多组分壳聚糖缀合物的抗菌表面的制作方法

多组分壳聚糖缀合物的抗菌表面
1.交叉引用
2.本技术要求2021年7月20日提交的美国临时专利申请63/223,969和2020年7月21日提交的美国临时专利申请63/054,719的权益；为了所有目的，其中的每一个都通过引用并入本文。
3.领域
4.本发明涉及方法和组合物，用于在多部分壳聚糖缀合物中应用多巴胺、聚多巴胺和/或其衍生物以及将其用作表面修饰的附着基序。
5.背景
6.表面的细菌污染在医学和非医学领域都是一个持续存在的问题。带有定植细菌的表面会导致疾病甚至死亡。已经开发了各种表面处理组合物和工艺来改善此类表面的抗菌性能。先前已经开发了使用各种化学技术对表面进行修饰，例如使用有机硫醇-金属、烯二醇-氧化物、硅烷-氧化物、膦酸和衍生物等。表面修饰通常包括包含通过连接基团锚定到修饰表面的活性端基。活性端基为修饰表面提供所需的功能。
7.聚多巴胺是最通用和广泛使用的表面功能化基序之一。受到海洋双壳类动物，特别是贻贝及其与多种表面结合能力的研究的启发，早期研究人员注意到邻苯二酚(3,4-二羟基苯)以3,4-二羟基-l-苯丙氨酸的形式占优势(dopa)以及贻贝粘附蛋白中以赖氨酸和组氨酸形式存在的伯胺和仲胺。早期的邻苯二酚/胺系统用于制作仿生粘附系统，包括dopa-lys聚氨基酸和与多胺(如壳聚糖)相连的邻苯二酚。
8.壳聚糖是甲壳素部分或完全脱乙酰化得到的天然多糖。正如dutta等人(甲壳素和壳聚糖：化学、性质和应用，j.sci.ind.res.,63卷.20-31页(2004))所描述的，甲壳素是仅次于纤维素的天然含量最高的多糖。它以葡糖胺和n-酰化葡糖胺单体的混合聚合物形式存在，其特征在于c-2胺的脱乙酰度。按照惯例，壳聚糖被定义为具有》50％的脱乙酰度。脱乙酰度(dda)以及链长和分子量是壳聚糖化学和物理行为的关键决定因素。壳聚糖的氨基葡萄糖单体单元具有以下结构，其中n是存在于寡聚物或聚合物中的单体单元数：
[0009][0010]
每个单体单元都有三个易于进行化学修饰的位点——c-2伯胺、c-3仲-oh和c-6伯-oh。这些位点使得壳聚糖易于修饰和定制用于生物医学应用。此外，壳聚糖具有生物相容性、可生物降解性，其降解产物不会引起炎症反应。
[0011]
壳聚糖在医学领域具有广泛的应用，例如作为药物输送载体、组织工程、抗血栓剂、骨再生和抗菌材料。此外，壳聚糖已用于化妆品、废水处理以及用作饲料和食品添加剂。壳聚糖的其他应用描述于例如vunain等人。壳聚糖在生物医学应用中的基础知识(基于壳
聚糖的生物材料：第1卷：基础知识，jennings,j.a.，bumgardner,j.d.编辑，3-30页，(2017)。
[0012]
抗菌壳聚糖在本领域中是众所周知的并且最近已有综述(freitas等人，关于季铵盐壳聚糖衍生物的特性、合成和应用的当前知识概述，polymers，第12卷(12)，2878页(2020))。尽管未修饰的壳聚糖的抗菌性较弱，但季铵基团的应用增强了壳聚糖的抗菌效力及其水溶性。壳聚糖不溶于中性至碱性水性条件。
[0013]
最常见的季铵化涉及n,n,n-三甲基壳聚糖，随后是n-[(2-羟基-3-三甲基铵)丙基]壳聚糖，通常称为htcc。插入膦(phosphonium)和吡啶鎓(pyridinium)盐也越来越普遍。
[0014]
除了增强的溶解性和抗菌效力外，通过在聚合物或寡聚物链上设置永久性阳离子位点，粘膜粘附性和渗透性也得到显著改善。
[0015]
本技术的一个创造性方面是构建包含季铵化壳聚糖聚合物或寡聚物的组合物，其通过连接多巴胺或类似物进一步修饰以形成三部分缀合物。
[0016]
第二个创造性方面是通过与金属、它们的合金、氧化物或纳米颗粒形式的连接/反应来进一步修饰这些缀合物，以及实现所述连接的方法。
[0017]
目前用于多巴胺沉积的方法通常需要在碱性条件下长时间浸泡在水性缓冲液中。本技术的示例性实施方式涉及包含双缀合的壳聚糖聚合物或寡聚物的组合物，其中缀合物是季铵、膦或吡啶鎓化合物，它们连接到壳聚糖分子的至少一些可用反应位点(-nh2、-oh)，然后将多巴胺或其类似物连接到壳聚糖分子的至少一些剩余可用位点。
[0018]
本技术的另一个示例性实施方式涉及通过这些双重修饰的壳聚糖通过它们的邻苯二酚(或类似物)侧基连接到表面而获得的组合物。这些表面可能包括金属、它们的合金、氧化物或纳米颗粒、陶瓷、类金属、聚合物等。
[0019]
概述
[0020]
申请人开发了在碱性或中性条件下，在水性或有机介质中快速有效的阳极沉积方法，以及将具有侧链邻苯二酚(pendant catechol)、修饰邻苯二酚和类似物(包括多巴胺)的壳聚糖缀合物连接到金属和金属氧化物表面。
[0021]
阳极沉积在多巴胺(dp)/表面界面提供了严苛的氧化环境，类似于添加化学氧化剂用于加速多巴胺连接和聚合。这种方法与在dp/表面界面使用较低的电压并在氧化和还原条件之间循环的其他电沉积技术形成对比。
[0022]
此外，壳聚糖缀合物通过加热结合到金属和/或金属氧化物表面，无论是常规地在烘箱中应用还是通过微波辐射或通过诱导。
[0023]
光接枝也被用于通过其悬垂邻苯二酚或类似基团结合季铵化的双重修饰壳聚糖缀合物。
[0024]
在本说明书中，如果引用或讨论了文件、行为或知识项，则该引用或讨论并不承认该文件、行为、知识项或其任何组合在优先权日时是公开可用的、为公众所知的、属于公知常识的一部分，或以其他方式构成适用法律规定下的现有技术；或已知与解决本说明书所涉及的任何问题的尝试有关。
[0025]
虽然已经讨论了常规技术的某些方面以促进本发明的公开，但是本技术的发明人决不放弃这些技术方面，并且预期要求保护的发明可以包含或包括本文所讨论的一个或多个常规技术方面。
[0026]
已知的表面功能化方法无一包括通过多巴胺或多巴胺衍生物接头将本说明书的壳聚糖和/或修饰壳聚糖结合到金属表面以使它们具有杀菌作用的过程。在医疗器械领域，洗脱系统具有潜在的全身效应，并可能产生细菌生物体的耐药性，而结合的抗菌表面不会有这些缺点。对于非医疗表面，结合表面处理可能会持续更长时间，并且与常用的清洗相比具有更长的功效窗口。本技术描述了独特的组合物和快速方便的方法，用于创建基于天然产品的抗菌表面，该表面很可能具有生物相容性。此外，本文描述的用于修饰聚多巴胺聚合物的方法不需要使用特定的多巴胺衍生物或特定的预合成化合物以及不同阶段的实施。
[0027]
此类修饰表面可用于各种应用，包括但不限于医疗设备。
[0028]
本技术的创造性方面旨在解决与将多巴胺、聚多巴胺和相关化合物连接到金属表面的常规方法相关的缺点。本技术还涉及包括修饰表面的新型涂层和新型设备。
[0029]
一个示例性实施方式是通过将邻苯二酚或其衍生物连接到金属表面来制备修饰金属表面的方法，该方法包括：制备邻苯二酚或其衍生物在缓冲液(包括但不限于，磷酸盐缓冲液)中的水性溶液；将金属工件的至少一部分浸入邻苯二酚或其衍生物的水性溶液中；施加电压或紫外线(uv)辐射一段时间以获得功能化金属工件；和将季铵化壳聚糖化学连接到功能化金属工件上。
[0030]
