对-氨基-苄基接头、其制备方法及其在缀合物中的用途与流程

对-氨基-苄基接头、其制备方法及其在缀合物中的用途
1.本发明涉及可用于将药物部分与抗体连接的对-氨基-苄基接头化合物，涉及其中所述对-氨基-苄基接头化合物与药物部分共价连接的接头-药物化合物，以及涉及包含与药物共价连接的所述对-氨基-苄基接头化合物的抗体-药物缀合物，其中所述药物在由所述抗体靶向的特定细胞或组织类型处从所述缀合物中酶促裂解。
2.发明背景
3.靶向治疗剂被设计为相对于常规疗法降低非特异性毒性并增加功效。这种方法体现为单克隆抗体或抗原结合片段将高效的缀合的小分子治疗剂特异性递送至抗原阳性细胞的强大靶向能力。为了解决毒性问题，化学治疗剂(药物)已经与可以高度特异性结合肿瘤细胞的靶向分子(例如抗体或蛋白质受体的配体)偶联，以形成称作抗体-药物缀合物(adc)或免疫缀合物的化合物(chau等人lancet 2019,394,793-804)。adc或免疫缀合物在理论上应具有较低毒性，因为与正常细胞相比，它们将细胞毒性药物引导至过表达特定细胞表面抗原或受体的疾病细胞。adc或免疫缀合物的有希望的进展已经看到通过在肿瘤部位或肿瘤胞内裂解的接头与抗体连接的细胞毒性药物。这样的进步可以应用于需要靶向递送的任何疾病(tumey,innovations for next-generation antibody-drug conjugates.humana press 2018,187-214)。最近的实例还显示出在免疫介导的炎性疾病(wang等人j am chem soc.2015,137,3229-32)、肌肉相关疾病(sugo等人j.control.release 2016,237,1-13)和由细菌感染引起的疾病(mariathasan等人trends mol.med.2017,23,135-149)中的价值。此外，adc不限于细胞毒性药物，并且可用于将成像剂(dammes等人，theranostics 2020,10,938-955)或寡核苷酸(dovgan等人，bioconjug.chem.2019,30,2483-2501)特异性递送至抗原阳性细胞。
4.接头(linker)可以影响adc的物理化学性质。由于许多细胞毒性剂本质上是疏水性的，因此将它们与具有另外的疏水部分的抗体连接可能导致聚集。adc聚集体是不溶性的，并且经常限制可实现的药物加载到抗体上，这可以不利地影响adc的效力。通常，生物制品的蛋白质聚集体也与增加的免疫原性有关。
5.靶向递送与细胞特异性配体缀合的药物(例如细胞毒性或细胞抑制性药物)的化学解决方案是“自我降解型接头”pabc或pab(对-氨基苄氧基羰基或对-氨基苄基)，其将药物部分连接至缀合物中的配体(alouane等人angew.chem.int.ed.2015,54,7492-7509；bargh等人chem.soc.rev.2019,48,4361-4374)。pab接头单元也称作电子级联间隔基。连接肽单元的羧基末端和pabc或pab的对-氨基苄基的酰胺键可以是底物并且可被某些蛋白酶裂解。芳族胺成为供电子的并引发导致离去基团排出的电子级联效应，其在消去二氧化碳后释放游离药物(de groot等人j.org.chem.2001,66,8815-8830)。一旦与pabc或pab相邻的肽键裂解(即，被胞内酶裂解)时，药物从配体释放，由此不结合接头的剩余部分(de groot等人molecular cancer therapeutics2002,1,901-911；de groot等人j.med.chem.1999,42,5277-5283)。
6.已经开发了包含对-氨基苄基或对-氨基苄氧基羰基(pab或pabc)单元与肽单元结合的接头，其具有在酶促、水解或其他代谢条件下的1,6-消除和片段化的“自我降解”或“自
我降解性”机制，从而从靶向配体例如抗体释放药物部分(ep 1 718667；wo 2016/040684)。关于pab单元在前药和缀合物中的用途，还参见：alouane等人angew.chem.int.ed.2015,54,7492-7509；bargh等人chem.soc.rev.2019,48,4361-4374；dal corso等人chem.eur.j.2019,25,14740-14757。
7.pab型自我降解接头的限制因素是导致缀合物的溶解性差和聚集的倾向。例如，在wo 2017/214282中，包含几个亲水基团(如葡糖苷酸、多羟基化侧链...)的pab类型自我降解接头导致缀合物的高聚集(》15％)。另外，一些包含pab的缀合物可能不是某些裂解酶的合适底物或裂解过慢而无法实现功效。因此，期望通过优化自我降解型接头的结构来改善抗体-药物缀合物的性质，以减少聚集，同时保持药理学活性和稳定性。出乎意料的是，本文所公开的包含对-氨基-苄基单元和肽单元的这些新型对-氨基-苄基接头解决了上述缺点，并且它们的使用导致adc具有低聚集水平、良好的稳定性、期望的药物载量水平和预期的药理学活性，如以下实施例中所证明的。
8.附图简述
9.图1显示使用细菌转谷氨酰胺酶(lar2)的位点特异性抗体缀合。
10.图2显示使用抗体的4个链间二硫键的缀合。
11.图3显示使用产生片段化的再桥接技术的缀合。
12.定义
13.术语“抗体”或“ab”以最广泛的含义使用，是指通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合靶标(例如蛋白质、多肽、碳水化合物、多核苷酸、脂质或前述的组合)的免疫球蛋白分子。抗体可以是多克隆或单克隆的、多链或单链的、或完整的免疫球蛋白，并且可以衍生自天然来源或重组来源。“完整”抗体是通常包含通过二硫键相互连接的至少两条重(h)链和两条轻(l)链的糖蛋白。每条重链由重链可变区(本文缩写为vh)和重链恒定区组成。重链恒定区包含三个结构域ch1、ch2和ch3。每条轻链由轻链可变区(本文缩写为vl)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域cl组成。vh和vl区可以进一步细分为高变区，称为互补决定区(cdr)，散布有更保守的区域，称为框架区(fr)。每个vh和vl由从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列的三个cdr和四个fr组成：fr1、cdr1、fr2、cdr2、fr3、cdr3、fr4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统的第一组分(clq)。抗体可以是单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、骆驼化抗体或嵌合抗体。抗体可以是任何同种型(例如igg、ige、igm、igd、iga和igy)、类别(例如iggl、igg2、igg3、igg4、igal和iga2)或亚类。抗体可以是完整抗体或其抗原结合片段。
