋白表位结合；对sars-cov-2具有减少的抗性形成；当在组合中时，具有减少的对sars-cov-2的抗性形成；有效中和活sars-cov-2病毒；当组合使用时，对活sars-cov-2病毒的中和表现出相加或协同作用；展示效应子功能；在相关的感染动物模型中具有保护性；能够以足够的数量进行大规模生产。
[0139]
在一些实施例中，组合物包含编码抗体或抗原结合片段的多核苷酸或载体。在某些实施例中，组合物包含第一载体和第二载体，所述第一载体包括第一质粒，所述第二载体包括第二质粒，其中第一质粒包括编码重链、vh或vh+ch的多核苷酸，并且第二质粒包括编码抗体或其抗原结合片段的同源轻链、vl或vl+cl的多核苷酸。在某些实施例中，组合物包含与合适递送媒剂或载体偶联的多核苷酸(例如，mrna)。用于向人受试者施用的示例性媒剂或载体包括脂质或脂质衍生的递送媒剂，如脂质体、固体脂质纳米颗粒、油性悬浮液、亚微米脂质乳剂、脂质微泡、反脂质胶束、耳蜗脂质体、脂质微管、脂质微圆柱体、或脂质纳米颗粒(lnp)或纳米级平台(参见例如li等人,《威利跨学科评论：纳米医学与纳米生物技术(wilery interdiscip rev.nanomed nanobiotechnol.)》11(2):e1530(2019))。用于设计适当的mrna和调配mrna-lnp并将其递送的原理、试剂和技术描述于例如pardi等人,(《控制释放杂志(j control release)》217345-351(2015))；thess等人,(《分子疗法》23:1456-1464(2015))；thran等人,(《embo分子医学(embo mol med)》9(10):1434-1448(2017)；kose等人,(《科学免疫学(sci.immunol.)》4eaaw6647(2019)；以及sabnis等人,(《分子疗法》26:1509-1519(2018))，这些技术包括封端、密码子优化、核苷修饰、mrna纯化、将mrna并入到稳定的脂质纳米颗粒中(例如，可电离的阳离子脂质/磷脂酰胆碱/胆固醇/peg-脂质；可电离的脂质：二硬脂酰pc；胆固醇；聚乙二醇脂质)，和其皮下、肌内、皮内、静脉内、腹膜内和气管内施用，通过引用并入本文。
[0140]
用途
[0141]
本文还提供了使用本公开的抗体或抗原结合片段或包含所述抗体或抗原结合片段的组合物治疗受试者的方法，其中所述受试者患有sars-cov-2、被认为患有sars-cov-2或有患有sars-cov-2感染的风险，任选地患有covid-19、被认为患有covid-19或有患有covid-19的风险。
[0142]
因此，在某些实施例中，提供了用于治疗受试者的sars-cov-2感染(例如，患有sars-cov-2感染或covid-19或有感染sars-cov-2感染或covid-19的风险)的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用有效量的如本文公开的抗体、抗原结合片段或组合物。
[0143]
通常，可以通过本公开治疗的受试者是人和其它灵长类动物受试者，如用于兽医学目的猴和猿。其它模式生物，如小鼠和大鼠也可以根据本公开治疗。在前述实施例中的任何实施例中，受试者可以是人受试者。受试者可以是男性或女性，并且可以处于任何合适的年龄，包括婴儿、少年、青少年、成人和老年受试者。
[0144]
简要地，根据本公开的某些实施例的药物组合物被调配成允许其中所包含的活性成分在将组合物施用到患者时生物可用。将向受试者或患者施用的组合物可以采取一种或多种剂量单位形式，其中例如，片剂可以是单个剂量单位，并且气雾剂形式的本文所描述的抗体或抗原结合的容器可以保存多个剂量单位。制备此类剂型的实际方法对于本领域的技术人员来说是已知的、或者是显而易见的；例如，参见《雷明顿：药学科学与实践(remington:the science and practice of pharmacy)》,第20版(费城医药科学学院(philadelphia college of pharmacy and science),2000)。在任何情况下，要施用的组合物将包含有效量的本公开的抗体或抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物，以便根据本文中的教导治疗所关注的疾病或病状。
[0145]
组合物可以呈固体或液体形式。在一些实施例中，载体是颗粒状的，使得组合物例如呈片剂或散剂形式。载体可以是液体，其中组合物是例如可用于例如吸入施用的口服油、可注射液体或气雾剂。当旨在用于口服施用时，药物组合物优选地呈固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬浮液和凝胶形式包括在本文视为固体或液体的形式中。
[0146]
作为用于口服施用的固体组合物，药物组合物可以调配成散剂、颗粒、压缩片剂、丸剂、胶囊、口嚼锭、粉片等。此类固体组合物将典型地包含一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。另外，可能存在以下中的一者或多者：如羧甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素、黄蓍胶或明胶等粘合剂；如淀粉、乳糖或糊精等赋形剂；如海藻酸、海藻酸钠、primogel、玉米淀粉等崩解剂；如硬脂酸镁或sterotex等润滑剂；如胶体二氧化硅等助流剂；如蔗糖或糖精等甜味剂；如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味品等调味剂；以及着色剂。当组合物呈胶囊(例如，明胶胶囊)形式时，除以上类型的物质以外，所述组合物还可以包含如聚乙二醇或油等液体载体。
[0147]
组合物可以呈液体形式，例如，酏剂、糖浆、溶液、乳液或悬浮液。作为两个实例，液体可以用于口服施用或用于通过注射递送。当旨在用于口服施用时，除了本发明的化合物之外，优选组合物包含甜味剂、防腐剂、染料/着色剂以及香味增强剂中的一者或多者。在旨在通过注射施用的组合物中，可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂中的一者或多者。
[0148]
液体药物组合物，无论其是溶液、悬浮液还是其它类似形式，都可以包括以下佐剂中的一种或多种：无菌稀释剂，如注射用水、盐水溶液，优选地生理盐水、林格氏溶液(ringer
′
s solution)、等渗氯化钠；固定油，如可以用作溶剂或悬浮介质的合成单甘油酯或二甘油酯、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它溶剂；抗菌剂，如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐、或磷酸盐；以及用于张度调节的药剂，如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可以封装在由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是优选佐剂。可注射药物组合物优选地是无菌的。
[0149]
旨在用于肠胃外或口服施用的液体组合物应包含一定量的如本文公开的抗体或
抗原结合片段，从而将获得合适剂量。典型地，此量为组合物中抗体或抗原结合片段的至少0.01％。当旨在用于口服施用时，此量可以在组合物重量的0.1％与约70％之间变化。某些口服药物组合物包含介于约4％与约75％之间的抗体或抗原结合片段。在某些实施例中，制备根据本发明的药物组合物和制剂，使得在稀释之前，肠胃外剂量单位包括0.01重量％到10重量％的抗体或抗原结合片段。
[0150]
组合物可以旨在用于局部施用，在这种情况下，载体可以适合地包括溶液、乳液、软膏或凝胶基质。例如，基质可以包括以下中的一者或多者：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物油、如水和醇等稀释剂以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可以存在于用于局部施用的组合物中。如果旨在用于经皮施用，则组合物可以包含经皮贴片或离子电渗疗法装置。药物组合物可以旨在以例如栓剂形式用于直肠施用，栓剂将在直肠中融化并且释放药物。用于经直肠施用的组合物可以包括油性基质作为合适的无刺激性赋形剂。此类基质包括但不限于羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
[0151]
组合物可以包含修改固体或液体剂量单位的物理形式的各种材料。例如，组合物可以包含围绕活性成分形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可以选自例如糖、虫胶以及其它肠溶包衣剂。可替代地，活性成分可以包裹在明胶胶囊中。固体或液体形式的组合物可以包含与本公开的抗体或抗原结合片段结合并且由此帮助递送化合物的试剂。可以起这一作用的合适试剂包括单克隆或多克隆抗体、一种或多种蛋白质或脂质体。组合物可以基本上由可以以气雾剂形式施用的剂量单位组成。术语气雾剂用于表示范围从胶体性质的系统到由加压包装组成的系统的各种系统。递送可以通过液化或压缩气体或通过分配活性成分的合适泵系统进行。气雾剂可以单相、双相或三相系统递送，以便递送活性成分。气雾剂的递送包括必要的容器、活化剂、阀门、子容器等，这些可以一起形成试剂盒。本领域的普通技术人员无需过多的实验就可以确定优选的气溶胶。
[0152]
应当理解，本公开的组合物还涵盖如本文所描述的多核苷酸的载体分子(例如，脂质纳米颗粒、纳米级递送平台等)。
[0153]
药物组合物可以通过制药领域熟知的方法制备。例如，可以通过将包含如本文所描述的抗体、其抗原结合片段或抗体缀合物和任选地盐、缓冲液和/或稳定剂中的一者或多者的组合物与无菌蒸馏水组合从而形成溶液，来制备旨在通过注射施用的组合物。可以添加表面活性剂以促进形成均匀溶液或悬浮液。表面活性剂是与肽组合物非共价相互作用以便促进抗体或其抗原结合片段在水性递送系统中的溶解或均匀悬浮的化合物。
[0154]
通常，适当剂量和治疗方案提供足以提供治疗和/或防治益处(如本文所描述的，包括改良临床结果(例如，腹泻或相关脱水或发炎的频率降低、持续时间缩短或严重程度降低，或无疾病存活期和/或总存活期更长，或症状严重程度减轻)的量的组合物。对于防治用途，剂量应足以预防与疾病或病症相关的疾病、延迟其发病或减轻其严重程度。根据本文所描述的方法施用的组合物的防治益处可以通过进行临床前(包括体外和体内动物研究)和临床研究并通过适当的统计学、生物学和临床方法和技术分析从中获得的数据来确定，所有这些都可以由本领域技术人员容易地实践。
[0155]
组合物以有效量施用(例如，以治疗sars-cov-2感染)，所述有效量将根据多种因素而变化，包括所采用的特定化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用时间长度；受试者的年龄、体重、总体健康、性别和饮食；施用模式和时间；排泄率；药物组合；特定病症或病状
的严重程度；以及经受疗法的受试者。在某些实施例中，在施用根据本公开的调配物和方法的疗法后，与安慰剂治疗的或其它合适的对照受试者相比，测试受试者将表现出与所治疗的疾病或病症相关的一种或多种症状减少约10％至多约99％。
[0156]
一般来说，抗体或抗原结合片段的治疗有效日剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.001mg/kg(即，0.07mg)至约100mg/kg(即，7.0g)；优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约0.01mg/kg(即，0.7mg)至约50mg/kg(即，3.5g)；更优选地，治疗有效剂量(对于70kg哺乳动物)为约1mg/kg(即，70mg)至约25mg/kg(即，1.75g)。对于本公开的多核苷酸、载体、宿主细胞和相关组合物，治疗有效剂量可以不同于抗体或抗原结合片段。
[0157]
在某些实施例中，根据本公开的方法包括以至多100mg、至多150mg、至多200mg、至多250mg、至多300mg、至多350mg、至多400mg、至多450mg或至多500mg的剂量向受试者施用当前公开的抗体或抗原结合片段。在某些实施例中，方法包括以约50mg至约500mg的范围、或以约50mg至约250mg的范围、或以约50mg至100mg的范围、或以约100mg至约500mg的范围、或以约250mg至约500mg的范围的剂量向受试者施用当前公开的抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，方法包括向受试者施用50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg或500mg的抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，方法包括向受试者施用50mg、150mg、250mg或500mg的抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，方法包括向受试者施用500mg的抗体或抗原结合片段。
[0158]
在特定实施例中，抗体或抗原结合片段分别包括seq id no:106、121、108、169、170和171的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。在另外的实施例中，抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括seq id no:113的氨基酸序列，所述vl包括seq id no:168的氨基酸序列。在某些另外的实施例中，抗体或抗原结合片段包括m428l和n434s fc突变和/或g236a、a330l和i332e fc突变。
[0159]
许多标准被认为促成与sars cov-2感染相关的疾病感染、传播、进展和/或重度症状或死亡的高风险。这些标准包括但不限于年龄、职业、总体健康、预先存在的健康状况、与患有sars-cov-2感染或疑似患有sars-cov-2感染或有患有sars-cov-2感染的风险的受试者密切接触以及生活习惯。在一些实施例中，根据本公开治疗的受试者包括一种或多种风险因素。
[0160]
在某些实施例中，根据本公开治疗的人受试者是婴儿、儿童、年轻成人、中年成人或老年人。在某些实施例中，根据本公开治疗的人受试者小于1岁，或是1岁到5岁，或在5岁与125岁之间(例如5岁、10岁、15岁、20岁、25岁、30岁、35岁、40岁、45岁、50岁、55岁、60岁、65岁、70岁、75岁、80岁、85岁、90岁、95岁、100岁、105岁、110岁、115岁或125岁，包括其中或其间的任何和所有年龄)。在某些实施例中，根据本公开治疗的人受试者是0-19岁、20-44岁、45-54岁、55-64岁、65-74岁、75-84岁或85岁或更年长。中年人和尤其老年人被认为处于特定风险下。在特定实施例中，人受试者是45-54岁、55-64岁、65-74岁、75-84岁或85岁或更年长。在一些实施例中，人受试者是男性。在一些实施例中，人受试者是女性。
[0161]
在某些实施例中，根据本公开治疗的人受试者(例如，如处于风险中的受试者或高风险受试者)：是疗养院或长期护理机构的居住者；是临终关怀工作者；是医疗保健提供者或医疗保健工作者；是第一应答者；是诊断患有或疑似患有sars-cov-2感染的受试者的家庭成员或其它密切接触者；是超重或临床肥胖的；是吸烟者或曾经是吸烟者；患有或曾患有
慢性阻塞性肺部疾病(copd)；患有哮喘(例如，患有中度至重度哮喘)；患有自身免疫性疾病或病状(例如，糖尿病)和/或免疫系统受损或耗竭(例如，归因于aids/hiv感染、如血癌等癌症、如化疗等淋巴耗竭疗法、骨髓或器官移植或遗传免疫病状)；患有慢性肝脏疾病；患有心血管疾病；患有肺部或心脏缺陷；工作或以其它方式长时间与其它人紧密接触，如在工厂、装运中心、医院环境等中。
[0162]
在一些实施例中，密切接触者包括以下受试者：(a)在指标诊断前7天内与指标病例一起居住，并且可以包括在如长期护理机构或疗养院等聚集环境中的居住者或工作人员；(b)是医务工作人员、第一应答者或与指标病例接触的其它护理人员；和/或(c)自最后一次暴露于指标病例(与患有sars-cov-2感染的人密切接触)起少于3天。
[0163]
在某些实施例中，根据本公开治疗的受试者已接受针对sars-cov-2的疫苗。在一些实施例中，所述疫苗被确定为无效，例如通过受试者的疫苗后感染或症状，通过临床诊断或科学或监管标准。在某些实施例中，根据本公开治疗的受试者尚未接受针对sars-cov-2的疫苗。在某些实施例中，根据本公开治疗的受试者已接受针对sars-cov-2的康复者血浆疗法、瑞德西韦(remdesivir)或两者。
[0164]
在某些实施例中，治疗以暴露前或暴露期间预防的形式施用。在某些实施例中，向可以处于门诊环境中的患有轻度至中度疾病的受试者施用治疗。在某些实施例中，向患有中度至重度疾病，如需要住院的受试者施用治疗。重度疾病的后遗症可以包括：呼吸衰竭；导致肺栓塞和中风的血栓栓塞性疾病；心律失常；休克；或其任何组合。在某些实施例中，重度covid-19包括：(i)血氧不足(在室内空气中的o2饱和度≤93％或pao2/fio2《300)，所述血氧不足需要氧气补充超过1天；或(ii)所述受试者需要≥4升/分钟氧气补充或等效物。
[0165]
在一些实施例中，其中受试者患有危重covid-19或有进展到危重covid-19的风险。与重度疾病相比，危重疾病通常包括死亡风险增加。在一些实施例中，危重covid-19包括：呼吸衰竭；休克；以及多器官功能障碍/衰竭，所述呼吸衰竭需要以下中的至少一者：侵入性机械通气和ecmo。
[0166]
在某些实施例中，受试者因covid-19而住院，这例如可以包括进入或转移到重症监护室(icu)。
[0167]
在当前公开的实施例中的任何实施例中，其中所述受试者患有sars-cov-2感染；患有轻度至中度covid-19；正在经历以下中的任何一种或多种：发烧；咳嗽；疲乏；呼吸短促或呼吸困难；肌肉酸痛；发冷；咽喉痛；流鼻涕；头痛；胸痛；味觉和/或嗅觉丧失；和红眼病(结膜炎)；不适；和异常影像；通过临床评估或影像发现有下呼吸道疾病证据且在海平面在室内空气中的氧气饱和度(sao2)大于(》)百分之93(％)；具有阳性sars-cov-2病毒测试结果；和/或有进展到重度covid-19和/或住院的高风险，例如人类受试者：(1)年龄为65岁或以上(≥65)；体重指数(bmi)为35或更高(≥35)；患有慢性肾脏疾病；患有糖尿病；(5)患有免疫抑制性疾病；正在接受免疫抑制性治疗；年龄为55岁或以上(≥55)并且患有心血管疾病、高血压、慢性阻塞性肺部疾病或其它慢性呼吸道疾病；和/或年龄为12至17岁并且针对所述受试者的年龄和性别bmi≥85％，或患有镰状细胞疾病、先天性或后天性心脏病、神经发育病症(例如，脑瘫)、医学相关的技术依赖性(例如，气管切开术、胃造口术或与covid-19无关的正压通气)、或哮喘、反应性气道或其它需要每日用药物控制的慢性呼吸道疾病；最近已被诊断为患有covid-19(例如，在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11
天、12天、13天或14天内)和/或在症状发作10天内；或患有或正在经历前述疾病的任何组合。
[0168]
在一些实施例中，接受疗法的受试者的年龄为18岁或以上。在一些实施例中，接受疗法的受试者的年龄为55岁或以下，条件是所述受试者的年龄为18岁或以上。在一些实施例中，受试者患有通过阳性聚合酶链式反应(pcr；例如，rt-pcr测试；例如对任何类型的呼吸道样品进行的测试)确定的实验室确诊的covid-19感染。在一些实施例中，受试者在室内空气(ra)中的外周毛细血管血氧气饱和度(spo2)》94％，所述受试者已经历covid-19的一种或多种症状持续≤120小时(5天)。在一些实施例中，接受根据本公开的疗法的受试者正在接受或已接受瑞德西韦、地塞米松(dexamethasone)、托珠单抗(tocilizumab)或其任何组合。在当前公开的实施例中的任何实施例中，所述方法可以包括向受试者施用单剂量的抗体、抗原结合片段或组合物。
[0169]
因此，施用当前公开的组合物的典型途径包括但不限于口服、局部、经皮、吸入、肠胃外、舌下、经颊、直肠、阴道和鼻内。如本文所使用的，术语“肠胃外”包括皮下注射、静脉内注射、肌内注射、胸骨内注射或输注技术。在某些实施例中，施用包括通过选自以下的途径施用：口服、静脉内、肠胃外、胃内、胸膜内、肺内、直肠内、皮内、腹膜内、瘤内、皮下、局部、经皮、脑池内、鞘内、鼻内和肌内。在特定实施例中，方法包括向受试者口服施用抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物。
[0170]
在优选的实施例中，方法包括向受试者静脉内或肌内施用抗体、抗原结合片段或组合物。
[0171]
在一些实施例中，所述受试者：(i)年龄为18至49岁；(ii)年龄为18岁或以上；(iii)患有轻度至中度covid-19；(iv)患有重度covid-19；(v)患有重度至危重covid-19；(vi)自症状发作以来，已有少于七天或5天或更少天；(vii)自症状发作以来，已有七天或更多天；
[0172]
(viii)已具有阳性逆转录酶-聚合酶链式反应或抗原sars-cov-2测试结果；(ix)年龄为55岁或以上；(x)患有以下中的一种或多种：需要药物的糖尿病、肥胖症(体重指数》30kg/m2)、慢性肾脏疾病(所估计的肾小球滤过率《60毫升/分钟/1.73m2)、充血性心力衰竭(纽约心脏协会ii级或更高级)、慢性阻塞性肺部疾病(慢性支气管炎病史、慢性阻塞性肺病病史或肺气肿伴强体力活动呼吸困难病史)以及中度至重度哮喘(受试者需要吸入性类固醇来控制症状或在过去一年中已开出一个疗程的口服类固醇)；或(xi)(i)至(x)的任何组合。
[0173]
如本文进一步讨论的，施用可以包括例如静脉内施用或肌内施用。在一些实施例中，在30分钟、60分钟或90分钟的过程中，向受试者静脉内施用单剂量的抗体或抗原结合片段。
[0174]
在某些实施例中，方法包括向受试者施用2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物。
[0175]
在某些实施例中，方法包括向所述受试者施用多次抗体、抗原结合片段或组合物，其中第二施用或后续施用分别是在第一施用或先前施用后约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约24小时、约48小时、约74小时、约96小时或更长时间进行的。
[0176]
在某些实施例中，方法包括在受试者感染sars-cov-2之前施用至少一次抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物。
[0177]
在某些实施例中，接受治疗的受试者的年龄为18岁或以上且患有实验室确诊的(例如，通过pcr测试)sars-cov-2感染。
[0178]
在一些实施例中，所述受试者的临床状态为4级(住院、通过面罩或鼻塞供氧)、5级(住院、非侵入性通气或高流量氧气)、6级(住院、插管和机械通气)或7级(通气和额外的器官支持-加压药、肾替代疗法(rrt)、体外膜肺氧合(ecmo))，如根据who临床严重程度评分9分序数量表定义的。
[0179]
在一些实施例中，受试者患有轻度至中度covid-19。在一些实施例中，受试者有进展到重度covid-19的风险。在一些实施例中，在向受试者施用抗体、抗原结合片段或组合物后，所述受试者因covid-19而住院的风险降低。在某些实施例中，在向受试者施用抗体、抗原结合片段或组合物后，因covid-19而住院的风险降低10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多、70％或更多、80％或更多或85％或更多。
[0180]
在一些实施例中，受试者患有重度covid-19或有进展到重度covid-19的风险，其中任选地，重度covid-19包括：(i)血氧不足(在室内空气中的o2饱和度≤93％或pao2/fio2《300)，所述血氧不足需要氧气补充超过1天；或(ii)受试者需要≥4升/分钟氧气补充或等效物。
[0181]
在一些实施例中，受试者患有危重covid-19或有进展到危重covid-19的风险，其中任选地，危重covid-19包括：呼吸衰竭；休克；以及多器官功能障碍/衰竭，所述呼吸衰竭需要以下中的至少一者：侵入性机械通气和ecmo。
[0182]
在一些实施例中，受试者自症状发作以来有少于七天。在其它实施例中，受试者自症状发作以来有七天或更长时间。
[0183]
在一些实施例中，所述受试者是(i)至(iii)中的任一者或多者：(i)18岁或以上并且具有阳性sars-cov-2测试结果(通过任何验证测试，例如，对任何样本类型进行的rt-pcr)；(ii)(1)因重度covid-19疾病而住院，而定义为符合4级或5级疾病的需要补充氧气或非侵入性通气，或(2)因危重covid-19疾病而住院，定义为需要机械通气的疾病(6级或7级疾病)；(iii)男性或女性，其中任选地所述女性是(1)无生育能力(woncbp)的妇女或(2)是具有生育能力的妇女(wocbp)并且使用避孕方法。
[0184]
在当前公开的任何实施例中，所述方法可以包括向受试者施用500mg的抗体或抗原结合片段。
[0185]
在当前公开的任何实施例中，受试者可能曾与或已与确诊的sars-cov-2感染者密切接触。
[0186]
在当前公开的任何实施例中，治疗可以包括预防sars-cov-2感染和/或预防covid-19。在当前公开的任何实施例中，治疗可以包括预防受试者的covid-19的进展。在当前公开的任何实施例中，治疗可以包括预防有症状的covid-19的感染和/或传播。在当前公开的任何实施例中，治疗可以包括预防无症状的covid-19的感染和/或传播。在当前公开的任何实施例中，受试者可能有感染covid-19或使covid-19进展的风险。
[0187]
在当前公开的任何实施例中，治疗可以包括预防或减少：(1)一种或多种选自以下的急性呼吸道症状：咳嗽；痰液产生；咽喉痛；以及呼吸短促；或(2)高于38℃的发烧；(3)以
下症状中的两种或更多种症状：疲乏；肌痛/关节痛；发冷；恶心/呕吐；腹泻；以及嗅觉丧失/味觉障碍。
[0188]
在当前公开的任何实施例中，治疗可以包括预防或减少以下症状中的一种或多种症状：高于38℃的发烧；发冷；咳嗽；咽喉痛；不适；头痛；肌痛；嗅觉或味觉发生变化；鼻塞/鼻液溢；呕吐；腹泻；劳力性呼吸短促。
[0189]
在当前公开的任何实施例中，受试者可以是成人。
[0190]
在当前公开的任何实施例中，受试者的年龄可以为18岁或以上，或者年龄可以为19岁或以上。在当前公开的任何实施例中，受试者的年龄可以为55岁，或者年龄为65岁，或者更年长。
[0191]
在当前公开的任何实施例中，施用抗体、抗原结合片段或组合物可以包括静脉内输注。在当前公开的任何实施例中，施用抗体、抗原结合片段或组合物可以包括肌内注射。
[0192]
在当前公开的任何实施例中，所述方法可以包括向受试者施用250mg的抗体或抗原结合片段。在当前公开的任何实施例中，所述方法可以包括向受试者施用500mg的抗体或抗原结合片段。
[0193]
在当前公开的任何实施例中，受试者可能患有轻度至中度sars-2-cov感染(例如，患有轻度至中度covid-19)，并且任选地有进展到重度疾病的风险。
[0194]
在当前公开的任何实施例中，所述受试者：(i)年龄可以为12岁或以上；并且(ii)在施用所述组合物之前少于三天，最后一次与确诊的sars-cov-2感染者接触。
[0195]
在当前公开的任何实施例中，受试者患有轻度至中度covid-19，并且所述方法包括向受试者肌内施用单剂量的抗体、抗原结合片段或组合物。
[0196]
在当前公开的任何实施例中，所述单剂量包括250mg的抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，根据治疗方法的单剂量包括500mg的抗体或抗原结合片段。
[0197]
在一些实施例中：(i)(i)(a)所述受试者的年龄为12岁或以上并且有covid-19进展的高风险，或(i)(b)所述受试者的年龄为65岁或以上；和/或(ii)所述受试者具有阳性sars-cov-2测试结果(例如，通过pcr测试)，在室内空气中的氧气饱和度≥94％，具有covid-19症状，并且自症状发作以来有少于或等于7天。
[0198]
在当前公开的任何实施例中：(i)(i)(a)所述受试者的年龄可以为12岁或以上并且有covid-19进展的高风险，或(i)(b)所述受试者的年龄可以为65岁或以上；并且(ii)所述受试者可以具有阳性sars-cov-2测试结果(例如，通过pcr测试)，在室内空气中的氧气饱和度≥94％，具有covid-19症状，并且自症状发作以来有少于或等于7天。
[0199]
在当前公开的任何实施例中，所述受试者未住院并且有(i)住院和/或(ii)covid-19进展的风险。
[0200]
在当前公开的任何实施例中，所述受试者：(1)年龄可以为12岁或以上，并且任选地有covid-19进展的高风险；和/或(2)年龄可以为65岁或以上。在当前公开的任何实施例中，所述受试者可以曾具有阳性sars-cov-2测试结果，在室内空气中的氧气饱和度≥94％，具有covid-19症状，并且自症状发作以来有少于或等于7天。
[0201]
在当前公开的任何实施例中，抗体或抗原结合片段是从用编码所述抗体或抗原结合片段的多核苷酸稳定转染的非克隆细胞池获得的。在当前公开的任何实施例中，抗体或抗原结合片段是从克隆主细胞库获得的。主细胞库(mcb)由原始抗体/抗原结合片段产生细
胞系产生。通常将mcb冷冻保存在多个小瓶中以通过消除在制造过程中细胞系传代或处理的总次数来防止遗传变异和潜在污染。优选地对mcb的污染物，如细菌、真菌和支原体进行测试；这些污染物不应该存在于mcb中。
[0202]
在当前公开的任何实施例中，所述受试者：是疗养院或长期护理机构的居住者；是临终关怀工作者；是医疗保健提供者或医疗保健工作者；是第一应答者；是诊断患有或疑似患有sars-cov-2感染的受试者的家庭成员或其它密切接触者；是超重或临床肥胖的；是吸烟者或曾经是吸烟者；患有或曾患有慢性阻塞性肺部疾病(copd)；患有哮喘(例如，患有中度至重度哮喘)；患有自身免疫性疾病或病状(例如，糖尿病)；免疫系统受损或耗竭(例如，归因于aids/hiv感染、如血癌等癌症、如化疗等淋巴耗竭疗法、骨髓或器官移植或遗传免疫病状)；患有慢性肝脏疾病；患有心血管疾病；和/或具有肺部或心脏缺陷；和/或工作或以其它方式长时间与其它人密切接触，如在工厂、装运中心、医院环境等中。在当前公开的任何实施例中，所述受试者已接受针对sars-cov-2的疫苗，并且所述疫苗被确定为无效，例如通过所述受试者的疫苗后感染或症状，通过临床诊断或科学或监管标准。在当前公开的任何实施例中，所述受试者尚未接受针对sars-cov-2的疫苗。
[0203]
在当前公开的任何实施例中，所述受试者已接受针对sars-cov-2的康复者血浆疗法、瑞德西韦或两者。在当前公开的任何实施例中，治疗包括暴露前或暴露期间预防。在当前公开的任何实施例中，治疗施用于患有轻度至中度疾病的所述受试者，任选地在门诊环境中。在当前公开的任何实施例中，治疗施用于患有中度至重度疾病，如需要住院的受试者。在当前公开的任何实施例中，所述受试者因covid-19而住院。
[0204]
在当前公开的任何实施例中，所述受试者患有sars-cov-2感染；患有轻度至中度covid-19；正在经历以下中的任何一种或多种：发烧；咳嗽；疲乏；呼吸短促或呼吸困难；肌肉酸痛；发冷；咽喉痛；流鼻涕；头痛；胸痛；味觉和/或嗅觉丧失；和红眼病(结膜炎)；不适；和异常影像；通过临床评估或影像发现有下呼吸道疾病证据且在海平面在室内空气中的氧气饱和度(sao2)大于(》)百分之93(％)；具有阳性sars-cov-2病毒测试结果；和/或有进展到重度covid-19和/或住院的高风险，例如人类受试者：(1)年龄为65岁或以上(≥65)；体重指数(bmi)为35或更高(≥35)；患有慢性肾脏疾病；患有糖尿病；(5)患有免疫抑制性疾病；正在接受免疫抑制性治疗；年龄为55岁或以上(≥55)并且患有心血管疾病、高血压、慢性阻塞性肺部疾病或其它慢性呼吸道疾病；和/或年龄为12至17岁并且针对所述受试者的年龄和性别bmi≥85％，或患有镰状细胞疾病、先天性或后天性心脏病、神经发育病症(例如，脑瘫)、医学相关的技术依赖性(例如，气管切开术、胃造口术或与covid-19无关的正压通气)、或哮喘、反应性气道或其它需要每日用药物控制的慢性呼吸道疾病；最近已被诊断为患有covid-19(例如，在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天或14天内)和/或在症状发作10天内；或患有或正在经历前述疾病的任何组合。
[0205]
在当前公开的任何实施例中，所述受试者的年龄为(a)18岁或以上，或(b)55岁或以下，条件是所述受试者的年龄为18岁或以上。在当前公开的任何实施例中，所述受试者患有通过阳性聚合酶链式反应(pcr；例如，rt-pcr测试；例如对任何类型的呼吸道样品进行的测试)确定的实验室确诊的covid-19感染。在当前公开的任何实施例中，所述受试者在室内空气(ra)中的外周毛细血管血氧气饱和度(spo2)》94％，并且已经历covid-19的一种或多种症状持续≤120小时(5天)。在当前公开的任何实施例中，所述受试者进一步接受或已接
受瑞德西韦、补充氧气、通气疗法、呼吸疗法、地塞米松、托珠单抗或其任何组合。
[0206]
在一些实施例中，以下中的一者或多者不适用于接受根据本公开的疗法的受试者：将阻止接受肌内注射的任何病状，如凝血病症、出血素质或血小板减少症；已知对存在于抗体组合物中的任何成分的过敏反应或超敏反应；先前对单克隆抗体的过敏性反应或超敏反应；先前接受过covid-19疫苗；先前接受过来自covid-19存活者的sars-cov-2超免疫静脉内免疫球蛋白(hivig)；先前接受过来自恢复的covid-19患者的康复者血浆或抗sars-cov-2mab；处于孕妇或哺乳期女性；丙氨酸氨基转移酶(alt)和/或天冬氨酸氨基转移酶(ast)》正常上限(uln)的5倍；4期重度慢性肾脏疾病或需要透析(即，所估计肾小球滤过率《30毫升/分钟/1.73m2)；具有与重度covid-19一致的症状，定义为休息时呼吸短促或呼吸窘迫或需要补充氧气；免疫功能受损严重的参与者，包括但不限于接受免疫抑制性化疗或免疫疗法的癌症患者、在过去3个月内接受过实体器官移植或同种异体干细胞移植的那些患者、心脏或肺移植的任何病史或高剂量长期全身性皮质类固醇(相当于每天≥20mg泼尼松(prednisone)或全身性等效物，持续超超过2周)；患有糖尿病(需要药物治疗)、慢性肾脏疾病(即，egfr《60，如通过肾脏疾病饮食调整(mdrd)研究确定的)、慢性肝脏疾病(例如，肝硬化)、充血性心力衰竭(纽约心脏协会(nyha)ii级或更高级)、慢性阻塞性肺部疾病(慢性支气管炎病史、慢性阻塞性肺病病史或肺气肿伴强体力活动呼吸困难病史)以及中度至重度哮喘(参与者需要吸入性类固醇来控制症状或在过去一年中已开出一个疗程的口服类固醇)；先前对单克隆抗体的过敏反应或超敏反应；终末器官功能障碍，如a.中风；b.脑膜炎；c.脑炎；d.脊髓炎；e.心肌梗塞；f.心肌炎；g.心包炎；h.有症状的充血性心力衰竭(纽约心脏协会[nyha]iii-iv级)；i.动脉或深静脉血栓形成或肺栓塞；终末器官衰竭类别，例如a.需要高流量氧气、非侵入性通气或有创机械通气；b.体外膜肺氧合(ecmo)；c.机械循环支持(例如，主动脉内球囊泵、心室辅助装置)；d.血管加压药疗法；e.在此入院期间开始肾脏替代疗法(rrt)(即，不是患有慢性rrt的患者)；中风；脑膜炎；脑炎；脊髓炎；心肌缺血；心肌炎；心包炎；有症状的充血性心力衰竭；动脉或深静脉血栓形成或肺栓塞；以及当前或即将需要侵入性机械通气、ecmo(体外膜肺氧合)、机械循环支持、血管加压药疗法或在入院时开始肾脏替代疗法(即，不是进行慢性肾脏替代疗法的患者)。
[0207]
包含本公开的抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物的组合物也可以在施用一种或多种其它治疗剂的同时、之前或之后施用。此类组合疗法可以包括施用包含本发明的化合物和一种或多种额外的活性剂的单个药物剂量调配物，以及施用包括呈自身独立剂量调配物的本公开的抗体或抗原结合片段和每种活性剂的组合物。例如，如本文所描述的抗体或其抗原结合片段和其它活性剂可以以单个口服剂量组合物(如片剂或胶囊)向患者一起施用，或每种药剂以独立口服剂量调配物施用。类似地，如本文所描述的抗体或抗原结合片段和其它活性剂可以以单个肠胃外剂量组合物(如在生理盐水溶液或其它生理学上可接受的溶液中)向受试者一起施用，或每种药剂以独立肠胃外剂量调配物施用。当使用独立剂量调配物时，包含抗体或抗原结合片段和一种或多种额外的活性剂的组合物可以基本上在同一时间(即，同时)施用或在交错时间分别(即，依序和以任何次序)施用；组合疗法应理解为包括所有这些方案。