另一个示例性实施方式是通过连接含有邻苯二酚或其衍生物的季铵化壳聚糖双缀合物来制备修饰的金属表面的方法，该方法包括：制备壳聚糖或其衍生物在缓冲液(包括但不限于，磷酸盐缓冲液)中的水性溶液；将金属工件的至少一部分浸入壳聚糖或其衍生物的水性溶液中；施加电压或紫外线辐射一段时间获得功能化金属工件；向金属工件提供化学连接的修饰壳聚糖。
[0031]
在制备具有连接到金属表面的邻苯二酚或其衍生物的修饰金属表面的另一个实施方式中，该方法包括：在碱存在下制备邻苯二酚或其衍生物在非水性质子溶剂中的溶液；将金属工件的至少一部分浸入邻苯二酚或其衍生物的溶液中；施加电压或紫外线辐射一段时间；以获得功能化金属工件；将修饰壳聚糖化学连接到功能化金属工件上。
[0032]
在制备具有连接到金属表面的壳聚糖或其衍生物的修饰金属表面的另一个示例性实施方式中，该方法包括：在碱存在下制备双缀合壳聚糖或其衍生物在非水性质子溶剂中的溶液；将金属工件的至少一部分浸入壳聚糖或其衍生物的溶液中；施加电压或紫外线辐射一段时间以获得功能化金属工件，该金属工件具有化学连接的修饰壳聚糖。
[0033]
在另一个示例性实施方式中，非水性质子溶剂包括任何有机溶剂，包括但不限于醇。醇可以选自但不限于甲醇、乙醇、丙醇、丁醇等。
[0034]
在另一个示例性实施方式中，碱可以是与有机溶剂混溶的任何有机碱。
[0035]
在另一个示例性实施方式中，碱可以是哌啶。
[0036]
在另一个示例性实施方式中，可以将在水性溶液或非水性溶液中由双缀合壳聚糖薄层覆盖的金属工件暴露于紫外光或热，以形成功能化金属工件。
[0037]
在另一个示例性实施方式中，该过程包括暴露于紫外光(光接枝)，其中在非水性质子溶剂中被双缀合壳聚糖薄层覆盖的金属工件暴露于波长(λmax)为约100至约400纳米的紫外线辐射。在另一示例性实施方式中，波长可以是约100nm、约125nm、约150nm、约175nm、约200nm、约225nm、约250nm、约251nm、约252nm、约253nm、约254nm、约255nm、约256nm、约257nm、约258nm、约259nm、约260nm、约275nm、约300nm、约325nm、约350nm、约
375nm、约400nm，或约100nm至约400nm之间的任何波长。
[0038]
在另一个示例中，光接枝可以进行约0.1秒至约10分钟的时间。在另一个示例性实施方式中，光接枝可以进行约0.1秒、约0.5秒、约1秒、约5秒、约10秒、约15秒、约20秒、约25秒、约30秒、约35秒、约40秒、约45秒、约50秒、约55秒、约60秒、约2分钟、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟的时间或约0.1秒至约10分钟之间的任何时间。
[0039]
在另一个示例性实施方式中，邻苯二酚或其衍生物共价键合到功能化金属工件的表面。
[0040]
在另一个示例性实施方式中，多巴胺或其衍生物功能化的金属工件的表面通过添加二咪唑及其衍生物或设计用于使分子、寡聚物或聚合物彼此缀合、结合或连接的任何试剂被活化。
[0041]
在另一个示例性实施方式中，缀合剂是n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺氯化氢(edci)。
[0042]
在另一个示例性实施方式中，金属连接的壳聚糖-多巴胺或类似物缀合物通过连接季铵、吡啶鎓或膦化合物而进一步修饰。
[0043]
在另一个示例性实施方式中，邻苯二酚或其衍生物包括任何取代或未取代的邻苯二酚，其可由下式表示：
[0044][0045]
其中r1、r2、r3、r4和r5中的每一个独立地选自下组：硫醇、伯胺、仲胺、腈、醛、咪唑、叠氮化物、卤化物、聚六亚甲基二硫代碳酸酯、氢、羟基、羧酸、醛、羧酸酯或酰胺，前提是r1、r2、r3、r4和r5中的至少一个不是氢原子，其中a范围为0至10且b范围为0至10，条件是a或b至少为1。邻苯二酚或其衍生物可包括但不限于儿茶酚胺、酚醛、酪醇及其衍生物，包括酪醇的羟基-、甲氧基-和混合甲氧基-羟基衍生物、酪胺及其衍生物，包括羟基化酪胺、多巴胺及其衍生物等。在另一个示例性实施方式中，其他含羟基化合物，包括但不限于苯酚(取代的和未取代的)，可以用作接头。在另一个示例性实施方式中，邻苯二酚或其衍生物是多巴胺或聚多巴胺。在另一个示例性实施方式中，多巴胺衍生物可以是甲氧基衍生物、4-乙醇衍生物等。
[0046]
在另一个示例性实施方式中，双缀合壳聚糖可以由下式表示：
[0047][0048]
其中r1、r2、r3、r4各自独立地选自下组：硫醇、烷烃、烯烃、炔烃、仲胺、腈、醛、咪唑、叠氮化物、卤化物、聚六亚甲基二硫代碳酸酯、氢、羟基、羧酸、醛、羧酸酯、乙酰基、酰胺、脲
和邻苯二酚或其类似物，条件是r1、r2、r3、r4中的至少一个不是氢原子。在上式中，n表示壳聚糖链中单体单元的数量，可以在约1至约500的范围内。c-2氮必须至少50％脱乙酰(根据壳聚糖的定义)，并且每个单体单元可以连接到两个缀合部分之一。
[0049]
缀合物最可能的连接点是在脱乙酰胺上，在c-3和c-5羟基上的次级连接可能性较小。在双缀合的壳聚糖中，一缀合物将与一部分可用的脱乙酰单体反应，而第二缀合物将与一部分剩余的未缀合的脱乙酰单体反应。
[0050]
壳聚糖可经历脱乙酰化反应，使得约50％至约100％、约55％至约95％、约60％至约90％、约65％至约85％、约70％至约80％，或约50％至约100％之间的任何点的乙酰基被去除，并且进一步地，基团r
1-r4中的至少两个可被修饰。
[0051]r1-r4基团中的至少一个可以含有季铵、膦或吡啶鎓官能团，并且壳聚糖可以具有约1％至约99％、约5％至约90％、约10％至约80％，约15％至约75％，约20％至约70％，约25％至约65％，约30％至约60％，约35％至约55％，约40％至约50％季铵化，或介于约1％至约99％之间的任何百分比。
[0052]r1-r4基团中的至少一个可以是邻苯二酚类似物，其提供二羟基苄基侧基以潜在地固定到基底上。
[0053]
包含具有下式的双缀合壳聚糖聚合物或寡聚物的组合物：
[0054][0055]
其中r1、r2、r3、r4、r3和r6中的每一个独立地选自下组：硫醇、烷烃、烯烃、炔烃、仲胺、腈、醛、咪唑、叠氮化物、卤化物、聚六亚甲基二硫代碳酸酯、氢、羟基、羧酸、醛、羧酸酯、酰胺、脲、邻苯二酚或其类似物，条件是r1、r2、r3、r4、r5和r6中的至少一个不是氢原子，其中n表示可用于缀合的单体单元的数量并且是约1至约500，并且其中m表示可用于第二缀合的单体单元的数量为约1至约500。
[0056]
在某些实施方式中，r1至r6中的至少两个独立地选自下组：硫醇、烷烃、烯烃、炔烃、仲胺、腈、醛、咪唑、叠氮化物、卤化物，聚六亚甲基二硫代碳酸酯、氢、羟基、羧酸、醛、羧酸酯、酰胺、脲和邻苯二酚或其类似物。
[0057]
在某些实施方式中，r1至r6中的至少一个选自下组：季铵、季膦或季吡啶鎓官能团，并且其中双缀合壳聚糖的季铵化程度为约1％至约99％。
[0058]
壳聚糖可经历脱乙酰化反应，使得约50％至约100％、约55％至约95％、约60％至约90％、约65％至约85％、约70％至约80％，或约50％至约100％之间的任何点的乙酰基被去除，并且进一步地，基团r