14.如本文所用的术语“抗体片段”或“抗原结合片段”或“片段”是指保留与抗原的表位特异性相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗原结合片段还可以保留内化到表达抗原的细胞中的能力。在一些实施方案中，抗原结合片段还保留免疫效应子活性。术语抗体、抗体片段、抗原结合片段等旨在包括在较大的大分子如adc的背景下使用来自抗体的结合结构域。已经显示全长抗体的片段可以执行全长抗体的抗原结合功能。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2、fv片段、scfv抗体片段、二硫键连接的fv(sdfv)、由vh和ch1结构域组成的fd片段、线性抗体、
单结构域抗体如sdab(vl或vh)、骆驼科vhh结构域、由抗体片段形成的多特异性抗体，如包含在铰链区通过二硫键连接的两个fab片段的二价片段，以及抗体的分离的cdr或其他表位结合片段。抗原结合片段也可以掺入到单结构域抗体、巨大抗体、小体、纳米体、细胞内抗体、双体、三抗体、四抗体、双特异性或多特异性抗体构建体、adc、v-nar和bis-scfv(参见，例如，holliger和hudson nat.biotechnol.2005,23,1126-1136)。还可以将抗原结合片段移植到基于多肽如纤连蛋白iii型(fn3)的骨架中(参见美国专利号no.6,703,199，其描述了纤连蛋白多肽小体)。
15.术语“scfv”是指包含至少一个包含轻链可变区的抗原结合片段和至少一个包含重链可变区的抗原结合片段的融合蛋白，其中轻链和重链可变区例如经由合成接头(例如短柔性多肽接头)连续连接，并且能够表达为单链多肽，并且其中scfv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非另有说明，scfv可以具有任何顺序的vl和vh可变区，例如，相对于多肽的n-末端和c-末端，scfv可以包含vl-接头-vh或可以包含vh-接头-vl。使用本领域技术人员已知的常规技术获得抗原结合片段，并且以与完整抗体相同的方式筛选结合片段的效用(例如，结合亲和力、摄入)。例如，抗原结合片段可以通过切割完整蛋白质来制备，例如通过蛋白酶或化学裂解。
16.如本文所用，术语“药物”或“药剂”或“治疗药物”或“治疗剂”是指能够调节生物过程和/或具有生物活性的化学化合物、化学化合物的混合物、生物大分子、由生物材料制成的提取物或其两种或多种的组合。特别地，术语“药物”可以表示“化学治疗剂”或“抗癌剂”。
17.术语“化学治疗剂”或“抗癌剂”在本文中用于指有效治疗癌症的所有药剂(无论作用机制如何)。抑制转移或血管生成通常是化疗剂的性质。化学治疗剂包括抗体、生物分子和小分子。化学治疗剂可以是细胞毒性剂或细胞抑制剂。化学治疗剂的实例包括但不限于单甲基澳瑞他汀e、澳瑞他汀e、sn-38、多柔比星等。
18.术语“细胞生长抑制剂”是指抑制或遏制细胞生长和/或细胞增殖的药剂。
19.术语“细胞毒性剂”是指主要通过干扰细胞的表达活性和/或功能而引起细胞死亡的物质。
20.如本文所用，术语“卤代(c1-c4)烷基”是指被一个或多个卤素原子如氟、氯、溴或碘取代的(c
1-c4)烷基基团，包括但不限于氟甲基、二氟甲基、三氟甲基、2-氟乙基、2,2-二氟乙基、2,2,2-三氟乙基、2,2,2-三氟-1,1-二甲基乙基、2,2,2-三氯乙基、3-氟丙基、4-氟丁基、氯甲基、三氯甲基、碘甲基和溴甲基。
21.术语“保护基”是指通常用于阻断或保护特定官能团同时使化合物上的其它官能团反应的取代基。例如，“氨基保护基”是与氨基连接的取代基，其阻断或保护化合物中的氨基官能团。合适的氨基保护基包括乙酰基、三氟乙酰基、叔丁氧基羰基(boc)、苄氧基羰基(cbz)和9-芴基亚甲氧基羰基(fmoc)。类似地，“羟基保护基”是指阻断或保护羟基官能团的羟基的取代基。合适的羟基保护基包括乙酰基、苄基、苯甲酰基、四氢吡喃基和三烷基甲硅烷基。此外，“羰基保护基”是指阻断或保护羰基官能团的羰基的取代基。合适的羰基保护基包括缩醛、酰基缩醛和二噻烷。类似地，“羧基保护基”是指阻断或保护羧基官能团的羧基的取代基。合适的羧基保护基包括甲酯、苄酯、叔丁酯、甲硅烷基酯和原酸酯。关于保护基团及其用途的一般描述，参见t.w.greene,protective groups in organic synthesis,john wiley&sons,new york,1991。
22.如本文所用的术语“部分”意指分子或化合物的指定区段、片段或官能团。化学部分有时表示为嵌入或附加(即，取代基或可变基团)至分子、化合物或化学式的化学实体。
23.如本文所用，术语“桥接间隔基”是指一个或多个接头组分，其共价连接在一起以形成将二价肽a
1-a2连接至反应性基团的二价部分。在某些实施方案中，“桥接间隔基”包含经由酰胺键连接至a2基团的n末端的羰基。在某些实施方案中，“桥接间隔基”包含经由酰胺键连接至a2基团的羰基的氨基。在一些实施方案中，桥接间隔基包含聚氧乙烯(peg)基团。在其它实施方案中，桥接间隔基包含丁酰基、戊酰基、己酰基、庚酰基或辛酰基。在一些实施方案中，桥接间隔基包含己酰基(即-co-(ch2)
5-基团)。在优选的实施方案中，桥接间隔基可以包含：-co-ch
2-ch
2-peg1-、-co-ch
2-peg3-或-nh-ch
2-ch
2-peg1-。
24.如本文所用，术语“聚氧乙烯”、“聚乙二醇”或“peg”是指由(och2ch2)基团组成的直链、支链或星形构型。在某些实施方案中，聚氧乙烯或peg基团是*-(och2ch2)
t
**，其中t是1-20，并且其中“*”表示指向a
2-a1基团的末端，并且“**”表示与反应性基团的连接点。在一些实施方案中，桥接间隔基包含peg基团，其为*-(och2ch2)
t-**，其中t为1-20，并且其中“*”表示与-(ch2)
n-c(o)-基团的连接点，其中羰基与a2基团的n末端连接并且n为1-5，并且“**”表示与反应性基团的连接点。在一些实施方案中，桥接间隔基包含peg基团，其为*-(och2ch2)
t-**，其中t为1-20，并且其中“*”表示与-(ch2)
n-nh-基团的连接点，其中氨基与a2基团的羰基连接，并且n为1-5，并且“**”表示与反应性基团的连接点。例如，如本文所用，术语“peg3”是指t为3。
25.如本文所用，术语“反应性基团”是能够与抗体或抗体片段的官能团形成共价键的官能团。在一些实施方案中，反应性基团选自但不限于硫醇、马来酰亚胺、二溴马来酰亚胺、卤代乙酰胺、叠氮化物、炔烃、环辛烯、三芳基膦、氧杂硼杂二烯、环辛炔、二芳基四嗪、单芳基四嗪、降冰片烯、醛、羟胺、肼、nh
2-nh-c(＝o)-、酮、乙烯基砜、氮丙啶、氨基、氨基酸残基......。在优选的实施方案中，反应性基团选自马来酰亚胺基团、二溴马来酰亚胺基团、硫醇基团、环辛炔基团或叠氮基，更优选马来酰亚胺基团、二溴马来酰亚胺基团或叠氮基。例如，马来酰亚胺或二溴马来酰亚胺基团可分别具有以下结构：
[0026][0027]
例如，叠氮基可以具有以下结构：-n＝n
+
＝n-。
[0028]