[0208]
在某些实施例中，提供了一种组合疗法，所述组合疗法包括一种或多种本公开的抗sars-cov-2抗体(或一种或多种核酸、宿主细胞、载体或组合物)和一种或多种抗炎剂和/
或一种或多种抗病毒剂。在特定实施例中，所述一种或多种抗炎剂包括皮质类固醇，例如地塞米松、泼尼松等。在一些实施例中，所述一种或多种抗炎剂包括细胞因子拮抗剂，例如，与il6结合的抗体(如司妥昔单抗(siltuximab))或与il-6r结合的抗体(如托珠单抗)，或与il-1β、il-7、il-8、il-9、il-10、fgf、g-csf、gm-csf、ifn-γ、ip-10、mcp-1、mip-1a、mip1-b、pdgr、tnf-α或vegf结合的抗体。在一些实施例中，使用抗炎剂，如鲁索替尼(ruxolitinib)和/或阿那白滞素(anakinra)。在一些实施例中，所述一种或多种抗病毒剂包括核苷酸类似物或核苷酸类似物前药，例如，瑞德西韦、索非布韦(sofosbuvir)、阿昔洛韦(acyclovir)和齐多夫定(zidovudine)。在特定实施例中，抗病毒剂包括洛匹那韦(lopinavir)、利托那韦(ritonavir)、法匹拉韦(favipiravir)、乐昂立单抗(leronlimab)或其任何组合。用于本公开的组合疗法的其它抗炎剂包括非甾体抗炎药(nsaids)。应当理解，在此类组合疗法中，所述一种或多种抗体(或一种或多种核酸、宿主细胞、载体或组合物)和所述一种或多种抗炎剂和/或所述一种或多种抗病毒剂可以以任何次序和任何顺序施用，或者一起施用。
[0209]
在一些实施例中，向先前已接受一种或多种抗炎剂和/或一种或多种抗病毒剂的受试者施用抗体(或一种或多种核酸、宿主细胞、载体或组合物)。在一些实施例中，向先前已接受抗体(或一种或多种核酸、宿主细胞、载体或组合物)的受试者施用一种或多种抗炎剂和/或一种或多种抗病毒剂。
[0210]
在某些实施例中，提供了一种组合疗法，所述组合疗法包括两种或更多种本公开的抗sars-cov-2抗体。方法可以包括向已接受第二抗体的受试者施用第一抗体，或者可以包括一起施用两种或更多种抗体。例如，在特定实施例中，提供了一种方法，所述方法包括向受试者施用(a)第一抗体或抗原结合片段，当受试者已接受第二抗体或抗原结合片段时；(b)第二抗体或抗原结合片段，当受试者已接受所述第一抗体或抗原结合片段时；或(c)所述第一抗体或抗原结合片段和所述第二抗体或抗原结合片段。
[0211]
在相关方面，提供了当前公开的抗体、抗原结合片段、载体、宿主细胞和组合物的用途。
[0212]
在某些实施例中，提供了任何当前公开的抗体、抗原结合片段、多核苷酸、载体、宿主细胞或组合物，其用于在治疗受试者的sars-cov-2感染和/或covid-19的方法(例如，当前公开的方法中的任何方法)中使用。
[0213]
在某些实施例中，提供了任何当前公开的抗体、抗原结合片段或组合物，其用于制造或制备用于治疗受试者的sars-cov-2感染和/或covid-19的药物的方法中。
[0214]
本公开还提供以下实施例。
[0215]
实施例1.一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中：(i)所述cdrh1包括根据以下中的任一个的氨基酸序列或由其组成：seq id no:2、56、64、80、88、96、106、156、179、195或240，或者包括所述序列的序列变体或由其组成，所述序列变体包括一个、两个或三个酸取代，所述取代中的一个或多个取代任选地是保守取代和/或种系编码的氨基酸的取代；(ii)所述cdrh2包括根据以下中的任一个的氨基酸序列或由其组成：seq id no:3、16-22、57、65、81、89、97、107、121-126、157、180、197、199或241，或者包括所述序列的序列变体或由其组成，所述序列变体包括一个、两个或三个氨基酸取代，所述取代中的一个或多个取代任选地是保守取代和/或种系编码的氨基酸的取代；(iii)所述cdrh3包括
根据以下中的任一个的氨基酸序列或由其组成：seq id no:4、25、26、58、66、82、90、98、104、108、127、128、158、181、201、203或242，或者包括所述序列的序列变体或由其组成，所述序列变体包括一个、两个或三个氨基酸取代，所述取代中的一个或多个取代任选地是保守取代和/或种系编码的氨基酸的取代；(iv)所述cdrl1包括根据以下中的任一个的氨基酸序列或由其组成：seq id no:6、51-54、60、68、73、74、84、92、100、110、160、169、183、235或244，或者包括所述序列的序列变体或由其组成，所述序列变体包括一个、两个或三个氨基酸取代，所述取代中的一个或多个取代任选地是保守取代和/或种系编码的氨基酸的取代；(v)所述cdrl2包括根据以下中的任一个的氨基酸序列或由其组成：seq id no:7、61、69、85、93、101、111、161、170、184、236或245，或者包括所述序列的序列变体或由其组成，所述序列变体包括一个、两个或三个氨基酸取代，所述取代中的一个或多个取代任选地是保守取代和/或种系编码的氨基酸的取代；和/或(vi)所述cdrl3包括根据以下中的任一个的氨基酸序列或由其组成：seq id no:8、62、70、77、78、86、94、102、112、151-154、162、171、185、237或246，或者包括所述序列的序列变体或由其组成，所述序列变体包括具有一个、两个或三个氨基酸取代，所述取代中的一个或多个取代任选地是保守取代和/或种系编码的氨基酸的取代，其中所述抗体或抗原结合片段能够与在宿主细胞的细胞表面上和/或在病毒粒子上表达的sars-cov-2的表面糖蛋白结合。
[0216]
实施例2.根据实施例1所述的抗体或抗原结合片段，其能够在体外感染模型和/或体内感染动物模型和/或人体内中和sars-cov-2感染。
[0217]
实施例3.根据实施例1至2中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其包括根据以下的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列：seq id no:(i)分别为2-4和6-8或235-237；(ii)分别为2、16-22中的任一个、4和6-8或235-237；(iii)分别为2、3、25-26中的任一个和6-8或235-237；(iv)分别为2-4、51、7或236和8或237；(v)分别为2-4、52、7或236和8或237；(vi)分别为2-4、53、7或236和8或237；(vii)分别为2-5、54、7或236和8或237；(viii)分别为56-58和60-62；(ix)分别为64-66和68-70；(x)分别为64-66、73或74、69和70；(xi)分别为64-66、68、69和77或78；(xii)分别为80-82和84-86；(xiii)分别为88-90和92-94；(xiv)分别为96-98和101-102；(xv)分别为96、97、104和100-102；(xvi)分别为106-108和110-112或167-171；(xvii)分别为106、121-126中的任一个、108和110-112；(xviii)分别为106、107、127或128和110-112；(xix)分别为106-108、110、111和151；(xx)分别为106-108、110、111和152；(xxi)分别为106-108、110、111和153；(xxii)分别为106-108、110、111和154；(xxiii)分别为106-108和169-171；(xxiv)分别为156-158和160-162；(xxv)分别为106、123、127和169-171；(xxvi)分别为2、17、25、6或235、或51-54中的任一个、7或236和8或237；(xxvii)分别为2、20、25、6或235、或51-54中的任一个、7或236和8或237；或(xxviii)分别为179-181和183-185；(xxix)分别为195、180、181和183-185；(xxx)分别为195、197、181和183-185；(xxxi)分别为195、199、181和183-185；(xxxii)分别为195、197、201和183-185；(xxxiii)分别为195、197、203和183-185；(xxxiv)分别为195、199、201和183-185；(xxxv)分别为195、199、203和183-185；(xxxvi)分别是179、180、181和183-185；(xxxvii)分别是179、197、181和183-185；(xxxviii)分别是179、199、181和183-185；(xxxix)分别是179、197、201和183-185；(xxxx)分别是179、197、203和183-185；(xxxxi)分别是179、199、201和183-185；(xxxxii)分别是179、199、203和183-185；(xxxxiii)分别是179、180、201和183-185；
(xxxxiv)分别是179、180、203和183-185；和(xxxxv)分别是240-242和244-246。
[0218]
实施例4.根据实施例1至5中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中：(i)所述vh包括与根据以下中的任一个的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成：seq id no:1、9-15、23、24、27、28-46、55、63、79、87、95、103、105、113-120、129-146、155、172、176-178、194、196、198、200、202和239，其中变异任选地限于一个或多个框架区和/或变异包括一个或多个种系编码的氨基酸的取代；和/或(ii)所述vl包括与根据以下中的任一个的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列或由其组成：seq id no:5、47-50、59、67、71-72、75、76、83、91、99、109、147-150、159、168、182、190、234和243，其中变异任选地限于一个或多个框架区和/或变异包括一个或多个种系编码的氨基酸的取代。
[0219]
实施例5.根据实施例1至6中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述vh包括表1中所示的任何vh氨基酸序列或由其组成，并且其中所述vl包括表1中所示的任何vl氨基酸序列或由其组成，其中任选地，所述vh和所述vl包括根据以下的氨基酸序列或由其组成：seq id no:(i)分别是1和5或234；(ii)分别是9-15中的任一个和5或234；(iii)分别是23或24和5或234；(iv)分别是27和5或234；(v)分别是28-46中的任一个和5或234；(vi)分别是1和47-50中的任一个；(vii)分别是9-15中的任一个和47-50中的任一个；(viii)分别是23或24和47-50中的任一个；(ix)分别是27和47-50中的任一个；(x)分别是28-46中的任一个和47-50中的任一个；(xi)分别是55和59；(xii)分别是63和67；(xiii)分别是63和71或72；(xiv)分别是63和75或76；(xv)分别是79和83；(xvi)分别是87和91；(xvii)分别是95和99；(xviii)分别是103和99；(xiv)分别是105和109或168；(xx)分别是113-120中的任一个和109或168；(xxi)分别是129和109或168；(xxii)分别是130-146中的任一个和109或168；(xxiii)分别是105和147-150中的任一个；(xxiv)分别是113-120中的任一个和147-150中的任一个；(xxv)分别是130-146中的任一个和147-150中的任一个；(xxvi)分别是155和159；(xxvii)分别是172和168；(xxviii)分别是176或177和5或234或47-50中的任一个；(xxix)分别是178和182或190；(xxx)分别是194和182；(xxxi)分别是196和182；(xxxii)分别是198和182；(xxxiii)分别是200和182；(xxxiv)分别是202和182；或(xxxv)分别是239和243。
[0220]
实施例6.一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，其中所述vh包括如seq id no:79所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述vl包括如seq id no:83所示的氨基酸序列或由其组成。
[0221]
实施例7.一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中所述cdrh1、所述cdrh2和所述cdrh3分别包括seq id no:80-82所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述cdrl1、所述cdrl2和所述cdrl3分别包括seq id no:84-86所示的氨基酸序列或由其组成。
[0222]
实施例8.一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，其中所述vh包括如seq id no:105所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述vl包括如seq id no:168所示的氨基酸序列或由其组成。
[0223]
实施例9.一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中所述
cdrh1、所述cdrh2和所述cdrh3分别包括seq id no:106-108所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述cdrl1、所述cdrl2和所述cdrl3分别包括seq id no:169-171所示的氨基酸序列或由其组成。
[0224]
实施例10.一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，其中所述vh包括如seq id no:178所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述vl包括如seq id no:182或seq id no:190所示的氨基酸序列或由其组成。
[0225]
实施例11.一种抗体或其抗原结合片段，其包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中所述cdrh1、所述cdrh2和所述cdrh3分别包括seq id no:179-181所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述cdrl1、所述cdrl2和所述cdrl3分别包括seq id no:183-185所示的氨基酸序列或由其组成。
[0226]
实施例12.根据实施例1至11中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其进行以下：(i)识别sars-cov-2的ace2受体结合基序(rbm，seq id no:167)中的表位；(ii)能够阻断sars-cov-2(例如，sars-cov-2 rbm)与ace2之间的相互作用；(ii)能够以高于与sars冠状病毒s蛋白结合的亲合力的亲合力与sars-cov-2 s蛋白结合；(iv)当抗体或抗原结合片段以10μg/ml存在时，能够对样品中约30％、约35％、约40％、约50％、约55％、约56％、约57％、约58％、约59％、约60％或更多的表达sars-cov-2表面糖蛋白的靶细胞进行染色，所述样品包括在大约100μl中约50000个所述靶细胞；(v)识别在sars-cov-2的ace2 rbm和sars冠状病毒的ace2 rbm中保守的表位；(vi)针对sars-cov-2和sars冠状病毒具有交叉反应性；(vii)识别sars-cov-2表面糖蛋白中不在ace2 rbm中的表位；或(viii)(i)至(vii)的任何组合。
[0227]
实施例13.根据实施例1至12中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是igg、iga、igm、ige或igd同种型。
[0228]
实施例14.根据实施例1至13中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是选自igg1、igg2、igg3和igg4的igg同种型。
[0229]
实施例15.根据实施例1至14中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其是人的、人源化的或嵌合的。
[0230]
实施例16.根据实施例1至15中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或所述抗原结合片段包括人抗体、单克隆抗体、经纯化的抗体、单链抗体、fab、fab
′
、f(ab
′
)2、fv、scfv或scfab。
[0231]
实施例17.根据实施例16所述的抗体或抗原结合片段，其中所述scfab包括：(i)如seq id no:218-219和226-227中的任一个所示的氨基酸序列；(ii)vl和vh，所述vl包括如seq id no:168所示的氨基酸序列，所述vh包括如seq id no:105或seq id no:113所示的氨基酸序列；或(iii)cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3，所述cdrh1包括如seq id no:106所示的氨基酸序列，所述cdrh2包括如seq id no:107或121所示的氨基酸序列，所述cdrh3包括如seq id no:108所示的氨基酸序列，所述cdrl1包括如seq id no:169所示的氨基酸序列，所述cdrl2包括如seq id no:170所示的氨基酸序列，所述cdrl3包括如seq id no:171所示的氨基酸序列。
[0232]
实施例18.根据实施例16所述的抗体或抗原结合片段，其中所述scfv包括：(i)如
seq id no:220-221或228-229中的任一个所示的氨基酸序列；(ii)vl和vh，所述vl包括如seq id no:168所示的氨基酸序列，所述vh包括如seq id no:105或seq id no:113所示的氨基酸序列；或(iii)cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3，所述cdrh1包括如seq id no:106所示的氨基酸序列，所述cdrh2包括如seq id no:107或121所示的氨基酸序列，所述cdrh3包括如seq id no:108所示的氨基酸序列，所述cdrl1包括如seq id no:169所示的氨基酸序列，所述cdrl2包括如seq id no:170所示的氨基酸序列，所述cdrl3包括如seq id no:171所示的氨基酸序列。
[0233]
实施例19.根据实施例16所述的抗体或抗原结合片段，其中所述scfv包括多于一个vh结构域和多于一个vl结构域。
[0234]
实施例20.根据实施例19所述的抗体或抗原结合片段，其中所述scfv包括：(i)如seq id no:222-225或seq id no:230-233中的任一个所示的氨基酸序列；(ii)两个vl结构域，所述两个vl结构域各自包括如seq id no:168所示的氨基酸序列，和两个vh结构域，所述两个vh结构域各自包括如seq id no:105或seq id no:113所示的氨基酸序列；或(iii)两个vl结构域，所述两个vl结构域各自包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，所述cdrl1包括如seq id no:169所示的氨基酸序列，所述cdrl2包括如seq id no:170所示的氨基酸序列，所述cdrl3包括如seq id no:171所示的氨基酸序列，和两个vh结构域，所述两个vh结构域各自包括cdrh1、cdrh2、cdrh3，所述cdrh1包括如seq id no:106所示的氨基酸序列，所述cdrh2包括如seq id no:107或121所示的氨基酸序列，所述cdrh3包括如seq id no:108所示的氨基酸序列。
[0235]
实施例21.根据实施例1至19中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是多特异性抗体或抗原结合片段。
[0236]
实施例22.根据实施例21所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段是双特异性抗体或抗原结合片段。
[0237]
实施例23.根据实施例21或22所述的抗体或抗原结合片段，其包括：(i)第一vh和第一vl；和(ii)第二vh和第二vl，其中所述第一vh和所述第二vh不同并且各自独立地包括与以下中的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列：seq id no:1、9-15、23、24、27-46、55、63、79、87、95、103、105、113-120、129-146、155、172、176-178、194、196、198、200、202和239，并且其中所述第一vl和所述第二vl不同并且各自独立地包括与以下中的任一个所示的氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列：seq id no:5、47-50、59、67、71、72、75、76、83、91、99、109、147-150、159、168、182、190、234和243；
[0238]
并且其中所述第一vh和所述第一vl一起形成第一抗原结合位点，并且其中所述第二vh和所述第二vl一起形成第二抗原结合位点。
[0239]
实施例24.根据实施例1至23中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段进一步包括fc多肽或其片段。
[0240]
实施例25.根据实施例24所述的抗体或抗原结合片段，其中所述fc多肽或其片段包括：(i)增强与fcrn的结合的突变，相较于不包括所述突变的参考fc多肽；和/或(ii)增强与fcγr的结合的突变，相较于不包括所述突变的参考fc多肽。
[0241]
实施例26.根据实施例25所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与fcrn的结合的突变包括：m428l；n434s；n434h；n434a；n434s；m252y；s254t；t256e；t250q；p257i；
q311i；d376v；t307a；e380a；或其任何组合。
[0242]
实施例27.根据实施例25或26所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与fcrn的结合的突变包括：(i)m428l/n434s；(ii)m252y/s254t/t256e；(iii)t250q/m428l；(iv)p257i/q311i；(v)p257i/n434h；(vi)d376v/n434h；(vii)t307a/e380a/n434a；或(viii)(i)至(vii)的任何组合。
[0243]
实施例28.根据实施例25至27中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与fcrn的结合的突变包括m428l/n434s。
[0244]
实施例29.根据实施例25至28中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与fcγr的结合的突变包括：s239d；i332e；a330l；g236a；或其任何组合。
[0245]
实施例30.根据实施例25至29中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述增强与fcγr的结合的突变包括：(i)s239d/i332e；(ii)s239d/a330l/i332e；(iii)g236a/s239d/i332e；或(iv)g236a/a330l/i332e。
[0246]
实施例31.根据实施例1至30中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其包括改变糖基化的突变，其中所述改变糖基化的突变包括n297a、n297q或n297g，和/或其是去糖基化的和/或去岩藻糖基化的。
[0247]
实施例32.一种分离的多核苷酸，其编码根据实施例1至31中任一项所述的抗体或抗原结合片段、或编码所述抗体或所述抗原结合片段的vh、重链、vl和/或轻链。
[0248]
实施例33.根据实施例32所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸包括脱氧核糖核酸(dna)或核糖核酸(rna)，其中所述rna任选地包括信使rna(mrna)。
[0249]
实施例34.根据实施例32或33所述的多核苷酸，其被密码子优化以在宿主细胞中表达。
[0250]
实施例35.根据实施例32至34中任一项所述的多核苷酸，其包括与根据seq id no:186-189、191-192、238、247、248-255和257-262中的任一个或多个的多核苷酸序列具有至少50％同一性的多核苷酸。
[0251]
实施例36.一种重组载体，其包括根据实施例32至35中任一项所述的多核苷酸。
[0252]
实施例37.一种宿主细胞，其包括根据实施例32至35中任一项所述的多核苷酸和/或根据实施例36所述的载体，其中所述多核苷酸对于所述宿主细胞是异源的。
[0253]
实施例38.一种人b细胞，其包括根据实施例32至35中任一项所述的多核苷酸，其中所述多核苷酸对于所述人b细胞是异源的和/或其中所述人b细胞是永生化的。
[0254]
实施例39.一种组合物，其包含：(i)根据实施例1至31或49至52中任一项所述的抗体或抗原结合片段；(ii)根据实施例32至35中任一项所述的多核苷酸；(iii)根据实施例36所述的重组载体；(iv)根据实施例37所述的宿主细胞；和/或(v)根据实施例38所述的人b细胞，以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
[0255]
实施例40.根据实施例39所述的组合物，其包括两个或更多个根据实施例1至31或49至52中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
[0256]
实施例41.根据实施例40所述的组合物，其包含：(i)第一抗体或抗原结合片段，所述第一抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括如seq id no:79所示的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括如seq id no:83所示的氨基酸序列或由其组成；以及(ii)第二抗体或抗原结合片段，所述第二抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括如seq id no:105
所示的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括如seq id no:168所示的氨基酸序列或由其组成。
[0257]
实施例42.根据实施例40所述的组合物，其包含：
[0258]
(i)第一抗体或抗原结合片段，所述第一抗体或抗原结合片段包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中所述cdrh1、所述cdrh2和所述cdrh3分别包括seq id no:80-82所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述cdrl1、所述cdrl2和所述cdrl3分别包括seq id no:84-86所示的氨基酸序列或由其组成；以及(ii)第二抗体或抗原结合片段，所述第二抗体或抗原结合片段包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中所述cdrh1、所述cdrh2和所述cdrh3分别包括seq id no:106-108所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述cdrl1、所述cdrl2和所述cdrl3分别包括seq id no:169-171所示的氨基酸序列或由其组成。
[0259]
实施例43.根据实施例40所述的组合物，其包含：(i)第一抗体或抗原结合片段，所述第一抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括如seq id no:178所示的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括如seq id no:182或seq id no:190所示的氨基酸序列或由其组成；以及(ii)第二抗体或抗原结合片段，所述第二抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括如seq id no:105所示的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括如seq id no:168所示的氨基酸序列或由其组成。
[0260]
实施例44.根据实施例40所述的组合物，其包含：(i)第一抗体或抗原结合片段，所述第一抗体或抗原结合片段包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中所述cdrh1、所述cdrh2和所述cdrh3分别包括seq id no:179-181所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述cdrl1、所述cdrl2和所述cdrl3分别包括seq id no:183-185所示的氨基酸序列或由其组成；以及(ii)第二抗体或抗原结合片段，所述第二抗体或抗原结合片段包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中所述cdrh1、所述cdrh2和所述cdrh3分别包括seq id no:106-108所示的氨基酸序列或由其组成，并且所述cdrl1、所述cdrl2和所述cdrl3分别包括seq id no:169-171所示的氨基酸序列或由其组成。
[0261]
实施例45.根据实施例40所述的组合物，其包含：
[0262]
(i)第一抗体或抗原结合片段，所述第一抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括如seq id no:178所示的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括如seq id no:182或seq id no:190所示的氨基酸序列或由其组成；以及(ii)第二抗体或抗原结合片段，所述第二抗体或抗原结合片段包括vh和vl，所述vh包括如seq id no:63所示的氨基酸序列或由其组成，所述vl包括如seq id no:67、seq id no:71-71中的任一个或seq id no:75-76中的任一个所示的氨基酸序列或由其组成。
[0263]
实施例46.根据实施例40所述的组合物，其包含：
[0264]
(i)第一抗体或抗原结合片段，所述第一抗体或抗原结合片段包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中所述cdrh1、所述cdrh2和所述cdrh3分别包括seq id no:179-181所示的氨基
酸序列或由其组成，并且所述cdrl1、所述cdrl2和所述cdrl3分别包括seq id no:183-185所示的氨基酸序列或由其组成；以及(ii)第二抗体或抗原结合片段，所述第二抗体或抗原结合片段包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中所述cdrh1、所述cdrh2和所述cdrh3分别包括seq id no:64-66所示的氨基酸序列或由其组成，所述cdrl1包括seq id no:68、seq id no:73或seq id no:74中的任一个所示的氨基酸序列或由其组成，所述cdrl2包括seq id no:69所示的氨基酸序列或由其组成；并且所述cdrl3包括seq id no:70、seq id no:77或seq id no:78中的任一个所示的氨基酸序列或由其组成。
[0265]
实施例47.一种组合物，其包括包封于载体分子中的根据实施例32至35中任一项所述的多核苷酸，其中所述载体分子任选地包括脂质、脂质衍生的递送媒剂，如脂质体、固体脂质纳米颗粒、油性悬浮液、亚微米脂质乳液、脂质微泡、反脂质胶束、耳蜗脂质体、脂质微管、脂质微柱、脂质纳米颗粒(lnp)或纳米级平台。
[0266]
实施例48.一种治疗受试者的sars-cov-2感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的(i)根据实施例1至31或51至54中任一项所述的抗体或抗原结合片段；(ii)根据实施例32至35中任一项所述的多核苷酸；(iii)根据实施例36所述的重组载体；(iv)根据实施例37所述的宿主细胞；(v)根据实施例38所述的人b细胞；和/或(vi)根据实施例39至47中任一项所述的组合物。
[0267]
实施例49.根据实施例1至31或51至54中任一项所述的抗体或抗原结合片段、根据实施例32至35中任一项所述的多核苷酸、根据实施例36所述的重组载体、根据实施例37所述的宿主细胞、根据实施例38所述的人b细胞和/或根据实施例39至47中任一项所述的组合物，其用于治疗受试者的sars-cov-2感染的方法中。
[0268]
实施例50.根据实施例1至31或51至54中任一项所述的抗体或抗原结合片段、根据实施例32至35中任一项所述的多核苷酸、根据实施例36所述的重组载体、根据实施例37所述的宿主细胞、根据实施例38所述的人b细胞和/或根据实施例39至47中任一项所述的组合物，其用于制备用于治疗受试者的sars-cov-2感染的药物。
[0269]
实施例51.根据实施例24至31中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述fc多肽包括l234a突变和l235a突变。
[0270]
实施例52.根据实施例1至31或51中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段与sars-cov-2 s蛋白结合，如使用生物层干涉测量法测量的。
[0271]
实施例53.根据实施例52所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以小于约4.5x10-9 m的kd与sars-cov-2 s蛋白结合。
[0272]
实施例54.根据实施例52或53所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段以小于1x10-12 m的kd与sars-cov-2 s蛋白结合。
[0273]
实施例55.根据实施例1至31或51至54中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够以约16μg/ml至约20μg/ml的ic50中和sars-cov-2感染和/或中和靶细胞的感染。
[0274]
实施例56.根据实施例1至31或51至54中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够以约0.3μg/ml至约0.4μg/ml或约3nm至约4nm的ic50中和sars-cov-2感染和/或中和靶细胞的感染。
[0275]