1-r4中的至少两个可被修饰。
[0059]r1-r6基团中的至少一个可以含有季铵、季膦或季吡啶鎓官能团，并且壳聚糖可以具有约1％至约99％、约5％至约90％、约10％至约80％，约15％至约75％，约20％至约70％，约25％至约65％，约30％至约60％，约35％至约55％，约40％至约50％的季铵化，或介于约1％至约99％之间的任何百分比。
[0060]r1-r6基团中的至少一个可以是邻苯二酚类似物，其提供二羟基苄基侧基以潜在地固定到基底上。
[0061]
r1至r6中的至少一个是邻苯二酚或其衍生物或类似物，其提供二羟基苄基侧基以将双缀合壳聚糖固定到基底上。
[0062]
在某些实施方式中，其中双缀合壳聚糖聚合物或寡聚物是：
[0063][0064]
其中邻苯二酚和季铵部分随机分布在双缀合壳聚糖聚合物或寡聚物的可用c-2胺连接点之间，并且其中q和n各自在约1至约500的范围内。
[0065]
在另一个示例性实施方式中，金属是非铁金属。在另一个示例性实施方式中，金属选自但不限于ti、zr、hf、v、nb、ta、al、co、w、mg及其合金、氧化物和纳米颗粒形式。在另一个示例性实施方式中，金属选自但不限于钛、氧化钛、钛合金、铝、氧化铝和铝合金。在另一个示例性实施方式中，金属是不锈钢。
[0066]
在另一个示例性实施方式中，邻苯二酚或其衍生物溶液的浓度为约0.1重量％至约20重量％。在另一个示例性实施方式中，邻苯二酚或其衍生物溶液的浓度为约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％，或约0.1％至约20％之间的任何百分比。
[0067]
在另一个示例性实施方式中，所施加的电压可以在从约1v到约100v的范围内。在另一个示例性实施方式中，所施加的电压可以是约1v、约2v、约3v、约4v、约5v、约6v、约7v、约8v、约9v、约10v、约11v、约12v、约13v、约14v、约15v、约16v、约17v、约18v、约19v、约20v、约21v、约22v、约23v、约24v、约25v、约26v、约27v、约28v、约29v、约30v、约31v、约32v、约33v、约34v、约35v、约36v、约37v、约38v、约39v、约40v、约41v、约42v、约43v、约44v、约45v、约46v、约47v、约48v、约49v、约50v、约51v、约52v、约53v、约54v、约55v、约56v、约57v、约58v、约59v、约60v、约61v、约62v、约63v、约64v、约65v、约66v、约67v、约68v、约69v、约70v、约71v、约72v、约73v、约74v、约75v、约76v、约77v、约78v、约79v、约80v、约81v、约82v、约83v、约84v、约85v、约86v、约87v、约88v、约89v、约90v、约91v、约92v、约93v、约94v、约95v、约96v、约97v、约98v、约99v、约100v、或约1v至约100v之间的任何电压。
[0068]
在另一个示例性实施方式中，一段时间为约1秒至约60分钟。在另一个示例性实施方式中，一段时间为约1秒、约5秒、约10秒、约15秒、约20秒、约25秒、约30秒、约35秒、约40秒、约45秒、约50秒、约55秒、约60秒、约65秒、约70秒、约75秒、约80秒、约85秒、约90秒、约95秒、约100秒、约105秒、约110秒、约115秒、约120秒、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约21分钟、约22分钟、约23分钟、约24分钟、约25分钟、约26分钟、约27分钟、约28分钟、约29分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟、或约1秒至约20分钟、约30分钟之间的任何时间、
或约1秒至约30分钟、约60分钟之间的任何时间或约1秒至约60分钟之间的任何时间。
[0069]
在另一个示例性实施方式中，水性缓冲液的ph为约6.0至约9.5、约6.0至约6.5、约6.5至约7.0、约7.0至约7.5、约7.5至约8.0、约8.0、约8.5、约9，约9.5，或约6.0至约9.5之间的任何ph，或约6.0至约9.5之间的任何范围。
[0070]
在另一个示例性实施方式中，多巴胺溶液包含约1重量％至约50重量％多巴胺和约1重量％至约20重量％哌啶，在乙醇或甲醇中，优选约5重量％至约45重量％多巴胺和约5重量％至约15重量％的哌啶、约10重量％至约40重量％的多巴胺和约10重量％至约15重量％的哌啶，或约1重量％至约50重量％的任意量的多巴胺与1重量％至约20重量％的任意量的哌啶，包括这些范围的端点。
[0071]
在另一个示例性实施方式中，施加紫外线辐射约1分钟至约60分钟、约5分钟至约55分钟、约10分钟至约50分钟、约15分钟至约45分钟、约20分钟至约40分钟，约25分钟至约35分钟，或约1分钟至约60分钟之间的任何时间，或少于约3小时的任何时间，包括这些范围的端点。
[0072]
在另一个示例性实施方式中，加热约30分钟至约1小时、约1小时至约2小时、约2小时至约4小时、约4小时至约6小时、约6小时至约8小时、约8小时至约10小时、或30分钟到10小时之间的任何时间，包括这些范围的端点。
[0073]
在另一个示例性实施方式中，修饰壳聚糖溶液包含壳寡糖。
[0074]
在另一个示例性实施方式中，壳寡糖可以通过添加季铵、膦或吡啶鎓化合物在c-2胺处被修饰，并且修饰的壳聚糖可以在c-6羟基、c-3羟基或先前未反应的c-2胺通过连接多巴胺(聚多巴胺)被进一步修饰，通过多巴胺(聚多巴胺)固定在表面上。
[0075]
在另一个示例性实施方式中，壳寡糖可以通过添加季铵、膦或吡啶鎓化合物在c-2胺处被修饰，并且修饰的壳聚糖可以在c-6羟基、c-3羟基或先前未反应的c-2胺通过连接3,4-二羟基氢化肉桂酸被进一步修饰，通过3,4-二羟基氢化肉桂酸固定在表面上。
[0076]
在另一个示例性实施方式中，修饰壳聚糖溶液包含用季膦化合物在葡糖胺单体处修饰的壳寡糖。
[0077]
在另一个示例性实施方式中，包含壳寡糖的修饰壳聚糖溶液在可用位点用季膦缀合进行修饰，缀合程度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％、或这些范围内的任何值，包括这些范围的端点。
[0078]
在另一个示例性实施方式中，包含季铵化壳寡糖的经修饰壳聚糖溶液在可用的剩余位点进一步用多巴胺或其类似物修饰，缀合度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约15％、约20％、约25％、约30％、约35％、约40％、约45％、约50％％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约100％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、约25％至约30％、约30％至约40％、约40％约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％、或这些范围内的任何值，包括这些范围的端点。