如本文所用，术语“连接基团”是指将桥接间隔基连接至抗体或其片段的二价或三价部分。连接基团是通过反应性基团与抗体或其片段上的官能团之间的反应形成的二价或三价部分。在一些实施方案中，用于形成连接基团的反应性基团选自但不限于硫醇、马来酰亚胺、二溴马来酰亚胺、卤代乙酰胺、叠氮化物、炔烃、环辛烯、三芳基膦、氧杂硼杂二烯、环辛炔、二芳基四嗪、单芳基四嗪、降冰片烯、醛、羟胺、肼、nh
2-nh-c(＝o)-、酮、乙烯基砜、氮丙啶、氨基、氨基酸残基......。在优选的实施方案中，用于形成连接基团的反应性基团选自马来酰亚胺基团、二溴马来酰亚胺基团、硫醇基团、环辛炔基团或叠氮基，更优选马来酰
亚胺基团、二溴马来酰亚胺基团或叠氮基。
[0029]
如本文所用，术语“间隔单元前体”或“间隔单元前体z
’”
或“z
’”
是指包含桥接间隔基和反应性基团的组分。
[0030]
如本文所用，术语“间隔单元”或“间隔单元z”或“z”是指包含桥接间隔基和连接基团的组分。
[0031]
如本文所用，术语“缀合物”或“抗体-药物缀合物”或“adc”或“免疫缀合物”是指通过式(i)的对-氨基-苄基接头与药物部分共价连接的抗体。在一个实施方案中，其中间隔单元z通过酰胺基团与抗体ab偶联的式(iii)的抗体-药物缀合物可以通过使抗体ab上的游离胺官能团与包含间隔单元z的前体的活性酯反应来制备。例如，间隔单元前体z'上的羧基可以通过与n-羟基琥珀酰亚胺反应来活化，然后与ab-nh2反应以形成其中ab和z通过酰胺基团偶联的缀合物。用于天然或通过化学操作与间隔单元z连接的抗体上的有用官能团包括但不限于巯基(-sh)、氨基、羟基、碳水化合物的异头羟基和羧基。在一个实施方案中，抗体上的反应性官能团是巯基和氨基。巯基可以通过还原抗体的分子内半胱氨酸二硫键来产生。或者，可以通过使用2-亚氨基四氢噻吩(traut试剂)或另一种巯基产生试剂使抗体的赖氨酸部分的氨基反应来产生巯基。在另一个实施方案中，间隔单元z通过抗体的硫原子和间隔单元z的硫原子之间的二硫键与抗体ab连接。在另一个实施方案中，间隔单元z的反应性基团包含可以与抗体的伯或仲氨基形成键的反应性位点。这些反应性位点的实例包括但不限于活化酯，如琥珀酰亚胺酯、4-硝基苯酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯、酸酐、酰氯、磺酰氯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。在另一个实施方案中，间隔单元z的反应性基团与糖基化抗体的糖(碳水化合物)上的醛、缩醛或缩酮基团反应。例如，可以使用试剂如高碘酸钠温和地氧化碳水化合物，并且可以将氧化的碳水化合物的所得(-cho)单元与包含以下官能团的间隔单元缩合：酰肼、肟、伯胺或仲胺、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯和芳基酰肼，如kaneko等人bioconjugate chem.1991,2,133-141中所述的那些。
[0032]
adc的生成可以通过本领域技术人员已知的技术来完成。在一个示例性实施方案中，本发明提供了式(iii)的adc，其通过使式(ii)的接头-药物化合物与具有反应性巯基、氨基或羧基部分的抗体(或其片段)在合适的条件下接触来制备，以实现反应性部分与式(ii)的接头-药物化合物的间隔单元前体z'部分的缩合，其中z'转化为由所述接触产生的z。
[0033]
在一些实施方案中，式(iii)的adc掺入间隔单元z，其是将a
2-a1基团的n-末端与抗体偶联的二价部分。在一些实施方案中，式(iii)的adc掺入间隔单元z，其是将a
2-a1基团的羰基偶联至抗体的二价部分。
[0034]
间隔单元z与来自抗体的官能团共价结合，所述官能团例如胺(例如来自lys残基的-nh2)、羧基(来自asp或glu残基的-cooh)、或巯基(例如来自cys残基的-sh)，其形成酰胺或硫醚或二硫化物基团。其中间隔单元前体z'与抗体(例如包含cys的肽或还原的抗体)的巯基官能团反应以形成硫醚键的本发明的抗体-药物缀合物包括由下式表示的结构：
[0035][0036]
其中ab为抗体或其抗原结合片段。在其他实施方案中，其中间隔单元前体z'与抗体的两个巯基官能团反应以形成两个硫醚键的本发明的抗体-药物缀合物包括由下式表示的结构：
[0037][0038]
其中ab为抗体或其抗原结合片段。
[0039]
在一些实施方案中，将抗体或抗原结合片段官能化以准备与接头-药物中间体反应的官能团。在一些实施方案中，用细菌转谷氨酰胺酶(btg)制备抗体或抗原结合片段，所述细菌转谷氨酰胺酶(btg)是用包含环辛炔bcn(n-[(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲氧基羰基]-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷)部分的胺进行特异性官能化的反应性谷氨酰胺。在一些实施方案中，本发明的adc包括下式表示的化合物，其中间隔单元前体z’与抗体的谷氨酰胺官能团反应以形成酰胺键：
[0040][0041]
其中ab为抗体或其抗原结合片段。
[0042]
术语“药物载量”由p表示，并且在本文中也称为药物与抗体比率(dar或药物：抗体比率)。药物载量可以在每个抗体或抗原结合片段为1至8个药物部分的范围内。在一些实施方案中，较高的药物载量(例如，p》8)可引起某些抗体-药物缀合物的聚集、不溶、毒性或细胞通透性损失。较高的药物载量也可能不利地影响某些adc的药代动力学(例如清除率)。在一些实施方案中，较低的药物载量(例如，p《2)可降低某些adc针对表达靶标的细胞的效力。在一些实施方案中，p为2至8的整数。在一些实施方案中，p为2，或p为4，或p为8。
[0043]
可以不同方式控制adc的药物载量，例如但不限于通过限制药物-接头中间体或接
头试剂相对于抗体的摩尔过量，或通过限制缀合反应时间或温度。
[0044]
在一些实施方案中，由缀合反应产生的adc混合物中的药物载量范围为每个抗体或抗原结合片段连接1至8个药物部分。每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数(即，平均药物载量或平均p)可以通过本领域已知的任何常规方法计算，例如通过质谱法(例如，液相色谱-质谱法(lc-ms))和/或高效液相色谱(例如，hic-hplc)。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数约为1.5至约2.5，或约7.0至约8。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数约为2。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数为2。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数约为4。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数为4。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数约为8。在一些实施方案中，每个抗体或抗原结合片段的药物部分的平均数为8。