实施例57.一种组合物，其包含(i)根据实施例8或9所述的抗体或抗原结合片段和(ii)根据实施例10或11所述的抗体或抗原结合片段，其中所述组合物能够以约0.07μg/ml至约0.08μg/ml的ic50中和sars-cov-2感染。
[0276]
实施例58.根据实施例1至31或51至54中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和/或抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)对抗被sars-cov-2感染的靶细胞。
[0277]
实施例59.一种用于体外诊断sars-cov-2感染的方法，所述方法包括：
[0278]
(i)使来自受试者的样品与根据实施例1至31或51至54中任一项所述的抗体或抗原结合片段接触；以及
[0279]
(ii)检测复合物，所述复合物包括抗原和所述抗体或包括抗原和所述抗原结合片段。
[0280]
实施例60.根据实施例59所述的方法，其中所述样品包括从所述受试者分离的血液。
[0281]
实施例61.根据实施例52至56中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段的fab能够以2.0x10-9
或更小、1.9x10-9
或更小或1.8x10-9
或更小的kd与sars-cov-2 s蛋白结合。
[0282]
实施例62.根据实施例1至31、51至54或61中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够中和由sars-cov-2引起的感染并且不与人ace2竞争与所述sars-cov-2 s蛋白结合，
[0283]
其中任选地，所述中和包括在体外感染模型中中和感染。
[0284]
实施例63.根据实施例1至31、51至54、61或62中任一项所述的抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段能够以3.0nm、3.1nm、3.2nm、3.3nm、3.4nm、3.5nm、3.6nm、3.7nm、3.8nm、3.9nm或4.0nm的ic50中和由sars-cov-2引起的感染。
[0285]
实施例64.根据实施例58所述的抗体或抗原结合片段，其中诱导adcc包括激活包括v158 fcγriiia变体的自然杀伤细胞、包括f158 fcγriiia变体的自然杀伤细胞或两者。
[0286]
实施例65.根据实施例58或64所述的抗体或抗原结合片段，其中所述adcp包括接合在吞噬细胞(如单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞)的表面上表达的fcγriia。
[0287]
实施例66.一种抗体或其抗原结合片段，其与根据实施例1至31、51至54或61至65中任一项所述的抗体或抗原结合片段竞争与sars-cov-2表面糖蛋白结合。
[0288]
实施例67.一种抗体或其抗原结合片段，其与抗体s309和/或抗体s303竞争与sars-cov-2表面糖蛋白结合。
[0289]
实施例68.一种抗体或其抗原结合片段，其与抗体s304和/或抗体s315竞争与sars-cov-2表面糖蛋白结合。
[0290]
实施例69.一种组合或组合物，其包含：
[0291]
(i)抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括：
[0292]
(a)cdrh1氨基酸序列gypftsyg、cdrh2氨基酸序列istyngnt或istyqgnt、cdrh3氨基酸序列ardytrgawfgesliggfdn；cdrl1氨基酸序列qtvssts、cdrl2氨基酸序列gas和cdrl3氨基酸序列qqhdtslt；或
[0293]
(b)vh氨基酸序列，其包括
[0294]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgypftsygiswvrqapgqglewmgwistyngntnyaqkfqgrvtmttdtstttgymelrrlrsddtavyycardytrgawfgesliggfdnwgqgtlvtvss或由其组成，
[0295]
或包括
[0296]
qvqlvqsgaevkkpgasvkvsckasgypftsygiswvrqapgqglewmgwistyqgntnyaqkfqgrvtmttdtstttgymelrrlrsddtavyycardytrgawfgesliggfdnwgqgtlvtvss或由其组成，
[0297]
和vl氨基酸序列，其包括
[0298]
eivltqspgtlslspgeratlscrasqtvsstslawyqqkpgqaprlliygassratgipdrfsgsgsgtdftltisrlepedfavyycqqhdtsltfgggtkveik或由其组成；以及
[0299]
(ii)抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段包括：(a)分别根据seq id no:79和83的vh和vl氨基酸序列；(b)分别根据seq id no:80-82和84-86的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列；(c)分别根据seq id no:178或194或196或198或200或202和182或190的vh和vl氨基酸序列；或(d)分别根据seq id no:179或195、180或197或199、181、201或203和183-185的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0300]
实施例70.一种预防或治疗或中和受试者的冠状病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据实施例69所述的组合或组合物，其中任选地，(i)所述抗体或抗原结合片段和(ii)所述抗体或抗原结合片段并发地、同时地或连续地施用。
[0301]
实施例71.一种预防或治疗或中和受试者的冠状病毒感染的方法，所述方法包括向已接受第一抗体或抗原结合片段的受试者施用第二抗体或抗原结合片段，所述第一抗体或抗原结合片段包括：(a)分别根据seq id no:79和83的vh和vl氨基酸序列；或(b)分别根据seq id no:80-82和84-86的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列；所述第二抗体或抗原结合片段包括：(a)根据seq id no:105或113的vh氨基酸序列和根据seq id no:168的vl氨基酸序列；或(b)分别根据seq id no:106-108或分别根据seq id no:106、121和108的cdrh1、cdrh2和cdrh3氨基酸，以及分别根据seq id no:169-171的cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0302]
实施例72.一种预防或治疗或中和受试者的冠状病毒感染的方法，所述方法包括向已接受第一抗体或抗原结合片段的受试者施用第二抗体或抗原结合片段，所述第一抗体或抗原结合片段包括：(a)根据seq id no:105或113的vh氨基酸序列和根据seq id no:168的vl氨基酸序列；或(b)分别根据seq id no:106-108或分别根据seq id no:106、121和108的cdrh1、cdrh2和cdrh3氨基酸，以及分别根据seq id no:169-171的cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列；所述第二抗体或抗原结合片段包括：(a)分别根据seq id no:79和83的vh和vl氨基酸序列；或(b)分别根据seq id no:80-82和84-86的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0303]
实施例73.一种预防或治疗或中和受试者的冠状病毒感染的方法，所述方法包括向已接受第一抗体或抗原结合片段的受试者施用第二抗体或抗原结合片段，所述第一抗体或抗原结合片段包括：
[0304]
(a)分别根据seq id no:178或194或196或198或200或202和182或190的vh和vl氨基酸序列；或(b)分别根据seq id no:179或195、180或197或199、181、201或203和183-185的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列；所述第二抗体或抗原结合片段包括：(a)根据seq id no:105或113的vh氨基酸序列和根据seq id no:168的vl氨基酸序列；
或(b)分别根据seq id no:106-108或分别根据seq id no:106、121和108的cdrh1、cdrh2和cdrh3氨基酸，以及分别根据seq id no:169-171的cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0305]
实施例74.一种预防或治疗或中和受试者的冠状病毒感染的方法，所述方法包括向已接受第一抗体或抗原结合片段的受试者施用第二抗体或抗原结合片段，所述第一抗体或抗原结合片段包括：(a)根据seq id no:105或113的vh氨基酸序列和根据seq id no:168的vl氨基酸序列；或(b)分别根据seq id no:106-108或分别根据seq id no:106、121和108的cdrh1、cdrh2和cdrh3氨基酸，以及分别根据seq id no:169-171的cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列；所述第二抗体或抗原结合片段包括：(a)分别根据seq id no:178或194或196或198或200或202和182或190的vh和vl氨基酸序列；或(b)分别根据seq id no:179或195、180或197或199、181、201或203和183-185的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列。
[0306]
实施例75.一种治疗受试者的sars-cov-2感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用单剂量的组合物，所述组合物包含根据实施例1至31、51至54和61至65中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
[0307]
实施例76.根据实施例48或75所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段分别包括根据seq id no:106、121、108、169、170和171的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列，并且任选地进一步包括(例如，igg1)fc多肽，所述fc多肽包括m428l/n434s突变，优选地其中所述抗体或抗原结合片段包括seq id no:173的ch1-ch3氨基酸序列和seq id no:174的cl氨基酸序列。
[0308]
实施例77.根据实施例48、75和76中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括根据seq id no:113的vh和根据seq id no:168的vl，并且任选地进一步包括(例如，igg1)fc多肽，所述fc多肽包括m428l/n434s突变，优选地其中所述抗体或抗原结合片段包括seq id no:173的ch1-ch3氨基酸序列和seq id no:174的cl氨基酸序列。
[0309]
实施例78.根据实施例48和75至77中任一项所述的方法，其中所述受试者：(i)年龄为18至49岁；(ii)年龄为18岁或以上；(iii)患有轻度至中度covid-19；(iv)患有重度covid-19；(v)患有重度至危重covid-19；(vi)自症状发作以来，已有少于七天或5天或更少天；(vii)自症状发作以来，已有七天或更多天；(viii)已具有阳性逆转录酶-聚合酶链式反应或抗原sars-cov-2测试结果；(ix)年龄为55岁或以上；
[0310]
(x)患有以下中的一种或多种：需要药物的糖尿病、肥胖症(体重指数》30kg/2)、慢性肾脏疾病(所估计的肾小球滤过率《60毫升/分钟/1.73m2)、
23
充血性心力衰竭(纽约心脏协会ii级或更高级)、慢性阻塞性肺部疾病(慢性支气管炎病史、慢性阻塞性肺病病史或肺气肿伴强体力活动呼吸困难病史)以及中度至重度哮喘(受试者需要吸入性类固醇来控制症状或在过去一年中已开出一个疗程的口服类固醇)；或
[0311]
(xi)(i)至(x)的任何组合。
[0312]
实施例79.根据实施例48或75至78中任一项所述的方法，其中所述施用包括静脉内输注。
[0313]
实施例80.一种预防或降低与确诊的sars-cov-2感染者密切接触的受试者的sars-cov-2感染的严重程度的方法，所述方法包括向所述受试者施用单剂量的组合物，所述组合物包含根据实施例1至31、51至54和61至65中任一项所述的抗体或抗原结合片段。
[0314]
实施例81.根据实施例80所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括分别根据seq id no:106、121、108、169、170和171的cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3氨基酸序列，并且任选地进一步包括(例如，igg1)fc多肽，所述fc多肽包括m428l/n434s突变，优选地其中所述抗体或抗原结合片段包括seq id no:173的ch1-ch3氨基酸序列和seq id no:174的cl氨基酸序列。
[0315]
实施例82.根据实施例80或81所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括根据seq id no:113的vh和根据seq id no:168的vl，并且任选地进一步包括(例如，igg1)fc多肽，所述fc多肽包括m428l/n434s突变，优选地其中所述抗体或抗原结合片段包括seq id no:173的ch1-ch3氨基酸序列和seq id no:174的cl氨基酸序列。
[0316]
实施例83.根据实施例80至82中任一项所述的方法，其中所述受试者：(i)年龄为12岁或以上；并且(ii)在施用所述组合物之前少于三天，最后一次与确诊的sars-cov-2感染者接触。
[0317]
实施例84.根据实施例48或80至83中任一项所述的方法，其中所述施用包括静脉内输注。
[0318]
实施例85.根据实施例48或75至78中任一项所述的方法，其中所述施用包括肌内注射。
[0319]
实施例86.根据实施例48或80至83中任一项所述的方法，其中所述施用包括肌内注射。
[0320]
实施例87.根据实施例75至86中任一项所述的方法，其中所述组合物的所述单剂量包括250mg的所述抗体或抗原结合片段。
[0321]
实施例88.根据实施例75至86中任一项所述的方法，其中所述组合物的所述单剂量包括500mg的所述抗体或抗原结合片段。
[0322]
实施例89.1.根据实施例48或75至88中任一项所述的方法，其中所述受试者患有轻度至中度sars-2-cov感染(例如，患有轻度至中度covid-19)，并且任选地有进展到重度疾病的风险。
[0323]
实施例89.2.一种治疗患有轻度至中度covid-19的受试者的covid-19的方法，所述方法包括向所述受试者肌内施用单剂量的组合物，所述组合物包含抗体，所述抗体包括根据seq id no:113的vh和根据seq id no:168的vl，并且任选地进一步包括(例如，igg1)fc多肽，所述fc多肽包括m428l/n434s突变，优选地其中所述抗体包括seq id no:173的ch1-ch3氨基酸序列和seq id no:174的cl氨基酸序列。
[0324]
实施例90.根据实施例89.2所述的方法，其中所述组合物的所述单剂量包括250mg的所述抗体。
[0325]
实施例91.根据实施例89.2所述的方法，其中所述组合物的所述单剂量包括500mg的所述抗体。
[0326]
实施例92.根据实施例89.2至91中任一项所述的方法，其中：
[0327]
(i)(i)(a)所述受试者的年龄为12岁或以上并且有covid-19进展的高风险，或(i)(b)所述受试者的年龄为65岁或以上；和/或
[0328]
(ii)所述受试者具有阳性sars-cov-2测试结果(例如，通过pcr测试)，在室内空气中的氧气饱和度≥94％，具有covid-19症状，并且自症状发作以来有少于或等于7天。
[0329]
实施例93.根据实施例89.2至92中任一项所述的方法，其中：
[0330]
(i)(i)(a)所述受试者的年龄为12岁或以上并且有covid-19进展的高风险，或(i)(b)所述受试者的年龄为65岁或以上；并且
[0331]
(ii)所述受试者具有阳性sars-cov-2测试结果(例如，通过pcr测试)，在室内空气中的氧气饱和度≥94％，具有covid-19症状，并且自症状发作以来有少于或等于7天。
[0332]
[实施例94至100-保留]
[0333]
实施例101.一种治疗受试者的sars-cov-2感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用单剂量的组合物，所述组合物包含抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够与在宿主细胞的细胞表面上和/或在病毒粒子上表达的sars-cov-2的表面糖蛋白结合，其中所述抗体包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3包括以下所示的氨基酸序列：(1)分别为seq id no:106、121、108、169、170和171；或(2)分别为seq id no:106、107、108、169、170和171。
[0334]
实施例102.一种治疗受试者的sars-cov-2感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的：(i)抗体或抗原结合片段，所述抗体或抗原结合片段能够与在宿主细胞的细胞表面上和/或在病毒粒子上表达的sars-cov-2的表面糖蛋白结合，或(ii)组合物，所述组合物包含(ii)(a)所述抗体或抗原结合片段以及(ii)(b)药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂，其中所述抗体包括重链可变结构域(vh)和轻链可变结构域(vl)，所述vh包括cdrh1、cdrh2和cdrh3，所述vl包括cdrl1、cdrl2和cdrl3，其中cdrh1、cdrh2、cdrh3、cdrl1、cdrl2和cdrl3包括以下所示的氨基酸序列：(1)分别为seq id no:106、121、108、169、170和171；或(2)分别为seq id no:106、107、108、169、170和171。
[0335]
实施例103.根据实施例102所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用单剂量的(i)所述抗体或抗原结合片段或(ii)所述组合物。
[0336]
实施例104.根据实施例101至103中任一项所述的方法，其中所述vh包括seq id no:113所示的氨基酸序列，并且所述vl包括seq id no:168所示的氨基酸序列。
[0337]
实施例105.根据实施例101至103中任一项所述的方法，其中所述vh包括seq id no:105所示的氨基酸序列，并且所述vl包括seq id no:168所示的氨基酸序列。
[0338]
实施例106.根据实施例101至105中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段进一步包括fc多肽或其片段。
[0339]
实施例107.根据实施例101至106中任一项所述的方法，其是igg、iga、igm、ige或igd同种型。
[0340]
实施例108.根据实施例101至107中任一项所述的方法，其是选自igg1、igg2、igg3和igg4的igg同种型。
[0341]
实施例109.根据实施例101至108中任一项所述的方法，其是igg1同种型。
[0342]
实施例110.根据实施例106至109中任一项所述的方法，其中所述fc多肽或其片段包括：(i)增强与fcrn的结合的突变，相较于不包括所述突变的参考fc多肽；和/或(ii)增强与fcγr的结合的突变，相较于不包括所述突变的参考fc多肽。
[0343]
实施例111.根据实施例110所述的方法，其中所述增强与fcrn的结合的突变包括：m428l；n434s；n434h；n434a；n434s；m252y；s254t；t256e；t250q；p257i；q311i；d376v；
t307a；e380a；或其任何组合。
[0344]
实施例112.根据实施例110或111所述的方法，其中所述增强与fcrn的结合的突变包括：(i)m428l/n434s；(ii)m252y/s254t/t256e；(iii)t250q/m428l；(iv)p257i/q311i；(v)p257i/n434h；(vi)d376v/n434h；(vii)t307a/e380a/n434a；或(viii)(i)至(vii)的任何组合。
[0345]
实施例113.根据实施例110至112中任一项所述的方法，其中所述增强与fcrn的结合的突变包括m428l/n434s。
[0346]
实施例114.根据实施例110至113中任一项所述的方法，其中所述增强与fcγr的结合的突变包括：s239d；i332e；a330l；g236a；或其任何组合，并且任选地不包括s239d。
[0347]
实施例115.根据实施例110至114中任一项所述的方法，其中所述增强与fcγr的结合的突变包括：
[0348]
(i)s239d/i332e；
[0349]
(ii)s239d/a330l/i332e；
[0350]
(iii)g236a/s239d/i332e；或
[0351]
(iv)g236a/a330l/i332e。
[0352]
实施例116.根据实施例101至115中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括seq id no:173或265的ch1-ch3氨基酸序列和seq id no:174的cl氨基酸序列。
[0353]
实施例117.根据实施例101至115中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括seq id no:175或266的ch1-ch3氨基酸序列和seq id no:174的cl氨基酸序列。
[0354]
实施例118.根据实施例101至117中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括重链多肽和轻链多肽，其中：
[0355]
(i)所述重链多肽包括seq id no:113中所示的vh氨基酸序列和seq id no:173或265中所示的ch1-ch3氨基酸序列；并且
[0356]
(ii)所述轻链包括seq id no:168中所示的vl氨基酸序列和seq id no:174中所示的cl氨基酸序列，
[0357]
并且其中任选地，所述方法包括向所述受试者施用单剂量的所述抗体或抗原结合片段。
[0358]
实施例119.根据实施例101至117中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段包括重链多肽和轻链多肽，其中：
[0359]
(i)所述重链多肽包括seq id no:113中所示的vh氨基酸序列和seq id no:175或266中所示的ch1-ch3氨基酸序列；并且
[0360]
(ii)所述轻链包括seq id no:168中所示的vl氨基酸序列和seq id no:174中所示的cl氨基酸序列，并且其中任选地，所述方法包括向所述受试者施用单剂量的所述抗体或抗原结合片段。
[0361]
实施例120.根据实施例101至119中任一项所述的方法，其中所述受试者：
[0362]
(i)年龄为18至49岁；
[0363]
(ii)年龄为18岁或以上；
[0364]
(iii)患有轻度至中度covid-19；
[0365]
(iv)患有重度covid-19；
[0366]
(v)患有重度至危重covid-19；
[0367]
(vi)自症状发作以来，已有少于七天或5天或更少天；
[0368]
(vii)自症状发作以来，已有七天或更多天；
[0369]
(viii)已具有阳性逆转录酶-聚合酶链式反应或抗原sars-cov-2测试结果；
[0370]
(ix)年龄为55岁或以上；
[0371]
(x)患有以下中的一种或多种：需要药物的糖尿病、肥胖症(体重指数》30kg/m2)、慢性肾脏疾病(所估计的肾小球滤过率《60毫升/分钟/1.73m2)、充血性心力衰竭(纽约心脏协会ii级或更高级)、慢性阻塞性肺部疾病(慢性支气管炎病史、慢性阻塞性肺病病史或肺气肿伴强体力活动呼吸困难病史)以及中度至重度哮喘(受试者需要吸入性类固醇来控制症状或在过去一年中已开出一个疗程的口服类固醇)；或
[0372]
(xi)(i)至(x)的任何组合。
[0373]
实施例121.根据实施例101至120中任一项所述的方法，其包括向所述受试者静脉内施用所述抗体、抗原结合片段或组合物。
[0374]
实施例122.根据实施例121所述的方法，其包括在30分钟、60分钟或90分钟的过程中，向所述受试者静脉内施用所述抗体、抗原结合片段或组合物。
[0375]
实施例123.根据实施例101至122中任一项所述的方法，其包括向所述受试者肌内施用所述抗体、抗原结合片段或组合物。
[0376]
实施例124.根据实施例101至123中任一项所述的方法，其中所述方法包括以以下剂量向所述受试者施用所述抗体或抗原结合片段：至多100mg、至多150mg、至多200mg、至多250mg、至多300mg、至多350mg、至多400mg、至多450mg或至多500mg。
[0377]
实施例125.根据实施例101至124中任一项所述的方法，其中所述方法包括以在以下范围内的剂量向所述受试者施用所述抗体或抗原结合片段：在约50mg至约500mg的范围内、或在约50mg至约250mg的范围内、或在约50mg至100mg的范围内、或在约100mg至约500mg的范围内或在约250mg至约500mg的范围内。
[0378]
实施例126.根据实施例101至125中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用50mg、75mg、100mg、125mg、150mg、175mg、200mg、225mg、250mg、275mg、300mg、325mg、350mg、375mg、400mg、425mg、450mg、475mg或500mg的所述抗体或抗原结合片段。
[0379]
实施例127.根据实施例101至126中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用50mg、150mg、250mg或500mg的所述抗体或抗原结合片段。
[0380]
实施例128.根据实施例101至127中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用500mg的所述抗体或抗原结合片段。
[0381]
实施例129.根据实施例101至128中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次或10次或更多次所述抗体、抗原结合片段或组合物。
[0382]
实施例130.根据实施例101至129中任一项所述的方法，其包括向所述受试者施用多次所述抗体、抗原结合片段或组合物，其中第二施用或后续施用是在第一施用或先前施用后约6小时、约7小时、约8小时、约9小时、约10小时、约11小时、约12小时、约24小时、约48小时、约74小时、约96小时或更长时间进行的。
[0383]
实施例131.根据实施例101至130中任一项所述的方法，其中所述受试者的年龄为18岁或以上且患有实验室确诊的(例如，通过pcr测试)sars-cov-2感染。
[0384]
实施例132.根据实施例101至131中任一项所述的方法，其中所述受试者的临床状态为4级(住院、通过面罩或鼻塞供氧)、5级(住院、非侵入性通气或高流量氧气)、6级(住院、插管和机械通气)或7级(通气和额外的器官支持-加压药、肾替代疗法(rrt)、体外膜肺氧合(ecmo))，如根据who临床严重程度评分9分序数量表定义的。
[0385]
实施例133.根据实施例101至131中任一项所述的方法，其中所述受试者患有轻度至中度covid-19。
[0386]
实施例134.根据实施例133所述的方法，其中所述受试者有进展到重度covid-19的风险。
[0387]
实施例135.根据实施例134所述的方法，其中在向所述受试者施用所述抗体、抗原结合片段或组合物后，所述受试者因covid-19而住院的风险降低。
[0388]
实施例136.根据实施例135所述的方法，其中在向所述受试者施用所述抗体、抗原结合片段或组合物后，因covid-19而住院的风险降低了10％或更多。
[0389]
实施例137.根据实施例135所述的方法，其中在向所述受试者施用所述抗体、抗原结合片段或组合物后，因covid-19而住院的风险降低了20％或更多。
[0390]
实施例138.根据实施例135所述的方法，其中在向所述受试者施用所述抗体、抗原结合片段或组合物后，因covid-19而住院的风险降低了30％或更多。
[0391]
实施例139.根据实施例135所述的方法，其中在向所述受试者施用所述抗体、抗原结合片段或组合物后，因covid-19而住院的风险降低了40％或更多。
[0392]
实施例140.根据实施例135所述的方法，其中在向所述受试者施用所述抗体、抗原结合片段或组合物后，因covid-19而住院的风险降低了50％或更多。
[0393]
实施例141.根据实施例135所述的方法，其中在向所述受试者施用所述抗体、抗原结合片段或组合物后，因covid-19而住院的风险降低了60％或更多。
[0394]
实施例142.根据实施例135所述的方法，其中在向所述受试者施用所述抗体、抗原结合片段或组合物后，因covid-19而住院的风险降低了70％或更多。
[0395]
实施例143.根据实施例135所述的方法，其中在向所述受试者施用所述抗体、抗原结合片段或组合物后，因covid-19而住院的风险降低了80％或更多。
[0396]
实施例144.根据实施例135所述的方法，其中在向所述受试者施用所述抗体、抗原结合片段或组合物后，因covid-19而住院的风险降低了85％或更多。
[0397]
实施例145.根据实施例101至144中任一项所述的方法，其中所述受试者患有重度covid-19或有进展到重度covid-19的风险，其中任选地，重度covid-19包括：(i)血氧不足(在室内空气中的o2饱和度≤93％或pao2/fio2《300)，所述血氧不足需要氧气补充超过1天；或(ii)所述受试者需要≥4升/分钟氧气补充或等效物。
[0398]
实施例146.根据实施例101至145中任一项所述的方法，其中所述受试者患有危重covid-19或有进展到危重covid-19的风险，其中任选地，危重covid-19包括：呼吸衰竭；休克；以及多器官功能障碍/衰竭，所述呼吸衰竭需要以下中的至少一者：侵入性机械通气和ecmo。
[0399]
实施例147.根据实施例101至146中任一项所述的方法，其中所述受试者自症状发作以来有少于七天。
[0400]
实施例148.根据实施例101至146中任一项所述的方法，其中所述受试者自症状发
作以来有七天或更长时间。
[0401]
实施例149.根据实施例101至148中任一项所述的方法，其中所述受试者是(i)至(iii)中的任何一者或多者：
[0402]
(i)18岁或以上并且具有阳性sars-cov-2测试结果(通过任何验证测试，例如，对任何样本类型进行的rt-pcr)；
[0403]
(ii)(1)因重度covid-19疾病而住院，定义为符合4级或5级疾病的需要补充氧气或非侵入性通气，或(2)因危重covid-19疾病而住院，定义为需要机械通气的疾病(6级或7级疾病)；
[0404]
(iii)男性或女性，其中任选地所述女性是(1)无生育能力(woncbp)的妇女或(2)是具有生育能力的妇女(wocbp)并且使用避孕方法。
[0405]
实施例150.根据实施例101至149中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用500mg的所述抗体或抗原结合片段。
[0406]
实施例151.根据实施例101至150中任一项所述的方法，其中所述受试者曾与或已与确诊的sars-cov-2感染者密切接触。
[0407]
实施例152.根据实施例101至151中任一项所述的方法，其中治疗包括预防sars-cov-2感染和/或预防covid-19。
[0408]
实施例153.根据实施例101至152中任一项所述的方法，其中治疗包括预防所述受试者的covid-19的进展。
[0409]
实施例154.根据实施例101至153中任一项所述的方法，其中治疗包括预防有症状的covid-19的感染和/或传播。
[0410]
实施例155.根据实施例101至153中任一项所述的方法，其中治疗包括预防无症状的covid-19的感染和/或传播。
[0411]
实施例156.根据实施例101至155中任一项所述的方法，其中所述受试者有感染covid-19或使covid-19进展的风险。
[0412]
实施例157.根据实施例101至156中任一项所述的方法，其中治疗包括预防或减少：
[0413]
(1)一种或多种选自以下的急性呼吸道症状：咳嗽；痰液产生；咽喉痛；以及呼吸短促；或
[0414]
(2)高于38℃的发烧；
[0415]
(3)以下症状中的两种或更多种症状：疲乏；肌痛/关节痛；发冷；恶心/呕吐；腹泻；以及嗅觉丧失/味觉障碍。
[0416]
实施例158.根据实施例101至157中任一项所述的方法，其中治疗包括预防或减少以下症状中的一种或多种症状：高于38℃的发烧；发冷；咳嗽；咽喉痛；不适；头痛；肌痛；嗅觉或味觉发生变化；鼻塞/鼻液溢；呕吐；腹泻；劳力性呼吸短促。
[0417]
实施例159.根据实施例101至158中任一项所述的方法，其中所述受试者是成人。
[0418]
实施例160.根据实施例101至159中任一项所述的方法，其中所述受试者的年龄为18岁或以上，或者年龄为19岁或以上。
[0419]
实施例161.根据实施例101至160中任一项所述的方法，其中所述受试者的年龄为55岁，或者年龄为65岁，或者更年长。
[0420]
实施例162.根据实施例101至161中任一项所述的方法，其中施用所述抗体、抗原结合片段或组合物包括静脉内输注。
[0421]
实施例163.根据实施例101至162中任一项所述的方法，其中施用所述抗体、抗原结合片段或组合物包括肌内注射。
[0422]
实施例164.根据实施例101至163中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用250mg的所述抗体或抗原结合片段。
[0423]
实施例165.根据实施例101至163中任一项所述的方法，其中所述方法包括向所述受试者施用500mg的所述抗体或抗原结合片段。
[0424]
实施例166.根据实施例101至165中任一项所述的方法，其中所述受试者患有轻度至中度sars-2-cov感染(例如，患有轻度至中度covid-19)，并且任选地有进展到重度疾病的风险。
[0425]
实施例167.根据实施例101至166中任一项所述的方法，其中所述受试者：
[0426]
(i)年龄为12岁或以上；并且
[0427]
(ii)在施用所述组合物之前少于三天，最后一次与确诊的sars-cov-2感染者接触。
[0428]
实施例168.根据实施例101至167中任一项所述的方法，其中所述受试者患有轻度至中度covid-19，并且所述方法包括向所述受试者肌内施用单剂量的所述抗体、抗原结合片段或组合物。
[0429]
实施例169.根据实施例168所述的方法，其中所述单剂量包括250mg的所述抗体或抗原结合片段。
[0430]
实施例170.根据实施例168或169所述的方法，其中所述单剂量包括500mg的所述抗体或抗原结合片段。
[0431]