[0079]
在另一个示例性实施方式中，修饰壳聚糖溶液包含用季铵化合物在葡糖胺单体处修饰的壳寡糖。
[0080]
在另一个示例性实施方式中，修饰壳聚糖溶液包含在可用位点用季铵、季膦或季吡啶鎓基团修饰的壳寡糖，其中可用位点的百分比为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、25％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、从约90％至约100％、或这些范围内的任何值，包括这些范围的端点。
[0081]
在另一个示例性实施方式中，修饰壳聚糖溶液包含用多巴胺或其类似物额外修饰的季铵化壳聚糖，其中多巴胺或其类似物在剩余可用于缀合的位点与修饰的壳聚糖缀合，可用位点(未与季铵、膦或吡啶鎓基团缀合)的百分比为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约5％至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、25％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％、或这些范围内的任何值，包括这些范围的端点。
[0082]
在另一个示例性实施方式中，壳寡糖或修饰的壳寡糖的长度为约5个单体、长度为约5至约10个单体、长度为约10至约20个单体、长度为约20至约30个单体、长度为约30至约40个单体、长度为约40至约50个单体、长度为约50至约60个单体、长度为约60至约70个单体、长度为约70至约80个单体、长度为约80至约90个单体、长度为约90至约100个单体、长度为约100至约200个单体、长度为约200至约300个单体、长度为约300至约400个单体、长度为约400至约500个单体、或这些范围内的任何值，包括这些范围的端点。
[0083]
在另一个示例性实施方式中，该方法还包括制备含修饰的壳聚糖的溶液的方法。
[0084]
在另一个示例性实施方式中，制备含修饰的壳聚糖的溶液的方法包括：(a)制备壳聚糖在乙酸和过氧化氢中的水性溶液；(b)加热壳聚糖的水性溶液；(c)调节壳聚糖的水性溶液的ph值至ph＝9；和(d)收集壳寡糖产品。
[0085]
在另一个示例性实施方式中，壳寡糖的重均分子量为约100至约5000。在另一个示例性实施方式中，壳寡糖的重均分子量为约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、约3000、约3100、约3200、约3300、约3400、约3500、约3600、约3700、约3800、约3900、约4000、约4100、约4200、约4300、约4400、约4500、约4600、约4700、约4800、约4900、约5000、或约100至约5000之间的任何重均分子量。
[0086]
在另一个示例性实施方式中，壳聚糖水性溶液的ph为约7.5至约10。在另一个示例性实施方式中，壳聚糖水性溶液的ph为约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10或约7.5至约10之间的任何ph。
[0087]
在另一个示例性实施方式中，可以通过添加氯化缩水甘油基三甲基铵来制备季铵化壳聚糖，以实现永久季铵官能化。或者，季铵化分子可以连接到壳聚糖单体的c-2胺上；替代分子可以连接到同一位置以获得额外的功能；可以在壳聚糖和接头等之间使用不同的连接化学物质。
[0088]
在另一个示例性实施方式中，季铵化壳聚糖通过与多巴胺或其类似物缀合而进一步被修饰。
[0089]
在另一个示例性实施方式中，多巴胺或其类似物连接的季铵化壳聚糖连接至金属、其合金、氧化物或纳米颗粒形式。
[0090]
在另一个示例性实施方式中，金属-、合金-、氧化物-或纳米颗粒-结合的多巴胺或其类似物-连接的壳聚糖或壳寡糖可以通过与季铵、吡啶鎓或膦化合物缀合而被季铵化。
[0091]
在另一个示例性实施方式中，本文所述的任何溶液可包括选自但不限于以下的溶剂：甲醇、乙醇、四氢呋喃(thf)、二甲基甲酰胺(dmf)及其混合物。
[0092]
本发明的其他示例性实施方式的细节将包括在以下详细描述和附图中。
[0093]
附图简述
[0094]
图1是根据示例性实施方式的多巴胺/聚多巴胺修饰的金属表面的红外光谱图。
[0095]
图2是通过应用紫外线辐射结合的多巴胺/聚多巴胺修饰的金属表面的红外光谱图。
[0096]
图3是根据示例性实施方式的壳聚糖修饰表面的红外光谱图。
[0097]
图4是双缀合壳聚糖寡聚物的红外光谱图。
[0098]
图5显示了基于本技术的实验实施例的结果针对多种细菌种类的效力数据。
[0099]
详细说明
[0100]
从下面参照附图描述的示例性实施方式，将更清楚地理解本发明的优点和特征，以及实现其的方法。然而，本发明不限于以下示例性实施方式并且可以以不同的形式实施。提供示例性实施方式仅是为了完整地公开本发明并向本领域普通技术人员充分提供本发明所属领域的发明类别，并且本发明将由任何所附权利要求和它们的组合限定。
[0101]
附图中所示的形状、尺寸、比例、角度、数量等仅是示例性的，本发明不限于此。贯穿本说明书，相似的参考数字通常表示相似的元件。此外，在下面的描述中，可以省略对公知相关技术的详细解释以避免不必要地模糊本发明的主题。本文使用的诸如“包括”、“具有”、“包含”和“由...组成”通常旨在允许包含其他成分，除非这些术语与术语“仅”结合使用。除非另有明确说明，否则任何对单数的引用都可能包括复数。
[0102]
成分被解释为包括一普通误差范围，即使没有明确说明。例如，关于本文描述的实施方式，至多正负百分之十(
±
10％)的误差范围将被认为是普通误差范围。
[0103]
如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确说明。此外，“或”的使用旨在包括“和/或”，除非上下文清楚地另有说明。
[0104]
当使用诸如“上”、“上面”、“下面”和“下一个”等术语描述两个部分之间的位置关系时，一个或多个部分可以位于两个部分之间，除非这些术语与“立即”或“直接”一词结合使用。
[0105]
当一个元件或层被称为在另一个元件或层“上”时，该元件或层可以直接在另一个元件或层上，或者可以存在中间元件或层。
[0106]
尽管术语“第一”、“第二”等用于描述各种成分，但这些成分不受这些术语的限制。这些术语仅用于将一个成分与其他成分区分开来，并且在本发明的技术构思中第一成分可以是第二成分。
[0107]
附图中示出的每个部件的尺寸和厚度是为了便于解释而表示的，并且附图不一定按比例绘制。
[0108]
每当在此指示数值范围时，其意在包括指示范围内的任何引用的数字(分数或整
