含有三唑衍生物作为活性成分的用于预防或治疗肝纤维化的组合物

本发明涉及一种使用三唑衍生化合物抑制肝组织炎症、纤维化以及由此引起的肝组织硬化的方法。

背景技术：

1、慢性肝病是导致韩国主要死亡原因的一种成人疾病，这是一种严重的疾病，其在症状持续存在并发展为肝硬化后，由决定肝病预后的各种并发症导致肝癌。阻止慢性肝炎向肝硬化的进展是治疗血脂异常、乙型和丙型肝炎病毒感染等多种因素引起的肝病的最终目标之一。此外，由于肝硬化是在肝纤维化的过程中发生的，而肝纤维化是由多种原因引起的，因此有效阻断和抑制肝纤维化的进展是预防肝癌等严重肝病最基本、最重要的一步。

2、肝纤维化是由慢性肝内炎症引起的细胞外基质(ecm)在肝组织中过度沉积引起的，如果这种ecm过度沉积持续存在，最终会发展为肝硬化，并伴有肝脏结构变形和肝细胞数量减少。虽然有效阻断从脂肪性肝炎到肝纤维化再到肝硬化这一过程的治疗药物的研究一直在积极进行，但尚未开发出有效缓解纤维化并具有适合长期给药安全性的治疗候选物质。

3、例如，噻唑烷二酮(tzd)是一种ppar-γ激动剂，作为一种通过促进脂联素分泌和改善脂肪、肌肉和肝组织中的胰岛素抵抗来治疗脂肪性肝炎的药物，已得到最广泛的研究。然而，当给予噻唑烷二酮(tzd)时，未观察到纤维化的显著改善，并且在停止给药后，大多数病例恢复到治疗前状态。此外，据报道噻唑烷二酮(tzd)具有诸如体重增加、骨质流失和膀胱癌发病率增加等副作用，因此目前已停止将其作为治疗剂的开发。二甲双胍是作为一种基于双胍类的口服抗糖尿病药物开发的，是一种ampk激活剂，有望对脂肪性肝炎和肝纤维化产生影响，但在成人和儿童患者的临床研究中，未观察到二甲双胍对脂肪性肝炎的组织学改善作用。此外，他汀类药物作为高脂血症的治疗药物，对非酒精性脂肪肝没有明显作用，一些研究表明，他汀类药物可降低alt水平，他汀类药物与维生素c和e的联合给药在影像学上可减少脂肪变性。然而，他汀类药物不能有效改善脂肪性肝炎患者的脂肪肝、炎症活性和纤维化。

4、因此，越来越需要开发一种安全性高的治疗剂，该治疗剂适合于长期给药以治疗慢性疾病，同时有效地阻断肝组织中的炎症和纤维化。

5、在说明书中，参考并引用了许多出版物和专利文件。所引用的出版物和专利文件的公开内容通过引用整体并入本文以更清楚地描述相关技术的状态和本公开内容。

技术实现思路

1、技术问题

2、本发明人进行了广泛的研究努力以开发出一种药物组合物，该药物组合物能够有效地阻断导致肝组织中炎症、纤维化和组织硬化的一系列病理阶段的进展。结果，本发明人发现，当将式i的化合物施用于受试者时，纤维化的进展被显著抑制，同时肝组织中炎症因子和胶原蛋白的表达显著降低，从而完成了本发明.

3、因此，本发明的目的是提供用于预防或治疗选自下组的肝脏疾病的组合物或功能性食品组合物：脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化。

4、本发明的另一目的在于提供一种抑制肝纤维化组合物的筛选方法。

5、本发明的其他目的和优点将从以下对本发明的详细描述、所附权利要求和附图中变得更加清楚。

6、技术方案

7、在本发明的一个方面，本发明提供了一种用于预防或治疗选自下组的肝病的组合物：脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化，其包含下式i表示的化合物或其药学上可接受的盐作为活性成分：