实施例171.根据实施例168至170中任一项所述的方法，其中：(i)(i)(a)所述受试者的年龄为12岁或以上并且有covid-19进展的高风险，或(i)(b)所述受试者的年龄为65岁或以上；和/或(ii)所述受试者具有阳性sars-cov-2测试结果(例如，通过pcr测试)，在室内空气中的氧气饱和度≥94％，具有covid-19症状，并且自症状发作以来有少于或等于7天。
[0432]
实施例172.根据实施例101至171中任一项所述的方法，其中：(i)(i)(a)所述受试者的年龄为12岁或以上并且有covid-19进展的高风险，或(i)(b)所述受试者的年龄为65岁或以上；并且(ii)所述受试者具有阳性sars-cov-2测试结果(例如，通过pcr测试)，在室内空气中的氧气饱和度≥94％，具有covid-19症状，并且自症状发作以来有少于或等于7天。
[0433]
实施例173.根据实施例101至172中任一项所述的方法，其中所述受试者未住院并且有(i)住院和/或(ii)covid-19进展的风险。
[0434]
实施例174.根据实施例101至173中任一项所述的方法，其中所述受试者：(1)年龄为12岁或以上，并且任选地有covid-19进展的高风险；和/或(2)年龄为65岁或以上。
[0435]
实施例175.根据实施例101至174中任一项所述的方法，其中所述受试者已具有阳性sars-cov-2测试结果，在室内空气中的氧气饱和度≥94％，具有covid-19症状，并且自症状发作以来有少于或等于7天。
[0436]
实施例176.根据实施例101至175中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是从用编码所述抗体或抗原结合片段的多核苷酸稳定转染的非克隆细胞池获得的。
[0437]
实施例177.根据实施例101至175中任一项所述的方法，其中所述抗体或抗原结合片段是从克隆主细胞库获得的。
[0438]
实施例178.根据实施例101至177中任一项所述的方法，其中所述受试者：是疗养院或长期护理机构的居住者；是临终关怀工作者；是医疗保健提供者或医疗保健工作者；是第一应答者；是诊断患有或疑似患有sars-cov-2感染的受试者的家庭成员或其它密切接触者；是超重或临床肥胖的；是吸烟者或曾经是吸烟者；患有或曾患有慢性阻塞性肺部疾病(copd)；患有哮喘(例如，患有中度至重度哮喘)；患有自身免疫性疾病或病状(例如，糖尿病)；免疫系统受损或耗竭(例如，归因于aids/hiv感染、如血癌等癌症、如化疗等淋巴耗竭疗法、骨髓或器官移植或遗传免疫病状)；患有慢性肝脏疾病；患有心血管疾病；和/或具有肺部或心脏缺陷；和/或工作或以其它方式长时间与其它人密切接触，如在工厂、装运中心、医院环境等中。
[0439]
实施例179.根据实施例101至178中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受针对sars-cov-2的疫苗并且所述疫苗确定为无效，例如通过所述受试者的疫苗后感染或症状，通过临床诊断或科学或监管标准。
[0440]
实施例180.根据实施例101至178中任一项所述的方法，其中所述受试者尚未接受针对sars-cov-2的疫苗。
[0441]
实施例181.根据实施例101至180中任一项所述的方法，其中所述受试者已接受针对sars-cov-2的康复者血浆疗法(即，来自covid-19康复者)、瑞德西韦或两者。
[0442]
实施例182.根据实施例101至181中任一项所述的方法，其中治疗包括暴露前或暴露期间预防。
[0443]
实施例183.根据实施例101至182中任一项所述的方法，其中治疗施用于患有轻度至中度疾病的所述受试者，任选地在门诊环境中。
[0444]
实施例184.根据实施例101至183中任一项所述的方法，其中治疗施用于患有中度至重度疾病，如需要住院的受试者。
[0445]
实施例185.根据实施例101至184中任一项所述的方法，其中所述受试者因covid-19而住院。
[0446]
实施例186.根据实施例101至185中任一项所述的方法，所述受试者患有sars-cov-2感染；患有轻度至中度covid-19；正在经历以下中的任何一种或多种：发烧；咳嗽；疲乏；呼吸短促或呼吸困难；肌肉酸痛；发冷；咽喉痛；流鼻涕；头痛；胸痛；味觉和/或嗅觉丧失；和红眼病(结膜炎)；不适；和异常影像；通过临床评估或影像发现有下呼吸道疾病证据且在海平面在室内空气中的氧气饱和度(sao2)大于(》)百分之93(％)；具有阳性sars-cov-2病毒测试结果；和/或有进展到重度covid-19和/或住院的高风险，例如人类受试者：(1)年龄为65岁或以上(≥65)；体重指数(bmi)为35或更高(≥35)；患有慢性肾脏疾病；患有糖尿病；(5)患有免疫抑制性疾病；正在接受免疫抑制性治疗；年龄为55岁或以上(≥55)并且患有心血管疾病、高血压、慢性阻塞性肺部疾病或其它慢性呼吸道疾病；和/或年龄为12至17岁并且针对所述受试者的年龄和性别bmi≥85％，或患有镰状细胞疾病、先天性或后天性心脏病、神经发育病症(例如，脑瘫)、医学相关的技术依赖性(例如，气管切开术、胃造口术或与covid-19无关的正压通气)、或哮喘、反应性气道或其它需要每日用药物控制的慢性呼吸道疾病；最近已被诊断为患有covid-19(例如，在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、
10天、11天、12天、13天或14天内)和/或在症状发作10天内；或患有或正在经历前述疾病的任何组合。
[0447]
实施例187.根据实施例101至186中任一项所述的方法，其中所述受试者的年龄为(a)18岁或以上，或(b)55岁或以下，条件是所述受试者的年龄为18岁或以上。
[0448]
实施例188.根据实施例101至187中任一项所述的方法，其中所述受试者患有通过阳性聚合酶链式反应(pcr；例如，rt-pcr测试；例如对任何类型的呼吸道样品进行的测试)确定的实验室确诊的covid-19感染。
[0449]
实施例189.根据实施例101至187中任一项所述的方法，所述受试者在室内空气(ra)中的外周毛细血管血氧气饱和度(spo2)》94％，并且已经历covid-19的一种或多种症状持续≤120小时(5天)。
[0450]
实施例190.根据实施例101至189中任一项所述的方法，其中所述受试者进一步接受或已接受瑞德西韦、补充氧气、通气疗法、呼吸疗法、地塞米松、托珠单抗或其任何组合。
[0451]
表1：序列
[0452]
[0453]
[0454]
[0455]
[0456]
[0457]
[0458]
[0459]
[0460]
[0461]
[0462]
[0463]
[0464]
[0465]
[0466]
[0467]
[0468]
[0469]
[0470]
[0471]
[0472]
[0473]
[0474]
[0475]
[0476]
[0477]
[0478]
[0479]
[0480]
[0481]
[0482]
[0483]
[0484]
[0485]
[0486]
[0487]
[0488]
[0489]
[0490]
[0491]
[0492]
[0493]
[0494]
[0495]
[0496]
[0497]
[0498]
[0499][0500]
实例
[0501]
实例1
[0502]
与sars-cov-2的刺突蛋白结合的人单克隆抗体
[0503]
将来自具有先前sars-cov感染的供体的b细胞进行分选并且用ebv永生化，并在384孔板中筛选，如欧洲专利ep1597280b1中所描述的。
[0504]
永生化后两周，使用基于流式细胞术的方法，针对与sars-cov-2刺突蛋白结合的抗体对永生化b细胞的上清液进行测试。用sars-cov-2(菌株βcov/wuhan-hu-1/2019)的s蛋白或用作为阴性对照的空质粒转染expicho细胞。鉴定了十四种与sars-cov-2 s结合的单克隆抗体，并且被称为sars-cov-2 s300至sars-cov-2 s312和sars-cov-2s315。
[0505]
实例2
[0506]
使用octet将人单克隆抗体与sars-cov-2的rbd结合
[0507]
在用动力学缓冲液(kb；0.01％不含内毒素的bsa，0.002^吐温-20，含0.005％ nan3的pbs)进行水合步骤10分钟之后，使用链霉亲和素生物传感器(颇尔富迪生物公司(pall fortebio))来以3ug/ml固定抗strep标签ii抗体(克隆5a9f9，生物素，瑞士穆滕茨的labforce股份有限公司(labforce ag，muttenz ch))。然后将具有strep标签ii(内部产生)的sars-cov-2 rbd在kb中以4μg/ml的浓度加载6分钟。允许来自b细胞上清液的抗体缔合一段时间。为了观察解离，将传感器从抗体溶液移动到kb中，并且监测抗体解离。
[0508]
s309 mab包括表1中提供的s309-v1 vh氨基酸序列和s309-v13 vl氨基酸序列(分
别为seq id no:105和168)。s303和s309的结合曲线的比较指示s303具有比s309更快的结合速率和更快的解离速率两者，这表明s309可以以更高的亲和力结合。
[0509]
实例3
[0510]
使用o
ctet
将人单克隆抗体与sars-cov-2和sars-cov-1的rbd结合
[0511]
使用octet测试了三种交叉反应性重组抗体(s303 rigg1、s304 rigg1、s309 rigg1)和两种sars-cov-1特异性抗体的亲和力。通过将抗体固定在传感器上并且将传感器浸入具有不同浓度rbd的孔中来测量亲和力。
[0512]
在缔合期期间记录抗体与rbd结合的动力学，之后将传感器浸入不含抗体的缓冲液中以观察在解离期期间抗体与rbd分离的动力学。简而言之，在用动力学缓冲液进行水合步骤10分钟之后(kb；0.01％不含内毒素的bsa，0.002^吐温-20，含0.005％ nan3的pbs)，使用蛋白a生物传感器(颇尔富迪生物公司)来以2.7ug/ml固定重组抗体持续1分钟。通过将抗体涂覆的传感器与不同浓度的sars-cov-1 rbd(义翘神州科技有限公司(sino biological))或sars-cov-2 rbd(在expi-cho细胞中内部产生；来自βcov/wuhan-hu-1/2019的刺突的残基331-550，登录号mn908947)一起温育，记录缔合曲线持续5分钟。所测试的最高rbd浓度为10ug/ml，然后以1:2.5连续稀释。通过将传感器移动到包含kb的孔中，记录解离持续9分钟。使用全局拟合模型(octet)计算由kd值表示的亲和力。使用octet red96(fortebio)设备。
[0513]
测试了三种交叉反应性抗体(s303 rigg1、s304 rigg1、s309 rigg1)和两种sars-cov-1特异性抗体(s230和s109)。所有抗体显示出与sars-cov-1 rbd的强结合。s230和s109不与sars-cov-2 rbd结合。s303 rigg1、s304 rigg1和s309 rigg1与sars-cov-2 rbd的结合处于纳摩尔范围内，其中s309 rigg1显示出最强亲和力。指示kd值位于图下方。在抗体结合非常强并且解离缓慢的情况下，kd值仅是估计值(kd＝《1.0x10-12
m)。由于解离过慢，因此无法通过此测定测量s309 rigg1的精确kd。
[0514]
实例4
[0515]
人单克隆抗体对sars-cov-2的中和
[0516]
使用如先前所描述的方法(temperton nj等人(2005)对sars冠状病毒及假型的中和抗体应答的纵向分析(longitudinally profiling neutralizing antibody response to sars coronavirus with pseudotypes.)《新兴传染病(emerg infect dis)》11(3):411
–
416)产生了用sars-cov-2 s基因(分离株βcov/wuhan-hu-1/2019；登录号mn908947)假型化的无复制能力的病毒。简而言之，将hek293t/17用sars-cov-2 s-表达质粒(phcmv1，genlantis公司(genlantis))以及用互补病毒-基因组报告基因载体pnl4-3.luc+.e-r+共转染。使用单循环感染性测定来测量用sars-cov-2 s蛋白假型化的荧光素酶编码病毒粒子的中和作用，如先前所描述的(temperton nj等人(2007)流感h5n1中和抗体的敏感逆转录病毒假型测定(a sensitive retroviral pseudotype assay for influenza h5n1-neutralizing antibodies.)《流感与其它呼吸道病毒(influenza other respi viruses)》1(3):105
–
112)。简而言之，将含病毒粒子的培养上清液的适当稀释液与不同浓度的抗体在37℃下预温育1小时，并且然后将病毒-mab混合物添加到感染前一天接种的vero e6细胞中。然后用steady-glo试剂(普洛麦格公司(promega)，e2520)裂解细胞，并且在光度计微板读取器(协同h1混合多模式读取器；伯腾公司(biotek))上确定细胞裂解物中
的相对发光单位(rlu)。通过比较在存在和不存在抗体的情况下的rlu来确定感染性的降低，并且表示为中和百分比。
[0517]
测试了抗体sars-cov-2 s300-v1、s301、s302、s303-v1、s304、s306、s307、s308-v1、s309(包括s309-v1 vh序列和s309-v13 vl(vk)序列)和s310的中和能力。显示抗体sars-cov-2 s300-v1和sars-cov-2 s309中和sars-cov-2。
[0518]
使用sars供体血浆和抗体sars-cov-2 s309、s311、s312、s303-v1(rigg1)、s304(rigg1)、s306(rigg1)、s310(rigg1)和s315进行进一步的中和测定。使用此测定，显示抗体s309、s311、s312和s315中和sars-cov-2。
[0519]
使用单克隆抗体s303、s304、s306、s309、s310和s315进行额外的中和测定。
[0520]
实例5
[0521]
重组人单克隆抗体对sars-cov-2的中和
[0522]
测定了两种重组sars-cov-1和sars-cov-2交叉中和抗体s304 rigg1和s309 rigg1对sars-cov-2假型化病毒(sars-cov-2pp)的中和活性。
[0523]
使用用sars-cov-2刺突蛋白(sars-cov-2pp)假型化的鼠白血病病毒(mlv)。将用ace2稳定转染的dbt细胞(dbt-ace2)用作靶细胞。用胰蛋白酶tpck以10ug/ml激活sars-cov-2pp。将经激活的sars-cov-2pp添加到抗体的稀释系列中(以50ug/ml终浓度/抗体开始，进行3倍稀释)。在介于50ug/ml与0.02ug/ml之间的浓度下对抗体进行测试。对于s304 rigg1和s309 rigg1的组合，每种抗体的起始浓度为50ug/ml，即起始抗体总量为100ug/ml。将dbt-ace2细胞添加到抗体-病毒混合物中并且温育48小时。在抽吸细胞培养上清液并且添加steady-glo底物(普洛麦格公司)之后测量发光。s309rigg1显示出0.37ug/ml的ic50，并且s304 rigg1显示出大约17ug/ml的ic50。两种抗体的组合被强烈中和，其中ic50为0.077μg/ml。使用与重组单克隆抗体s309和s315的相同程序，单独地或组合地进行进一步中和分析。s309显示出1.091ug/ml的ic50，并且s315显示出25.1ug/ml的ic50。两种抗体的组合显示出0.3047ug/ml的ic50。
[0524]
实例6
[0525]
人单克隆抗体对sars-cov和sars-cov-2的反应性
[0526]
通过酶联免疫吸附测定(elisa)测定了额外的人mab s311和s312与刺突s1亚基蛋白以及sars-cov和sars-cov-2蛋白的rbd的反应性。
[0527]
用重组sars-cov-2刺突s1亚基蛋白(义翘神州科技有限公司)、sars-cov-2 rbd(义翘神州科技有限公司或内部产生；来自βcov/wuhan-hu-1/2019的刺突的残基331-550，登录号mn908947)、重组sars-cov刺突s1亚基蛋白(义翘神州科技有限公司)或sars-cov rbd(义翘神州科技有限公司)涂覆96孔板。
[0528]
将孔洗涤并且用pbs+1％ bsa在室温下封闭1小时，并且然后在室温下与连续稀释的mab一起温育1小时。通过将碱性磷酸酶缀合的山羊抗人igg(南部生物科技公司(southern biotechnology)：2040-04)在室温下温育1小时并且通过含1mg/ml对硝基苯磷酸底物的0.1m甘氨酸缓冲液(ph 10.4)在室温下显影30分钟来检测结合的mab。在elisa读取器(powerwave 340/96分光光度计，伯腾公司)中以405nm的波长测量光密度(od)值。
[0529]
使用同一程序进行进一步测定，以确定人单克隆抗体s300、s307和s309对sars-cov-2和sars-cov-1的rbd的反应性。
[0530]
实例7
[0531]
重组人单克隆抗体s309和s315对sars-cov-2的中和
[0532]
测定了重组抗体s309 rigg1-ls和s315 rigg1-ls对sars-cov-2假型化病毒(sars-cov-2pp)的中和活性。
[0533]
使用用sars-cov-2刺突蛋白(sars-cov-2pp)假型化的鼠白血病病毒(mlv)。将用ace2稳定转染的dbt细胞(dbt-ace2)用作靶细胞。用胰蛋白酶tpck以10ug/ml激活sars-cov-2pp。将经激活的sars-cov-2pp添加到抗体的稀释系列中。将dbt-ace2细胞添加到抗体-病毒混合物中并且温育48小时。在抽吸细胞培养上清液并且添加steady-glo底物(普洛麦格公司)之后测量发光。使用受感染细胞的荧光素酶信号来计算相对于无抗体对照的中和百分比。
[0534]
s309 rigg1-ls显示出大约3.9nm的ic50，并且s315 rigg1-ls显示出大约111.7mm的ic50。
[0535]
将s309-rfab的中和活性与全长s309 rigg1-ls的中和活性进行比较。全长s309rigg-ls显示出3.821nm的ic50，而s309-rfab显示出3.532nm的ic50。
[0536]
实例8
[0537]
人单克隆抗体对sars-cov-1的rbd、sars-cov-2的rbd和各种冠状病毒的胞外域的反应性
[0538]
通过酶联免疫吸附测定(elisa)来测定单克隆抗体与sars-cov-1和sars-cov-2的rbd以及sars-cov-1、sars-cov-2、oc43和mers的刺突蛋白的反应性。
[0539]
用1μg/ml的sars-cov-1、sars-cov-2、oc43或mers的稳定化的融合前刺突蛋白三聚体或用10μg/ml的sars-cov-2 rbd(内部产生；来自βcov/wuhan-hu-1/2019的刺突的残基331-550，登录号mn908947)或1μg/ml的sars-cov-1 rbd(义翘神州科技有限公司)涂覆384孔浅elisa板。
[0540]
将孔洗涤并且用pbs+1％ bsa在室温下封闭1小时，并且然后在室温下用连续稀释的抗体温育1至2小时。在5μg/ml至0.00028μg/ml的浓度范围下测试抗体。将板洗涤，并且通过将碱性磷酸酶缀合的山羊抗人igg(南部生物科技公司：2040-04)在室温下温育1小时，随后使用含1mg/ml对硝基苯磷酸底物(西格玛-奥德里奇公司(sigma-aldrich)71768)的0.1m甘氨酸缓冲液(ph 10.4)在室温下显色30分钟来检测结合的抗体。在elisa读取器(powerwave 340/96分光光度计，伯腾公司)中以405nm的波长测量光密度(od)值。
[0541]
实例9
[0542]
单克隆抗体与sars-cov-1和sars-cov-2刺突蛋白的结合
[0543]
使用expifectamine cho增强子，用phcmv1-sars-cov-2-s、sars-刺突_pcdna.3(菌株sars)或空phcmv1转染expicho细胞。转染后两天，收集细胞以用抗体进行免疫染色。使用alexa647标记的次级抗体抗人igg fc进行检测。使用ze5细胞分析仪(伯乐公司(biorard))和flowjo软件(treestar)通过流式细胞术分析单克隆抗体与经转染的细胞的结合。阳性结合通过cov-s转染子与模拟转染子的差异性染色来定义。通过流式细胞术以10μg/ml测试单克隆抗体s309对表达sars-cov-1或sars-cov-2的s蛋白的expicho细胞的染色能力。
[0544]
通过流式细胞术测量单克隆抗体s303、s304、s306、s309、s310、s315、s110、s124、
s230和s109与sars-cov-1s蛋白或sars-cov-2 s蛋白的结合，并且计算ec50值。计算出这些抗体中的八种抗体对sars-cov-2 s蛋白结合的ec50值的范围介于1.4ng/ml与6,100ng/ml之间，并且对sars-cov-1s蛋白结合的ec50值的范围介于0.8ng/ml与254ng/ml之间。
[0545]
使用同一程序对重组单克隆抗体s309和四种s309变体进行进一步的结合测定。表2中示出了针对每种抗体的ec50值。实例17中概括了vh和vl氨基酸seq id no:。
[0546]
表2：
[0547]
抗体ec50(ng/ml)
–
实验1ec50(ng/ml)
–
实验2s309-11(“11”)23.111.5s309-12(“12”)22.39.6s309-13(“13”)21.88.9s309-14(“14”)21.48.4s309-15(“15”)18.87.8
[0548]
使用单克隆抗体s303、s304、s306、s309、s310、s315和比较抗体s109、s110、s124和s230进行使用同一程序的额外的测定。
[0549]
还使用重组单克隆抗体s300和s307进行使用同一程序的测定。
[0550]
实例10
[0551]
使用octet将人单克隆抗体s309、s303、s304和s315与sars-cov-2和sars-cov-1的rbd结合
[0552]
使用octet测试重组单克隆抗体s309、s303、s304和s315的亲和力。
[0553]
将sars-cov-1或sars-cov-2的his标记的rbd在动力学缓冲液(kb)中以3μg/ml加载到抗his(his2)生物传感器(分子装置，富迪生物公司(fortebio))上持续15分钟。全长抗体的缔合在kb中以15μg/ml进行5分钟。fab片段的缔合在kb中以5μg/ml进行5分钟。测量kb中的解离10分钟。
[0554]
使用全局拟合模型(octet)计算由kd值表示的亲和力。使用octet red96(富迪生物公司)设备。
[0555]
这些抗体中的每种抗体以纳摩尔至亚皮摩尔亲和力与sars-cov-2和sars-cov-1rbd结合。
[0556]
实例11
[0557]
人单克隆抗体s309 igg和s309 fab与sars-cov-2 s蛋白胞外域三聚体和rbd的结合
[0558]
与fab片段相比，igg1的亲和力和亲合力测定：将sars-cov-2的生物素化rbd(内部产生；来自βcov/wuhan-hu-1/2019的刺突蛋白的残基331-550，登录号mn908947，用来自赛默飞世尔公司(thermofisher)的ez-link nhs-peg4-生物素进行生物素化)和生物素化sars-cov-2 2p s avi标签在动力学缓冲液(kb；0.01％不含内毒素的bsa，0.002％吐温-20，含0.005％ nan3的pbs)中以7.5μg/ml加载到链霉亲和素生物传感器(分子装置，富迪生物公司)上持续8分钟。igg1和fab的缔合在kb中以100nm、33nm、11nm、3.6nm、1.2nm进行5分钟。测量kb中的解离10分钟。使用1:1全局拟合模型(octet)计算kd值。s309 igg分别以亚皮摩尔和皮摩尔亲合力与sars-cov-2 rbd和s胞外域三聚体结合。s309 fab以纳摩尔至亚纳摩尔亲和力与sars-cov-2 rbd和s胞外域三聚体两者结合。
[0559]
人单克隆抗体与sars-cov-1或sars-cov-2的rbd的竞争性结合
[0560]
测量了成对的单克隆抗体与sars-cov-1 rbd或sars-cov-2 rbd的竞争性结合以定义抗体的结合位点。
[0561]
在用动力学缓冲液(kb；0.01％不含内毒素的bsa，0.002^吐温-20，含0.005％ nan3的pbs)进行水合步骤10分钟之后，使用链霉亲和素生物传感器(颇尔富迪生物公司)来以3ug/ml固定抗strep标签ii抗体(克隆5a9f9，生物素，瑞士穆滕茨的labforce股份有限公司)。然后将具有strep标签ii(内部产生)的sars-cov-1或sars-cov-2 rbd在kb中以4μg/ml的浓度加载6分钟。允许第一抗体缔合一段时间，然后允许第二抗体缔合一段时间。
[0562]
实例13
[0563]
人单克隆抗体s309和rbd与人ace2的竞争性结合
[0564]
测量了单克隆抗体和rbd与人ace2的竞争性结合。将ace2-his(生物技术股份有限公司(bio-techne ag))在动力学缓冲液(kb)中以5μg/ml加载到抗his(his2)生物传感器(分子装置-富迪生物公司)上，持续30分钟。在使用或不使用30μg/ml的抗体的情况下预温育30分钟之后，将sars-cov-1 rbd-兔fc或sars-cov-2 rbd-小鼠fc(义翘神州欧洲分公司(sino biological europe gmbh))以1μg/ml缔合15分钟。监测解离持续5分钟。
[0565]
实例14
[0566]
人单克隆抗体的抗体依赖性细胞毒性和抗体依赖性细胞吞噬作用
[0567]
自然杀伤细胞(nk)介导的抗体依赖性细胞毒性(adcc)可以通过杀伤在其表面上显示病毒蛋白的受感染细胞而有助于病毒控制。为了研究分离的ab利用此功能的能力，使用新鲜分离的人nk细胞作为效应子细胞并且使用sars-cov-2 s转染的expicho细胞作为靶细胞对adcc进行体外研究。将靶细胞与不同量的抗体一起温育，并且在10分钟之后，与作为效应子细胞的原代人nk细胞以9:1的靶标:效应子比率一起温育。使用macsxpress nk分离试剂盒(美天旎生物科技公司(miltenyi biotec)，目录号：130-098-185)从健康供体的新鲜血液中分离nk细胞。使用ldh释放测定(细胞毒性检测试剂盒(ldh)(罗氏公司(roche)，目录号：11644793001)在37℃下温育4小时之后测量抗体依赖性细胞杀伤。
[0568]
巨噬细胞或树突状细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)也可以通过清除受感染细胞和通过用病毒抗原呈递潜在地刺激t细胞应答而有助于病毒控制。用外周血单核细胞作为吞噬细胞和用pkh67荧光细胞接头试剂盒(西格玛奥德里奇公司，目录号：mini67)荧光标记的sars-cov-2 s转染的作为靶细胞的expicho测试adcp。将靶细胞与不同量的抗体一起温育10分钟，随后与从用细胞痕量紫色(英杰公司(invitrogen)，目录号：c34557)荧光标记的健康供体中分离的人pbmc以20:1的效应子:靶标比率一起温育。在37℃下温育过夜之后，将细胞用抗人cd14-apc抗体(bd pharmingen公司(bd pharmingen)，目录号：561708，克隆m5e2)进行染色，以对吞噬细胞进行染色。通过流式细胞术确定抗体介导的吞噬作用，从而测量对pkh67荧光呈阳性的单核细胞的％。
[0569]
测定了人单克隆抗体s309、s304、s306、s315、s230以及s309和s304的组合的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)。
[0570]
测试了单克隆抗体s309的fc变体的adcc。s309-ls包含mlns fc突变。s309-grlr包含g236r/l328r fc突变，所述突变表现出与fcγr的最小结合。s309-ls-gaalie包含mlns fc突变和gaalie fc突变两者。
[0571]
测定了人单克隆抗体s303、s304、s306、s309、s315以及s309和s315的组合的adcc和adcp。至少非grlr s309抗体(单独或与s304组合)显示出adcc和adcp。
[0572]
实例15
[0573]
单克隆抗体对经sars-cov-2感染的细胞的细胞裂解物的反应性
[0574]
测量了单克隆抗体s304、s306、s309和s310对经sars-cov-2感染的veroe6细胞的细胞裂解物的反应性。
[0575]
实例16
[0576]
单克隆抗体s304和s309单独地和组合地对sars-cov-2感染的中和
[0577]
使用sars-cov-2活病毒测定评估单克隆抗体s304和s309对sars-cov-2感染的中和。活病毒中和测定通过用np特异性多克隆兔血清染色病毒核蛋白(np)来对受感染细胞的数量进行定量。通过在感染后24小时和45小时测量np表达来评估抑制。使用酶免疫测定(eia)来对所测试的每种抗体稀释液的感染水平进行定量。
[0578]
在96孔板中使用单层vero e6细胞在所指示的抗体浓度下在室温下进行中和一小时。用100tcid50的病毒感染孔。在24小时或45小时之后，将单层固定并且染色以抑制np表达。单克隆抗体s304和s309示出了中和的协同增强。
[0579]
实例17
[0580]
s309 rigg变体的产生
[0581]
重组igg1抗体使用单克隆抗体s309的vh和vl序列产生。s309-11包括s309的野生型vh序列(seq id no:105)和野生型vl序列(seq id no:168)。s309-12包括s309的n55q vh变体序列(seq id no:113)和野生型vl序列(seq id no:168)。s309-13包括s309的w50f变体序列(seq id no:129)和野生型vl序列(seq id no:168)。s309-14包括s309的w105f变体序列(seq id no:119)和野生型vl序列(seq id no:168)。s309-15包括s309的w50f/g56a/w105f vh变体序列(seq id no:172)和野生型vl序列。s309重组抗体和四种变体中的每种变体都是通过在hd 293f细胞(金斯瑞公司(genscript))中瞬时转染和表达编码重组抗体的质粒载体而产生的。在第4天采集细胞，并且通过蛋白质印迹和蛋白a滴度分析验证igg表达。
[0582]
实例18
[0583]
通过spr测量的s309 rigg和变体与sars-cov-2 rbd的结合
[0584]
使用表面等离子体共振(spr)测量重组单克隆抗体s309和四种变体(参见实例17)与rbd的结合。使用单循环动力学方法，用biacore t200仪器进行spr实验。将s309 igg捕获在表面上，并且注射递增浓度的糖基化或去糖基化的经纯化的sars-cov-2 rbd。使用具有共价固定的抗人fc的传感器芯片(美国通用电气公司(ge))进行spr。所使用的缓冲液是10mm hepes ph 7.4、150mm nacl、3mm edta和0.05％ p20洗涤剂。在25℃下进行测定。将重组抗体从上清液稀释到大约2μg/ml。rbd浓度为0.8nm、3.1nm、12.5nm、50nm和200nm。通过在hek293细胞中表达来获得糖基化rbd，并且使用一步ni亲和纯化进行纯化。通过在存在几夫碱(kifunensine)的情况下生长的expi293细胞中内部表达、使用一步ni亲和纯化进行纯化以及用糖苷内切酶h处理来获得去糖基化rbd。用3分钟注射和20分钟解离周期进行单循环动力学测定。监测缔合和解离动力学并且将其拟合到结合模型以确定亲和力。表3中概括了结果。
[0585]
表3：
[0586][0587]
在两个不同的spr测定中使用不同参数测量与去糖基化rbd的结合。实验1使用10分钟注射和从100nm开始的4倍稀释的rbd浓度系列。实验2使用3分钟注射和从200nm开始的4倍稀释的浓度系列，如上所述。表4中示出了结果。
[0588]
表4：
[0589][0590]
使用上述相同程序通过表面等离子体共振(spr)测量重组单克隆抗体s309和五种变体与rbd的结合，除了使用经纯化的重组抗体而不是细胞培养上清液。表5中示出了结果。
[0591]
表5：
[0592][0593]
实例19
[0594]
重组单克隆抗体s309和四种变体对sars-cov-2的中和
[0595]
使用基于vsv的荧光素酶报告基因假型化系统(卡拉法斯特公司(kerafast))来测定重组单克隆抗体s309和四种变体(实例17)的中和活性。将vsv假颗粒和抗体在dmem中混合，并允许在37℃下温育30分钟。然后允许感染混合物与vero e6细胞在37℃下一起温育1小时，随后添加具有pen-strep和10％ fbs的dmem(不去除感染混合物)。将细胞在37℃下温育18-24小时。在添加bio-glo试剂(普洛麦格公司)之后，使用ensight酶标仪(珀金埃尔默公司(perkin elmer))测量荧光素酶。表6中示出了基于此实验的所计算的ec50值。
[0596]
表6：
[0597]
重组抗体ec50s309-11(wt)109s309-12(n55q)103s309-13(w50f)97s309-14(w105f)65s309-15(w50f/g56a/w105f)53
[0598]
实例20
[0599]
人fcγriiia或fcγriia的抗体依赖性激活的测定
[0600]
使用用sars-cov-2 s(βcov/wuhan-hu-1/2019)瞬时转染、与滴定浓度的抗体一起温育10分钟的expicho细胞，对人fcgriiia或fcgriia的抗体依赖性激活进行测定。然后将expicho细胞与在其表面表达fcγriiia受体或fcgriia的jurkat细胞一起温育，并且用nfat驱动的荧光素酶基因(普洛麦格公司，目录号：g9798和g7018)以对于fcγriiia的6:1效应子与靶标比率以及对于fcγriia的5:1效应子与靶标比率进行稳定转染。在此生物测定中激活人fcγr导致nfat介导的荧光素酶报告基因表达。根据制造商的说明书，在5％ co2的情况下在37℃下温育21小时之后，使用bio-glo tm荧光素酶测定试剂测量发光。测定了单克隆抗体s303、s304、s306、s309、s315以及s309和s315的组合，连同比较抗体s320。s309(单独地或与s315组合地)激活fcγriiia(v158)和fcγriia(h131)。
[0601]
实例21
[0602]
sars-cov-2 s糖蛋白序列的分析
[0603]
对2,229个sars-cov-2分离株的s糖蛋白序列进行分析，并且表明sars-cov-2 s胞外域发生了具有可变频率的若干突变。
[0604]
使用11,839个sars-cov-2分离株对s糖蛋白序列进行另外的分析。s309结合的表位在除了四个分离株外的所有分离株中都是保守的，并且这些分离株包含预期不会影响s309识别的n354d或s359n取代。
[0605]
实例22
[0606]
抗体s309与从sars-cov-2患者中分离的抗体的竞争
[0607]
测试从sars-cov-2感染中恢复的患者中分离的人单克隆抗体与单克隆抗体s309的rbd结合位点的重叠。使用octet(仪器：octet red96，富迪生物公司)进行竞争测定。使用抗his传感器(生物传感器抗penta-his(his1k)1*1st)来以3μg/ml的浓度固定内部产生的sars-cov-2的his标记的rbd(来自βcov/wuhan-hu-1/2019的刺突蛋白的残基331-550，登录号mn908947)。抗体以15μg/ml缔合6分钟。所有蛋白质均在动力学缓冲液(kb)中稀释。然后将竞争性抗体以相同浓度缔合另外6分钟。显示两种抗体与s309竞争结合rbd，但与s309不同，所述两种抗体不会中和sars-cov-2。数据未示出。
[0608]
实例23
[0609]
针对单克隆抗体s309-12-mlns的sars-cov-2的抗性选择
[0610]
为了检查抗性选择，在存在vero e6细胞和固定浓度的单克隆抗体s309-12-mlns(即，在fc中具有mlns突变的s309 n55q(vh))的情况下将sars cov-2传代一个月以上。通过目视检查板评估致细胞病变效应(cpe)。即使在未观察到cpe时，也通过用甲基纤维素覆盖的病灶形成测定来评估病毒滴度。即使在所测试的最小抗体浓度下，在抗体处理的孔中也