[0045]
发明详述
[0046]
本发明的第一个方面，提供了式(i)的对-氨基-苄基接头化合物：
[0047][0048]
其中：
[0049]
·
r1表示羟基或卤素原子；
[0050]
·
r2表示-s(o)2(oh)基团、-s(o)2(o-m
+
)基团、直链或支链的-(c
1-c4)烷基-s(o)2(oh)基团、直链或支链的-(c
1-c4)烷基-s(o)2(o-m
+
)基团、直链或支链的-卤代(c
1-c4)烷基-s(o)2(oh)基团或直链或支链的-卤代(c
1-c4)烷基-s(o)2(o-m
+
)基团；
[0051]
·
a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团；
[0052]
·
a2表示-c(o)-ch(r4)-nh-基团、基团、基团或基团；
[0053]
·
r3和r4彼此独立地表示氨基酸侧链；
[0054]
·
x表示氢原子、羟基或保护基；
[0055]
·m+
表示药学上可接受的一价阳离子。
[0056]
在一个优选的实施方案中，r1表示羟基、溴原子、氯原子或碘原子。更优选地，r1表
示羟基、氯原子或碘原子。甚至更优选地，r1表示羟基。
[0057]
优选地，r2表示-s(o)2(oh)基团、-s(o)2(o-m
+
)基团、-ch
2-s(o)2(oh)基团、-ch
2-s(o)2(o-m
+
)基团、-ch
2-ch
2-s(o)2(oh)基团、-ch
2-ch
2-s(o)2(o-m
+
)基团、-ch
2-ch
2-ch
2-s(o)2(oh)基团或-ch
2-ch
2-ch
2-s(o)2(o-m
+
)基团。m
+
的实例包括li
+
、na
+
或k
+
。在一个优选的实施方案中，m
+
表示na
+
。
[0058]
在一个具体的实施方案中，a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团，且a2表示-c(o)-ch(r4)-nh-基团，其中r3和r4彼此独立地表示氨基酸侧链。带有侧链的碳可以为d或l(r或s)构型。优选地，带有侧链的碳为l构型。在一个具体实施方案中，r3和r4彼此独立地表示、但不限于氢、甲基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、苯基、苄基、对羟基苄基、-ch2oh、-ch2sh、-ch2seh-ch2ch2oh、-ch2ch2sh、-ch(oh)ch3、-ch2sch3、-ch2ch2sch3、-ch2conh2、-ch2cooh、-ch2ch2conh2,-ch2ch2cooh、-(ch2)3nhc(＝nh)nh2、-(ch2)3nh2、-(ch2)3nhcoch3,-(ch2)3nhcho、-(ch2)4nhc(＝nh)nh2、-(ch2)4nh2、-(ch2)4nhco-(3-甲基-3,4-二氢-2h-吡咯-2-基)、-(ch2)4nhco-(3,4-二氢-2h-吡咯-2-基)、-(ch2)4nhcoch3、-(ch2)4nhcho、-(ch2)3nhconh2、-(ch2)4nhconh2、-ch2ch2ch(oh)ch2nh2、4-咪唑基甲基、3-吲哚甲基、
…
[0059]
在一个优选的实施方案中，a
1-a2基团形成包含2个氨基酸单元的二肽，其中所述氨基酸单元选自天然和非天然氨基酸，优选天然氨基酸。所述氨基酸单元可以是丙氨酸(ala)、半胱氨酸(cys)、天冬氨酸(asp)、谷氨酸(glu)、苯丙氨酸(phe)、甘氨酸(gly)、组氨酸(his)、异亮氨酸(ile)、赖氨酸(lys)、亮氨酸(leu)、甲硫氨酸(met)、天冬酰胺(asn)、脯氨酸(pro)、谷氨酰胺(gln)、精氨酸(arg)、丝氨酸(ser)、苏氨酸(thr)、缬氨酸(val)、色氨酸(trp)、酪氨酸(tyr)、瓜氨酸(cit)、正缬氨酸(nva)、正亮氨酸(nle)、硒代半胱氨酸(sec)、吡咯赖氨酸(pyl)、高丝氨酸、高半胱氨酸和去甲基吡咯赖氨酸。
[0060]
在一个实施方案中，当a1表示脯氨酸(pro)氨基酸单元时，a1由下式定义：
[0061][0062]
其中羰基连接至对-氨基苄基部分的氨基，波浪线表示与a2基团的羰基的共价连接位点。
[0063]
在一个实施方案中，当a2表示脯氨酸(pro)氨基酸单元时，a2由下式定义：
[0064][0065]
其中羰基与a1基团的氨基连接，波浪线表示与本发明定义的x基团、z'基团或z基团的共价连接位点。
[0066]
在一个具体的实施方案中，a
1-a2基团可以表示：val-cit；cit-val；ala-ala；ala-cit；cit-ala；asn-cit；cit-asn；cit-cit；val-glu；glu-val；ser-cit；cit-ser；lys-cit；
cit-lys；asp-cit；cit-asp；ala-val；val-ala；phe-ala；ala-phe；phe-lys；lys-phe；val-lys；lys-val；ala-lys；lys-ala；phe-cit；cit-phe；leu-cit；cit-leu；ile-cit；cit-ile；phe-arg；arg-phe；cit-trp；trp-cit。在一个优选的实施方案中，a
1-a2基团表示cit-val或ala-val。
[0067]
优选地，a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团，其中r3表示-(ch2)
3-nh-co-nh2基团或甲基。
[0068]
有利地，a2表示：-c(o)-ch(r4)-nh-基团，其中r4表示异丙基；基团、基团或基团。
[0069]
在一个优选的实施方案中，a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团，其中r3表示-(ch2)
3-nh-co-nh2基团或甲基，且a2表示-c(o)-ch(r4)-nh-基团，其中r4表示异丙基。
[0070]
在另一个优选的实施方案中，a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团，其中r3表示-(ch2)
3-nh-co-nh2基团，且a2表示：基团或基团。
[0071]
在一个实施方案中，x表示氢原子或保护基。优选地，x表示氢原子、或氨基官能团、羰基官能团或羧基官能团的保护基。更优选地，x表示氢原子或选自fmoc、boc或cbz的保护基。甚至更优选地，x表示fmoc保护基。
[0072]
优选的式(i)的对-氨基-苄基接头化合物为：
[0073]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠；
[0074]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠；
[0075]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸；