数)。短语“第一指示数字和第二指示数字之间的范围”以及“第一指示数”到“第二指示数之间的范围”在本文中可互换使用，并意味着包括第一和第二指定数字以及其间的所有分数和整数。
[0109]
本文所公开的尺寸和数值不应理解为严格限于所列举的精确数值。相反，除非另有说明，否则每个这样的尺寸旨在表示所列举的值和围绕该值的功能等效范围。例如，公开为“10％”的尺寸意在表示“约10％”。
[0110]
以术语“约”开头的数字和/或数值范围不应被认为限于这些列举的范围。相反，前面有术语“约”的数字和/或数字范围应理解为包括对于根据本发明的构造中的任何给定元素本领域技术人员所接受的范围。
[0111]
本发明各个实施方式中的特征可以部分或者全部相互结合或者结合，可以通过各种技术方式相互衔接和运作，各个实施方式之间可以独立实施，或者也可以结合实施。
[0112]
在下文中，将参照附图详细描述本发明的各种示例性实施方式。
[0113]
示例性实施方式是通过将邻苯二酚或其衍生物连接到金属表面来制备修饰金属表面的方法，该方法包括：制备邻苯二酚或其衍生物在缓冲液或有机溶剂中的水性或非水性质子溶液；调整至碱性ph值或添加碱；将金属工件的至少一部分浸入邻苯二酚或其衍生物的溶液中；施加电压使得工件在电化学电路中作为阳极一段时间以获得功能化金属工件；将修饰壳聚糖化学连接到功能化金属工件上。
[0114]
一个示例性实施方式是通过将双修饰的壳聚糖或其衍生物连接到金属表面来制备修饰金属表面的方法，该方法包括：制备壳聚糖或其衍生物在缓冲液或有机溶剂中的水性或非水性质子溶液；调整至碱性ph值或添加碱；将金属工件的至少一部分浸入双修饰的壳聚糖或其衍生物的溶液中；施加电压使得工件在电化学电路中作为阳极持续一段时间以获得功能化金属工件。
[0115]
一个示例性实施方式是通过将邻苯二酚或其衍生物修饰的壳聚糖或其衍生物连接到金属表面来制备修饰金属表面的方法，该方法包括：制备修饰的壳聚糖或其衍生物在缓冲液或有机溶剂中的水性或非水性质子溶液；调整至碱性ph值或添加碱；将金属工件的至少一部分浸入修饰的壳聚糖或其衍生物的溶液中；施加电压使工件在电化学电路中作为阳极持续一段时间以获得功能化金属工件和化学连接季铵、吡啶鎓或膦分子以获得功能化金属工件。
[0116]
另一个示例性实施方式是通过将邻苯二酚或其衍生物连接到金属表面来制备修饰金属表面的方法，该方法包括：制备邻苯二酚或其衍生物在缓冲液或有机溶剂中的水性或非水性质子溶液；调整至碱性ph值或添加碱；喷涂以覆盖金属工件的表面并将工件暴露在紫外线下一段时间以确保化学连接到工件以产生功能化金属工件并将修饰壳聚糖化学连接到功能化金属工件。
[0117]
另一个示例性实施方式是通过将双修饰的壳聚糖或其衍生物连接到金属表面来制备修饰金属表面的方法，该方法包括：制备壳聚糖或其衍生物在缓冲液或有机溶剂中的水性或非水性质子溶液；调整至碱性ph值或添加碱；喷涂以覆盖金属工件的表面，并将工件暴露在紫外线下一段时间，以确保化学连接到工件上，从而产生功能化金属工件。
[0118]
另一个示例性实施方式是通过将邻苯二酚或衍生物修饰的壳聚糖或其衍生物连接到金属表面来制备修饰金属表面的方法，该方法包括：制备修饰的壳聚糖或其衍生物在
缓冲液或有机溶剂中的水性或非水性质子溶液；调整至碱性ph值或添加碱；喷涂以覆盖金属工件的表面并将工件暴露在紫外线下一段时间以确保化学连接到工件以产生功能化金属工件并将季铵、吡啶鎓或膦分子化学连接到功能化金属工件。
[0119]
另一个示例性实施方式是通过将修饰壳聚糖或其衍生物连接到金属表面来制备修饰金属表面的方法，该方法包括：制备双修饰壳聚糖的水性溶液或非水性溶液，该双修饰壳聚糖已经连接有季铵、吡啶鎓或膦化合物及邻苯二酚或其衍生物，将所述溶液喷涂到金属表面上以覆盖金属表面并在烘箱中烘烤足够的时间和温度以使季铵化壳聚糖缀合物与表面化学结合。
[0120]
另一个示例性实施方式是通过将修饰壳聚糖或其衍生物连接到金属表面来制备修饰金属表面的方法，该方法包括：制备双修饰壳聚糖的水性溶液或非水性溶液，该双修饰壳聚糖已经连接有季铵、吡啶鎓或膦化合物及邻苯二酚或其衍生物，将所述溶液喷涂到金属表面上以覆盖金属表面，并将表面暴露于紫外光下足够时间以使季铵化壳聚糖缀合物与表面化学结合。
[0121]
另一个示例性实施方式是通过将修饰壳聚糖或其衍生物连接到金属表面来制备修饰金属表面的方法，该方法包括：制备双修饰壳聚糖的水性溶液或非水性溶液，该双修饰壳聚糖已经连接有季铵、吡啶鎓或膦化合物和邻苯二酚或其衍生物，将金属工件浸入溶液中，并将其与电化学电池的阳极接触。浸入阴极并施加足以实现壳聚糖缀合物与金属工件的化学连接的电压。
[0122]
在另一个示例性实施方式中，邻苯二酚或其衍生物共价键合到功能化金属工件的表面。
[0123]
在另一个示例性实施方式中，邻苯二酚或其衍生物功能化的工件通过添加本领域技术人员已知的缀合剂活化以实现碳-碳键形成、碳-氧键形成、碳-硫键形成、碳-氮键形成、碳-磷键形成、碳-硅键形成等，并实现额外功能化学实体如修饰和未修饰的壳聚糖寡聚物的连接或固定。
[0124]
在另一个示例性实施方式中，完全形成的壳聚糖缀合物连接于金属、合金、氧化物或纳米颗粒表面。
[0125]
在另一个示例性实施方式中，邻苯二酚或其衍生物包括任何取代或未取代的邻苯二酚，其可由以下式表示：
[0126][0127]
其中，r1、r2、r3、r4和r5中的每一个独立地选自下组：硫醇、伯胺、仲胺、腈、醛、咪唑、叠氮化物、卤化物、聚六亚甲基二硫代碳酸酯、氢、羟基、羧酸、醛、羧酸酯或酰胺，前提是r1、r2、r3、r4和r5中的至少一个不是氢原子，其中a在0到10的范围内，b在0到10的范围内，条件是a或b至少为1。邻苯二酚或其衍生物可包括但不限于儿茶酚胺、酚醛、酪醇及其衍生物，包括酪醇的羟基-、甲氧基-和混合甲氧基-羟基衍生物，酪胺及其衍生物，包括羟基化酪胺、多巴胺及其衍生物等。在另一个示例性实施方式中，其他含羟基化合物，包括但不限于苯酚
(取代的和未取代的)，可以用作接头。在另一个示例性实施方式中，邻苯二酚或其衍生物是多巴胺或聚多巴胺。在另一个示例性实施方式中，多巴胺衍生物可以是甲氧基衍生物、4-乙醇衍生物等。
[0128]
在另一个示例性实施方式中，金属是非铁金属，并且可以包括它们各自的氧化物、合金和纳米颗粒形式。金属可包括但不限于钛及其氧化物和合金、铝及其氧化物和合金、钒及其氧化物和合金、锆及其氧化物和合金、铪及其氧化物和合金、铌及其氧化物和合金、钽及其氧化物和合金、钨及其氧化物和合金、镁及其氧化物和合金、不锈钢、钴铬合金等。然而，邻苯二酚或其衍生物所连接的材料不受限制，并且可以包括聚合物、生物聚合物、陶瓷等。
[0129]
在另一个示例性实施方式中，邻苯二酚或其衍生物溶液的浓度为约0.1重量％至约20重量％。在另一个示例性实施方式中，邻苯二酚或其衍生物溶液的浓度为约0.1％、约0.2％、约0.3％、约0.4％、约0.5％、约0.6％、约0.7％、约0.8％、约0.9％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％，或约0.1％至约20％之间的任何百分比。
[0130]