未观察到病毒突破的证据。数据表示一式三份的孔。
[0611]
实例24
[0612]
单克隆抗体s309对c
alu-3人肺细胞的sars-cov-2感染的中和
[0613]
使用纳米荧光素酶测定，测试了单克隆抗体s309中和活sars-cov-2病毒感染的calu-3人肺细胞(其对于跨膜蛋白酶tmprss2呈阳性)和veroe6细胞的能力。在此测定中，s309在calu-3细胞中的ic50为97.70μg/ml，并且在veroe6细胞中的ic50为158.5μg/ml。
[0614]
实例25
[0615]
单克隆抗体s309对sars-cov-2感染的中和
[0616]
使用纳米荧光素酶测定和ifa测定测试了单克隆抗体s309对活sars-cov-2病毒感染的中和。简而言之，模型细胞用活sars-cov-2荧光素酶病毒感染六小时。使用三种不同的抗体浓度收集数据：1、0.1和0.01moi。
[0617]
来自纳米荧光素酶测定的结果如下：在1moi下，s309 ic50为240.6μg/ml；在0.1moi下，s309 ic50为235.3μg/ml，并且在0.01moi下，s309 ic50为206.6μg/ml。
[0618]
来自ifa测定的结果如下：在1moi下，s309 ic50为233.0μg/ml；在0.1moi下，s309 ic50为156.5μg/ml，并且在0.01moi下，s309 ic50为142.8μg/ml。值得注意的是，在这种感染形式中没有观察到感染簇(或病灶(foci))。
[0619]
实例26
[0620]
单克隆抗体s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie对sars-cov-2感染的中和
[0621]
测定了单克隆抗体s309 n55q ls(在本文中也称为s309 n55q mlns，包括m428l/n434s fc突变)和s309 n55q ls gaalie(在本文中也称为s309 n55q mlns gaalie，包括g236a、a330l、i332e、m428l和n434s fc突变)中和活sars-cov-2病毒感染的能力。s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie中的每一个包括vh和vl，所述vh具有seq id no:113所示的序列，所述vl具有seq id no:168所示的序列。针对s309 n55q ls的所计算的ec50为100.1ng/ml。针对s309 n55q ls gaalie的所计算的ec50为78.3ng/ml。
[0622]
实例27
[0623]
单克隆抗体s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie对sars-cov-2假型化病毒的中和
[0624]
测试了单克隆抗体s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie对sars-cov-2假型化病毒的中和。假型化病毒是用sars-cov-2刺突蛋白假型化的vsv。针对s309 n55q ls的所计算的ec50值为24.06ng/ml。针对s309 n55q ls gaalie的所计算的ec50值为22.09ng/ml。
[0625]
实例28
[0626]
单克隆抗体s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie与sars-cov-2 rbd的结合
[0627]
通过表面等离子体共振(spr)测量单克隆抗体s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie与sars-cov-2 rbd的结合。两种抗体都表现出强结合。
[0628]
实例29
[0629]
单克隆抗体s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie与sars-cov-2刺突蛋白的结合
[0630]
通过流式细胞术测量单克隆抗体s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie与sars-cov-2与sars-cov-2刺突蛋白的结合。两种抗体都以低至大约10ng/ml的浓度与刺突蛋白结合，并且以10,000ng/ml抗体与超过60％的细胞结合。
[0631]
实例30
[0632]
单克隆抗体s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie与人fcγ受体的结合
[0633]
使用spr测定单克隆抗体s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie与人fcγ受体的结合。测量了与fcγriia(低亲和力r131和高亲和力h131等位基因两者)、fcγriiia(低亲和力f158和高亲和力v158等位基因两者)和fcγriib的结合。将生物素捕获试剂(经修饰的链霉亲和素)跨对接在biacore t200(思拓凡公司(cytiva))中的cap传感器芯片的所有流通池注射。将1μg/ml的生物素化fc受体以10微升/分钟跨单流动池注射60秒(每个流动池一个受体)，其中保留一个流动池作为参考表面。使用30微升/分钟的流速将100μg/ml的抗体(稀释在hbs-ep+中)跨所有流动池注射200秒，并且监测缔合。注射后再监测解离200秒。以10hz收集数据。在每次结合测量之后，注射cap再生试剂以制备用于新循环的表面。实验在25℃下进行，其中在注射之前将样品在仪器中保持在15℃下。两种抗体都具有与所有所测试的fcγ受体的至少可测量结合。s309 n55q ls gaalie与除了fcγriib之外的所有fcγ受体的结合增加(与s309 n55q ls相比)。
[0634]
实例31
[0635]
单克隆抗体s309 ls、s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie与补体组分c1q的结合
[0636]
在octet仪器上通过生物层干涉测量法(bli)测量单克隆抗体s309 ls、s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie与补体组分c1q的结合。使用抗人fab(ch1特异性)传感器来捕获10μg/ml的抗体10分钟。然后将加载igg的传感器暴露于包含3μg/ml的经纯化的人c1q的动力学缓冲液中持续4分钟，随后是在同一缓冲液中进行解离步骤持续另外4分钟。随着干涉图样的变化，实时测量缔合和解离谱。s309 ls和s309 n55q ls与c1q强烈结合，但s309 n55q ls gaalie不强烈结合。
[0637]
实例32
[0638]
单克隆抗体s309 ls、s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie对人fcγ受体的体外激活
[0639]
在体外测定了单克隆抗体s309 ls、s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie引发人fcγ受体的抗体依赖性激活的能力。将s309 ls、s309 n55q ls、s309 n55q ls gaalie中的每一个和阴性对照抗体s309-grlr在测定缓冲液中从10,000ng/ml连续稀释6倍至0.006ng/ml。在室温下，将连续稀释为九个浓度的抗体在每个白色平底96孔板的孔中与12,500个(对于fcγriiia和fcγriib)或10,000个(对于fcγriia)cho-cov-2-刺突细胞温育15分钟。将表达所指示的fcγr并且用nfat驱动的荧光素酶基因稳定转染的jurkat效应细胞解冻，在测定缓冲液中稀释，并且以对于fcrγiiia和fcγriib为6:1或对于fcγriia为5:1的效应子与靶细胞比率添加到板中。包括对照孔以测量非抗体依赖性激活(包含靶细胞和效应细胞但不包含抗体)和板的背景发光(仅包含测定缓冲液的孔)。在37℃下，在5％ co2的情况下，将板温育18小时。在此生物测定中激活人fcγr导致nfat介导的荧光素酶报告基因表达。根据制造商的说明书，在添加bio-glo
tm
荧光素酶测定试剂之后，用光度计测量发光。阴性对照显示示出fcγriib的低水平激活，并且不激活任何其它fcγr。s309 n55q ls gaalie是强烈激活fcγriiia(f158)的唯一抗体。所有非grlr s309抗体激活fcγriia、fcγriib和fcγriiia(v158)。
[0640]
实例33
[0641]
人单克隆抗体s309 ls、s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie的效应子功能
[0642]
测定了人单克隆抗体s309 ls、s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie促进nk细胞介导的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)和单核细胞介导的抗体依赖性细胞吞噬作用(adcp)对抗表达cov2刺突蛋白的细胞的能力。
[0643]
通过将来自表达纯合低亲和力(f/f158)或高亲和力(v/v158)fcγriiia的两个基因分型的供体的新鲜分离的人nk细胞暴露于用cho-cov-2-刺突细胞预温育的抗体并且在37℃下温育4小时之后根据制造商的说明书(细胞毒性检测试剂盒(ldh)，罗氏公司)测量ldh释放作为读数，对adcc进行体外测量。简而言之，将板以400x g离心4分钟，并且将35μl的上清液转移到平坦的384孔板中。制备ldh试剂，并且将35μl添加到每个孔中。使用动力学方案，每2分钟测量一次490nm和650nm处的吸光度持续8分钟，并且将动力学曲线的斜率用作结果。通过应用下式确定百分比特异性裂解：(特异性释放-自发释放)/(最大释放-自发释放)x100。将s309 grlr用作阴性对照。所有非grlr s309抗体均引发adcc。
[0644]
通过将新鲜分离的人pbmc(用细胞痕量紫色标记)暴露于用抗体预温育的表达cho-cov-2-刺突的细胞(用pkh67荧光细胞接头试剂盒(西格玛奥德里奇公司)标记)通过原代cd14+单核细胞来体外测量单克隆抗体s309 ls、s309 n55q ls、s309 n55q ls gaalie和对照抗体s309-grlr促进adcp的能力。将mab的连续稀释液(在补充有10％胎牛血清fbs+2x抗-抗(抗生素-抗真菌剂)的rpmi-1640+l-谷氨酰胺中从5
′
,000ng/ml连续稀释5倍至0.32ng/ml)与96孔聚丙烯板的每孔10
′
000个cho-cov-2-刺突细胞一起温育10分钟。根据制造商的说明书，用细胞痕量紫色荧光标记原代pbmc。然后将靶细胞和抗体混合物与经标记的pbmc以16:1的效应子与靶标比率一起温育。在过夜温育之后，通过标记cd14的单核细胞群体并且通过流式细胞术测量cd14+单核细胞中细胞痕量紫色+pkh67+细胞的百分比来测量adcp活性。
[0645]
实例34
[0646]
单克隆抗体s309对sars-cov-2刺突蛋白介导的细胞融合的影响
[0647]
使用经工程化以在细胞表面上过表达刺突蛋白的细胞来测试单克隆抗体s309对sars-cov-2刺突蛋白介导的融合的影响。添加s309这些细胞培养物抑制s蛋白介导的细胞-细胞融合。
[0648]
实例35
[0649]
单克隆抗体s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie对sars-cov-2复制的影响
[0650]
在veroe6细胞、pbmc和树突状细胞中测试单克隆抗体s309 n55q ls和s309 n55q ls gaalie对sars-cov-2复制的影响。将sars-cov-2病毒与抗体s309 n55q ls或s309n55q ls gaalie一起温育一小时。然后将病毒/抗体混合物添加到铺板的veroe6、pbmc或单核细胞衍生的树突状(modc)细胞中。在将细胞与病毒/抗体混合物在37℃下一起温育一小时之后，将细胞洗涤并且在新鲜培养基中进一步温育72小时。然后测定来自培养细胞的上清液的病灶形成单位(ffu)。将上清液以1:5稀释并且添加到veroe6细胞中。在37℃下一小时之后，用甲基纤维素覆盖veroe6细胞。在24小时进一步温育之后，对veroe6细胞培养物针对sars-cov-2核蛋白进行染色。结果显示，s309变体抗体不会引起抗体介导的人供体源性pbmc或树突状细胞中sars-cov-2复制的增强。
[0651]
实例36
[0652]
从sars-cov-2感染中恢复的个体的血清中的rbd表位特异性抗体
[0653]
测试来自诊断为患有covid-19的住院、有症状和无症状个体的血清与结合sars-cov-2刺突蛋白rbd的经鉴定的抗原位点的单克隆抗体的结合竞争。
[0654]
根据制造商的说明书，使用ez-linktm nhs-peo固相生物素化试剂盒(赛默科技公司(thermo scientific)，#21450)产生、纯化和生物素化六种抗体(s2h13、s2h14、s2a4、s2x35、s304和s309)，这些抗体的抗原结合位点通过x晶体学或cryo-em在rbd分子上得以鉴定。通过elisa测量与rbd的结合。简而言之，用1ug/ml rbd(小鼠fc标签，义翘神州欧洲分公司，目录号40592-v05h)涂覆96孔半面积板(康宁公司(corning)，目录3690)，并且用封闭缓冲液(酪蛋白1％，赛默飞世尔科技公司，目录号37528，+0.05％吐温20)封闭。滴定生物素化单克隆抗体并且将其添加到板中，随后与链霉亲和素-ap和pnpp底物(西格玛(sigma)n2765-100tab)一起温育。通过分光光度计在405nm处读取板以确定光密度(od)。使用graph prism软件通过非线性回归分析计算确定80％与rbd(ec80)结合的生物素化抗体的浓度。大多数血清(58-62％)包含针对rbd位点ia的抗体，所述rbd site ia是与ace2受体相互作用的受体结合基序的主要部分之一。此部分仅在rbd的开放构象中是可访问的。小部分的血清(25-41％)包含识别其它rbd位点的抗体。
[0655]
为了测定rbd抗原性位点特异性抗体的量，如上所述通过elisa用额外的步骤测试滴定的血清，其中在温育20分钟之后将2x bc80浓度的生物素化抗体添加到血清顶部。测量反映生物素化抗体的残余结合的od，并且测量与对照孔(在不含血清和生物素化抗体的孔中为100％，在不含血清的孔中为0％)相比的结合抑制百分比。使用graph prism软件通过非线性回归分析计算确定80％的结合阻断(bd80)的血清稀释度。类似地，通过测试经纯化的单克隆抗体而不是血清的滴定来确定6种单克隆抗体结合的80％的自阻断(bc80)。对于每种血清，将rbd抗原性位点特异性抗体的所估计量用下式以浓度当量(ug/ml)样品进行测定：bd80xbc80。对六个rbd位点的抗体应答在个体之间有所变化，其中一些个体显示出较差的抗体应答。
[0656]
实例37
[0657]
材料与方法
[0658]
针对与在哺乳动物细胞上表达的cov s蛋白的结合的基于流式细胞术的筛选
[0659]
用sars-cov-2、sars-cov和mers-cov的s蛋白，或用空质粒作为阴性对照转染expicho细胞。然后通过流式细胞术以10μg/ml测试单克隆抗体对表达2019-ncov、sars-cov、mers-cov的s蛋白的expicho细胞或模拟细胞转染子的染色能力。
[0660]
重组sars-cov-2蛋白的瞬时表达
[0661]
将sars-cov-2菌株(2019-ncov-s)分离株βcov/wuhan-hu-1/2019(登录号mn908947)的全长s基因进行密码子优化以用于人细胞表达并且克隆到phcmv1表达载体(genlantis公司)中。使用expifectamine cho增强子，用phcmv1-sars-cov-2-s、phcmv1-mers-cov-s(london1/2012)、sars-刺突_pcdna.3(菌株sars)或空phcmv1(模拟)瞬时转染expi-cho细胞。转染后两天，将细胞收集、固定或固定并用皂苷透化，以用于与对sars-cov受体结合结构域(rbd)具有反应性的一组单克隆抗体进行免疫染色。使用alexa647标记的次级抗体抗人igg fc进行检测。使用ze5细胞分析仪(伯乐公司)和flowjo软件(treestar)通过流式细胞术来分析抗体与经转染的细胞的结合。阳性结合通过cov-s转染子对模拟转
染子的差异性染色来定义。
[0662]
使用octet(bli，生物层干涉测量法)的竞争实验
[0663]
除非本文另外指示，否则使用抗his传感器(生物传感器抗penta-his(his1k))来固定sars-cov的s1亚基蛋白(义翘神州公司欧洲分公司)。将传感器用动力学缓冲液(kb；0.01％不含内毒素的bsa，0.002^吐温-20，含0.005％ nan3的pbs)进行水合持续10分钟。然后将sars-cov s1亚基蛋白在kb中以10μg/ml的浓度加载8分钟。针对全长mab ncov-10和ncov-6mab，将抗体以15μg/ml缔合6分钟，或者针对fab ncov-4，将抗体以5μg/ml缔合，并且在随后的实验中包括全部以10μg/ml的ncov-1。然后将竞争性抗体以相同浓度缔合另外6分钟。
[0664]
使用octet(bli，生物层干涉测量法)的竞争实验
[0665]
对于ace2竞争实验，将ace2-his(生物技术股份有限公司)在kb中以5μg/ml加载到抗his(his2)生物传感器(分子装置-富迪生物公司)上持续30分钟。在使用或不使用抗体(30μg/ml，30分钟)的情况下预温育之后，将1μg/ml的sars-cov-1 rbd-兔fc或sars-cov-2 rbd-小鼠fc(义翘神州公司欧洲分公司)缔合15分钟。监测解离持续5分钟。
[0666]
使用octet(bli，生物层干涉测量法)的亲和力测定
[0667]
对于全长抗体的kd测定，在用动力学缓冲液进行水合步骤10分钟之后，使用蛋白a生物传感器(颇尔富迪生物公司)来将重组抗体以2.7μg/ml固定1分钟。通过将抗体涂覆的传感器与不同浓度的sars-cov-1 rbd(义翘神州科技有限公司)或sars-cov-2 rbd(内部产生；来自βcov/wuhan-hu-1/2019的刺突的残基331-550，登录号mn908947)一起温育，记录缔合曲线持续5分钟。所测试的最高rbd浓度为10ug/ml，然后以1:2.5连续稀释。通过将传感器移动到包含kb的孔中，记录解离持续9分钟。使用全局拟合模型(octet)计算kd值。使用octet red96(富迪生物公司)设备。
[0668]
对于与fab片段相比全长抗体的kd测定，将sars-cov-1或sars-cov-2的his标记的rbd在kb中以3μg/ml加载到抗his(his2)生物传感器(分子装置，富迪生物公司)上持续15分钟。在kb中分别以15ug/ml和5ug/ml进行全长抗体和fab的缔合持续5分钟。测量kb中的解离10分钟。
[0669]
elisa结合
[0670]
通过酶联免疫吸附测定(elisa)来确定mab与sars-cov刺突s1亚基蛋白(菌株wh20)蛋白的反应性。简而言之，用3μg/ml的重组sars-cov刺突s1亚基蛋白(义翘神州生物公司)涂覆96孔板。将孔洗涤并且用pbs+1％ bsa在室温下封闭1小时，并且然后在室温下与连续稀释的mab一起温育1小时。通过将碱性磷酸酶缀合的山羊抗人igg(南部生物科技公司：2040-04)在室温下温育1小时并且通过含1mg/ml对硝基苯磷酸底物的0.1m甘氨酸缓冲液(ph 10.4)在室温下显影30分钟来检测结合的mab。在elisa读取器(powerwave 340/96分光光度计，伯腾公司)中以405nm的波长测量光密度(od)值。
[0671]
中和测定
[0672]
除非另有指示，否则使用用sars-cov-2刺突蛋白(sars-cov-2pp)或sars-cov-1刺突蛋白(sars-cov-1pp)假型化的鼠白血病病毒(mlv)。将用ace2稳定转染的dbt细胞(dbt-ace2)用作靶细胞。用胰蛋白酶tpck以10ug/ml激活sars-cov-2pp或sars-cov-1pp。将经激活的sars-cov-2pp或sars-cov-1pp添加到抗体的稀释系列中(以50ug/ml终浓度/抗体开
始，进行3倍稀释)。将dbt-ace2细胞添加到抗体-病毒混合物中并且温育48小时。在抽吸细胞培养上清液并且添加steady-glo底物(普洛麦格公司)之后测量发光。
[0673]
除非另外指示，否则假颗粒中和测定使用基于vsv的荧光素酶报告基因假型化系统(卡拉法斯特公司)。将vsv假颗粒和抗体在dmem中混合，并允许在37℃下温育30分钟。然后允许感染混合物与vero e6细胞在37℃下一起温育1小时，随后添加具有pen-strep和10％ fbs的dmem(不去除感染混合物)。将细胞在37℃下温育18-24小时。在添加bio-glo试剂(普洛麦格公司)之后，使用ensight酶标仪(珀金埃尔默公司(perkin elmer))测量荧光素酶。
[0674]
spr单循环动力学
[0675]
使用单循环动力学方法，用biacore t200仪器进行spr实验。将s309 igg捕获在表面上，并且注射递增浓度的糖基化或去糖基化的经纯化的sars-cov-2 rbd。监测缔合和解离动力学并且将其拟合到结合模型以确定亲和力。
[0676]
重组抗体的表达
[0677]
如先前所述，在用表达重链和轻链的质粒瞬时共转染的expicho细胞中表达重组抗体。(stettler等人(2016)由寨卡病毒感染引发的抗体的特异性、交叉反应性和功能(specificity,cross-reactivity,and function of antibodies elicited by zika virus infection.)《科学》,353(6301),823-826)单克隆抗体s303、s304、s306、s309、s310和s315被表达为rigg-ls抗体。ls突变赋予更长的体内半衰期。(zalevsky等人(2010),增强的抗体半衰期提高体内活性(enhanced antibody half-life improves in vivo activity.)《自然生物技术》,28(2),157-159)。
[0678]
序列比对
[0679]
使用“完全(》29,000bp)”和“低覆盖率排除”过滤器于2020年3月29日从gisaid下载sars-cov-2基因组序列。去除蝙蝠和穿山甲序列以产生仅人的序列。通过用genewise2进行参考蛋白(yp_009724390.1)-基因组比对来定位刺突orf。拯救不完全匹配和包含插入缺失的orf，并且将其包括在下游分析中。使用seqkit在计算机上翻译核苷酸序列。去除具有超过10％未确定氨基酸(由于n次碱基调用)的序列。使用mafft进行多重序列比对。通过使用r/bioconductor包biostrings将比对序列(n＝2,229)与参考序列进行比较来确定变体。使用类似策略来从来自来源于vipr的sars-cov基因组中提取和翻译刺突蛋白序列(搜索标准：sars相关冠状病毒、全长基因组、人宿主、在2019年12月之前保藏以排除sars-cov-2，n＝53)。来源的sars-cov基因组序列包括所有主要的公开菌株，如urbani、tor2、tw1、p2、frankfurt1等。如tsan-yuk lam等人所示的穿山甲序列来源于gisaid。如lu等人(《柳叶刀(lancet)》2020)所示的来自沙贝病毒(sarbecoviruse)的三个进化枝的蝙蝠序列来源于genbank。麝猫和貉序列类似地来源于genbank。
[0680]
实例38
[0681]
索托维单抗(s309 n55q ls)和vir-7832(s309 n55q ls gaalie)用于治疗轻度至中度covid-19疾病的1/2期临床研究
[0682]
在多中心、多组、多剂量、多阶段开放标签、适应性、无缝i期/ii期贝叶斯随机化平台试验(600名患者)的一个组中，确定用于治疗covid-19的多种候选药剂的最佳剂量、活性和安全性，评估了索托维单抗(s309 n55q ls；更详细地，索托维单抗是经工程化的单克隆
抗体(igg1*01g1m17；seq id no:113的vh、m428l和n434s fc突变；seq id no:168的vl(κ轻链igkc*01k1m3))和vir-7832((igg1*01g1m17；seq id no:113的vh、g236a、a330l、i332e、m428l和n434s fc突变；seq id no:168的vl(κ轻链igkc*01k1m3))，在候选物与对照之间随机化，其中以2:1分配有利于候选物。在6名患者的群组中依次评估每个剂量的安全性。此组包括3:1的vir-7832的随机化、盲法、安慰剂对照的i期试验，随后是2:2:1的vir-7832对比于索托维单抗以及安慰剂的盲法平行组ii期试验。通过静脉内(iv)输注施用单剂量的vir-7832。起始剂量为50mg，并且可以使用150mg和500mg的剂量递增。活性比较物是索托维单抗(经1小时静脉内输注500mg)。通过经1小时静脉内输注给予安慰剂。
[0683]
主要结果量度：
[0684]
1.剂量-发现/i期[时间范围：距随机化29天]
[0685]
确定用于功效评估的剂量。剂量限制性毒性(研究中药物的安全性和耐受性-ctcae v5等级≥3个不良事件)
[0686]
2.功效评估/ii期-重度患者(a组)[时间范围：距随机化29天]
[0687]
活性和安全性的测定。
[0688]
在重度患者(a组)中：临床改善的时间。将根据who临床进展量表确定改善；改善被定义为从量表中的随机化直至随机化后第29天的最小2步变化。
[0689]
3.功效评估/ii期-轻度至中度患者(b组)[时间范围：距随机化15天]
[0690]
活性和安全性的测定。
[0691]
在轻度至中度患者(b组)中：研究中药物的药效学，定义为鼻和/或咽喉拭子中达到阴性病毒滴度的时间，在随机化后至多15天测量。
[0692]
次要结果量度：
[0693]
1.通过不良事件率评估的安全性[时间范围：距随机化至多29天]
[0694]
根据ctcae v5的不良事件率
[0695]
2.评估临床改善[时间范围：从随机化至第29天]
[0696]
在第8天、第15天和第29天具有临床改善(如以上所定义)的患者的比例。
[0697]
3.使用who临床进展量表评估临床改善[时间范围：从随机化至第15天]
[0698]
在who临床进展量表中距随机化第8天和第15天的变化
[0699]
4.使用who临床进展量表评估临床改善[时间范围：从随机化至第29天]
[0700]
who临床进展量表的一点改变的时间
[0701]
5.使用spo2/fio2评估临床改善[时间范围：从随机化至第29天]
[0702]
氧气饱和度与吸入氧浓度的分数的比率(spo2/fio2)
[0703]
6.评估出院[时间范围：从随机化至第29天]
[0704]
在第8天、第15天和第29天出院的患者的比例
[0705]
7.评估icu入院[时间范围：从随机化至第29天]
[0706]
icu入院率
[0707]
8.进一步评估安全性(wcc)[时间范围：从随机化至第29天]
[0708]
在第1天、第3天、第5天、第8天、第11天(当住院时)；以及第15天和第29天的白细胞计数
[0709]
9.进一步评估安全性(hg)[时间范围：从随机化至第29天]
[0710]
在第1天、第3天、第5天、第8天、第11天(当住院时)；以及第15天和第29天的血红蛋白
[0711]
10.进一步评估安全性(血小板)[时间范围：从随机化至第29天]
[0712]
在第1天、第3天、第5天、第8天、第11天(当住院时)；以及第15天和第29天的血小板
[0713]
11.进一步评估安全性(肌酐)[时间范围：从随机化至第29天]
[0714]
在第1天、第3天、第5天、第8天、第11天(当住院时)；以及第15天和第29天的肌酐
[0715]
12.进一步评估安全性(alt)[时间范围：从随机化至第29天]
[0716]
在第1天、第3天、第5天、第8天、第11天(当住院时)；以及第15天和第29天的alt
[0717]
13.评估总体死亡率[时间范围：从随机化至第29天]
[0718]
第8天、第15天和第29天的死亡率。从随机化至死亡的时间
[0719]
14.评估无氧天数[时间范围：从随机化至第29天]
[0720]
氧气使用的持续时间(天)和无氧天数
[0721]
15.评估无呼吸机天数[时间范围：从随机化至第29天]
[0722]
机械通气的持续时间(天)和无机械通气天数
[0723]
16.评估新机械通气使用的发生率[时间范围：从随机化至第29天]
[0724]
新机械通气使用的发生率
[0725]
17.评估国家早期预警评分(news)2/qsofa[时间范围：从随机化至第29天]
[0726]
在住院时每天评估的news2/qsofa
[0727]
18.评估翻译结果(病毒载量)[时间范围：从随机化至第29天]
[0728]
病毒载量随着时间的变化
[0729]
19.评估翻译结果(基线sars-cov-2)[时间范围：从随机化至第29天]
[0730]
病毒载量随着时间的变化
[0731]
合格标准
[0732]
适合研究的年龄：18岁及以上(成人、老年人)
[0733]
适合研究的性别：全部
[0734]
接受健康志愿者：否
[0735]
纳入标准
[0736]
1.患有实验室确诊的sars-cov-2感染(pcr)的成人(≥18岁)
[0737]
2.提供由研究患者或法律可接受的代表签署的知情同意书的能力
[0738]
3.具有生育能力的妇女(wocbp)和与wocbp性活跃的男性患者同意从第一次施用试验治疗开始、贯穿整个试验治疗以及在最后一剂的试验治疗之后的候选者特异性试验协议中概述的持续时间内使用高效的避孕方法(如协议中所概述)
[0739]
可以应用额外的标准：
[0740]
a组(重度疾病)4a。临床状态为4级(住院、通过面罩或鼻塞供氧)、5级(住院、非侵入性通气或高流量氧气)、6级(住院、插管和机械通气)或7级(通气和额外的器官支持-加压药、肾替代疗法(rrt)、体外膜肺氧合(ecmo))的患者，如根据who临床严重程度评分9分序数量表定义的。
[0741]
b组(轻度至中度疾病)4b。具有以下特性的流动患者或住院患者：外周毛细血管血氧气饱和度(spo2)》94％ ra n.b.
[0742]
主要试验排除标准在主协议中概述为：
[0743]
1.*
[0744]
2.*
[0745]
3.怀孕或哺乳期
[0746]
4.*
[0747]
5.对任何研究药物过敏
[0748]
6.在纳入的30天或5倍半衰期(以较长者为准)内服用其它违禁药物(如cst协议中所概述)的患者
[0749]
7.参与另一研究医学产品的临床试验(ctimp)的患者
[0750]
*
‘
主协议规定
‘1’
、
‘2’
和
‘4’
，如下：
[0751]
‘
1.丙氨酸转氨酶(alt)和/或天冬氨酸转氨酶(ast)》正常上限(uln)的5倍
[0752]
2.4期重度慢性肾脏疾病或需要透析(即，所估计的肾小球滤过率《30毫升/分钟/1.73m2)
[0753]
4.
‘
在72小时内预期转移到另一家不是研究地点的医院’[0754]
这些标准不适用于本协议，因为imp是单克隆抗体，其不会被肝脏或肾脏(1和2)从体内清除并且住院患者被排除在研究之外。
[0755]
出于vir-7832和索托维单抗候选者特异性试验的目的，以下排除标准也适用：
[0756]
8.当前住院或调查者判断为可能需要在接下来24小时内需要进行急性医疗而住院
[0757]
9.与重度covid-19一致的症状，定义为休息时呼吸短促或呼吸窘迫或需要补充氧气10.在调查者判断中，可能在接下来7天内死亡的参与者
[0758]
11.免疫功能受损严重的参与者，包括但不限于接受免疫抑制性化疗或免疫疗法的癌症患者、最近3个月内接受过实体器官移植或同种异体干细胞移植的那些患者、心脏或肺移植的任何病史或高剂量长期全身性皮质类固醇(相当于每天≥20mg泼尼松(prednisone)或全身性等效物，持续超过2周)
[0759]
12.仅i期：糖尿病(需要药物)、慢性肾脏疾病(即，egfr《60，如通过肾疾病饮食调整(mdrd)研究确定的)、慢性肝脏疾病(例如，肝硬化)、充血性心力衰竭(纽约心脏协会(nyha)ii级或更高级)、慢性阻塞性肺部疾病(慢性支气管炎病史、慢性阻塞性肺病病史或肺气肿伴强体力活动呼吸困难病史)以及中度至重度哮喘(参与者需要吸入类固醇来控制症状或在过去一年中已开出一个疗程的口服类固醇)。
[0760]
13.在调查者判断中，任何当前的医疗病状都会妨碍参与者安全参与研究和完成研究。
[0761]
14.已知对调查产品中存在的任何成分的超敏反应
[0762]
15.先前对单克隆抗体的过敏反应或超敏反应
[0763]
16.作为临床试验或其它试验的一部分，曾接受过sars-cov-2疫苗。
[0764]
17.纳入前48小时内接受任何疫苗。给药后4周内将不允许接种疫苗。
[0765]
18.在过去3个月内接受来自恢复的covid-19患者的康复者血浆或抗sars-cov-2mab。
[0766]
19.在调查者判断中，将不太可能或无法遵守协议要求的参与者
[0767]
实例39
[0768]
索托维单抗用于治疗轻度至中度covid-19疾病的2期/3期临床研究
[0769]
进行随机化、多中心、双盲、安慰剂对照的研究，以评估索托维单抗(s309 n55q ls)用于门诊患者的covid-19的早期治疗的安全性和功效。索托维单抗是经工程化的单克隆抗体(igg1*01g1m17；seq id no:113的vh、m428l和n434s fc突变；seq id no:168的vl(κ轻链igkc*01k1m3))。
[0770]
主要目标是评估索托维单抗与安慰剂相比在预防轻度/中度至重度或危重covid-19疾病进展方面的功效。主要终点是发展为重度疾病、危重疾病或死亡的参与者的比例，其中主要分析一直到第29天。
[0771]
关键的次要目标是确定索托维单抗与安慰剂相比的安全性和耐受性；评估索托维单抗与安慰剂相比在预防covid-19疾病进展至第8天、第15天和第22天的功效；评估索托维单抗与安慰剂相比在预防死亡率方面的功效；评估索托维单抗与安慰剂相比在缩短呼吸机天数、icu停留时间(los)和总医院los方面的功效；评估索托维单抗与安慰剂相比在缩短covid-19临床体征和症状的持续时间并降低其严重程度方面的功效；评估索托维单抗与安慰剂相比在预防covid-19的非呼吸道并发症方面的功效；评估索托维单抗与安慰剂相比在减少sars-cov-2病毒脱落的持续时间方面的功效；评估索托维单抗与安慰剂相比在诱导抗病毒应答方面的功效；评估索托维单抗与安慰剂相比在促进恢复正常生命方面的功效；评估索托维单抗在血清中的药代动力学(pk)，并且评估索托维单抗的免疫原性。
[0772]
探索性目标是评估索托维单抗相对于与安慰剂相比在预防covid-19疾病进展至第8天、第15天和第22天方面的功效；监测针对索托维单抗sars-cov-2抗性突变体的治疗出现；评估索托维单抗与安慰剂相比在减少sars-cov-2病毒载量方面的功效；评估索托维单抗与安慰剂相比对宿主对sars-cov-2的应答的潜在生物标志物的影响；评估受试者遗传多态性与索托维单抗作用机制和/或pk之间的潜在关系，并且测量索托维单抗治疗对由于covid-19疾病所致的缺勤时间和工作效率方面的影响。
[0773]
图6示出了另外的研究细节。
[0774]
评估标准的细节
[0775]
本研究的主要终点如下：
[0776]
·
直到第29天进展到重度或危重covid-19或死亡的受试者的比例，如通过以下定义的：
[0777]
1.重度疾病：血氧不足(在室内空气中的o2饱和度≤93％或pao2/fio2《300)，所述血氧不足需要氧气补充》1天或
[0778]
受试者需要≥4升/分钟氧气补充或等效物，并且调查者或指定者确定在室内空气中的o2饱和度的测量结果在医学上是不安全的。
[0779]
或
[0780]
2.危重疾病：呼吸衰竭；或休克；或多器官功能障碍/衰竭，所述呼吸衰竭需要以下中的至少一者：侵入性机械通气，ecmo
[0781]
或
[0782]
3.死亡
[0783]
本研究的次要终点如下：
[0784]
1.不良事件(ae)的发生率
[0785]
2.严重不良事件(sae)的发生率
[0786]
3.特别关注的不良事件(aesi)的发生率
[0787]
4.在第8天、第15天或第22天进展到发展为重度或危重covid-19的受试者的比例
[0788]
5.29天、60天和90天全因死亡率
[0789]
6.从随机化至第29天的呼吸机总天数
[0790]
7.重症监护总停留时间(los)