8、

9、其中，r1和r2各自独立地为氢或c1-c3烷基，r1和r2不同时为氢，并且r3为c2-c4烷基。

10、本发明人进行了广泛的研究努力以开发出一种药物组合物，该药物组合物能够有效地阻断导致肝组织中炎症、纤维化和组织硬化的一系列病理阶段的进展。结果，本发明人已经发现，当将式i的化合物给予受试者时，纤维化的进展被显著抑制，同时肝组织中炎症因子和胶原蛋白的表达显著降低。

11、如本文所用，术语“烷基”指直链或支链饱和烃基，术语“c1-c3烷基”指具有1-3个碳原子的烷基单元的烷基，并且当c1-c3烷基被取代时，不包括取代基的碳原子。

12、在本发明一个特定的实施方式中，r1为c1烷基，r2为氢，并且r3为c3烷基。更具体地，r3为异丙基。

13、式i化合物(其中r1为c1烷基(甲基)，r2为氢，并且r3为异丙基)的iupac名称为“n-(4-(1h-1,2,3-三唑-1-基)苄基)-2-(2-异丙基苯基)-5-甲基嘧啶-4-胺”(cas号：1572414-83-5)。已知该化合物具有泛素特异性蛋白酶1(usp1)抑制剂活性，因此被认为对usp1介导的疾病(如乳腺癌和卵巢癌)具有治疗作用，但其与肝纤维化的关系尚不清楚。

14、如本文所用，术语“药学上可接受的盐”是指衍生自药学上可接受的无机酸、有机酸或碱的盐。合适的酸的实例包括盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯-对-磺酸、酒石酸、乙酸、三氟乙酸、柠檬酸、甲磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸等。衍生自合适的碱的盐包括碱金属如钠、碱土金属如镁、铵等的盐。具体地，本发明所用的药学上可接受的盐是钠盐。

15、如本文所用，术语“脂肪性肝炎”是指由肝内脂肪堆积引起的肝组织慢性炎症。脂肪性肝炎是一种不同于肝脂肪变性的病理学病症，在肝脂肪变性中，异常水平的脂肪只是长时间存在于肝组织或肝细胞中。脂肪性肝炎的症状不能通过简单的降低血脂来缓解或消除，只有通过控制激活的炎症细胞因子和活性氧才能从根本上治疗脂肪性肝炎。

16、如本文所用，术语“肝纤维化”是指由于肝脏慢性炎症导致细胞外基质过度沉积，在肝组织中形成过多的纤维结缔组织，导致肝脏正常结构和功能受损的疾病。

17、如本文所用，术语“肝硬化”是指由于肝组织中持续长时间的炎症和细胞外基质沉积而导致正常肝组织丢失，并且由于瘢痕组织替代丢失的肝组织而使肝组织不能正常发挥作用的一种病理状态。

18、肝纤维化和肝硬化不是具有不同病因的独立疾病，而是从慢性肝炎经纤维化到肝硬化的连续性疾病。迄今为止，市售的各种代谢性疾病治疗药物均因具有降脂作用而未能有效缓解肝纤维化和肝组织硬化。

19、如本文所用，术语“预防”是指在从未被诊断为患有病症或疾病但可能患有此类病症或疾病的受试者中抑制病症或疾病的发生。

20、如本文所用，术语“治疗”是指(a)抑制病症、疾病或症状的发展；(b)减轻病症、疾病或症状；(c)消除病症、疾病或症状。当将本发明的组合物施用于受试者时，它起到抑制症状进展的作用，或通过抑制皮肤成纤维细胞的增殖和纤维化因子的表达，减少皮肤中过多纤维组织的产生，从而消除或减轻症状。因此，本发明的组合物可以单独用作疾病的治疗组合物，或者可以与其他药理成分组合施用并用作疾病的治疗辅助剂。因此，如本文所用，术语“治疗”或“治疗剂”涵盖“治疗辅助”或“治疗助剂”。

21、如本文所用，术语“施用”或“给药”是指将治疗有效量的本发明的组合物直接施用至受试者，使得在受试者体内形成相同量的组合物。

22、如本文所用，术语“治疗有效量”是指含有药理学成分(例如，丙酮酸乙酯)的组合物的量足以对将施用本发明的药物组合物的受试者提供治疗或预防效果。因此，术语“治疗有效量”涵盖“预防有效量”。