[0076]-[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯基]甲磺酸钠；
[0077]-2-(氯甲基)-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸；
[0078]-2-(氯甲基)-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁
酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯磺酸；
[0079]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(碘甲基)苯磺酸；
[0080]-n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n
5-氨基甲酰基-n-[4-(羟甲基)-3-(2-磺酸根合乙基)苯基]-l-鸟氨酰胺钠；
[0081]-n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n
5-氨基甲酰基-n-[4-(羟甲基)-3-(3-磺酸基丙基)苯基]-l-鸟氨酰胺。
[0082]
本发明还涉及制备式(i)的对-氨基-苄基接头化合物的方法，该方法的特征在于使用式(iv)的化合物作为原料：
[0083][0084]
其中r1和r2如式(i)所定义，
[0085]
使其经历还原反应以产生式(v)的化合物：
[0086][0087]
其中r1和r2如上文所定义，
[0088]
式(v)的化合物进一步与式(vi)的化合物偶联：
[0089]
ho-a
1-p(vi)
[0090]
其中p为氨基-保护基，且a1如式(i)中所定义，
[0091]
得到式(vii)的化合物
[0092][0093]
其中a1,p,r1和r2如上文所定义，
[0094]
式(vii)的化合物进一步与式(viii)的化合物偶联：
[0095]
ho-a
2-x(viii)
[0096]
其中x和a2如式(i)中所定义，
[0097]
得到式(i)的对-氨基-苄基接头化合物。
[0098]
制备式(i)的对-氨基-苄基接头化合物的替代方法的特征在于，使用由式(iv)的
化合物获得的式(v)的化合物作为原料，使其与式(ix)的化合物偶联：
[0099]
ho-a
1-a
2-x(ix)
[0100]
其中a1、a2和x如式(i)中所定义，
[0101]
得到式(i)的对-氨基-苄基接头化合物。
[0102]
在一个实施方案中，在上述方法结束时获得的式(i)的对-氨基-苄基接头化合物可以根据常规分离技术进一步纯化，如果需要，其与药学上可接受的酸或碱转化为其加成盐，并且其可以根据常规分离技术分离为其异构体，应当理解，根据合成的需要，在上述方法过程中的任何适宜的时间点，可以保护起始试剂或合成中间体的一些基团(羟基、氨基
……
)，随后脱保护和官能化。式(iv)、(vi)、(viii)和(ix)的化合物可商购获得或可由本领域技术人员使用文献中描述的常规化学反应获得。
[0103]
本发明还涉及式(i)的对-氨基-苄基接头化合物在制备抗体-药物缀合物中的用途。更具体地，本发明涉及式(i)的对-氨基-苄基接头化合物在制备抗体-药物缀合物的用途，所述化合物选自：
[0104]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠，
[0105]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠，
[0106]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸，
[0107]-[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯基]甲磺酸钠，
[0108]-2-(氯甲基)-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸，或
[0109]-2-(氯甲基)-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯磺酸，
[0110]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(碘甲基)苯磺酸，
[0111]-n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n
5-氨基甲酰基-n-[4-(羟甲基)-3-(2-磺酸根合乙基)苯基]-l-鸟氨酰胺钠，或
[0112]-n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n
5-氨基甲酰基-n-[4-(羟甲基)-3-(3-磺酸基丙基)苯基]-l-鸟氨酰胺。
[0113]
在第二个方面，本发明提供了式(ii)的接头-药物化合物：
[0114][0115]
其中：
[0116]
·
d表示药物部分；
[0117]
·
t为价键、-o-c(o)-n(ch3)-ch
2-ch
2-n(ch3)-c(o)-*、-o-*、-nr
5-*,
[0118]-nr
5-c(o)-*或-o-c(o)-*，其中*表示与d的连接点；
[0119]
·
r2表示-s(o)2(oh)基团、-s(o)2(o-m
+
)基团、直链或支链的-(c
1-c4)烷基-s(o)2(oh)基团、直链或支链的-(c
1-c4)烷基-s(o)2(o-m
+
)基团、直链或支链的-卤代(c
1-c4)烷基-s(o)2(oh)基团或直链或支链的-卤代(c
1-c4)烷基-s(o)2(o-m
+
)基团；
[0120]
·
a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团；
[0121]
·
a2表示：-c(o)-ch(r4)-nh-基团、基团、基团或基团。
[0122]
·
r3和r4彼此独立地表示氨基酸侧链；
[0123]
·
r5表示氢原子或(c
1-c4)烷基；
[0124]
·
z’表示间隔单元前体；
[0125]
·m+
表示药学上可接受的一价阳离子。
[0126]