[0791]
8.总医院los
[0792]
9.使用flu-pro患者报告的结果测量仪器，报告covid-19相关疾病的体征和症状的受试者的严重程度和持续时间
[0793]
10.心脏、血栓栓塞、肾、神经系统事件的发生率
[0794]
11.在基线和至第29天的随访时段期间通过pcr检测鼻分泌物中的sars-cov-2
[0795]
12.血清中的索托维单抗药代动力学(pk)
[0796]
13.血清ada对索托维单抗的发生率和滴度(如果适用)
[0797]
本研究的探索性终点如下：
[0798]
1.对于临床改善，在第8天、第15天、第22天和第29天受试者在序数量表的每个类别中的比例(参见下文)
[0799]
2.sars-cov-2对mab的病毒抗性突变体的出现
[0800]
3.通过qrt-pcr的鼻分泌物和血液中的病毒载量
[0801]
4.宿主转录组和免疫分型分析
[0802]
5.如通过基因分型确定的fcγr多态性
[0803]
6.如通过基因分型确定的igg1同种异型
[0804]
7.工作效率和活动障碍(wpai)相对于基线的变化
[0805]
8.根据eq-5d-5l，健康相关生活质量相对于基线的变化
[0806]
用于对临床改善进行分类的序数量表如下：
[0807]
1.未感染：没有感染的临床或病毒学证据
[0808]
2.非住院，活动不受限制(如果在家使用氧气，报告为第4类)
[0809]
3.非住院，活动受限
[0810]
4.住院，无吸氧疗法
[0811]
5.住院，通过面罩或鼻塞进行的低流量氧气
[0812]
6.住院、高流量氧气、持续气道正压(cpap)、双水平气道正压(bipap)、非侵入性通气
[0813]
7.住院、插管和机械通气
[0814]
8.住院、机械通气加上器官支持(血管加压药、rrt、ecmo)
[0815]
9.死亡
[0816]
受试者数量
[0817]
本研究包含两部分。导入期纳入大约20名有进展为疾病的高风险的患有早期、轻度至中度covid-19的受试者。扩展期纳入大约850名有进展为疾病的高风险的患有早期、轻度至中度covid-19的受试者。
[0818]
纳入的诊断和主要标准
[0819]
纳入标准包括：
[0820]
年龄：
[0821]
1.年龄为18岁及以上的受试者，所述受试者有covid-19疾病并发症的高风险，所述并发症包括糖尿病、肥胖(bmi》30)、慢性肾脏疾病、充血性心力衰竭、慢性阻塞性肺部疾病和中度至重度哮喘
[0822]
以及
[0823]
2.≥55岁的受试者，无论是否有合并症
[0824]
疾病特性：
[0825]
1.具有阳性sars-cov-2测试结果(通过任何验证测试，例如，对任何样本类型进行的rt-pcr)的受试者
[0826]
以及
[0827]
2.在室内空气中的氧气饱和度≥94％
[0828]
以及
[0829]
1.患有由以下症状中的一种或多种症状定义的轻度至中度或中度无并发症的covid-19疾病：
[0830]
发烧、发冷、咳嗽、咽喉痛、不适、头痛、关节痛或肌痛、嗅觉或味觉发生变化、呕吐、腹泻、劳力性呼吸短促
[0831]
以及
[0832]
3.自症状发作以来有少于或等于4天
[0833]
性别：
[0834]
1.无性别限制
[0835]
2.女性受试者必须满足并同意遵守以下避孕标准。妇女使用的避孕应符合当地关于参与临床研究的那些人的避孕方法的法规。
[0836]
3.如果女性受试者未处于怀孕或哺乳期，且符合以下条件之一，方可参加：
[0837]
是不具有生育能力的妇女(woncbp)
[0838]
或
[0839]
是具有生育能力的妇女(wocbp)，并且使用高效的避孕方法，在研究干预期期间和最后一剂研究干预后至多一年的失败率《1％。调查者应评估与第一剂研究干预相关的避孕方法失败的可能性(例如，不依从，最近开始)。
[0840]
4.wocbp必须在入院时或在第一剂研究干预之前具有阴性高度敏感的妊娠试验(当地法规要求的尿液或血清)。如果不能证实尿检是阴性的(例如，不明确的结果)，则需要进行血清妊娠试验。在这种情况下，如果血清妊娠结果是阳性的，则受试者必须被排除在参与之外。
[0841]
知情同意书：
[0842]
5.愿意遵守研究要求并且能够给出签署的知情同意书，或者如果不能给出签署的知情同意书，如果能够遵循替代性同意程序。
[0843]
排除标准：
[0844]
医疗病状
[0845]
·
当前住院或调查者判断为可能需要在接下来24小时内住院
[0846]
·
与重度covid-19一致的症状，定义为休息时呼吸短促或呼吸窘迫或需要补充氧气
[0847]
·
在调查者判断中，可能在接下来7天内死亡的患者
[0848]
·
免疫功能严重受损的患者，包括但不限于积极接受免疫抑制性化疗或免疫疗法的癌症患者、在过去3个月内接受实体器官移植或同种异体干细胞移植的那些患者或患有在随机化6周内需要使用全身性皮质类固醇(相当于每天≥0.5mg/kg体重的泼尼松)的病状的那些患者
[0849]
·
已知对调查产品中存在的任何成分的超敏反应
[0850]
·
先前对单克隆抗体的过敏反应或超敏反应
[0851]
既往/同期临床研究经验
[0852]
·
在过去180天内在任何研究性疫苗研究或在第1天之前的30天内或在研究性化合物的五个半衰期内纳入任何其它研究性药物研究中，以较长者为准
[0853]
·
纳入sars-cov-2研究性疫苗的任何试验中
[0854]
其它排除
[0855]
·
纳入前48小时内接受任何疫苗。在随机化之前在任何时间点接受sars-cov-2疫苗。给药后4周内不允许进行疫苗接种(包括针对sars-cov-2的疫苗接种)
[0856]
·
在过去3个月内接受来自恢复的covid-19患者的康复者血浆或抗sars-cov-2单克隆抗体
[0857]
·
在调查者判断中，至第29天将不太可能或无法遵守协议要求的患者
[0858]
研究参与和随访的持续时间
[0859]
研究药物治疗的持续时间是单剂量。每个受试者的所估计的总研究时间(包括筛选和随访)为大约九个月。在从研究单位出院之前，通过至少两小时给药后监测所有受试者。将纳入研究导入部分中的受试者在住院环境中进行监测，持续最少七天。随后在门诊患者的基础上主动监测受试者，其中在第1周、第2周、第3周和第4周进行面对面研究访视，并且在至第14天在非研究访视日进行每天电话呼叫。在第29天之后，每月通过远程医疗健康或电话呼叫监测患者，自给药持续总共九个月。
[0860]
研究设计
[0861]
独立数据监测委员会(idmc)主动监测中期非盲安全性数据(导入期)和中期非盲安全性和功效数据(扩展期)，以作出关于正在进行的研究进行的建议。idmc成员包括受过相关医学专家培训的医生和一名统计员。idmc在扩展期开始之前审查来自研究导入期的非盲安全数据。另外，idmc在扩展期期间执行定期安全审查。第一安全性审查包括至第14天来自总共60名患者(每组30名)的可用安全性和耐受性数据。如果根据预先指定的标准没有安全性或耐受性问题，则idmc建议对患有重度至危重covid-19的住院患者开始单独研究。如果必要的话，在每纳入另外大约100名患者(每组50名)之后进行额外的安全性审查。最终，对大约33％的所纳入的受试者(每组145名)和大约67％的所纳入受试者(每组290名)进行两次中期分析，以评估安全性、无效性和功效。联合安全审查小组(jsrt)确定在输入流盲法数据审查期间识别的安全性问题是否需要上报给idmc。
[0862]
本研究是索托维单抗(一种针对sars-cov-2的单克隆抗体(mab))的随机化、双盲、
多中心、安慰剂对照的试验，用于预防高风险受试者的轻度至中度covid-19疾病的进展，进行中期监测以允许因无效性、功效或安全性而提前停止。将有进展为疾病的高风险的患有早期、轻度至中度covid-19的受试者按1:1随机化以接受单次静脉内输注的索托维单抗或等体积生理盐水安慰剂。安全性和功效的比较基于来自同时随机化参与者的数据。
[0863]
研究包含2个部分。导入期纳入20名患有早期、轻度至中度covid-19并且有疾病进展的高风险的受试者。在通过独立数据监测委员会(idmc)对非盲数据进行安全性评估后，扩展期继续进行，其中纳入患有早期、轻度至中度covid-19并且有疾病进展的高风险的额外的受试者。
[0864]
导入期：
[0865]
本研究的导入期评估索托维单抗在患有早期、轻度至中度covid-19的有进展到重度疾病的高风险的受试者中的安全性和耐受性。在住院环境中监测受试者持续七天，包括评估呼吸状态、氧合作用和其它生命体征以及实验室评估。研究单剂量水平并且通过静脉内输注递送。受试者进入研究单位并且密切监测不良事件、实验室参数的变化以及疾病体征和症状的进展或改善。
[0866]
所纳入的前两名符合条件的受试者按1:1随机化至索托维单抗或安慰剂。在住院环境中对这些哨点受试者进行给药并监测持续至少48小时。在剂量施用期间，在一小时iv输注过程内每15分钟监测一次生命体征。在输注两小时之后，还每小时监测一次生命体征。调查者审查了生命体征、ecg、症状定向的身体检查和不良事件(ae)。如果调查者没有发现直接的安全性问题，则对导入期中的其余受试者进行给药(每组总共十名受试者，包括哨点受试者)。
[0867]
将纳入在导入中的所有20名受试者(每组n＝10；索托维单抗或安慰剂)分配到强化pk和免疫原性子研究。从未纳入在子研究中的所有参与者收集稀疏样品。收集血清pk和抗药物抗体(ada)样品。
[0868]
扩展期：
[0869]
在idmc评估来自导入期的可用非盲安全性数据(n＝每组10人至随访14天)后的研究进展的扩展期。扩展期的目的是评估索托维单抗与安慰剂对照组相比的安全性和功效。将患有早期轻度至中度covid-19的有进展到重度疾病的风险的受试者按1:1比率(每组435名受试者)随机化以接受单次iv输注索托维单抗或安慰剂。
[0870]
在从研究单位出院之前，通过至少2小时给药后监测受试者。随后在门诊患者的基础上主动监测受试者，其中在第1周、第2周、第3周和第4周进行面对面研究访视，并且在至第14天在非研究访视日进行每天电话呼叫，以便了解ae和疾病恶化情况。另外，向受试者提供监测血氧不足的装置。
[0871]
在第29天之后，每月通过远程医疗健康或电话呼叫监测患者，以评估随后的covid-19疾病(如果有的话)的发生率和严重程度，自给药持续总共9个月。
[0872]
对大约33％的所纳入受试者(每组145名受试者)和大约67％的所纳入受试者(每组290名受试者)进行两次中期分析，以评估无效性、功效和安全性，以及如果总体疾病进展速率低于预期，则允许进行样本量再估计。
[0873]
安慰剂对照将索托维单抗的安全性和耐受性与covid-19的背景体征和症状区分开来，并且评估其对临床结果的潜在益处。使用安慰剂组允许有效评估可归因于索托维单
抗的功效和安全性的任何变化相对于可归因于在研究期间给予的背景支持性护理的那些变化。
[0874]
评估治疗的功效的主要终点是进展到重度疾病，定义为需要氧气补充的缺氧，或发展为危重疾病(呼吸衰竭；或休克；或多器官功能障碍/衰竭，所述呼吸衰竭需要以下中的至少一者：侵入性机械通气，ecmo)，或在随机化29天内死亡。从没有缺氧或氧气需求的门诊患者状态转变至需要氧气疗法或更高水平的呼吸/器官支持的缺氧是临床上显著的里程碑。
[0875]
显著的次要终点是在第29天的全因死亡率。与住院时间相关的其它次要功效终点
–
住院时间、icu停留时间、通气时间以及受试者报告的covid-19体征和症状的严重程度和持续时间也是临床相关的。
[0876]
免疫学评估子研究：
[0877]
为了探索宿主免疫应答和感染的潜在生物标志物，受试者可能同意进行在指定时间点收集外周血单核细胞(pbmc)的任选的子研究。在所选择的地点进行此任选的子研究。每组大约20-50名参与者纳入任选的子研究中。来自本研究的导入期和扩展期两者的受试者可能包括在免疫学评估子研究中。
[0878]
研究干预组和持续时间
[0879]
在第一剂量前24小时内进行筛选评估。在第1天用单次iv剂量以盲法方式治疗符合条件的受试者，并且持续至多9个月(36周)。
[0880]
在导入期，将20名患有轻度至中度covid-19的受试者按1:1随机化以接受单次iv剂量的索托维单抗或安慰剂。将纳入研究的导入期中的受试者在住院环境中进行密切监测，持续最少7天。在7天结束时，基于临床状态的调查者评估，所述受试者要么出院回家，要么留在住院病房，要么正式住院。
[0881]
在扩展期，将患有轻度至中度covid-19的受试者按1:1随机化以接受单次iv剂量的索托维单抗或安慰剂。
[0882]
通过以下标准对处于扩展期的参与者进行分层：
[0883]
1.症状的持续时间：≤2天对3-4天
[0884]
2.年龄：≤70岁对》70岁
[0885]
研究干预
[0886]
研究干预和给药说明如下表7所示：
[0887]
表7：
[0888][0889][0890]
剂量选择由活病毒中和数据、抗性数据、由非人灵长类动物pk为根据的人pk预测以及在食蟹猴中未观察到的不良作用水平(noael)指导。
[0891]
图1-2d中示出了另外的研究细节。
[0892]
实例40
[0893]
索托维单抗单一疗法降低患有covid-19的成人的早期治疗中的住院和死亡风险
[0894]
在实例39中描述的临床试验的3期部分中，在全球583名非住院参与者(治疗组中的291名患者和安慰剂组中的292名患者)中评估单次静脉内输注索托维单抗(500mg)或安慰剂的安全性和功效。主要功效终点是有covid-19进展的患者的比例，如通过在随机化29天内住院至少24小时的需要或死亡定义的。在所研究的那些人中，63％是西班牙裔或拉丁裔，并且7％是黑色人种或非裔美国人。根据疾病控制和预防中心(the centers for disease control and prevention)，这些群体因covid-19而住院的可能性为大约三倍以上，并且因covid-19而死亡的可能性为大约两倍以上(数据来源：covid-net(www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/covid-data/covid-net/purpose-methods.html，2020年3月1日至2021年1月30日访问)；数字是标准化至2019美国标准covid-net集水区人口的年龄调整率的比率；数据来源：nchs临时死亡计数(data.cdc.gov/nchs/deaths-involving-coronavirus-disease-2019-covid-19/ks3g-spdg，截至2021年1月30日的数据)。数字是标准化至2019年美国人口普查间隔期估计值的年龄调整率的比率)。
[0895]
对纳入本试验中的583名患者的数据进行的中期分析表明，与安慰剂相比，接受索托维单抗作为单一疗法的患者的住院或死亡降低了85％(p＝0.002)，这是本试验的主要终点。索托维单抗耐受性良好。本试验仍在进行中并且对患者进行为期24周的盲法随访；收集额外的结果，包括流行病学和病毒学数据。
[0896]
进一步详细地描述了本研究和结果：
[0897]
方法：在多中心、双盲、3期试验中，将患有有症状的covid-19以及至少一种疾病进展的风险因素的非住院患者按(1:1)随机化以接受静脉内输注500mg索托维单抗或安慰剂。主要功效终点是具有covid-19进展的患者的比例，定义为住院长于24小时或死亡，直至第29天。
[0898]
结果：在此预先计划的中期分析中，该分析包括583名患者的意向治疗群体(索托维单抗，291名；安慰剂，292名)，满足主要功效终点。covid-19进展的风险显著降低了85％(97.24％置信区间，44％至96％；p＝0.002)，其中索托维单抗组中总共三名(1％)患者进展到主要终点相对于安慰剂组中有21位(7％)患者进展到主要终点。所有五名接受重症监护的患者，包括到第29天死亡的一名患者，都接受安慰剂。在868名患者(索托维单抗，430名；安慰剂，438名)中评估了安全性。17％和19％的分别接受索托维单抗和安慰剂的患者报道了不良事件；相较于安慰剂(6％)，索托维单抗(2％)的严重不良事件不太常见。
[0899]
在意向治疗分析(n＝1057，全数据集)中，至第29天，在索托维单抗(n＝523)对安慰剂(n＝526)的接受者中，调整后的住院(所有原因)的相对风险降低为79％(95％ci，9％至50％；p《0.001)。与安慰剂相比，用索托维单抗治疗(itt)可减少因疾病管理而急诊就诊、因急性疾病管理(任何持续时间)而住院或死亡(任何原因)的需要。与接受安慰剂的9名参与者相比，接受索托维单抗的参与者都不需要icu入院，其中4名参与者需要机械通气。与接受安慰剂的4名参与者相比，接受索托维单抗的参与者无死亡。治疗组之间的不良事件的发生率类似，并且sae在安慰剂组中在数值上更常见。
[0900]
结论：索托维单抗降低了患有轻度/中度疾病的患者的covid-19的进展，耐受性良好，并且未发现安全性信号。
[0901]
方法
[0902]
试验目标和监督
[0903]
此3期、随机化、双盲、多中心、安慰剂对照的研究评估单次静脉内输注500mg索托维单抗用于预防高风险非住院患者的轻度/中度covid-19的进展。对于此预先计划的中期分析，在2020年8月27日开始纳入患者，并且随后直至2021年3月4日在四个国家(美国、加拿大、巴西和西班牙)的37个研究地点纳入患者。此实例的补充附录中概括了在试验开始后对协议和统计分析计划所进行的任何改变。
[0904]
本研究是根据《赫尔辛基宣言(the declaration of helsinki)》和《国际医学科学组织理事会国际伦理指南(council for international organizations of medical sciences international ethical guidelines)》、《适用的国际协调委员会良好临床实践指南(applicable international council for harmonisation good clinical practice guidelines)》以及《适用的法律法规(applicable laws and regulations)》的原则进行的。所有患者都提供书面知情同意书。
[0905]
患者和程序
[0906]
年龄为18岁或以上的具有阳性逆转录酶-聚合酶链式反应或抗原sars-cov-2测试结果和在前5天内症状发作的成年患者被筛选为合格；在研究药物施用前24小时内进行筛选。患者需要处于covid-19进展的高风险中，定义为老年人(年龄≥55岁)或具有以下风险因素中的至少一个风险因素的成年人：需要药物的糖尿病、肥胖症(体重指数》30kg/m2)、慢性肾脏疾病(所估计的肾小球滤过率《60毫升/分钟/1.73m2)、
23
充血性心力衰竭(纽约心脏协会ii级或更高级)、慢性阻塞性肺部疾病以及中度至重度哮喘。
24
[0907]
已经患有定义为休息时呼吸短促、呼吸窘迫或需要补充氧气的重度covid-19的患者被排除在外。在此实例的补充附录中描述了纳入标准。
[0908]
使用交互式网络响应系统将符合条件的患者按1:1随机化，以在第1天接受单次
500mg，1小时输注的索托维单抗或等体积生理盐水安慰剂(图69)。
[0909]
功效评估
[0910]
主要终点是至第29天，因任何原因住院超过24小时或死亡的患者的比例。次要功效终点包括急诊室访视、住院或死亡的患者的比例；死亡率；患者报告的结果；病毒载量的变化；以及进展到需要补充氧气的患者的比例。
[0911]
安全性评估
[0912]
安全性终点包括不良事件、严重不良事件和特别关注的不良事件，定义为输注相关反应(包括超敏反应)、抗药物抗体的免疫原性测试和抗体依赖性增强的评估。所有住院，包括由covid-19导致的住院，被视为严重不良事件。
[0913]
统计学分析
[0914]
当大约41％的所需研究患者数量达到第29天时，触发针对安全性、无效性和巨大功效的预先计划的中期分析。样本量计算基于具有两项中期分析的成组序贯设计，以评估因缺乏功效或巨大功效而导致的无效性。使用lan-demetsα消耗函数来控制i类误差，采用pocock类似物规则来确定无效性并且采用hwang-shih-decani(其中参数γ＝1)类似物来确定功效。
25
总样本量1360将提供大约90％能力以在总体双侧5％的显著性水平上检测到在减少covid-19的进展到第29天中37.5％的相对功效，其中在安慰剂组中假定的进展速率为16％。
[0915]
中期分析意向治疗(itt)群体包括至预先指定的中期分析截止日期2021年1月19日的所有随机化患者，无论其是否接受研究药物。中期分析安全性分析群体包括接受研究药物治疗并且随机化至2021年2月17日的所有患者；根据所接受的实际治疗将患者进行分组。使用泊松回归模型(poisson regression model)对itt群体中的主要终点进行分析，所述模型具有针对治疗、症状持续时间、年龄和性别进行调整的稳健夹心估计量(robust sandwich estimator)。在随机假设的缺失下，使用多重插补对缺失的进展状态进行插补。基于此分析模型，使用针对此中期分析的调整后的显著性水平来提供统计学显著性测试、相对进展风险及其适当的置信区间(ci)。
[0916]
作为观察到的功效的结果，独立数据监测委员会建议在2021年3月10日停止本研究中的纳入，此时已经将1057名患者随机化。当所有患者完成第29天时，对所有次要终点和探索性终点进行分析。
[0917]
结果
[0918]
患者
[0919]
在所筛选的795名患者中，至2021年1月19日将583名患者随机化至索托维单抗(291名患者)或安慰剂(292名患者)；这些患者包括中期分析itt群体(方案1，在本实例的补充附录中)。在此itt群体中，在整个治疗组中观察到类似的处置。总体而言，索托维单抗组和安慰剂组各有四名患者退出研究。索托维单抗组中三名患者在给药前退出，其中第四名患者因个人原因在第5天撤回同意书。安慰剂组中的一名患者在给药前撤回同意书，并且三名患者在给药后出于个人原因退出(第16天、第25天和第85天)。对于索托维单抗组，itt群体的随访的中值持续时间为72天(范围，5天至190天)，并且对于安慰剂组，中值持续时间为72天(范围，16天至190天)。
[0920]
总体而言，将868名患者(索托维单抗，430名患者；安慰剂，438名患者)随机化并且
至2021年2月17日接受研究药物；这些患者包括中期分析安全性分析群体。对于索托维单抗组，此群体的随访的中值持续时间为56天(范围，5至190天)，并且对于安慰剂组，中值持续时间为55天(范围，2至190天)。
[0921]
itt群体中的治疗组对于基线人口统计学和疾病特性是良好平衡的(表8)。总体而言，22％的患者的年龄大于65岁，7％的患者是黑色人种或非裔美国人，63％的患者是西班牙裔或拉丁裔，并且42％的患者患有被认为是covid-19进展的风险因素的两种或更多种病状。最常见的风险因素是肥胖症、年龄55岁或以上以及需要药物的糖尿病。最常见的主要症状(所有患者中》60％)是咳嗽、肌肉酸痛/肌痛、头痛和疲乏(表11，在本实例的补充附录中)。安全性分析群体中的基线人口统计学和疾病特性在治疗组之间是类似的，并且报告于本实例的补充附录中表12中。
[0922]
功效结果
[0923]
与安慰剂相比，由于任何原因，用索托维单抗进行治疗导致经24小时住院或死亡的需要减少85％(相对风险，0.15[97.24％ ci，0.04至0.56])。索托维单抗组中有三名(1％)患者进展到主要终点，而安慰剂组中有21名(7％)患者进展到主要终点(p＝0.002)(表9)。超过24小时的24次住院的主要原因与进行性covid-19(表13，在本实例的补充附录中)一致，其中一种可能的例外是：索托维单抗组中的患者，具有值得注意的小肠梗阻既往病史，在输注后22天呈现小肠梗阻。关于这些住院的严重程度，需要接受重症监护的所有五名患者都在安慰剂组中；这五名患者中有两名患者需要侵入性机械通气，并且第三名患者拒绝插管并且随后在第29天死亡。与安慰剂组相比，在索托维单抗组中观察到急诊室访视或住院少于24小时的患者较少(表9)。
[0924]
安全性
[0925]
报告不良事件的安全分析群体中的患者的比例在索托维单抗组中为17％(430名患者中有73名患者)并且在安慰剂组中为19％(438名患者中有85名患者)(表10)。与安慰剂组(6％)相比，索托维单抗组(2％)中较低比例的患者报告了3级或4级不良事件。总体而言，在至少1％的接受索托维单抗的患者中发生的唯一不良事件是腹泻，这种情况很少发生—索托维单抗组中有六名(1％)患者，而安慰剂组中有三名(《1％)患者。在索托维单抗组中的患者中，腹泻的所有病例的严重程度是轻度(五名患者)或中度(一名患者)。
[0926]
在接受索托维单抗(1％)的患者中观察到与安慰剂(1％)相比类似比例的输注相关反应。接受索托维单抗的一名患者具有被认为与研究治疗相关的输注相关反应：中度(2级)呼吸困难。
[0927]
在2％接受索托维单抗的患者和6％接受安慰剂的患者中发生严重不良事件。这些事件中的大多数是由于covid-19相关原因的住院。不认为严重不良事件与索托维单抗相关。
[0928]
安慰剂组中的一名患者在第29天后死亡；此患者在第37天因covid-19肺炎而死亡。
[0929]
在血液学、肝脏或化学实验室数据中未观察到任何趋势。总体而言，索托维单抗组和安慰剂组的实验室结果类似。
[0930]
讨论
[0931]
在comet-ice研究的此预先计划的中期分析中，与安慰剂相比，单次500mg剂量的
索托维单抗使患有有症状的covid-19的高风险成人住院(》24小时)或死亡的风险降低了85％(p＝0.002)。对于每17名患有有症状的covid-19的高风险患者，索托维单抗避免了一次住院。在住院的那些患者中，与接受安慰剂的五名患者相比，接受索托维单抗的患者无需接受重症监护，这表明索托维单抗除了避免其自身住院之外，还可以预防covid-19的更严重的并发症。全分析提供了类似的结果。此外，作为调查者地点选择的结果，超过60％的研究群体由自鉴定为西班牙裔或拉丁裔的患者组成；因此，此试验是首次在covid-19临床试验中基本上未被充分代表的群体中的证明功效的试验之一，尽管大流行病已经在此族群中产生不成比例的负面影响。总体而言，索托维单抗的耐受性良好，并且在本研究中未识别任何安全性信号。也没有证据表明索托维单抗的抗体依赖性增强，与安慰剂相比，这可能表现为疾病恶化。
26
[0932]
面对不断进化的病毒，covid-19的治疗将需要保持活性。为此，索托维单抗可能由于靶向泛沙贝冠状病毒表位而具有固有的高抗性屏障。
14
在一项分析中，在全球流感监测和反应系统数据库(全球关于共享所有流感数据的倡议)中的超过584,000个序列中，包括索托维单抗表位的氨基酸位置在天然存在的病毒中是至少99.96％保守的。
14
此外，在需要进一步增强对抗性的广度和屏障时，索托维单抗可能由于其非重叠抗性谱而与当前授权的受体结合基序靶向抗体组合。
[0933]
这些结果还表明，不直接阻断ace2受体相互作用的非受体结合基序结合抗体可用于临床治疗，并且提示对其它受体的作用。
27
此外，由于索托维单抗具有有效的效应子功能，因此缺乏安全性信号和观察到的功效强烈表明效应子功能既无害也不与抗体依赖性增强相关。
26
事实上，covid-19的临床前模型表明其有效的效应子功能可能是有益的。
13,14
[0934]
来自comet-ice试验支持的此中期分析(以及来自全意向治疗分析)的结果表明，索托维单抗可以是covid-19门诊治疗的重要治疗剂。值得注意的是，可以肌内施用500mg的剂量，从而增加患有covid-19的患者获得抗体疗法的便利性和可及性。当前正在进行研究以评估这种施用途径。
[0935]
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[0963]
表8：基线人口统计学和疾病特性(itt群体)
[0964][0965][0966]
itt表示意向治疗、sd标准偏差、egfr估计的肾小球滤过率、mdrd肾疾病饮食调整、nyha纽约心脏协会。
[0967]
*针对索托维单抗组中的一名患者和安慰剂组中的一名患者的种族数据是不可获
得的。
[0968]
体重指数是体重(千克)除以身高(米)的平方。
[0969]
索托维单抗组中的一名患者的症状持续时间为6天。
[0970]
表9：至第29天的功效结果的概括(itt群体)
[0971][0972]
itt表示意向治疗，ci置信区间。
[0973]
*在此中期分析中未对次要终点进行推断测试。一名患者因糖尿病管理住院不到24小时。
[0974]
如通过补充氧气使用所表明的重度或危重进展。
[0975]
表10：不良事件的概括(安全性分析群体)
[0976]
[0977][0978]
*在对研究治疗不知情的同时，由个体研究调查者确定相关性。
[0979]
如果患者在静脉内输注期间经历危及生命的输注相关反应，包括严重过敏或超敏反应，则患者在药物输注完成后永久停药。
[0980]
对于两名患者，不良事件是输注外渗；两次输注完成。
[0981]
§
输注相关反应定义为不良事件，在研究药物施用24小时内具有发热、发冷、头晕、呼吸困难、瘙痒、皮疹和输注相关反应的优选术语。
[0982]
除了安慰剂组中在第29天死亡的患者之外，安慰剂组中的另一名患者在第37天由于covid-19肺炎而死亡；此患者在第29天之前入院并且因此被认为符合covid-19进展的主要终点定义。
[0983]
补充附录
[0984]
目录表
[0985]
补充方法
[0986]
协议/sap的变化
[0987]
表11：主要症状(itt群体)
[0988]
表12：基线人口统计学和疾病特性(安全性分析群体)
[0989]
表13：住院超过24小时的主要原因(itt群体)
[0990]
方案1：患者处置(itt群体)
[0991]
补充方法
[0992]
纳入标准
[0993]
仅当以下所有标准都适用时，患者才有资格被包括在研究中：
[0994]
年龄和风险因素
[0995]
6.患者的年龄必须为18岁或以上，并且基于存在以下风险因素中的一种或多种风险因素有covid-19进展的高风险：
[0996]
1.糖尿病(需要药物)
[0997]
2.肥胖症(体重指数》35kg/m2)
[0998]
1.变化：在原始协议中体重指数阈值为》30kg/m2。更多信息参见“协议/sap的变化”部分
[0999]
3.慢性肾脏疾病(即，根据肾病研究方程中饮食调整的所估计的肾小球滤过率《60毫升/分钟/1.73m2)
[1000]
4.充血性心力衰竭(纽约心脏协会ii级或更高级)
[1001]
5.慢性阻塞性肺部疾病(慢性支气管炎病史、慢性阻塞性肺病病史或肺气肿伴强
体力活动呼吸困难病史)以及中度至重度哮喘(患者需要吸入类固醇来控制症状或在过去一年中已开出一个疗程的口服类固醇)
[1002]
或
[1003]
7.患者的年龄为55岁或以上，无论是否存在合并症
[1004]
注：70岁以上的患者的目标纳入率约为15％
[1005]
变化：目标纳入标准不在原始协议中。更多信息参见“协议/sap的变化”部分
[1006]
患者的类型和疾病特性
[1007]
8.具有阳性sars-cov-2测试结果(通过任何验证测试[例如，对任何样本类型进行的rt-pcr，基于抗原的测试])的患者
[1008]
以及
[1009]
9.在室内空气中的氧气饱和度≥94％
[1010]
以及
[1011]
10.具有以下症状中的一种或多种症状所定义的covid-19：发烧、发冷、咳嗽、咽喉痛、不适、头痛、关节痛或肌痛、嗅觉或味觉发生变化、呕吐、腹泻、劳力性呼吸短促
[1012]
以及
[1013]
11.自症状发作以来有少于或等于5天
[1014]
性与避孕/屏障要求
[1015]
12.无性别限制
[1016]
13.女性患者必须满足并同意遵守以下避孕标准：
[1017]
1.妇女使用的避孕应符合当地关于参与临床研究的那些人的避孕方法的法规
[1018]
2.如果女性患者未处于怀孕或哺乳期，且符合以下条件之一，方可参加：
[1019]
14.是不具有生育能力的妇女
[1020]
15.是具有生育能力的妇女，并且使用高效的避孕方法，在研究干预期期间和最后一剂研究干预后至多24周的失败率《1％。调查者应评估与第一剂研究干预相关的避孕方法失败的可能性(例如，不依从，最近开始)
[1021]
16.具有生育能力的妇女必须在第一剂研究干预之前具有阴性高度敏感的妊娠试验(当地法规要求的尿液或血清)。如果不能证实尿检是阴性的(例如，不明确的结果)，则需要进行血清妊娠试验。在这种情况下，如果血清妊娠结果是阳性的，则患者必须被排除在参与之外
[1022]
17.调查者负责审查医学病史、月经史和最近性活动，以降低纳入早期未检测到的怀孕的妇女的风险
[1023]
知情同意书
[1024]
18.能够给出签署的知情同意书，其包括遵守知情同意书和本协议中列出的要求和限制
[1025]
或
[1026]
19.如果患者不能给出书面知情同意书，将遵循替代性同意程序
[1027]
既往/同期临床研究经验
[1028]
20.在过去180天内在任何研究性疫苗研究或在第1天之前的30天内或在研究性化合物的五个半衰期内纳入任何其它研究性药物研究中，以较长者为准
[1029]
21.纳入sars-cov-2研究性疫苗的任何试验中
[1030]
程序
[1031]
在第5天、第8天、第11天、第15天、第22天和第29天进行面对面研究访视，以及进行每天电话呼叫，直至第15天(除了面对面访视日之外)，以评估covid-19的不良事件和恶化情况。从第8周开始，每月通过交替电话呼叫(第8周和第16周)和面对面访视(第12周、第20周和第24周)监测患者的covid-19疾病，自给药持续总共24周。在第1天、第15天、第22天和第29天收集血液样品用于实验室评估，并且在第1天和第29天收集血液样品用于抗药物抗体。患者报告的结果评估施用至第24周。
[1032]
协议/sap的变化
[1033]
22.修改筛选时的当地安全性实验室评估，以指定每个协议仅需要abo分型
[1034]
23.基本原理：
[1035]
24.尽管必须局部地进行或证明某些用于确认研究患者合格性的筛选评估(例如，通过经验证的诊断试验对具有生育能力的妇女进行妊娠试验和sars-cov-2感染)，abo分型是出于安全性目的在筛选时唯一需要的当地实验室评估
[1036]
25.筛选访视期间的所有其它当地安全性实验室评估(血液学、临床化学和凝血参数)可以根据研究调查者的临床判断或根据局部法规的要求进行或不进行
[1037]
26.考虑到随机化的时间和在第1天(随机化)对中央实验室测试的要求，样品收集的量对于地点来说过于繁琐
[1038]
27.修改了研究目标和终点(次要和探索性终点)，包括引入额外的次要终点(即，评估具有covid-19进展到第29天的患者的比例，如通过去医院急诊室针对疾病管理进行访视、因急性管理疾病而住院或死亡所定义的)，修正现有患者报告的结果和病毒学终点，以及引入额外的探索性终点
[1039]
1.基本原理：
[1040]
2.针对靶向covid-19的其它单克隆抗体产生的初步临床试验数据表明，导致需要住院的covid-19的进展速率可能低于最初估计的，并且抗刺突蛋白单克隆抗体在治疗门诊患者群体的covid-19中至第29天就医访视的比例下降了50％以上
[1041]
3.鉴于来自抗sars-cov-2mab的最近临床试验的新数据，对次要终点和探索性终点进行修改，以反映与接受covid-19单克隆抗体的门诊患者群体最相关的临床结果
[1042]
28.修改“年龄和风险因素”合格性标准(纳入标准#3和#4)，以富集具有医疗需求未满足程度最高的高风险群体
[1043]
1.基本原理：
[1044]
2.“年龄和风险因素”合格性标准已经被修改以增加定义肥胖症的体重指数要求并且引入年龄》70岁的目标最小数量的患者(大约15％)
[1045]
3.鉴于关于门诊环境中covid-19的进展的新临床数据，合格性标准被修改以富集有进展到重度covid-19的高风险的群体
[1046]
4.修改“医学病状”合格性标准(排除标准#10)以富集具有医疗需求未满足程度最高高风险群体
[1047]
5.基本原理：
[1048]
6.“医学病状”合格性标准已经被修改以阐明“免疫功能严重受损”的定义
[1049]
7.鉴于关于门诊环境中covid-19的进展的新临床数据，合格性标准被修改以富集有进展到重度covid-19的高风险的免疫抑制群体
[1050]
29.修改“其它排除”合格性标准和“研究期间不允许的药物”以阐明围绕sars-cov-2疫苗给药的限制
[1051]
1.基本原理：
[1052]
1.考虑到最近关于sars-cov-2疫苗公布的数据，修改协议以阐明围绕施用实验性或批准的sars-cov-2疫苗的限制
[1053]
2.输注相关反应的明确指南
[1054]
1.基本原理：
[1055]
1.修改协议语言以阐明地点应遵循用于输注相关反应的治疗的当地或机构指南
[1056]
2.修改统计分析计划(中期分析#1、中期分析#2和统计方法)
[1057]
1.基本原理：
[1058]
1.针对靶向covid-19的其它单克隆抗体产生的初步临床试验数据表明，需要住院的covid-19的进展速率可能低于最初估计的，并且抗刺突蛋白单克隆抗体在治疗门诊患者群体的covid-19中的至第29天就医访视的比例下降了50％以上