23、如本文所用，术语“施用”或“给药”是指将有效量的本发明的组合物直接施用至受试者，使得在受试者体内形成相同量的组合物。

24、如本文所用，术语“受试者”包括但不限于人、小鼠、大鼠、豚鼠、狗、猫、马、牛、猪、猴子、黑猩猩、狒狒或恒河猴。具体而言，本发明的受试者是人。

25、在本发明的一个特定实施方式中，本发明的组合物所要预防或治疗的脂肪性肝炎为非酒精性脂肪性肝炎。

26、在本发明的一个特定实施方式中，本发明的组合物降低血液中alt(丙氨酸氨基转移酶)或ast(天冬氨酸氨基转移酶)的水平。alt和ast是存在于肝细胞中的氨基转移酶，当肝细胞被破坏时，alt和ast被释放到血液中并且其在血液中的水平增加。因此，alt和ast被用作肝功能指标。根据本发明，与对照组相比，本发明的组合物显著降低血液中ast和alt的水平分别为55％和30％，从而显著恢复因脂肪性肝炎和肝纤维化而降低的肝功能。

27、在本发明的一个特定实施方式中，本发明的组合物降低肝组织中c-c基序趋化因子配体2(ccl2)、转化生长因子-β(tgf-β)和f4/80的表达。

28、如下实施例所示，证实本发明的组合物显著抑制作为主要炎症因子的ccl2、tgf-β和f4/80的表达，表明该组合物不仅表现出简单和定量的减少累积脂质的作用，而且有效地阻断炎症的进展和由此产生的组织损伤。

29、如本文所用，术语“表达降低”是指作为炎症指标或原因的蛋白质或基因的表达水平降低到肝组织中的病理性炎症和纤维化停止、减轻或改善的程度，或者其风险降低。具体地，它可以表示与对照组相比表达水平降低至少20％、更具体地至少30％、更具体地至少40％的状态。

30、当本发明的组合物制备成药物组合物时，本发明的药物组合物含有药学上可接受的载体。

31、包含在本发明的药物组合物中的药学上可接受的载体的实例包括但不限于制剂中常用的乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、海藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁、矿物油等。除了上述成分以外，本发明的药物组合物还可以含有润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂、防腐剂等。合适的药学上可接受的载体和试剂在雷明顿药物科学(remington's pharmaceutical sciences)(第19版，1995)中有详细描述。

32、本发明的药物组合物可以口服或肠胃外给药。具体而言，可以肠胃外给药。更具体地，可以皮下或透皮给药。

33、本发明的药物组合物的合适剂量可根据各种因素如配制方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病理状况、饮食、给药时间、给药途径、排泄速率和反应敏感性而变化。本发明的药物组合物的优选剂量范围为成人0.001至100mg/kg。

34、本发明的药物组合物可以根据本领域技术人员可以容易地执行的方法，通过与药学上可接受的载体和/或赋形剂配制而制备成单位剂型或制备成包含在多剂量容器中。在此，药物组合物的剂型可以是药物组合物在油或水性介质中的溶液、混悬液、糖浆或乳剂，或者是含有该药物组合物的提取物、散剂、颗粒剂、片剂或胶囊剂，还可以含有分散剂或稳定剂。

35、在本发明的另一方面，提供了一种用于改善选自下组的肝病的功能性食品组合物：脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化，其包含下式i表示的化合物或其食品上可接受的盐作为活性成分：

36、

37、其中，r1和r2各自独立地为氢或c1-c3烷基，r1和r2不同时为氢，并且r3为c2-c4烷基。

38、由于在本发明中使用的式i化合物和使用该化合物改善的肝脏疾病已经在上文中进行了描述，因此将省略其描述以避免过多的重复。

39、如本文所用，术语“食品可接受的盐”是指在由通过静电引力结合在一起的阳离子和阴离子组成的盐中，可用于食品组合物的形式的盐，其具体实例包括上述“药学上可接受的盐”的实例。