在本发明第二方面的一个实施方案中，d是包含氮原子或氧原子的药物部分，其中d经由药物部分的所述氮原子或氧原子直接连接至t。在一些实施方案中，d为包含季铵化叔胺的药物部分。在一个具体实施方案中，d是单甲基澳瑞他汀e(iupac名称：(s)-n-((3r,4s,5s)-1-((s)-2-((1r,2r)-3-(((1s,2r)-1-羟基-1-苯基丙-2-基)氨基)-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基)吡咯烷-1-基)-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基)-n,3-二甲基-2-((s)-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰氨基)丁酰胺或mmae)、澳瑞他汀e(iupac名称：(2s)-2-[[(2s)-2-(二甲基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-n-[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-n,3-二甲基-丁酰胺)、sn-38(iupac名称:(4s)-4,11-二乙基-4,9-二羟基-1h-吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4h,12h)-二酮)或多柔比星(iupac名称:(1s,3s)-3,5,12-三羟基-3-(羟基乙酰基)-10-甲氧基-6,11-二氧代-1,2,3,4,6,11-六氢-并四苯-1-基3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-l-来苏型-吡喃己糖苷)。
[0127]
优选地，t为价键或-o-c(o)-*，其中*表示与d的连接点。在一些实施方案中，当t为价键时，d为包含季铵化叔胺的药物部分。
[0128]
优选地，在本发明的第二个方面中，r2表示-s(o)2(oh)基团、-s(o)2(o-m
+
)基团、-ch
2-s(o)2(oh)基团、-ch
2-s(o)2(o-m
+
)基团、-ch
2-ch
2-s(o)2(oh)基团、-ch
2-ch
2-s(o)2(o-m
+
)基团、-ch
2-ch
2-ch
2-s(o)2(oh)基团或-ch
2-ch
2-ch
2-s(o)2(o-m
+
)基团。在本发明第二个方面
的一个优选的实施方案中，m
+
表示na
+
。
[0129]
有利地，在本发明的第二个方面中，a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团，其中r3表示-(ch2)
3-nh-co-nh2基团或甲基。
[0130]
在本发明第二个方面的一个优选的实施方案中，a2表示：-c(o)-ch(r4)-nh-基团，其中r4表示异丙基；基团、基团或基团。
[0131]
在本发明第二个方面的另一个优选的实施方案中，a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团，其中r3表示-(ch2)
3-nh-co-nh2基团，且a2表示：基团或基团。
[0132]
在本发明第二个方面的另一个优选的实施方案中，a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团，且a2表示-c(o)-ch(r4)-nh-基团，其中r3和r4彼此独立地表示氨基酸侧链。特别地，当r3和r4表示氨基酸侧链时，带有侧链的碳为l构型。在一个优选的实施方案中，a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团，其中r3表示-(ch2)
3-nh-co-nh2基团或甲基，且a2表示-c(o)-ch(r4)-nh-基团，其中r4表示异丙基。优选地，在本发明的第二个方面中，a
1-a2基团表示cit-val或ala-val。
[0133]
优选地，间隔单元前体z’选自：
[0134][0135]
其中波浪线表示与a2基团的n-末端或羰基的共价连接点。
[0136]
优选的式(ii)的接头-药物化合物选自：
[0137]
[0138][0139]
其中r2和d如上文所定义。
[0140]
更优选的式(ii)的接头-药物化合物选自：
[0141]
[0142][0143]
其中r2和d如上文所定义。
[0144]
在一个优选的实施方案中，式(ii)的接头-药物化合物选自：
[0145]
[0146]
[0147]
[0148][0149]
其中d如上文所定义。
[0150]
在一个具体的实施方案中，优选的式(ii)的接头-药物化合物为：
[0151]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸钠；
[0152]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,
2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸钠；
[0153]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[2-[2-[2-(2-叠氮基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸钠；
[0154]-5-[[(2s)-2-[[1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨基甲酰基]环丁烷羰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸；
[0155]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸钠；
[0156]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸；
[0157]-5-[[(2s)-2-[[3-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨基甲酰基]氧杂环丁烷-3-羰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸；
[0158]-[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯基]甲磺酸；
[0159]-[4-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基-[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁
基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸盐；
[0160]-n-({[4-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基}氨基)-2-磺基苯基]甲氧基}羰基)-n-甲基-l-缬氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s,2r)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺；
[0161]-n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n
5-氨基甲酰基-n-(4-{[({[(4s)-4,11-二乙基-9-羟基-3,14-二氧代-3,4,12,14-四氢-1h-吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-4-基]氧基}羰基)氧基]甲基}-3-磺基苯基)-l-鸟氨酰胺；