[1059]
2.鉴于此新数据，修改中期分析以更准确地反映关于covid-19进展的最新数据以及单克隆抗体对sars-cov-2的潜在功效
[1060]
3.指定进行“非covid-19”安全性分析的意图
[1061]
1.基本原理：
[1062]
1.由于不可能在单个患者中描述住院是与covid-19并发症直接相关还是可能与由于抗体依赖性增强而引起更严重的疾病的索托维单抗相关，所有住院(无论原因如何)都包括在主要终点中并且被视为严重不良事件
[1063]
2.为了告知非covid-19不良事件和严重不良事件的数量和性质，进行额外的安全性分析，其中排除与covid-19疾病的已知进展一致的所选择的预先指定的术语。
[1064]
表11：主要症状(itt群体)
[1065]
[1066]
itt表示意向治疗。
[1067]
表12：基线人口统计学和疾病特性(安全性分析群体)
[1068][1069]
sd表示标准偏差、egfr估计的肾小球滤过率、mdrd肾疾病饮食调整、nyha纽约心脏协会。
[1070]
*针对索托维单抗组中的一名患者和安慰剂组中的一名患者的种族数据是不可获得的。
[1071]
体重指数是以体重(千克)除以身高(米)的平方。
[1072]
索托维单抗组中的一名患者的症状持续时间为6天。对于索托维单抗组中的另外两名患者，在此中期分析时不能获得症状持续时间数据。
[1073]
表13：住院超过24小时的主要原因(itt群体)
[1074][1075][1076]
itt表示意向治疗，m男性，f女性，n否，y是。
[1077]
*与住院相关的不良事件始于患者入院前一天。
[1078]
方案1：患者处置(itt群体)。
[1079][1080]
itt表示意向治疗。
[1081]
实例41
[1082]
索托维单抗用于治疗患有重度至危重covid-19疾病的住院受试者的2期/3期临床研究
[1083]
进行随机化、多中心、双盲、安慰剂对照的研究，以评估单克隆抗体索托维单抗在患有重度或危重covid-19疾病的患者中的安全性和功效。
[1084]
主要目的是比较索托维单抗与安慰剂相比的功效。次要目标是比较索托维单抗与安慰剂相比对上呼吸道样品和下呼吸道样品中的病毒脱落的功效，比较索托维单抗与安慰剂相比的安全性和耐受性，确定索托维单抗与安慰剂相比诱导抗病毒应答的功效，确定索托维单抗与安慰剂相比增加icu天数和无住院天数的功效，以及确定索托维单抗的血清药代动力学(pk)。
[1085]
探索性目标是比较索托维单抗与安慰剂相比在预防covid-19疾病的非呼吸道并发症方面的功效，比较索托维单抗与安慰剂相比对上呼吸道样品和下呼吸道样品和血液样品中的病毒脱落的影响，评估对索托维单的抗性的出现，评估索托维单抗对宿主应答的潜在生物标志物的影响，并且评估功效、安全性、pk、病毒脱落与免疫原性之间的相关性。
[1086]
评估标准的细节
[1087]
本研究的主要终点如下：
[1088]
1.直到第29天进展到重度或危重covid-19或死亡的受试者的比例，如通过以下定义的：
[1089]
1.重度疾病：血氧不足(在室内空气中的o2饱和度≤93％或pao2/fio2《300)，所述血氧不足需要氧气补充》1天或受试者需要≥4升/分钟氧气补充或等效物，并且调查者或指定者确定在室内空气中的o2饱和度的测量结果在医学上是不安全的或
[1090]
2.危重疾病：呼吸衰竭；或休克；或多器官功能障碍/衰竭，所述呼吸衰竭需要以下
中的至少一者：侵入性机械通气，ecmo
[1091]
或
[1092]
3.死亡
[1093]
2.与护理标准(soc)相比，临床应答的时间，定义为至第29天存活并且不依赖于氧气补充。
[1094]
本研究的次要终点如下：
[1095]
3.不良事件(ae)的发生率
[1096]
4.严重不良事件(sae)的发生率
[1097]
5.特别关注的不良事件(aesi)的发生率
[1098]
6.在第8天、第15天或第22天进展到发展为重度或危重covid-19的受试者的比例
[1099]
7.29天、60天和90天全因死亡率
[1100]
8.从随机化至第29天的呼吸机总天数
[1101]
9.至29天需要补充氧气的总天数
[1102]
10.重症监护总停留时间(los)
[1103]
11.总医院los
[1104]
12.使用flu-pro患者报告的结果测量仪器，报告covid-19相关疾病的体征和症状的受试者的严重程度和持续时间
[1105]
13.心脏、血栓栓塞、肾、神经系统事件的发生率
[1106]
14.在基线和至第29天的随访时段期间通过pcr检测鼻分泌物中的sars-cov-2
[1107]
15.通过定量rt-pcr从鼻咽样品没有检测到病毒rna(《lloq)的时间
[1108]
16.血清中的索托维单抗药代动力学(pk)
[1109]
17.血清ada对索托维单抗的发生率和滴度(如果适用)
[1110]
本研究的探索性终点如下：
[1111]
30.对于临床改善，在第8天、第15天、第22天和第29天受试者在序数量表的每个类别中的比例(参见下文)
[1112]
31.sars-cov-2对mab的病毒抗性突变体的出现
[1113]
32.通过qrt-pcr的鼻分泌物和血液中的病毒载量
[1114]
33.宿主转录组和免疫分型分析
[1115]
34.如通过基因分型确定的fcγr多态性
[1116]
35.如通过基因分型确定的igg1同种异型
[1117]
36.工作效率和活动障碍(wpai)相对于基线的变化
[1118]
37.根据eq-5d-5l，健康相关生活质量相对于基线的变化
[1119]
用于临床改善分类的序数量表如下：
[1120]
1.未感染：没有感染的临床或病毒学证据
[1121]
2.非住院，活动不受限制(如果在家使用氧气，报告为第4类)
[1122]
3.非住院，活动受限
[1123]
4.住院，无吸氧疗法
[1124]
5.住院，通过面罩或鼻塞进行的低流量氧气
[1125]
6.住院、高流量氧气、持续气道正压(cpap)、双水平气道正压(bipap)、非侵入性通
气
[1126]
7.住院、插管和机械通气
[1127]
8.住院、机械通气加上器官支持(血管加压药、rrt、ecmo)
[1128]
9.死亡
[1129]
所计划的受试者的数量
[1130]
本研究包含两部分。第1部分纳入大约20名患有严重covid-19疾病的受试者。第2部分纳入大约500名患有重度至危重covid-19疾病的受试者；每个治疗组大约250名受试者。
[1131]
随机化和分层
[1132]
受试者按1:1比率随机化以接受单次iv剂量的索托维单抗加上护理标准(soc)或等体积生理盐水安慰剂加上soc。
[1133]
对于第1部分，纳入研究中的前20名受试者(每组十名)位于重度covid-19疾病群体(4级或5级)中。这些受试者按自症状发作的时间进行分层，1)少于七天或2)七天或更多。将纳入第1部分中的所有受试者分配到强化pk采样。从这些受试者收集血清pk样品。
[1134]
对于第2部分，受试者的临床状态按疾病状态(重度或危重)和自症状发作的时间进行分层，如下：
[1135]
1.重度(4级或5级)并且自症状发作以来有少于七天
[1136]
2.重度(4级或5级)并且自症状发作以来有七天或更长时间
[1137]
3.危重(6级或7级)并且自症状发作以来有少于七天
[1138]
4.危重(6级或7级)并且自症状发作以来有七天或更长时间。
[1139]
从纳入第2部分中的受试者收集稀疏pk样品。
[1140]
纳入的诊断和主要标准
[1141]
纳入标准包括：
[1142]
年龄：
[1143]
10.受试者的年龄为18岁及以上
[1144]
疾病特性：
[1145]
11.具有阳性sars-cov-2测试结果(通过任何验证测试，例如，对任何样本类型进行的rt-pcr)的受试者
[1146]
以及
[1147]
12.因重度covid-19疾病而住院，定义为与4级或5级疾病一致的需要补充氧气或非侵入性通气
[1148]
或
[1149]
13.因危重covid-19疾病而住院，定义为需要机械通气的疾病(6级或7级疾病)
[1150]
以及
[1151]
14.第14天的14天内covid-19症状的发作
[1152]
以及
[1153]
15.入院48小时内随机化
[1154]
性别：
[1155]
16.无性别限制
[1156]
17.女性受试者必须满足并同意遵守以下避孕标准。妇女使用的避孕应符合当地关于参与临床研究的那些人的避孕方法的法规。
[1157]
18.如果女性受试者未处于怀孕或哺乳期，且符合以下条件之一，方可参加：
[1158]
是不具有生育能力的妇女(woncbp)
[1159]
或
[1160]
是具有生育能力的妇女(wocbp)，并且使用高效的避孕方法，在研究干预期期间和最后一剂研究干预后至多一年的失败率《1％。调查者应评估与第一剂研究干预相关的避孕方法失败的可能性(例如，不依从，最近开始)。
[1161]
19.wocbp必须在入院时或在第一剂研究干预之前具有阴性高度敏感的妊娠试验(当地法规要求的尿液或血清)。如果不能证实尿检是阴性的(例如，不明确的结果)，则需要进行血清妊娠试验。在这种情况下，如果血清妊娠结果是阳性的，则受试者被排除在参与之外。
[1162]
知情同意书：
[1163]
20.愿意遵守研究要求并能够给出签署的知情同意书或法律上可接受的代表愿意并能够代表受试者给出书面知情同意书，以参与对无意识成年人和由于其医学病状而无法自行同意的那些人的研究。
[1164]
排除标准：
[1165]
·
在负责调查员看来，参与不符合参与者最高利益，或可能限制协议指定的评估的任何条件；预期无法参与研究程序；在研究者看来，在随机化时不太可能存活超过48小时的参与者；计划或预计在随机化时在72小时内出院或转移到另一家医院；对其它mab或存在于调查产品中的赋形剂中的任何赋形剂的超敏性病史；
[1166]
·
对于导入期：终末器官衰竭或功能障碍的参与者不符合导入期的条件，但符合扩展期的条件。
[1167]
o终末器官功能障碍类别是：a.中风；b.脑膜炎；c.脑炎；d.脊髓炎；e.心肌梗塞；f.心肌炎；g.心包炎；h.有症状的充血性心力衰竭(纽约心脏协会[nyha]iii级-iv级)；i.动脉或深静脉血栓形成或肺栓塞
[1168]
o终末器官衰竭类别是：a.需要高流量氧气、非侵入性通气或侵入性机械通气；b.体外膜肺氧合(ecmo)；c.机械循环支持(例如，主动脉内球囊泵、心室辅助装置)；d.血管加压药疗法；e.在此入院期间开始肾替代疗法(rrt)(即，不是接受慢性rrt的患者)。
[1169]
·
在接受以下之前：
[1170]
o来自covid-19存活者的任何sars-cov-2超免疫静脉内免疫球蛋白(hivig)
[1171]
o来自从covid-19中恢复的康复者血浆或
[1172]
o在任何时间sars-cov-2中和单克隆抗体。
[1173]
·
参与涉及调查研究干预的其它临床试验，包括用于covid-19
[1174]
·
处于怀孕或哺乳期的女性
[1175]
研究参与和随访的持续时间
[1176]
研究药物治疗的持续时间是单剂量。每名受试者的所估计的总研究时间(包括筛选和随访)为大约36周。在第一剂量前至多48小时进行筛选评估。完成筛选评估后，用单次ic剂量的索托维单抗或安慰剂对符合条件的受试者进行治疗。每天评估受试者直至出院当
天。出院后，在第15天和第29天进行评估，并且在随机化后继续随访至第36周。
[1177]
研究设计
[1178]
独立数据监测委员会(idmc)主动监测中期非盲安全性数据(第1部分)和中期非盲安全性和功效数据(第2部分)，以作出关于正在进行的研究进行的建议。idmc成员包括3-4名受过相关医学专家培训的医生和一名统计员。联合安全审查小组(jsrt)确定基于输入流盲法数据审查的安全性问题是否需要上报给idmc。
[1179]
本研究是针对sars-cov-2的单克隆抗体(mab)索托维单抗的随机化、双盲、多中心、安慰剂对照的试验，以在调查者定义的护理标准(soc)的基础上评估单次iv剂量的索托维单抗与安慰剂相比作为因covid-19疾病而住院的成人参与者的治疗的功效和安全性。研究群体由具有阳性sars-cov-2测试结果的患有covid-19疾病的住院受试者组成。这些参与者可能患有危重(6级或7级)或重度(4级或5级)疾病。除了研究治疗之外，所有受试者根据机构协议接受soc。
[1180]
本研究包括2个部分。第1部分纳入20名患有重度covid-19疾病的参与者。在通过idmc在第14天对非盲数据进行初步安全性评估后，第2部分(主要群组)继续进行，其中纳入患有重度和危重covid-19疾病的参与者。仅重度参与者纳入第2部分中而不暂停研究，直到idmc建议也纳入危重参与者。
[1181]
为了探索宿主免疫应答和感染的潜在生物标志物，受试者可能同意进行在指定时间点收集外周血单核细胞(pbmc)的任选的子研究。在所选择的地点进行此任选的子研究。每组大约50-100名参与者纳入任选的子研究中。
[1182]
在本研究期间，由idmc进行的非盲安全性数据审查确定从第1部分扩展到第2部分是否安全，所述第1部分包括患有重度(4级或5级)covid-19疾病的受试者，所述第2部分另外包括患有危重(6级或7级)covid-19疾病的受试者。
[1183]
安慰剂对照将索托维单抗的安全性和耐受性与covid-19的背景体征和症状区分开来，并且评估其对临床结果的潜在益处。使用安慰剂组允许有效评估可归因于索托维单抗的功效和安全性的任何变化对可归因于soc和研究期间给予的其它治疗的那些变化。
[1184]
评估治疗功效的主要终点是临床应答的时间，定义为受试者在随机化的29天内存活并且不依赖补充氧气或恢复到病态前氧气需求(对于长期使用氧气的受试者)持续至少24小时。从需要氧气疗法或更高水平的呼吸/器官支持的转变是临床上显著的里程碑。
[1185]
显著的次要终点是在第29天的全因死亡率。与住院时间相关的其它次要功效终点
–
住院时间、icu停留时间、通气时间以及受试者报告的covid-19体征和症状的严重程度和持续时间也是临床相关的。
[1186]
研究干预组和持续时间
[1187]
在第一剂量前至多48小时进行筛选评估。筛选程序包括：获取医学和疾病病史；在先前没有确认的阳性测试的情况下，通过鼻拭子、鼻咽拭子或气管内拭子测试sars-cov-2感染；全面的身体检查，包括测量身高和体重；测量生命体征，包括血压、脉搏、呼吸频率和体温；未进行侵入性机械通气的受试者的氧气饱和度(spo2)；氧气递送和通气状态；12导联ecg(一式三份)；对所有具有生育能力的女性受试者进行尿液或血清妊娠试验；实验室评估，包括血液学、临床化学概况、凝血参数、crp、d-二聚体、尿液分析和心肌肌钙蛋白；胸片(根据soc住院后获得的胸部x光或计算机断层扫描)；以及审查既往或伴随用药情况。
[1188]
在第1天，用单次iv剂量(索托维单抗或安慰剂)加上soc对符合条件的受试者进行治疗。每天对这些受试者进行评估，直至出院当天。出院后，在第15天和第29天进行评估，并且在随机化后继续随访至第36周。
[1189]
在第1部分中，将患有重度covid-19疾病(4级或5级)的受试者通过交互式反应技术(irt)以盲法方式按1:1随机化以接受单次iv剂量的索托维单抗或安慰剂。在第2部分(主要群组)中，将患有重度(4级或5级)或危重(6级或7级)covid-19疾病的受试者按1:1随机化以接受单次iv剂量的索托维单抗或安慰剂。除了研究治疗之外，所有参与者根据机构协议接受soc。
[1190]
基于随机化时疾病严重程度(重度或危重)和自症状发作以来的时间(少于七天或七天或更长)对随机化进行分层。
[1191]
研究干预
[1192]
研究干预和给药说明如下：
[1193]
表14：
[1194][1195]
图3示出了另外的研究细节。
[1196]
实例42
[1197]
索托维单抗在因covid-19而住院的患者中的3期临床研究
[1198]
进行3期临床研究，评估不同药物在治疗因感染而住院的人的covid-19的安全性和有效性。研究中的参与者用研究药物(例如，索托维单抗)加上当前标准护理(soc)或安慰剂加上当前soc进行治疗。
[1199]
所述协议用于随机化、盲法、受控平台研究，该研究允许在研究期间添加和丢弃调查药物。这允许在同一研究中针对安慰剂和标准护理(soc)治疗的药物进行有效测试。当同时测试多于一种药物时，参与者被随机分配到治疗或安慰剂。
[1200]
按研究地点药房和疾病严重程度对随机化进行分层。有2个疾病严重程度等级：不具有器官衰竭的参与者(严重程度等级1)；以及具有器官衰竭的参与者(严重程度等级2)。
[1201]
独立数据和安全监测委员会(dsmb)定期审查中期分析并且概括安全性和功效结果。对于具有最小预先存在的安全知识的调查药物，最初限制纳入速度，并且dsmb对安全性数据进行早期审查。对于每种药剂的研究，在试验开始时，仅纳入疾病严重程度等级1的参
与者。这一直持续到大约300名参与者被纳入并随访5天。确切数量可能根据纳入速度和dsmb会议的定时而有所不同。在扩大纳入以也包括疾病严重程度等级2的患者之前，评估安全性，并且使用在第5天评估的2个序数结果通过dsmb进行预先指定的无效评估。
[1202]
将两个序数结果用于评估无效性，因为尚不清楚研究中的调查药物是否主要影响非肺部结果，部分地通过可能不同于影响肺部结果的机制的那些机制，sars-cov-2感染增加了非肺部结果的风险。
[1203]
对于通过此无效性评估的研究药剂，参与者纳入被无缝扩展并且无需任何数据非盲，以包括疾病严重程度等级2的参与者以及疾病严重程度等级1的参与者。未来的中期分析基于持续恢复的主要终点，并且使用预先指定的指南来确定研究药剂的益处、危害或无效性的早期证据。参与者在随机化后被随访18个月。
[1204]
此协议内的国际试验在数百个临床地点进行。参与站点隶属于美国国立卫生研究院(nih)和美国退伍军人事务部资助的网络。
[1205]
纳入大约10,000名参与者。分配是随机的。干预模型是并行分配。掩蔽是三重的(参与者、护理提供者、调查者)。主要目的是治疗。在一组中，参与者被随机化以接受药物(例如，索托维单抗)加上soc或安慰剂加上soc。随后，参与者不再随机化至索托维单抗。在安慰剂组中，提供了安慰剂(通过iv输注施用的可商购获得的0.9％氯化钠溶液)加上瑞德西韦，无禁忌症。
[1206]
主要结果量度
[1207]
1.从随机化到持续恢复的时间[时间范围：直到第90天]。持续恢复，定义为从指数住院到出院，随后在第90天之前连续14天存活并且回家。
[1208]
次要结果量度
[1209]
1.全因死亡率[时间范围：至第90天]
[1210]
2.持续恢复时间和死亡率的复合[时间范围：至第90天]
[1211]
3.在短期急性护理医院外的存活天数[时间范围：直到第90天]
[1212]
4.肺序数结果[时间范围：第1-7天、第14天和第28天]
[1213]
通过7个类别测量的氧气需求(1＝最不严重，7＝最严重)。使用参与者观察到的最高(即，最严重)评分。
[1214]
5.肺部+序数结果[时间范围：第1-7天]
[1215]
通过7个类别测量的肺外并发症和呼吸功能障碍(1＝最不严重，7＝最严重)使用参与者观察到的最高(即，最严重)评分。
[1216]
6.临床器官衰竭的发生率[时间范围：至第28天]
[1217]
7.死亡或严重临床covid-19相关事件的复合[时间范围：至第90天]
[1218]
8.心血管事件和血栓栓塞事件的复合[时间范围：至第90天]
[1219]
9.3级和4级临床不良事件、严重不良事件(sae)或死亡的复合[时间范围：至第5天和第28天]
[1220]
10.输注反应的发生率[时间范围：至第0天]
[1221]
11.sae或死亡的复合[时间范围：至18个月]
[1222]
12.sars-cov-2中和抗体水平的变化[时间范围：基线至第1天、第3天、第5天、第28天和第90天]
[1223]
13.抗体总体滴度的变化[时间范围：基线至第1天、第3天、第5天、第28天和第90天]
[1224]
14.中和抗体水平的变化[时间范围：基线至第1天、第3天、第5天、第28天和第90天]
[1225]
15.高于发病前氧气使用的补充氧气的家庭使用的发生率[时间范围：18个月]
[1226]
测量为：在家中存活并且不使用连续补充氧气，持续不间断的14天时段
[1227]
16.高于发病前氧气使用的补充氧气的无家庭使用的发生率[时间范围：14天]
[1228]
测量为：在家中存活持续不间断的14天时段，并且在14天时段结束时不使用连续补充氧气。
[1229]
所有性别的年龄在18岁及以上的成年人(成人和老年人)都是合格的。纳入标准是：签署知情同意书；针对covid-19的阳性测试以及表明正在进行的covid-19感染的进行性疾病；covid-19的症状持续≤12天；并且需要入院接受紧急医疗护理(并非纯粹出于公共卫生或检疫目的)。排除标准为：
[1230]
·
已经接受来自从covid-19恢复的人或已经在住院前的任何时间接受中和性单克隆抗体的人的血浆的患者。
[1231]
·
患者不愿意放弃参与其它covid-19治疗试验，直到研究的第5天后。基于研究领导小组的意见，可以允许在比较推荐的护理标准治疗的某些试验中的共同纳入。
[1232]
·
在负责的调查员看来，参与不符合参与者的最佳利益或可能阻止、限制或混淆协议指定的评估的任何条件。
[1233]
·
被认为无法参与研究程序的患者。
[1234]
·
在研究开始时尚未怀孕并且不愿接受强烈建议避免与男性发生性行为或在研究的18个月内采取适当避孕措施的具有生育能力的妇女。
[1235]
·
在研究的18个月内，不愿接受强烈建议避免与具有生育能力的妇女发生性关系或使用屏障避孕的男性。
[1236]
·
孕妇
[1237]
·
哺乳期母亲
[1238]
·
在研究纳入时存在以下中的任一项：
[1239]
1.中风
[1240]
2.脑膜炎
[1241]
3.脑炎
[1242]
4.脊髓炎
[1243]
5.心肌缺血
[1244]
6.心肌炎
[1245]
7.心包炎
[1246]
8.有症状的充血性心力衰竭
[1247]
9.动脉或深静脉血栓形成或肺栓塞
[1248]
·
针对以下中的任一项的当前或迫切要求：
[1249]
1.侵入性机械通气
[1250]
2.ecmo(体外膜肺氧合)
[1251]
3.机械循环支持
[1252]
4.血管加压药疗法
[1253]
5.此次入院时开始肾替代疗法(即，不是接受慢性肾替代疗法的患者)。
[1254]
另外，在已经纳入大约150名参与者(索托维单抗)和150名参与者(安慰剂)时进行的初始无效性评估之前，将排除进行高流量氧气或非侵入性通气的患者(肺序数结果的第5类)。如果这种药剂通过了初始无效性评估，则这些患者可能有资格进行试验。
[1255]
施用单剂量的500mg索托维单抗。基于体外中和数据、体外抗性数据、从在食蟹猴中的研究外推的预期人pk以及glp猴毒理学研究的结果来选择剂量。索托维单抗以186.3ng/ml(范围：125.8ng/ml
–
329.5ng/ml)的平均ec90值中和sars-cov-2活病毒。在抗性分析中，在固定浓度的抗体下，即使在所测试的最低剂量(约10x ec50)下，通过10次传代没有观察到病毒突破，这表明索托维单抗具有高抗性屏障的潜力。
[1256]
使用递增浓度选择方法来迫使抗性出现，对于一些传代，在病毒选择期间观察到ec50的适度变化倍数(ec50的5至6倍变化)。使用假型化病毒系统对来自这些传代的刺突变体进行测序和测试没有鉴定效力的这种适度变化的因果变体。病毒的一次传代确实证明了与e340a突变相关的ec50的》10倍位移。进一步评估已鉴定e340a是单克隆抗体抗性突变体(marm)，其赋予对索托维单抗的易感性降低》100倍。值得注意的是，e340在可获得的sars-cov-2序列中是100％保守的。由于抗性选择结果的二元性质，抗性谱未告知特定的抑制商数(iq)。然而，由于非常少的菌株可用于直接评估覆盖宽度，因此在这种情况下，保守的iq(》10)是适当的。将食蟹猴pk研究(单次iv剂量，5mg/kg)拟合到2室pk模型。使用完全人igg的异速生长缩放方法(cl和v的异速生长系数分别为0.85和1；10)从食蟹猴缩放人pk参数。假定人体重为70kg，估计索托维单抗在人中的预测的血清清除率为141毫升/天，并且所估计的分布体积为6500ml(约93ml/kg)。预计人终末消除半衰期为大约32天。
[1257]
为了降低患者的风险(治疗失败、出现病毒抗性)，选择单一治疗剂量，其确保在28天治疗窗口的持续时间期间和更长时间内，肺中的索托维单抗浓度保持远高于预期保护sars-cov-2感染的水平。在28天治疗时段的持续时间内，预期500mg的剂量将血清水平维持在38.5μg/ml或以上。基于来自ec90范围的最高端的保守ec90(0.33μg/ml)，并且考虑igg的肺:血清比率(假定保守值为0.25；对于全肺和间质液分别报道的范围为0.25-0.68；预期500mg剂量后的血清谷浓度产生与最大(》99％)抗病毒活性相关的肺浓度；对于28天治疗时段的持续时间，》29x组织调整后的ec90。肺中的这种保守抑制商数(29倍)被认为适于增加治疗成功的可能性并降低抗性的风险。
[1258]
另外，预期500mg剂量使得鼻咽分泌物中的索托维单抗达到保护水平(》5x组织调整后的ec90，假定nps:血清比率为0.05，12)，这可以潜在地降低传播。
[1259]
索托维单抗的noael为500mg/kg(所测试的最高剂量)，当在食蟹猴中通过iv输注每周一次施用索托维单抗持续2周时。在此noael下，初步cmax和曲线下面积(auc)0-t(第2次剂量后输注结束后时间从0小时至168小时的auc)分别为13500μg/ml和48200μg天/毫升。人等效剂量(hed)(hed是根据关于血管内施用蛋白质的fda指南通过直接mg/kg转换计算，其中mr》100,000道尔顿)为500mg/kg或30,000mg固定剂量(使用60kg的人体重量)。使用安全因子10，人体的最大推荐起始剂量为大约50mg/kg或3,000mg固定剂量。基于所提出的500mg人体剂量，基于hed、cmax和auc(基于来自tx-7831-0102的部分auc0-t和人类的预期
aucinf的保守auc余量)的余量分别为60倍、87倍和13.6倍，从而支持所提出的500mg临床剂量。
[1260]
除了主协议中概述的纳入标准和排除标准之外，还将排除以下患者：1)孕妇；以及2)哺乳期母亲。另外，在已经纳入大约150名参与者(索托维单抗)和150名参与者(安慰剂)时进行的初始无效性评估之前，排除进行高流量氧气或非侵入性通气的患者(肺序数结果的第5类)。如果这种药剂通过了初始无效性评估，则这些患者可能有资格进行试验。
[1261]
在一小时时段内施用单次输注。密切监测研究参与者，并且根据监督输注的医生的判断进行监测，调整输注速率和/或暂停或停止输注。
[1262]
如果指示的话，则监督输注的医生可以根据当地实践使用支持措施。索托维单抗以10ml溶液的小瓶提供，各个小瓶包含250mg抗体。索托维单抗必须储存在介于2℃与8℃之间。总共需要2个小瓶用于以500mg剂量给予药剂。药剂以1mg/ml至10mg/ml的浓度施用。安慰剂是来自当地供应的正常生理盐水。如果在施用期间发生输注反应，或者如果参与者具有表明潜在受益于术前用药的病史，则研究调查者应确定适当的术前用药。如果参与者间的输注反应的频率允许术前用药，则可能推荐术前用药。如果观察到较小的输注反应，则可以在开始输注之前施用对乙酰氨基酚500mg至1000mg、抗组胺剂和/或其它适当指示的药物用于随后的参与者。调查者和赞助者决定在后续参与者中实施用于输注的术前用药，并且记录在研究文件中。所给予的任何术前用药都记录为伴随疗法。
[1263]
在第0天、第28天和第90天，收集静脉血液样品以确定针对索托维单抗的抗体产生。免疫原性可以通过在存在索托维单抗的情况下设计用于检测ada的经验证的测定来评估。可以进一步表征抗体中和索托维单抗活性的能力。来自pk样品的剩余体积也可以根据需要用于免疫原性评估。
[1264]
在第0天、第1天、第5天、第28天和第90天，收集静脉血液样品以确定索托维单抗血清浓度用于药代动力学评估。pk/免疫原性评估需要2ml所收集的血清。可以在生物分析实验室通过经验证的测定来评估pk样品。pk评估使用相同的2ml血清。没有计划分析来自安慰剂治疗的受试者的样品。用于pk的剩余样品可以合并并且视情况可用于探索性代谢或生物分析方法实验。随着子研究的展开，样品可能会分批运送到实验室进行分析。将来自此类分析的结果返回到试验中央数据库。将此数据和关于参与者的所有其它数据保留在试验中央数据库中，直到试验非盲为止。输注后应密切监测所有参与者持续2小时，因为存在输注反应和与任何生物药剂的超敏反应(包括过敏反应)的风险。
[1265]
作为输注反应的一部分可能出现的症状和体征包括但不限于发烧、发冷、恶心、头痛、支气管痉挛、低血压、血管性水肿、喉咙刺激、包括荨麻疹在内的皮疹、瘙痒、肌痛和头晕。
[1266]
临床地点应具有必要的设备、药物、足够合格且经验丰富的工作人员以及适当的医疗保险来管理任何输注反应，所述输注反应可以包括但不限于氧气、iv流体、肾上腺素(epinephrine/adrenaline)、对乙酰氨基酚(acetaminophen)(/扑热息痛(paracetamol))和抗组胺剂。
[1267]
如果参与者经历输注反应，则应根据体征和症状使用支持性护理。如果使用索托维单抗/安慰剂发生严重且可能危及生命的输注反应，则应永久停止其使用。以下是用于药剂索托维单抗或用于索托维单抗的安慰剂的aesi：输注相关反应；过敏/超敏反应。
[1268]
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[1285]
实例43
[1286]
用于预防暴露于sars-cov-2的成人和青少年受试者的covid-19的索托维单抗的3期临床研究
[1287]
进行随机化、多中心、双盲、安慰剂对照的3期研究，以评估单克隆抗体索托维单抗在预防暴露于sars-cov-2的成人和青少年受试者的covid-19的安全性和功效。
[1288]
主要目标是评估索托维单抗与安慰剂相比在预防患有sars-cov-2感染的人的密切接触中的有症状的covid-19的功效，并且确定索托维单抗与安慰剂相比的安全性和耐受性。
[1289]
次要目标是：
[1290]
·
与安慰剂相比，评估索托维单抗在预防患有sars-cov-2感染的人的密切接触者中的无症状的sars-cov-2感染的功效
[1291]
·
评估索托维单抗在减少患有sars-cov-2感染的人中的病毒脱落持续时间方面的功效
[1292]
·
评估索托维单抗在降低患有sars-cov-2感染的人的covid-19的临床体征和症状的发生率、严重程度和持续时间方面的功效
[1293]
·
评估索托维单抗在减轻患有sars-cov-2感染的人的临床症状方面的功效
[1294]
·
评估索托维单抗在减缓进展到患有sars-cov-2感染的人的重度疾病方面的功效，如通过住院率、icu入院率或由于covid-19而死亡所评估的
[1295]
·
评估索托维单抗的血清药代动力学(pk)
[1296]
·
评估对索托维单抗的潜在免疫原性(诱导ada)应答
[1297]
探究性目标包括：
[1298]
·
评估索托维单抗在减少患有sars-cov-2感染的人中的病毒载量方面的功效
[1299]
·
评估sars-cov-2病毒载量与治疗和疾病严重程度的关联
[1300]
·
监测患有确诊的sars-cov-2的受试者对索托维单抗的病毒抗性的出现
[1301]
·
评估受试者遗传多态性与索托维单抗作用机制和/或pk之间的潜在关系
[1302]
·
测量索托维单抗对由于covid-19所致的缺勤时间和工作效率方面的影响
[1303]
·
评估索托维单抗对宿主应答的潜在生物标志物的影响
[1304]
评估标准
[1305]
本研究的主要功效终点如下：
[1306]
·
至第2周(第15
±
1天)，患有实验室确诊的(rt-pcr)covid-19的受试者的比例，定义为以下中的一者或多者：
[1307]
1.急性呼吸道症状(咳嗽、痰液产生、咽喉痛或呼吸短促)；
[1308]
或
[1309]
2.发烧》38℃；
[1310]
或
[1311]
3.以下症状中的2种或更多种症状(疲乏、肌痛/关节痛、发冷、恶心/呕吐、腹泻、嗅觉丧失/味觉障碍)
[1312]
本研究的主要安全性终点如下：
[1313]
·
施用索托维单抗后发生治疗紧急不良事件(ae)和严重ae(sae)的受试者的比例
[1314]
·
临床评估，包括但不限于实验室测试结果
[1315]
本研究的次要终点如下：
[1316]
·
至第2周(第15
±
1天)，具有阴性基线测试的受试者的实验室确诊的(rt-pcr)无症状的sars-cov-2感染的发生率
[1317]
·
如通过rt-pcr从鼻拭子评估的，索托维单抗与安慰剂治疗组之间的病毒脱落持续时间的差异
[1318]
·
covid-19临床体征和症状的发生率、严重程度和持续时间
[1319]
·
由于covid-19而需要住院的参与者的百分比
[1320]
·
需要icu护理的参与者的百分比
[1321]
·
需要机械通气或ecmo的参与者的百分比
[1322]
·
与covid-19相关死亡的参与者的百分比
[1323]
·
血清中索托维单抗的浓度
[1324]
·
血清ada对索托维单抗的发生率和滴度(如果适用)
[1325]
本研究的探索性终点包括：
[1326]
·
通过qrt-pcr从鼻拭子评估的索托维单抗与安慰剂治疗组之间在疾病发作时病毒载量的差异
[1327]
·
病毒载量(qrt-pcr)与covid-19严重程度之间的关系
[1328]
·
在第4周，具有阴性基线测试的受试者的通过血清学的实验室确诊的sars-cov-2感染的发生率
[1329]
·
如通过基因分型确定的fcr多态性
[1330]
·
如通过基因分型确定的免疫球蛋白g1(igg1)同种异型
[1331]
·
工作效率和活动障碍(wpai)相对于基线的变化
[1332]
·
根据eq-5d-5l，健康相关生活质量相对于基线的变化
[1333]
·
索托维单抗施用对宿主应答的生物标志物的影响，如通过宿主转录组和免疫分型分析所评估的受试者数量
[1334]
纳入大约1350名受试者(每个治疗组450名)。
[1335]
诊断和主要合格性标准
[1336]
1.年龄为12岁或以上的男性和女性受试者
[1337]
2.与患有已知的pcr确诊的sars-cov-2感染的人(指标)密切接触
[1338]
密切接触定义为：
[1339]
a.在指标诊断前7天内与指标病例一起居住，包括在如长期护理机构或疗养院等聚集环境中的居住者或工作人员
[1340]
b.医务工作人员、第一应答者或其它护理人员
[1341]
c.自最后一次暴露于指标病例(与患有sars-cov-2感染的人密切接触)起少于3天
[1342]
4.女性受试者必须具有阴性妊娠试验或确认绝经后状态
[1343]
5.给药前4小时内sars-cov-2感染的阴性快速试验
[1344]
研究参与的持续时间
[1345]
每名受试者的所估计的总研究时间(包括筛选)为至多36周。在随机化之前24小时内筛选受试者。在研究药物施用后，针对终点评估，对受试者进行评估持续至多6周(第43
±
3天)，并且针对安全性随访，持续至多36周。
[1346]
研究设计
[1347]
这是用于预防暴露于病毒的成人的有症状的sars-cov-2感染的2种剂量水平的索托维单抗的随机化、双盲、安慰剂对照研究。设计本研究以评估低剂量和高剂量索托维单抗与安慰剂相比在预防有症状的sars-cov-2感染方面的功效。
[1348]
本研究纳入大约1350名年龄为12岁或以上的无症状的男性和女性受试者，包括患有合并症的那些受试者，所述受试者与患有逆转录酶-聚合酶链式反应(rt-pcr)确诊的sars-cov-2感染的人密切接触(即，家庭成员或医疗保健提供者)。在筛选中使用快速诊断测试来富集未确立感染的受试者。将符合条件的受试者在第1天作为单次施用按1:1:1比率随机化以接受低剂量索托维单抗、高剂量索托维单抗或安慰剂。
[1349]
由具有相关专业知识的成员组成的独立数据监测委员会(dmc)召开会议以审查研究数据。dmc的目的是监测安全性、功效和无效性，并且基于安慰剂组中的观察到的感染率确定是否需要重新调整样本量。进行两项中期分析。第一中期分析是在已经纳入大约20％的受试者(每组约90名)后进行的，以评估s309 n55q ls的每个剂量水平的安全性和耐受性。
[1350]
第二中期分析是在已经纳入大约50％的受试者(每组约225名)后进行的，以评估安全性、无效性和功效。剂量水平可能由于安全问题或缺乏功效而中断。
[1351]
如果出现关于sars-cov-2预防的有效药剂的数据，则可能修改协议以在对照组中包括新的标准护理剂。
[1352]
本研究包括在大约75名受试者(每组25名)中的pk子研究，用于强化pk和ada样品
收集。所有其它受试者具有稀疏的pk和ada样品收集。如果将新批次的索托维单抗引入研究中，则可能将额外的受试者包括到强化pk和免疫原性子研究中。
[1353]
研究程序
[1354]
筛选：