在另一个示例性实施方式中，所施加的电压可以在从约1v到约100v的范围内。在另一个示例性实施方式中，所施加的电压可以是约1v、约2v、约3v、约4v、约5v、约6v、约7v、约8v、约9v、约10v、约11v、约12v、约13v、约14v、约15v、约16v、约17v、约18v、约19v、约20v、约21v、约22v、约23v、约24v、约25v、约26v、约27v、约28v、约29v、约30v、约31v、约32v、约33v、约34v、约35v、约36v、约37v、约38v、约39v、约40v、约41v、约42v、约43v、约44v、约45v、约46v、约47v、约48v、约49v、约50v、约51v、约52v、约53v、约54v、约55v、约56v、约57v、约58v、约59v、约60v、约61v、约62v、约63v、约64v、约65v、约66v、约67v、约68v、约69v、约70v、约71v、约72v、约73v、约74v、约75v、约76v、约77v、约78v、约79v、约80v、约81v、约82v、约83v、约84v、约85v、约86v、约87v、约88v、约89v、约90v、约91v、约92v、约93v、约94v、约95v、约96v、约97v、约98v、约99v、约100v、或约1v和约100v之间的任何电压。
[0131]
在另一个示例性实施方式中，施加电压持续约1秒至约60分钟的一段时间。在另一个示例性实施方式中，一段时间为约1秒、约5秒、约10秒、约15秒、约20秒、约25秒、约30秒、约35秒、约40秒、约45秒、约50秒、约55秒、约60秒、约65秒、约70秒、约75秒、约80秒、约85秒、约90秒、约95秒、约100秒、约105秒、约110秒、约115秒、约120秒、约3分钟、约4分钟、约5分钟、约6分钟、约7分钟、约8分钟、约9分钟、约10分钟、约11分钟、约12分钟、约13分钟、约14分钟、约15分钟、约16分钟、约17分钟、约18分钟、约19分钟、约20分钟、约25分钟、约30分钟、约35分钟、约40分钟、约45分钟、约50分钟、约55分钟、约60分钟或约1秒和约60分钟两者之间的任何时间。
[0132]
在另一个示例性实施方式中，缓冲液的ph为约7.5、约8.0、约8.5、约9、约9.5或约7.5至约9.5之间的任何ph。
[0133]
在另一个示例性实施方式中，该方法还包括清洁和干燥功能化表面。
[0134]
在另一个示例性实施方式中，该方法还包括在真空下或在惰性或非反应性气氛下干燥功能化表面。在另一个示例性实施方式中，惰性气氛是氮气或氩气。
[0135]
在另一个示例性实施方式中，将咪唑溶液中的功能化金属工件搅拌约1小时至约10小时。在另一个示例性实施方式中，搅拌进行约1小时、约1.5小时、约2小时、约2.5小时、
约3小时、约3.5小时、约4小时、约4.5小时、约5小时、约5.5小时，约6小时、约6.5小时、约7小时、约7.5小时、约8小时、约8.5小时、约9小时、约9.5小时、约10小时、或约1小时至10小时之间的任何时间。
[0136]
在另一个示例性实施方式中，修饰壳聚糖溶液包含壳寡糖。
[0137]
在另一个示例性实施方式中，壳寡糖可以通过添加季铵、吡啶鎓或膦化合物在其单体单元的c-2胺处被修饰，并且修饰的壳聚糖可以在c-6羟基处、c-3羟基或c-2胺处通过连接多巴胺(聚多巴胺)或其类似物被进一步修饰，通过多巴胺(聚多巴胺)或其类似物固定在表面上。
[0138]
在另一个实施方式中，修饰壳聚糖溶液包含用季膦化合物在葡糖胺单体处修饰的壳寡糖。
[0139]
在另一个实施方式中，修饰的壳聚糖溶液包含在可用位点用季膦缀合修饰的壳寡糖，缀合度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约5至约10％、约10％至约15％、约15％至约20％、约20％至约25％、25％至约30％、约30％至约40％、约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％、或这些范围内的任何值，包括这些范围的端点。
[0140]
在另一个实施方式中，修饰壳聚糖溶液包含用季铵、膦或吡啶鎓化合物在葡糖胺单体处修饰的壳寡糖。
[0141]
在另一个实施方式中，修饰壳聚糖溶液包含在可用位点用季铵、膦或吡啶鎓缀合修饰的壳寡糖，缀合程度为约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、5至约10％，约10％至约15％，约15％至约20％，约20％至约25％，25％至约30％，约30％至约40％，约40％至约50％、约50％至约60％、约60％至约70％、约70％至约80％、约80％至约90％、约90％至约100％，或这些范围内的任何值，包括这些范围的端点。
[0142]
在另一个实施方式中，壳寡糖或修饰的壳寡糖长度为约5个单体、长度为约5至约10个单体、长度为约10至约20个单体、长度为约20至约30个单体、从长度为约30至约40个单体、长度为约40至约50个单体、长度为约50至约60个单体、长度为约60至约70个单体、长度为约70至约80个单体、长度为约80至约90个单体、长度为约90至约100个单体、长度为约100至约200个单体、长度为约200至约300个单体、长度为约300至约400个单体、从约400至约500个单体长度、或这些范围内的任何值，包括这些范围的端点。
[0143]
在另一个示例性实施方式中，该方法还包括制备含修饰的壳聚糖的溶液的方法。
[0144]
在另一个示例性实施方式中，制备含修饰的壳聚糖的溶液的方法包括：(a)制备壳聚糖在乙酸和过氧化氢中的水性溶液；(b)加热壳聚糖水性溶液；(c)调节壳聚糖水性溶液的ph值至ph＝9；(d)收集壳寡糖产品。
[0145]
在另一个示例性实施方式中，壳寡糖的重均分子量为约100至约5000。在另一个示例性实施方式中，壳寡糖的重均分子量为约100、约200、约300、约400、约500、约600、约700、约800、约900、约1000、约1100、约1200、约1300、约1400、约1500、约1600、约1700、约1800、约1900、约2000、约2100、约2200、约2300、约2400、约2500、约2600、约2700、约2800、约2900、约3000、约3100、约3200、约3300、约3400、约3500、约3600、约3700、约3800、约3900、约4000、约4100、约4200、约4300、约4400、约4500、约4600、约4700、约4800、约4900、约5000，或约100至约5000之间的任何重均分子量。
[0146]
在另一个示例性实施方式中，壳聚糖水性溶液的ph为约7.5至约10。在另一个示例性实施方式中，壳聚糖水性溶液的ph为约7.5、约8、约8.5、约9、约9.5、约10或约7.5至约10之间的任何ph。
[0147]
在另一个示例性实施方式中，可以通过添加氯化缩水甘油基三甲基铵来制备季铵化壳聚糖，以实现永久季铵官能化。交替季铵化分子可以连接到壳聚糖单体的c-2胺、c-3羟基或c-6羟基上；交替分子可以连接到同一位置以获得额外的功能；可以使用不同的连接化学物质将修饰的壳寡糖固定到功能化表面等。