[0162]-(1s,3s)-3,5,12-三羟基-3-(羟基乙酰基)-10-甲氧基-6,11-二氧代-1,2,3,4,6,11-六氢-并四苯-1-基2,3,6-三脱氧-3-[({[4-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰基}氨基)-2-磺基苯基]甲氧基}羰基)氨基]-α-l-来苏型-吡喃己糖苷
[0163]-n-{3-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基}-l-缬氨酰基-n-{4-[(5s,8s,11s,12r)-11-[(2s)-丁-2-基]-12-(2-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s,2r)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-5,8-二(丙-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]-3-(2-磺基乙基)苯基}-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺；
[0164]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[6-(3,4-二溴-2,5-二氧代-吡咯-1-基)己酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸。
[0165]
本发明还涉及制备式(ii)的接头-药物化合物的方法，所述方法的特征在于使用式(i)的化合物作为原料：
[0166][0167]
其中r1、r2、a1、a2和x如上文所定义，
[0168]
然后对其修饰，得到式(x)的化合物：
[0169][0170]
其中a1、a2、d、r2、t和x如式(ii)中所定义，
[0171]
在除去保护基x后，进一步使式(x)的化合物与式(xi)的化合物偶联：
[0172]
ho-z’(xi)
[0173]
其中z’如式(ii)中所定义，
[0174]
得到式(ii)的接头-药物化合物。
[0175]
用于制备式(ii)的接头-药物化合物的替代方法的特征在于，使用由式(iv)的化合物以两步获得的式(vii)的化合物作为原料，使其与基团d-t偶联，得到式(xii)的化合物：
[0176][0177]
其中a1、d、p、r2和t如上文所定义，
[0178]
进一步使式(xii)的化合物与式(xiii)的化合物偶联：
[0179]
ho-a
2-z’(xiii)
[0180]
其中z和a2如式(i)中所定义，
[0181]
得到式(ii)的接头-药物化合物。
[0182]
在一个实施方案中，在上述方法结束时获得的式(ii)的接头-药物化合物可以根据常规分离技术进一步纯化，如果需要，其与药学上可接受的酸或碱转化为它们的加成盐，并且其可以根据常规分离技术分离为它们的异构体，应当理解，根据合成的需要，在上述方法的过程中被认为合适的任何时间点，起始试剂或合成中间体的一些基团(羟基、氨基...)可以被保护，随后脱保护和官能化。式(iv)、(xi)和(xiii)的化合物可商购获得或可由本领域技术人员使用文献中描述的常规化学反应获得。
[0183]
本发明还涉及式(ii)的接头-药物化合物在制备抗体-药物缀合物中的用途。
[0184]
在本发明的第三方面，提供了式(iii)的抗体-药物缀合物(adc)：
4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-n,3-二甲基-丁酰胺)、sn-38(iupac名称:(4s)-4,11-二乙基-4,9-二羟基-1h-吡喃并[3',4':6,7]吲嗪并[1,2-b]喹啉-3,14(4h,12h)-二酮)或多柔比星(iupac名称:(1s,3s)-3,5,12-三羟基-3-(羟基乙酰基)-10-甲氧基-6,11-二氧代-1,2,3,4,6,11-六氢-并四苯-1-基3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-l-来苏型-吡喃己糖苷)。
[0200]
优选地，在本发明的第三个方面中，t为价键或-o-c(o)-*，其中*表示与d的连接点。在本发明第三个方面的一些实施方案中，当t为价键时，d为包含季铵化叔胺的药物部分。
[0201]
优选地，在本发明的第三个方面中，r2表示-s(o)2(oh)基团、-s(o)2(o-m
+
)基团、-ch
2-s(o)2(oh)基团、-ch
2-s(o)2(o-m
+
)基团、-ch
2-ch
2-s(o)2(oh)基团、-ch
2-ch
2-s(o)2(o-m
+
)基团、-ch
2-ch
2-ch
2-s(o)2(oh)基团或-ch
2-ch
2-ch
2-s(o)2(o-m
+
)基团。在本发明第三个方面的一个优选的实施方案中，m
+
表示na
+
。
[0202]
有利地，在本发明的第三个方面中，a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团，其中r3表示-(ch2)
3-nh-co-nh2基团或甲基。
[0203]
在本发明第三个方面的一个优选的实施方案中，a2表示：-c(o)-ch(r4)-nh-基团，其中r4表示异丙基；基团；基团；或基团。
[0204]
在本发明第三个方面的另一个优选的实施方案中，a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团，其中r3表示-(ch2)
3-nh-co-nh2基团，且a2表示：基团或基团。
[0205]
在本发明第三个方面的另一个优选的实施方案中，a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团，且a2表示-c(o)-ch(r4)-nh-基团，其中r3和r4彼此独立地表示氨基酸侧链。特别地，当r3和r4表示氨基酸侧链时，带有侧链的碳为l构型。在一个优选的实施方案中，a1表示-c(o)-ch(r3)-nh-基团，其中r3表示-(ch2)
3-nh-co-nh2基团或甲基，且a2表示-c(o)-ch(r4)-nh-基团，其中r4表示异丙基。优选地，在本发明的第三个方面中，a
1-a2基团表示cit-val或ala-val。
[0206]
在一个优选的实施方案中，式(iii)的adc由选自如下的式(ii)的接头-药物化合物形成：
[0207]
[0208][0209]
其中r2和d如上文所定义。
[0210]
更优选地，式(iii)的adc由选自如下的式(ii)的接头-药物化合物形成：
[0211]
[0212][0213]
其中r2和d如上文所定义。
[0214]
在一个优选的实施方案中，式(iii)的adc由选自如下的式(ii)的接头-药物化合物形成：
[0215]
[0216]
[0217]
[0218][0219]
其中d如上文所定义。