[1355]
在随机化前24小时内进行筛选，并且包括书面知情同意书、合格性确定、人口统计学收集、过去和当前的医学状况(包括已知的怀孕和/或泌乳状态)、伴随的药物以及关于暴露于指标病例的信息。
[1356]
给药(第1天)：
[1357]
在第1天收集用于rt-pcr的基线鼻拭子后，将符合条件的受试者随机化以接受索托维单抗或安慰剂。受试者在给药后留在诊所，持续最少4小时，以评估索托维单抗的安全性和局部耐受性并完成评估。
[1358]
随访时段：
[1359]
受试者完成从第1天至第2周访视的每天日记。此调查包括感染的临床体征和症状的记录以及伴随药物审查。另外，所有受试者在第4天、第7天和第10天在家中收集鼻拭子以监测无症状的sars-cov-2感染。研究小组成员通过电话联系受试者以评估不良事件并为完成研究程序提供支持。受试者在第2周(第15
±
1天)和第6周(第42
±
3天)进行临床访视并完成评估。
[1360]
如果受试者经历如下定义的症状发作，则根据covid-19监测时间表对受试者进行随访：呼吸道症状急性发作(干咳、呼吸短促、咽喉痛或痰液产生)；或》38.0℃的发烧；或≥以下症状中的2种症状：肌痛/关节痛、发冷、恶心/呕吐、腹泻、嗅觉丧失/味觉障碍。
[1361]
符合潜在有症状的covid-19标准的受试者完成sars-cov-2感染的临床评估，包括用于确认感染的鼻拭子。受试者在症状发作后21天内继续完成每天日记。收集额外的鼻拭子以评估病毒载量和病毒脱落的持续时间。在这些受试者中，在阳性测试后第一周每隔一天收集鼻拭子并且然后在感染后的第二周和第三周期间每隔3天收集鼻拭子。
[1362]
给药后对受试者进行随访持续至多36周，用于评估安全性、pk和免疫原性。随访持续时间通过基于nhp pk的异速生长缩放的索托维单抗的预测的人t1/2告知。最终随访时段在协议中被指定。在第6周访视与最后一次随访之间，通过电话联系受试者进行不良事件监测。
[1363]
产品、剂量和施用模式
[1364]
索托维单抗是针对sars-cov-2刺突蛋白的经工程化的人igg单克隆抗体，其具有修饰以增加半衰期。索托维单抗是以单次剂量iv或im以低剂量或高剂量水平施用的。随机化至安慰剂的受试者通过im注射施用无菌、不含防腐剂的0.9％生理盐水溶液。
[1365]
统计方法
[1366]
并非所有暴露于sars-cov-2的个体都被感染或出现症状，并且早期估计在可能暴露后将家庭成员置于3％至15％的感染风险中。出于样本量计算的目的，使用所估计的10％攻击率。选择样本量以实现用于实验室确诊的有症状的covid-19的终点的80％能力和0.05双侧1型误差，10％的攻击率以及索托维单抗在减轻有症状的covid-19方面的50％功效。基于这些假设，每个治疗组纳入大约450名受试者(总共1350名)。
[1367]
针对本研究进行两项中期分析。第一中期分析是在已经纳入大约20％的受试者
(每组90名)后进行的，以评估每个剂量水平的索托维单抗的安全性和耐受性。剂量水平可能由于安全问题而中断。第二中期分析是在已经纳入大约50％的受试者(每组225名)后进行的，以评估安全性、无效性和功效。剂量水平可能由于安全问题或缺乏功效而中断。根据在中期分析中观察到的攻击率，可以调整样本量以增加达到总体预期病例数的可能性，从而达到主要终点。为了将总体1类误差率(
‘
α’)适当控制在0.05水平下，使用奥布莱恩-弗莱明方法(o
′
brien-fleming method)来在第二中期分析(0.0052)与最终分析(0.048)之间分配α。
[1368]
使用itt群体(所有随机化受试者)进行所有功效分析。还评估了在mitt群体(基线访视时sars-cov-2阴性的受试者)中有症状的和无症状的sars-cov-2感染的发生率。在接受任何量的研究药物的所有受试者中评估安全性。
[1369]
图4示出了本研究的进一步细节。
[1370]
实例44
[1371]
用于预防暴露于sars-cov-2的成人和青少年受试者的covid-19的索托维单抗的3期临床研究
[1372]
进行随机化、双盲、安慰剂对照的3期研究，以评估索托维单抗预防covid-19的安全性和功效。将大约3150名参与者按2:1比率随机化以分别接受索托维单抗或安慰剂，从而评估索托维单抗预防covid-19的安全性和功效。
[1373]
主要目标是评估相较于安慰剂，在预防covid-19方面的安全性和功效。主要终点是至第13周(3个月)协议定义的covid-19的发病率，如下定义：
[1374]
·
来自鼻咽拭子的阳性sars-cov-2逆转录酶聚合酶链式反应
[1375]
(rt-pcr)
[1376]
以及
[1377]
·
在至少24小时的时段后持续存在或再次发生的以下症状中的至少一种或多种症状的新发作(或恶化)：
[1378]
ο》38℃的发烧、发冷、咳嗽、咽喉痛、不适、头痛、肌痛、嗅觉或味觉发生变化、鼻塞/鼻液溢、呕吐、腹泻、劳力性呼吸短促
[1379]
对于临床医生和参与者两者而言，这是具有临床意义的终点，因为有症状的covid-19的预防可以使得这种疾病的发病率和死亡率降低，并且可能降低传播。另外，采用统计检验分级方法来控制总体i型误差，以确定索托维单抗在额外的时间点(直至第17周、第21周和第26周)预防协议定义的有症状的covid-19的功效。
[1380]
包括预防cdc定义的有症状的covid-19和预防无症状的sars-cov-2感染(如在第13周和第26周通过血清转化所评估的)的其它次要功效终点也是临床相关的。
[1381]
如果参与者至第26周完成了研究，则认为所述参与者已经完成研究。
[1382]
在给予知情同意时年龄为18岁或以上(除了韩国之外，其中参与者的年龄为19岁或以上)并且任何性别的参与者是合格的。女性参与者必须满足并同意遵守
[1383]
以下列出的避孕标准。女性使用的避孕措施应符合当地
[1384]
关于参与临床研究的那些人的避孕方法的法规。
[1385]
如果女性参与者未处于怀孕或哺乳期，且符合以下条件之一，方可参加：
[1386]
a.是无生育能力的妇女(woncbp)，或
[1387]
或
[1388]
b.是具有生育能力的妇女(wocbp)并且使用
[1389]
高效的避孕方法，在研究干预期期间和最后一剂研究干预后至多26周的失败率《1％。
[1390]
调查者应评估与第一剂研究干预相关的避孕方法失败的可能性(例如，不依从，最近开始)。
[1391]
wocbp必须在第一剂研究干预之前具有阴性高度敏感的妊娠试验(当地法规要求的尿液或血清)。
[1392]
a.如果不能证实尿检是阴性的(例如，不明确的结果)，则需要进行血清妊娠试验。在这种情况下，如果血清妊娠结果是阳性的，则参与者必须被排除在参与之外。
[1393]
b.研究干预期间和之后的妊娠试验的额外的要求可能已经就位。
[1394]
调查者审查医学病史、月经史和最近性活动，以降低纳入早期未检测到的怀孕的妇女的风险。
[1395]
参与者能够给出知情同意书。参与者同意研究程序，包括收集鼻咽拭子、自我收集的鼻中鼻甲拭子和静脉血，如活动时间表中指定的。参与者能够并愿意完成研究监测调查问卷和活动。
[1396]
在筛选纳入期间，参与者进行抗刺突sars-cov-2抗体测试。未纳入具有阳性抗刺突sars-cov-2抗体测试的参与者。参与者在给药前第1天进行鼻咽sars-cov-2rt-pcr和抗n sars-cov-2抗体测试。在第1天发现具有阳性sars-cov-2rt-pcr测试或阳性抗n sars-cov-2抗体测试的参与者被排除在主要分析(mitt)群体之外。
[1397]
排除标准
[1398]
如果以下任何标准适用，则参与者将被排除在研究之外：
[1399]
医疗病状
[1400]
1.先前阳性sars-cov-2rt-pcr或抗原测试的病史或阳性sars-cov-2血清学测试的病史，包括在筛选期间。
[1401]
2.在随机化前7天内具有或不具有呼吸道症状(例如，咳嗽、鼻塞)的发热性疾病
[1402]
3.身体状况不稳定，预计无法在研究参与期间存活，由调查者判断
[1403]
4.参与者患有在调查者看来会禁止接受肌内注射的任何病状，如凝血病症、出血素质或血小板减少症
[1404]
5.已知对调查产品6中存在的任何成分的超敏反应。先前对单克隆抗体的过敏反应或超敏反应
[1405]
7.在调查者判断中，至第26周将不太可能或无法遵守协议要求的参与者
[1406]
既往用药
[1407]
8.在纳入前的任何时间接受过covid-19疫苗，或计划在研究的前13周内接受covid-19疫苗
[1408]
9.纳入前48小时内接受任何疫苗。给药后2周将不允许接种疫苗
[1409]
10.接受来自covid-19存活者的任何sars-cov-2超免疫静脉内免疫球蛋白(hivig)
[1410]
11.在筛选和/或研究期间之前3个月或5个半衰期(以较长者为准)，接受来自恢复
的covid-19患者的康复者血浆或抗sars-cov-2mab
[1411]
既往/同期临床研究经验
[1412]
12.在第1天之前的90天内或在研究化合物的5个半衰期内(以较长者为准)参加针对sars-cov-2/covid-19的任何研究药物或装置研究。
[1413]
其它排除
[1414]
13.处于怀孕或哺乳期女性。
[1415]
(所有女性参与者，无论生育能力如何，都必须在筛选/给药前具有阴性妊娠试验)
[1416]
将索托维单抗调配在一次性小瓶(62.5mg/ml)的溶液中。单位剂量强度为500mg/小瓶(500mg/8ml)。通过肌内注射以单次剂量(500mg，一次)施用索托维单抗。安慰剂是局部来源的无菌0.9％(w/v)氯化钠溶液，通过肌内注射以单次剂量施用。
[1417]
简要概括：
[1418]
导入期
[1419]
研究的导入期旨在评估索托维单抗的安全性、耐受性和药代动力学(pk)，其中频繁评估注射位点反应(isr)和密集血液取样用于pk分析。将这些参与者与扩展期参与者合并用于功效评估。纳入大约21名参与者并按2:1随机化，以接受vir-7831(n＝14)或等体积生理盐水安慰剂(n＝7)。给药后监测参与者6小时，用于安全监测和局部注射位点耐受性评估。在6小时结束时，所述参与者出院。在纳入导入期时暂停随机化，直到联合安全性审查小组(jsrt)进行的第8天安全性评估建议继续进行。如果jsrt需要上报给idmc，则随机化暂停，等待idmc的建议。
[1420]
强化pk取样和免疫原性
[1421]
参加导入期的所有参与者都具有进行pk血液采样的额外的时间点。收集血清pk和抗药物抗体(ada)样品。
[1422]
方案2概括了研究的导入期，其中索托维单抗被鉴定为vir-7831。
[1423]
方案2：导入期
[1424][1425]
扩展期
[1426]
研究的扩展期被门控为安全的以进行来自jsrt的建议。具体地，在对局部注射位点耐受性评估数据(isr)和jsrt从导入期至随访第8天的其它安全性数据进行盲法评估后，开始随机化至扩展期。
[1427]
纳入大约3129名额外的参与者并且按2:1比率随机化，以分别通过im施用接受索
托维单抗或等体积生理盐水安慰剂。
[1428]
在从诊所/研究单位出院之前，在给药后1或2小时监测处于扩展期的参与者。监测的持续时间(1小时或2小时)基于来自导入期的isr的评估。关于监测持续时间的决定被作为jsrt建议的一部分传送给站点，并作为协议文件注释。
[1429]
在整个研究过程中，通过两种机制监测来自导入期和扩展期两者的参与者的covid-19：
[1430]
1.向参与者提供需要注意的covid-19体征和症状的印刷指南，以及研究中心电话号码，在经历这些症状中的任何症状的24小时内，或者如果所述参与者有任何其它理由怀疑他们可能感染sars-cov-2，可以拨打该电话号码。
[1431]
2.另外，所述网站从第1天至第13周(从第13周至第26周每两周一次)定期给参与者每周一次电话呼叫，以捕获不良事件(ae)、严重不良事件(sae)以及与参与者一起审查covid-19症状检查表。
[1432]
在研究开始时，所有参与者都配备有鼻(中鼻甲)拭子自检试剂盒和用于中央实验室测试的回邮信封。在26周的研究随访时段期间经历covid-19症状的任何参与者都被告知立即使用自检试剂盒，并遵循任何额外的当地指南来管理疑似covid-19。测试呈阳性的那些参与者完成每周自我报告的covid-19症状监测和每周工作效率和活动障碍(wpai)问卷调查，并且在症状发作后按照covid-19疾病监测时间表随访持续4周。如果参与者测试呈阴性并且仍正在经历症状，则将第二自收集试剂盒寄送给参与者以进行重复测试。
[1433]
所有参与者都具有定期的随访电话呼叫并且参加特定的随访，以评估功效、安全性和pk(稀疏)。
[1434]
参与者的数量：
[1435]
将大约3150名参与者按索托维单抗或安慰剂的2:1比率随机分配到研究干预中。接受研究干预的任何参与者都被认为是可评估的。
[1436]
研究筛选、随机化和持续时间
[1437]
筛选评估从第1天之前14天期间进行。在第1天用im剂量以盲法方式治疗符合条件的参与者，并且持续至研究结束(eos)-26周(6个月)。直至eos，参与者仍然不知情。对发展为covid-19(住院或未住院)的参与者进行随访，直至出现症状感染后4周或eos，以较早者为准。
[1438]
处于导入期和扩展期两者的参与者随机化基于以下进行分层：
[1439]
年龄层(年龄为《65岁，年龄为≥65岁)风险暴露增加组
[1440]
存在免疫功能受损病状
[1441]
区组随机化按国家进行。
[1442]
独立数据监测委员会
[1443]
非盲独立数据监测委员会(idmc)评估索托维单抗的总体安全性概况，包括在整个研究进行过程中评估随机化到索托维单抗的参与者与随机化到安慰剂的那些参与者相比的covid-19病例的发病率和严重程度。idmc章程中定义了idmc的角色和职责，包括成员资格、范围、会议频率和通信计划。如idmc章程所概括的，idmc会议在整个研究过程中定期举行。
[1444]
联合安全性审查小组
[1445]
联合安全性审查小组(jsrt)由来自临床研究、药物警戒的小组成员和来自研究赞助商的统计组成，确定在输入流盲法数据审查期间识别的安全性问题是否需要上报给idmc。jsrt负责如上所述的导入期的盲法安全性审查，如果需要则上报给idmc。idmc根据idmc章程中定义的流程执行。扩展期的启动视来自jsrt进行推荐的安全而定。jsrt的职责和评估频率可在相关安全性审查小组(srt)文件中获得。
[1446]
至第13周(3个月)协议定义的covid-19的发病率，并且使用泊松回归模型进行分析以估计相对风险。模型包括治疗组、年龄层、暴露风险组、免疫功能受损组和国家的术语。然而，对于没有事件的国家，国家可能陷入模型的区域中。给出了相对风险、95％置信区间和对应p值，用于比较索托维单抗与安慰剂。
[1447]
实例45
[1448]
用于轻度/中度covid-19的肌内索托维单抗
[1449]
进行3期随机化、多中心、开放标记研究，以评估肌内对静脉内给予索托维单抗在治疗高风险非住院患者的轻度/中度covid-19方面的功效、安全性和耐受性。组和干预如表15所示。
[1450]
表15：组和干预
[1451]
组所分配的干预有源比较器：iv 500mg索托维单抗通过静脉内输注给予索托维单抗iv 500mg索托维单抗实验：im 500mg索托维单抗通过肌内注射给予索托维单抗im 500mg索托维单抗实验：im 250mg索托维单抗通过肌内注射给予索托维单抗im 250mg索托维单抗
[1452]
结果量度
[1453]
主要结果量度：
[1454]
1.covid-19的进展
[1455]
[时间范围：直至第29天]
[1456]
次要结果量度:
[1457]
2.不良事件(ae)的发生率
[1458]
[时间范围：直至24周]
[1459]
3.严重不良事件(sae)的发生率
[1460]
[时间范围：直至24周]
[1461]
4.特别关注的不良事件(aesi)的发生率
[1462]
[时间范围：直至24周]
[1463]
5.血清抗药物抗体(ada)对索托维单抗的发生率和滴度(如果适用)
[1464]
[时间范围：直至24周]
[1465]
6.如通过qrt-pcr测量的鼻分泌物中sars-cov-2病毒载量的曲线下面积的平均值[时间范围：直至第8天]
[1466]
7.通过qrt-pcr的病毒载量相对于基线的变化
[1467]
[时间范围：直至第8天]
[1468]
8.通过qrt-pcr在第8天具有持续高sars-cov-2病毒载量的参与者的比例
[1469]
[时间范围：直至第8天]
[1470]
9.重度和/或危重呼吸道covid-19的发展
[1471]
[时间范围：直至第29天]
[1472]
10.血清中的iv和im索托维单抗药代动力学(pk)
[1473]
[时间范围：直至第24周]
[1474]
合格标准
[1475]
最小年龄：12岁
[1476]
最大年龄：
[1477]
性别：全部
[1478]
基于性别：否
[1479]
接受健康志愿者：否
[1480]
标准：纳入标准：
[1481]
·
参与者必须在同意时年龄为12岁或以上并且有covid-19进展的高风险或≥65岁
·
参与者必须具有阳性sars-cov-2测试结果并且在室内空气中的氧气饱和度≥94％并且具有covid-19症状且自症状发作以来有少于或等于7天
[1482]
排除标准：
[1483]
·
当前住院或调查者判断为可能需要在接下来24小时内住院
[1484]
·
与重度covid-19一致的症状
[1485]
·
在调查者判断中，可能在接下来7天内死亡的参与者
[1486]
·
已知对调查产品中存在的任何成分的超敏反应
[1487]
实例46
[1488]
第二代索托维单抗材料在患有轻度至中度冠状病毒病2019(covid-19)的非住院参与者中的ii期研究
[1489]
在实例39-40中描述的研究中使用的索托维单抗药物材料是使用稳定转染的非克隆细胞池生产的。其被称为“gen1”药物材料。“gen2”药物材料是使用衍生自转染子的原始池的克隆主细胞库制备的。进行多中心、随机化、双盲、平行组ii期研究，以评估gen2药物材料在患有轻度至中度covid-19的非住院参与者中的安全性、耐受性和药代动力学。
[1490]
主要目标是评估gen2和gen1索托维单抗药物材料的安全性和耐受性。终点是：至第29天发生不良事件(ae)；至第29天发生严重不良事件(sae)；至第29天发生特别关注的不良事件(aesi)；至第29天在12导联心电图(ecg)读数上发生临床上显著的异常；以及至第29天发生疾病进展事件(未分类为ae)。
[1491]
次要目标是：
[1492]
(1)评估索托维单抗gen2和gen1在血清中的药代动力学(pk)
[1493]
终点：c
max
、c
last
、t
max
、t
last
、auc
d0-28
、auc
inf
、auc
last
、％auc
exp
、t
1/2
、λz、vz、v
ss
、cl；
[1494]
(2)评估索托维单抗gen2和gen1的安全性和耐受性谱
[1495]
终点：至第24周发生sae；至第24周发生aesi；至第24周在12导联ecg读数上发生临床上显著的异常；至第24周发生疾病进展事件(未归类为ae)。
[1496]
探索性终点是：
[1497]
(1)评估索托维单抗gen2和gen1的潜在免疫原性
[1498]
终点：血清抗药物抗体(ada)对索托维单抗的发生率和滴度(如果适用)
[1499]
(2)表征索托维单抗gen2和gen1对上呼吸道样品中的病毒脱落谱的影响。
[1500]
终点：如通过来自唾液样品的定量逆转录酶聚合酶链式反应(qrt-pcr)测量的，至第29天，所有访视中病毒载量相对于基线的变化。
[1501]
本研究是用于预防非住院患者的轻度至中度covid-19的进展的针对sars-cov-2的单克隆抗体(mab)索托维单抗的随机化、双盲、多中心、平行组ii期试验。将患有早期轻度至中度covid-19的参与者按3:1随机化，以接受gen2或gen1研究材料的单次500mg静脉内输注。评估安全性、耐受性和pk。
[1502]
在输注开始前24小时内进行筛选评估。在第1天用单次iv剂量以盲法方式治疗符合条件的参与者，并且持续至多24周。在第1天重新监测参与者持续大约9小时，用于安全性评估和强化pk取样。
[1503]
研究包括患有轻度至中度sars-cov-2感染的非住院患者，如通过当地实验室测试和/或护理点测试确认的。研究单剂量水平的gen1或等体积的gen2材料，并且通过iv输注递送。参与者在诊所/研究单位接受输注，在诊所/研究单位，在输注后时段中密切监测所述参与者的不良事件。通过临床或家庭护理访视(除第16周之外)进行研究活动和临床监测的随后访视。双盲设计是用于随机化、对照研究以使偏差最小化的标准方法。纳入gen1研究组以在研究进行期间维持gen1对gen2索托维单抗研究材料接受的盲法。这种盲法对于最小化在研究评估期间(包括在ae和疾病相关安全性结果的评估期间)可能发生的偏差是至关重要的。
[1504]
jsrt至第24周定期审查盲法安全性数据。在本研究中不存在安慰剂，因为主要目的是评估gen2材料的安全性和耐受性。在本研究期间，所有参与者都接受covid-19疾病的标准护理，如果负责的调查者认为必要的话，包括入院。
[1505]
分析可比性研究支持gen2在临床研究中的使用。
[1506]
实例47
[1507]
s309抗体中和sars-cov2中和的ace2独立机制
[1508]
在以下实验中，将s309抗体(seq id no:105的vh，seq id no:168的vl)表达为具有m428l和n434s fc突变的重组igg1。研究了ace2过表达对s309抗体中和感染的影响。在存在s309(10μg/ml)的情况下，将vero e6或vero e6-tmprss2细胞用sars-cov-2(分离株usa-wa1/2020)在moi 0.01下感染。感染后24小时将细胞固定，将病毒核衣壳蛋白进行免疫染色和定量。在抗体处理的细胞中实际上不存在核衣壳染色。s309在vero e6细胞中的ic50(ng/ml)为65，并且在vero e6-tmprss2中的ic50为91(数据未示出)。
[1509]
在存在s309的情况下，一组7个细胞系(hela、293t(wt)、vero e6、huh7、293t ace2、mrc 5-ace2-tmprss2、a549-ace2-tmprss2克隆5、a549-ace2-tmprss2克隆10)被用sars-cov-2刺突蛋白假型化的sars-cov-2-nluc或vsv感染。感染后24小时对荧光素酶信号进行定量。s309最大中和值如表16所示。
[1510]
表16：s309的最大中和值
[1511][1512]
通过流式细胞术定量与这些细胞系结合的经纯化、荧光标记的sars-cov-2刺突蛋白的结合。hela和239t wt细胞具有最低的mfi，随后是huh7和veroe6细胞。293t ace2细胞(最高)、mrc 5-ace2-tmprss2(第三高)、a549-ace2-tmprss2克隆5(第四高)和a549-ace2-tmprss2克隆10(第二高)具有较高的mfi。确定了s309的刺突结合最大中和电位之间的相关性分析；两种病毒模型的s309斯皮尔曼相关值(spearman correlation value)为：r＝-0.94。p＝0.017。
[1513]
为了进一步表征sars-cov-2易感细胞系，将上文所述的七个细胞系与经纯化、荧光标记的sars-cov-2刺突蛋白或rbd蛋白一起温育，并且通过流式细胞术定量蛋白质结合。按mfi递减次序，细胞系为：a549-ace2-tmprss2克隆10；293t ace2；mrc 5-ace2-tmprss2；a549-ace2-tmprss2克隆5；vero e6；huh7；293t(wt)；以及hela。
[1514]
使用感染sars-cov-2vsv假病毒的hek293t细胞筛选所选择的凝集素和所公开的受体候选物。ace2、dc-sign、l-sign和siglec-1产生最高信号。ace2提供大约105个相对发光单位(rlu)的信号，并且dc-sign、siglec-1和l-sign具有大约104个rlu的信号。所测试的所有其它凝集素/候选物给出大约10
2-103个rlu的信号。
[1515]
将hek 293t、hela和mrc5细胞瞬时转导以过表达dc-sign、l-sign、siglec1或ace2，并用sars-cov-2vsv假病毒感染。包括未感染的细胞和未转导的细胞作为对照。在hek293t细胞中，ace2、dc-sign、siglec-1和l-sign全部提供感染的显著增加。在hela和mrc5细胞中，仅ace2增加感染。
[1516]
将过表达dc-sign、l-sign、siglec-1或ace2的稳定hek293t细胞系用真实sars-cov-2(moi 0.1)感染，固定并在24小时对sars-cov-2核蛋白进行免疫染色。野生型细胞(感染和未感染)用作对照。在过表达dc-sign、l-sign或siglec-1的细胞中观察到染色增加，并且在过表达ace2的细胞中染色显著增加。
[1517]
用sars-cov-2-nluc感染稳定细胞系并且在24小时对荧光素酶水平进行定量。按rlu递增次序：未感染(大约10
2-103个rlu)；亲本293t(大约104个rlu)；dc-sign(大约105个rlu)；l-sign(大约105个rlu)；siglec-1(大约10
5-106个rlu)；ace2(》107个rlu)。
[1518]
将稳定细胞系与不同浓度的抗siglec1 mab(克隆7-239)一起温育并且用sars-cov-2-nluc感染。在表达dc-sign、l-sign或ace2的293t细胞中，感染占未处理细胞的百分比仍接近或超过100％，但在表达siglec-1的293t细胞中，感染降到低于50％(0.2μg/ml抗siglec)至接近0(1μg/ml或5μg/ml抗siglec)。
[1519]
在衍生自人肺细胞图谱(human lung cell atlas；nature.com/articles/s41586-020-2922-4)的不同肺细胞类型中确定所选择的潜在sars-cov-2(共)受体候选物的单细胞表达水平。dc-sign、l-sign和siglec-1在肺中的多种细胞类型中表达，其表达水
平类似于或甚至高于ace2的表达水平。
[1520]
通过流式细胞术和免疫荧光分析来分析靶向dc/l-sign、dc-sign、siglec1或ace2的抗体在稳定过表达相应附着受体的hek293t细胞上的结合。过表达相应附着受体的hek 293t细胞感染了用sars-cov-2野生型刺突或携带b1.1.7谱系突变的刺突假型化的vsv。感染后一天分析发光。表达附着受体的细胞中感染增加。对于每个测试组，用任一刺突假型化的vsv引起的感染相似。表达ace2的细胞产生最高发光信号。
[1521]
用sars-cov-2以moi 0.01感染vero e6细胞、体外分化的modc或pbmc。感染后24小时，固定细胞，对病毒核衣壳蛋白进行免疫染色，并对受感染细胞进行定量。只有veroe6细胞示出了感染(大约7％的细胞)。在24、48和72小时取受感染细胞的上清液，并且通过ffu测定在vero e6细胞上定量感染性病毒滴度。
[1522]
评估重度covid-19患者的支气管肺泡灌洗液(balf)和痰液中具有可检测的sars-cov-2基因组的主要细胞类型。生成t-sne图，并确定每种sars-cov-2+细胞类型的计数(来自ren等人,《细胞(cell)》2021中的8名受试者的总n＝3,085个细胞)。细胞类型为t细胞、nk细胞、浆细胞、嗜中性粒细胞、巨噬细胞、纤毛细胞、鳞状细胞和分泌细胞。评估每种细胞类型的ace2、dc-sign、l-sign、siglec-1和这些的组合的表达。
[1523]
在巨噬细胞和分泌细胞中，ace2、dc-sign(cd209)、l-sign(clec4m)、siglec1转录物计数与sars-cov-2rna计数相关。相关性基于来自ren等人《细胞》2021的计数(对数转换前)。
[1524]
通过用编码转基因的慢病毒转导hek293t细胞来产生过表达dc-sign、l-sign或ace2的细胞系，并且进行免疫荧光测定以评估转基因表达。
[1525]
与wt hek293t细胞的感染相比，dc-sign或l-sign的表达使假病毒感染水平增加了10倍以上，并且与wt hek293t细胞的感染相比，ace2的表达使假病毒感染水平增加了100倍以上。
[1526]
在经工程化的hek293t细胞中评估了示例性mab s309针对vsv假病毒的中和活性。s309完全中和了通过dc-sign和l-sign引起的感染，并且在较小程度上中和了ace2引起的感染。
[1527]
使用发光测定检查具有荧光素酶报告基因的活sars-cov-2感染hek293t细胞的能力。与wt hek293t细胞的感染相比，dc-sign或l-sign的表达使活病毒感染水平增加了3倍以上，并且与wt hek293t细胞的感染相比，ace2的表达使活病毒感染水平增加了100倍以上。
[1528]
在经工程化的hek293t细胞中评估了mab s309针对vsv假病毒的中和活性。s309完全中和了通过dc-sign和l-sign引起的感染并且在较小程度上中和了通过ace2引起的感染。
[1529]
进行实验以研究s309抗体是否能中和sars-cov-2通过siglec-1的进入。简而言之，如上文所描述的产生稳定的细胞hek293t系，以过表达dc-sign/l-sign、dc-sign、siglec-1或ace2。与wt hek293t细胞的感染相比，dc-sign、l-sign或siglec的表达使活病毒感染水平增加了10倍以上，并且与wt hek293t细胞的感染相比，ace2的表达使假病毒感染水平增加了100倍以上。s309完全中和了通过dc-sign、l-sign和siglec-1引起的感染。
[1530]
在多种细胞类型上确定dc-sign(cd209)和其它细胞表面受体蛋白(包括siglec-1
和其它siglec)的表达。
[1531]
进行另外的实验以研究dc-sign、l-sign和siglec-1在sars-cov-2感染中的功能。在一组实验中，用活sars-cov-2nluc以三种不同的感染复数(moi)：0.01、0.1和1感染稳定表达dc-sign、l-sign、siglec-1或ace2的hek293t细胞。感染使用相对发光单位确定并且与hek293t细胞(亲本)中的感染进行比较。在被测的最低moi时，观察到表达dc-sign、l-sign或siglec的细胞中的感染增加。在被测的最高moi下，与亲本相比，感染未通过dc-sign、l-sign或siglec的表达进一步增加。这些数据表明，亲本293t细胞易受sars-cov-2感染，并且l-sign、dc-sign和siglec-1增强感染水平但不作为感染的主要受体。
[1532]
在另一组实验中，用编码dc-sign、l-sign、siglec-1或ace2的慢病毒瞬时转导293t细胞、hela细胞和mrc5细胞，并在转导后三天用vsv假病毒感染。虽然293t细胞示出低水平的易感性(将未感染的与未转导的进行比较)，但hela和mrc5细胞对所述病毒完全不应。l-sign、dc-sign或siglec-1的表达可以增加293t细胞中的低水平感染，这与这些蛋白质作为附着因子的作用一致。hela和mrc5细胞即使在表达l-sign、dc-sign或siglec-1后仍对感染保持不应，并且仅在表达ace2后才变得易感。这些数据指示，l-sign、dc-sign和siglec-1不是sars-cov-2的主要受体。
[1533]
实例48
[1534]
s309抗体在感染的动物模型中的体内功效
[1535]
研究s309在叙利亚仓鼠中的功效。此动物模型代表迄今为止不需要体内过表达ace2以支持生产性感染和疾病的最相关的sars-cov-2感染模型。s309的预防性施用在仓鼠中诱导了针对sars-cov-2感染和组织损伤的剂量依赖性保护，如通过病毒rna水平、病毒载量以及肺中的组织病理学评分所证明的。这些数据表明，当使用过表达ace2的细胞时，s309在体外对进入的不良和不完全中和不危害非rbm mab的体内功效。
[1536]
由于与fcγ受体的结合减少，携带n297a突变的s309触发效应子功能的能力降低。这进一步由s309-n297a变体与脾脏中的仓鼠单核细胞的减少的结合证实。用n297amab测量的体内功效与wt s309的体内功效相似或仅略差，表明在这些条件下，mab的中和能力优于其效应子功能能力。将肺中的病毒rna减少90％所需的s309的血清浓度为9μg/ml。
[1537]
实例49
[1538]
针对sars-cov-2变体的抗体活性
[1539]
已经出现许多sars-cov-2变体，在2020年年底报道的变体的感染数量增加。受体结合基序(rbm)似乎特别易受突变影响。在苏格兰、英国、南非、加利福尼亚、哥伦布和丹麦的明克斯中已经观察到显著出现的变体，并且已经报道一些突变会导致抗体中逃逸或血清中和。进行实验以评估s309抗体中和变体的能力。s309 n55q mlns(vh：seq id no:113；vl：seq id no:168；具有m428l和n434s fc突变)针对带有一组20种最常见的sars-cov-2 rbd变体突变的sars-cov-2进行测试，如通过序列读段所确定的。包括了抗体regn10933和regn10987(hansen等人,《科学》369(6506):1010-1014；eabd0827-0810(2020)和pdb 6xdg(rcsb.org/structure/6xdg))用于比较。表17中概括了结果。
[1540]
表17：抗体针对sars cov-2变体的中和的概述
[1541][1542][1543]
y＝活病毒或假病毒中和减少小于三倍
[1544]
n＝活病毒或假病毒中和减少大于三倍
[1545]
p＝由于变体氨基酸位于表位之外，预测抗体的中和
[1546]
？＝未知
[1547]
已知逃逸抗体的sars-cov-2测序的突变体(截至2021年1月29日)的总计数是：s309 n55q mlns＝29；regn10987＝10,425；regn10933＝3,621。
[1548]
通过bli评估s309抗体与sars-cov-2变体rbd的结合。评估具有野生型fc的s309(vh：seq id no:105；vl：seq id no:168)和带有mlns或mlns+gaalie fc突变的s309 n55q(vh：seq id no:113；vl：seq id no:168)。regn10987和regn10933被包括作为比较对象。简而言之，将抗体在动力学缓冲液中以3ug/ml稀释并加载到蛋白a传感器上持续75秒。在动力学缓冲液中的短暂的平衡步骤之后，将加载的传感器在动力学缓冲液中以5ug/ml在含有rbd变体的孔中移动，并且在3分钟期间记录缔合。在动力学缓冲液中进行复合物的解离，持续3分钟。数据示于图71a-71b中；“wt”＝具有d614g的wuhan-hu-1；下一行中的“三突变体”＝具有d614g并且添加南非变体b.1.351 rbd突变k417n、e484k和n501y的wuhan-hu-1。在所测试的“sa”rbd中不存在南非变体b.1.351中存在的其它突变。
[1549]
使用mlv假病毒和表达tmprss2的vero-e6靶细胞评估针对sars-cov-2变体的s309抗体的中和。评估具有野生型fc的s309(vh：seq id no:105；vl：seq id no:168)和带有mlns或mlns+gaalie fc突变的s309 n55q(vh：seq id no:113；vl：seq id no:168)。还评估了regn10987、regn10933以及regn10987+regn10933的组合。s309抗体中和sars-cov-2变体。
[1550]
可以将上述各个实施例进行组合以提供进一步的实施例。本说明书中提及和/或在申请数据表中列出的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国
专利申请和非专利出版物，包括于2020年6月12日提交的美国专利申请第63/038,738号、于2020年8月18日提交的美国专利申请第63/066,966号、于2021年1月25日提交的美国专利申请第63/141,430号、于2021年3月10日提交的美国专利申请第63/159,404号、于2021年5月7日提交的美国专利申请第63/186,055号和于2021年6月2日提交的美国专利申请第63/196,089号的全部内容通过引用并入本文。如果需要可以修改实施例的各方面，以采用各种专利、申请和出版物的概念来提供又进一步的实施例。
[1551]
鉴于以上详细描述，可以对实施例做出这些和其它改变。通常，在以下权利要求中，所用术语不应被解释为将权利要求限于本说明书和权利要求中所公开的特定实施例，而应被解释为包括所有可能的实施例以及这些权利要求所有权获得的等效物的全部范围。因此，权利要求不受本公开限制。