[0148]
在另一个示例性实施方式中，本文所述的任何溶液可包括溶剂，选自但不限于甲醇、乙醇、四氢呋喃(thf)、二甲基甲酰胺(dmf)及其混合物。
[0149]
邻苯二酚是一种含有额外羟基的苯酚衍生物，具有以下化学结构：
[0150][0151]
多巴胺是一种以乙胺基团为取代基的取代邻苯二酚，具有以下化学结构：
[0152][0153]
邻苯二酚和邻苯二酚衍生物，如多巴胺通过与环氧原子形成共价键连接在金属表面。然后，多巴胺的悬空胺支链可以通过参与多巴胺聚合在表面形成聚多巴胺来稳固连接的分子。一些胺可用于与所需分子进一步反应以赋予表面功能。这种分子的用途是它们可以包含可以进一步修饰的官能团。这允许将各种化学物质安装到这些分子的远端。因此，这些分子的共价连接随后是定制化学物质的安装等同于所述化学物质共价连接到表面上。
[0154]
此类官能团可包括但不限于取代或未取代的羟基、取代或未取代的胺、取代或未取代的酯、取代或未取代的硫醇、取代或未取代的醚、取代或未取代的膦酸酯，取代或未取代的次膦酸酯、取代或未取代的磷酸酯、取代或未取代的羧酸酯、取代或未取代的丙烯酸酯、取代或未取代的磺酸酯盐、取代或未取代的亚磺酸酯、取代或未取代的亚砜、取代或未取代的硅烷、取代或未取代的硅氧烷、取代或未取代的聚二甲基硅氧烷(pdms)、取代或未取代的氨基酯、取代或未取代的天然和合成的肽、取代或未取代的寡肽、蛋白质、核苷酸、寡核苷酸、多核苷酸、取代或未取代的糖、取代或未取代的多糖等，这些基团可以进一步修饰。官能团可以是酯，例如甲基丙烯酸酯、氨基甲酸酯、脲、卤代烷等。
[0155]
与未处理的表面相比，操纵表面在环境中的化学表现会改变该表面的行为。例如，可以使表面具有疏水性、亲水性、疏油性、润滑性、抗菌性等。也可以将表面制得增强或削弱粘合剂的有效性。此外，可以连接蛋白质和蛋白质片段、氨基酸(天然的和合成的)和肽以增强或减弱所需的物理、化学或生物反应。
[0156]
如本技术的示例性实施方式中所述，成功的表面修饰取决于接头的选择和结合化学特性。虽然已经开发了几种用于金属和非金属表面的结合策略，但重点是使用修饰邻苯二酚，主要是多巴胺或3,4-二羟基氢化肉桂酸，作为选择的接头。邻苯二酚或其衍生物因其可应用于表面的普遍性及其易于进一步修饰而具有吸引力。
[0157]
在一些实施方式中，多巴胺或聚多巴胺共价键合到金属表面，这使得多巴胺分子的胺部分可在表面上用于进一步官能化。选择氨基甲酸酯或尿素形成作为结合化学物质以将修饰壳聚糖连接到聚多巴胺。尽管连接到多巴胺单体的许多胺参与了多巴胺聚合，但仍有足够数量的胺可用于进一步的表面修饰。在本文所述的实验中，选择二氯甲烷中的羰基二咪唑(cdi)用于活化化学，以允许多巴胺的活化胺与修饰壳聚糖的c-6羟基或未反应的c-2胺缀合。另外，可以使用其他对环境更友好的缀合化学物质。
[0158]
该过程的最后一步是将修饰壳聚糖连接到cdi激活的聚多巴胺表面。修饰壳聚糖(htcc)与cdi活化的聚多巴胺表面缀合，赋予表面抗菌性能。最可能的连接点显示为c-2胺，它们在htcc的形成过程中没有被季铵化。这样就完成了组成独特的抗菌表面的构造。
[0159]
本文描述的修饰过程的第一个示意图如下：
[0160][0161]
在上图中，n代表季铵化单体单元的数量，从约1到约500，m代表剩余的连接到多巴胺表面的脱乙酰未季铵化单体单元的数量，从约1到约500。
[0162]
上面的第一个示意图是为清楚起见而提供的，不应解释为限于以规则模式与多巴胺连接点交替的季铵化位置，但也可能包括壳聚糖单体的c-2胺的不同化学环境，其随机分布在季铵化、多巴胺连接、乙酰化和脱乙酰化位点之间。
[0163]
第二示意图进一步阐明了本技术的另一个示例性实施方式：
[0164][0165]
在上述示意图中，n代表约1至约500的季铵化单体单元的数量，m代表约1至约500的可用于缀合的未季铵化、脱乙酰单体单元的数量，q代表邻苯二酚衍生的单体单元的数量，约1至约500。
[0166]
上面的第二个示意图是为清楚起见而提供的，不应被解释为限于以规则模式与肉桂酸连接点交替的季铵化位置，但也可能包括壳聚糖单体的c-2胺的不同化学环境，其随机分布在季铵化、肉桂酸连接、乙酰化和脱乙酰化位点之间。
[0167]
在这个例子中，完全形成的双缀合壳聚糖是在固定到金属表面之前合成的。邻苯二酚侧接htcc可以分离和储存直到需要，从而增加了此方法的便利性。htcc可以如上文和文献中所述合成。第二缀合通过众所周知的edc/nhs缀合将htcc缀合到3,4-二羟基氢化肉桂酸以形成酰胺键。
[0168]
固定到金属表面可以通过前面描述的方法实现，即烘烤、阳极氧化或光接枝。
[0169]
然后使用标准分析技术分析制备好的工件，包括但不限于红外(ir)光谱、接触角、x射线光电子能谱(xps)、能量色散x射线光谱(edx)、原子力显微镜(afm)、飞行时间二级离子质谱(tof-sims)、摩擦系数(cof)研究及其组合。
实施例
[0170]
在以下实施例中描述了使用多巴胺作为连接基团的金属表面的功能化。本文所述的过程获得高效表面，其对一些生物体提供相对于对照大于5的杀灭对数，同时保持优异的生物相容性。
[0171]
实施例1：用多巴胺修饰金属表面
[0172]
制备ph＝8.5磷酸盐缓冲液中的1wt％多巴胺水性溶液，并将干净的商业纯(cp)钛试样片浸入缓冲液中。每个试样片被布置成与直流电源的阳极端子接触。施加10v电压5分钟。然后取出试样片并在水中超声处理15分钟。重复超声处理过程，然后用大量水洗涤试样片。随后在乙醇中进一步超声处理5分钟，然后在乙醇中清洗。将试样片干燥，并使用红外(ir)光谱法研究其表面。使用上述过程修饰的表面的红外光谱示于图1中。
[0173]
图1的光谱显示了以约1600cm-1
和1490cm-1
为中心的特征宽峰，表明c＝c和n＝c伸缩振动的组合。宽峰表示存在于许多不同化学环境中的振动物质，表示有聚合物。约1428cm-1
和约1268cm-1
处的峰表示c＝c和cnc官能。
[0174]
实施例2：光接枝多巴胺至钛表面上
[0175]
制备多巴胺(10mg/ml)在磷酸盐缓冲液(ph＝8.5)中的溶液。将该溶液喷洒在清洁干燥的钛试样片表面上以覆盖其表面。然后将试样片暴露于uv辐射(λmax＝254nm)5分钟，然后再应用两次喷雾溶液并进行曝光。然后洗涤处理过的试样片并在水中超声处理15分钟，然后用etoh洗涤。它们在氩气下干燥。经处理的试样片的红外光谱示于图2，其表明聚多巴胺在表面上。
[0176]
图2的光谱显示了以约1600cm-1
和1490cm-1
为中心的特征宽峰，表明c＝c和n＝c伸缩振动的组合。宽峰表示存在于许多不同化学环境中的振动物质，表示有聚合物。约1443cm-1
处的峰表示c＝c和cnc官能。
[0177]
实施例3：多巴胺修饰金属表面的cdi激活
[0178]
将表面连接有多巴胺的金属试样片浸入250ml的ch2cl2和3g的cdi的溶液中，室温下以400rpm～500rpm的搅拌速度搅拌4小时。将试样片从ch2cl2/cdi溶液中取出并用丙酮洗涤，然后在丙酮中超声处理10分钟。重复洗涤处理。然后在真空下干燥试样片。