40、当本发明的组合物制备成食品组合物时，它不仅可以包含本发明的化合物作为活性成分，还可以包含通常在食品制备中添加的碳水化合物、调味料和调味剂。碳水化合物的实例包括但不限于单糖如葡萄糖和果糖，二糖如麦芽糖和蔗糖，多糖如糊精和环糊精，以及糖醇如木糖醇、山梨糖醇和赤藓糖醇。调味剂的实例包括天然调味剂[奇异果甜蛋白、甜叶菊提取物(例如，莱鲍迪甙a、甘草甜素等)]和合成调味剂(糖精、阿斯巴甜等)。例如，当将本发明的食品组合物制成饮料时，除了作为本发明的有效成分的松树皮提取物之外，还可以含有柠檬酸、液体果糖、砂糖、葡萄糖、醋酸、苹果酸、果汁、杜仲提取物、大枣提取物、甘草提取物等。

41、在本发明的又一方面，本发明提供了一种抑制肝纤维化组合物的筛选方法，该方法包括以下步骤：

42、(1)将受试物质与含有表达泛素特异性蛋白酶1(usp1)的细胞的生物样品接触；和

43、(2)测量样品中usp1的活性或表达水平，

44、其中，当usp1的活性或表达水平降低时，则确定受试物质为抑制肝纤维化的组合物。

45、由炎症引发的纤维化疾病(如肝纤维化)与usp1酶之间的相关性尚不清楚。在本发明中，本发明人通过观察报道具有usp1抑制活性的本发明化合物抑制肝纤维化，首次证明了usp1酶可以作为肝纤维化的治疗靶点。

46、根据本发明的筛选方法，首先使测试物质与包含表达usp1的细胞的生物样品接触。如本文所用，术语“生物样品”是包含获自哺乳动物(包括人)的usp1表达细胞的任何样品，并且包括但不限于组织、器官、细胞或细胞培养物。具体地，生物样品包括肝细胞或其培养物。

47、在涉及本发明的筛选方法时使用的术语“测试物质”是指用于筛选以检查其是否在基因或蛋白质水平上影响usp1的活性或表达水平的未知物质。测试物质的实例包括但不限于化合物、核苷酸、抗体、反义rna、小干扰rna(sirna)和天然产物提取物。随后，测量用测试物质处理的生物样品中usp1的表达水平或活性。表达水平的测量可以通过本领域已知的各种免疫测定方法进行，或通过使用专门设计的引物或靶向序列已知的基因的探针的各种基因检测方法进行。作为测量的结果，当usp1的表达水平或活性降低时，测试物质可被确定为用于抑制肝纤维化的组合物。

48、如本文所用，术语“表达水平或活性降低”是指usp1的表达水平或独特的体内功能降低到肝功能通过显著抑制由usp1诱导的组织纤维化而改善至可测量水平的程度。活性的降低不仅包括简单的功能降低，还包括由于稳定性降低而导致的最终活性降低。具体地，术语“表达水平或活性降低”可以指其中活性或表达水平与对照组相比降低至少20％、更具体至少40％、甚至更具体至少60％的状态。

49、根据本发明的另一方面，本发明提供了一种预防、治疗或改善选自下组的肝病：脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化的方法，该方法包括以下步骤：向受试者施用包含由下式i表示的化合物或其食品可接受的盐作为活性成分的组合物。

50、

51、由于在本发明中使用的式i化合物和使用该化合物改善的肝脏疾病已经在上文中进行了描述，因此将省略其描述以避免过多的重复。

52、有益效果

53、本发明的特征和优点概括如下:

54、(a)本发明提供用于预防或治疗选自下组的肝脏疾病的药物组合物或功能性食品组合物：脂肪性肝炎、肝纤维化和肝硬化。

55、(b)本发明发现的三唑衍生化合物可减少肝组织中胶原蛋白的积累，并显著抑制炎症因子的表达。因此，所述的三唑衍生化合物有效地阻止了一系列严重肝病的进展，从肝组织过度纤维化到组织硬化(肝硬化)到肝细胞数量减少和肝功能衰竭，而不像传统药物只有单纯的降脂作用。因此，该三唑衍生化合物可用作对肝纤维化和肝硬化从根本上进行治疗的组合物。

56、<110>    延世大学校产学协力团

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