[0179]
实施例4：壳聚糖寡聚物的连接
[0180]
该过程的最后一步是将修饰的壳聚糖连接到cdi-活化的聚多巴胺表面。修饰壳聚糖(n-4或htcc)是通过在乙酸/过氧化氢水性溶液中加热解聚壳聚糖(平均mw＝50000，dd》90％)内部制备的。将解聚反应的产物从ph＝9的溶液中分离出来，洗涤并分离。分离的产物是一种壳寡糖，平均分子量约为2000。分离的壳寡糖通过葡糖胺单体的c-2胺与氯化缩水甘油基三甲基铵之间的反应进行季铵化，得到修饰壳聚糖产物。然后将该产物缀合到cdi激活的聚多巴胺表面。
[0181]
制备n-4在dmso中的1wt％溶液。将具有cdi活化聚多巴胺表面的试样片平放成阵列并喷洒n-4/dmso溶液，并在100℃下加热约10分钟。将试样片翻转过来，然后重复该过程。对每侧至少重复两次喷涂/加热循环的整个过程。在最后的喷涂步骤之后，将修饰试样片在约100℃下加热约4小时，然后在乙醇中超声处理10分钟。用红外(ir)光谱证实了修饰壳聚糖连接后的表面特征。得到的ir光谱如图3所示。
[0182]
图3的谱图显示了壳聚糖和壳寡糖的许多特征峰。3277cm-1
附近的宽峰表示n-h和o-h伸缩，而2869cm-1
附近的宽峰表示c-h伸缩。剩余的乙酰羰基伸缩显示在1662cm-1
和1376cm-1
。1476cm-1
表示季铵中心的甲基发生角度弯曲。在1151cm-1
和1085cm-1
处可以看到其他特征峰，分别对应于c-o-c和c-o伸缩。
[0183]
实施例5：双缀合壳聚糖的形成
[0184]
将3,4-二羟基氢化肉桂酸(1mmol)溶解在无水dmso中。然后将edc(1-乙基-3-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺)和nhs(n-羟基琥珀酰亚胺)分别以二羟基氢肉桂酸的羧基摩尔比为1.1和1.2的比例添加到溶液中(打开前edc和nhs平衡至室温)。将混合物在室温搅拌3小时。在搅拌下将混合物滴加到1％季铵化壳聚糖(n-4或htcc)溶液(w/v，300mg/30ml dmso)中。将反应混合物在室温下在黑暗中搅拌过夜。在反应结束时，通过离心分离棕色沉淀物并用丙酮和dmso洗涤三次，用mwco为1kda的透析管(生物设计biodesign，纽约)对水透析并冻
干。溶液用丙酮洗涤。将多巴胺季铵化壳聚糖(hycnq)在25℃下真空干燥72小时。多巴胺季铵化的壳聚糖通过1h-nmr(布鲁克ac500分光光度计，德国)和傅立叶变换红外(ft-ir)光谱法确认。
[0185]
图4显示了hycnq寡聚物的特征红外光谱。3200cm-1
左右的宽峰对应于存在的许多羟基的o-h伸缩。以2900cm-1
为中心的峰对应于c-h伸缩。通过在1733cm-1
处存在c＝o伸缩来证明连接肉桂酸形成的酰胺。还存在在1671cm-1
处弯曲的仲胺、在1530cm-1
处伸展的芳香c＝c以及在1488cm-1
处的指示四元中心的甲基弯曲峰。
[0186]
实施例6：hycnq的表面连接
[0187]
将多巴胺季铵化的壳聚糖溶液(hycnq)(0.1g/10ml dmso)一次喷涂到金属试样片(约0.001g)上。将试样片水平放置在板上以提高涂层的厚度均匀性，然后在100℃的烘箱中反应20分钟。将试样片从烘箱中取出并再喷涂一次并在真空中再加热4小时。对于试样片，每一面都按上述方式处理。将试样片在etoh中超声处理5分钟并真空干燥。
[0188]
实验实施例
[0189]
表面结合壳聚糖缀合物的抗微生物特性通过以下实验实施例表征。
[0190]
细菌接种物制备：将10ml胰蛋白酶大豆肉汤(tsb)接种测试生物体的单个菌落，并在35
±
2℃的振荡培养箱中以250rpm的速度孵育过夜。第二天，将过夜培养物传代到3ml的tsb中，并在35
±
2℃和250rpm下孵育，直到600nm处的光密度达到0.5和0.7之间。用无菌tsb将传代培养物稀释至od600＝0.3，然后用无菌静止缓冲液(0.3mm kh2po4，ph7.2)进一步稀释至od600＝0.01。
[0191]
试样片制备：如实施例1至4中所述制备测试试样片。对照和测试试样片在70％的etoh中灭菌10分钟，并在层流罩中干燥10分钟，然后转移到24孔板的孔中。
[0192]
实验实施例1
–
低体积修改的astm e2149
[0193]
在35
±
2℃和250rpm下，将对照和测试试样片与500微升细菌接种物一起孵育1小时。通过使用静止缓冲液进行连续稀释并使用miles和misra方法确定每毫升菌落形成单位(cfu)的数量来确定细菌浓度。所有实验一式三份进行，平均cfu/ml的对数减少由以下等式确定：
[0194]
对数减少(logreduction)＝log10(对照cfu/ml)-log10(测试cfu/ml)。
[0195]
表1列出了处理过的表面与对照对金黄色葡萄球菌(mssa)的效力。如表1所示，在如上所述的astm 2149中，未经处理的试样片落至平均2.3x10
6 cfu/ml，针对mssa处理的试样片回落至零细菌，5+对数减少或超过99.999％。
[0196]
表1
[0197][0198]
图5显示了结合多巴胺-n4针对细菌组的效力。以与实验例1中概述的相同方式测试mst20-001抗多种细菌。针对mst20-001测定的各种物种列于图5的左侧。底部的刻度示出相对于对照(未处理的试样片)的对数减少。例如，在上面的实施例中，经过处理的样本回落至零细菌，而对照样本为2.34e+6cfu/ml。考虑到初始接种，这转化为约5个杀灭对数，其归因于处理过的试样片。这些数据对应于图表顶部的条形图(对于金黄色葡萄球菌s.aureus)。数据条右侧的箭头表示从处理过的样品中回落至零细菌，因此处理效力至少为5个对数。
[0199]
以类似的方式，mrsa、表皮葡萄球菌(s.epidermidis)和单核细胞李斯特菌(l.monocytogenes)在2149测定中都回落至零细菌。对于粪肠球菌(e.faecalis)，效力小于2个对数或90％至99％有效。屎肠球菌(e.faecium)被减少了3个对数以上或大于99.9％，而绿脓杆菌(p.aeruginosa)和肠道沙门菌(s.enterica)被减少了99.9％或3个对数。
[0200]
实验实施例2-高压灭菌测试
[0201]
将对照和测试试样片置于chex-aiiii即时密封灭菌袋中，并在121℃下高压灭菌30分钟(型号ha-300mii，平山制造公司，东京，日本)。在每个循环之后，将要进行更多循环高压灭菌的试样片冷却约10分钟，然后再转移到新的灭菌袋中。遵循先前描述的astme2149协议。结果如表2所示，该表列出了基于本技术的实验实施例结果的杀菌测试数据。
[0202]
表2
[0203][0204]
从表1和表2中的数据可以看出，未高压灭菌(在前的)和高压灭菌处理过的试样片
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