[0220]
在一个具体的实施方案中，本发明提供了式(iii)的抗体-药物缀合物，其中
[0221][0222]
包含选自如下的式：
[0223]
[0224][0225]
其中波浪线表示与抗体的共价连接点，且r2和d如上文所定义。
[0226]
在一个优选的实施方案中，本发明提供了式(iii)的抗体-药物缀合物，其中
[0227][0228]
包含选自如下的式：
[0229]
[0230][0231]
其中波浪线表示与抗体的共价连接点，且r2和d如上文所定义。
[0232]
在一个优选的实施方案中，本发明提供了式(iii)的抗体-药物缀合物，其中
[0233][0234]
包含选自如下的式：
[0235]
[0236]
[0237]
[0238][0239]
其中波浪线表示与抗体的共价连接点，且d如上文所定义。
[0240]
本发明的adc可用于治疗有需要的哺乳动物(例如患者)的疾病。因此，adc可以在多种环境中用于治疗与adc的抗体所结合的抗原的表达相关的病症，例如癌症。adc可用于将药物递送至靶细胞。不受理论束缚，在一个实施方案中，adc的抗体与细胞表面抗原或受
体结合或缔合，并且在结合后，adc可以通过抗原或受体介导的内吞作用或其他内化机制在所述细胞内摄取(摄入)。抗原可以附着于所述细胞，或者可以是与所述细胞相关的胞外基质蛋白。一旦进入细胞内，通过酶促或非酶促的裂解机制，根据接头系统的组分的不同，药物在细胞内释放。在另一个实施方案中，在所述细胞附近将药物从adc裂解，随后药物透入细胞。
[0241]
本发明提供了药物组合物，其包含本文所述的adc组合物和药学上可接受的载体。药物组合物可以是允许将adc施用于患者以治疗与adc的抗体所结合的抗原的表达相关的病症的任何形式。特别地，本发明涉及药物组合物，其包含至少一种式(iii)的抗体-药物缀合物与一种或多种药学上可接受的赋形剂的组合。例如，药物组合物可以是液体或冻干固体的形式。在本发明的药物组合物中，可以更特别地提及适合于口服、肠胃外、鼻、经皮或跨皮肤、直肠、经舌、眼或呼吸施用的那些。优选的给药途径是肠胃外施用。肠胃外施用包括皮下注射、静脉内、肌内和胸骨内注射或输注技术。在优选的实施方案中，包含adc的药物组合物以液体溶液的形式通过静脉内施用。液体可用于通过注射递送。在用于通过注射施用的组合物中，还可以包括表面活性剂、防腐剂、润湿剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂、稀释剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂、吸收剂和等渗剂中的一种或多种。
[0242]
在另一个方面，本发明涉及上文定义的任何抗体-药物缀合物在制备用于治疗有需要的哺乳动物的药物制剂中的用途。在另一个方面，本发明涉及上文定义的任何抗体-药物缀合物，其用于治疗有需要的哺乳动物。本发明还涉及治疗有需要的哺乳动物的方法，其中该方法包含以治疗有效剂量向哺乳动物施用药物组合物。
[0243]
通过以下实施例进一步示例本发明。这些实施例用于示例目的，并不旨在限制本发明的范围。
[0244]
缩写
[0245]
acn
ꢀꢀꢀꢀ
乙腈(或ch3cn)
[0246]
bbs
ꢀꢀꢀꢀ
硼酸盐缓冲盐水
[0247]
dbco
ꢀꢀꢀ
二苯并环辛炔
[0248]
dea
ꢀꢀꢀꢀ
n,n-二乙胺
[0249]
dcm
ꢀꢀꢀꢀ
二氯甲烷
[0250]
diea
ꢀꢀꢀ
二异丙基乙胺
[0251]
dipea
ꢀꢀ
n,n-二异丙基乙胺
[0252]
dma
ꢀꢀꢀꢀ
二甲基乙酰胺
[0253]
dmap
ꢀꢀꢀ
4-二甲基氨基吡啶
[0254]
dmf
ꢀꢀꢀꢀ
二甲基甲酰胺(或n,n-二甲基甲酰胺)
[0255]
dmso
ꢀꢀꢀ
二甲亚砜
[0256]
edc
ꢀꢀꢀꢀ
n-乙基-n’,n'-二甲基氨基-丙基碳二亚胺
[0257]
edta
ꢀꢀꢀ
乙二胺四乙酸
[0258]
eedq
ꢀꢀꢀ
n-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氢喹啉
[0259]
etoac
ꢀꢀ
乙酸乙酯
[0260]
etoh
ꢀꢀꢀ
乙醇
[0261]
fa
ꢀꢀꢀꢀꢀ
甲酸
[0262]
hatu
ꢀꢀꢀ
1-[双(二甲基氨基)亚甲基]-1h-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶鎓3-氧化物六氟磷酸盐
[0263]
hbtu
ꢀꢀꢀ
[苯并三唑-1-基氧基(二甲基氨基)亚甲基]-二甲基-铵；六氟磷酸盐
[0264]
hoat
ꢀꢀꢀ
1-羟基-7-氮杂苯并三唑
[0265]
hobt
ꢀꢀꢀ
1-羟基-苯并三唑
[0266]
meoh
ꢀꢀꢀ
甲醇
[0267]
mmae
ꢀꢀꢀ
(2s)-n-[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-3-甲基-2-(甲基氨基)丁酰胺
[0268]
nmp
ꢀꢀꢀꢀ
n-甲基-2-吡咯烷酮
[0269]
pbs
ꢀꢀꢀꢀ
磷酸缓冲盐水
[0270]
pd/c
ꢀꢀꢀ
钯/碳
[0271]
rmp
ꢀꢀꢀꢀ
蛋白质a的多点连接
[0272]
r.t.
ꢀꢀꢀ
室温
[0273]
tea
ꢀꢀꢀꢀ
三乙胺
[0274]
tfa
ꢀꢀꢀꢀ
三氟乙酸
[0275]
thf
ꢀꢀꢀꢀ
四氢呋喃
[0276]
tstu
ꢀꢀꢀ
[二甲基氨基-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基-亚甲基]-二甲基-铵；四氟硼酸盐材料和方法/一般方法
[0277]
所有从商业来源获得的试剂均不经进一步纯化而使用。无水溶剂从商业来源获得，无需进一步干燥即可使用。在具有预填充硅胶柱(macherey-nagel chromabond flash)的combiflash rf(teledyne isco)上进行快速色谱。用涂覆有merck type 60f254硅胶的5x10cm板进行薄层色谱。在cem仪中进行微波加热。
[0278]
使用dmso-d6(也书写为dmso-d6或dmso)或cdcl3作为溶剂，在400mhz bruker avance或500mhz avance neo光谱仪上进行1h-nmr测量。1h nmr数据为δ值的形式，以百万分率(ppm)给出，使用溶剂的残留峰(dmso-d6为2.50ppm，cdcl3为7.26ppm)作为内标。分裂模式表示为：s(单峰)、d(双峰)、t(三重峰)、q(四重峰)、m(多重峰)、brs(宽单峰)、dd(双联双峰)、brm(宽多重峰)、td(三联双峰)、dt(双联三重峰)、br dd(宽双联双峰)。
[0279]
在配备atr golden gate装置(specac)的bruker tensor 27上进行ir测量。在ltq orbitrap velospro质谱仪(thermofisher scientific)上进行hrms测量。将样品溶于ch3cn/h2o(2/1：v/v)，浓度范围约为0.01-0.05mg/ml，并以0.1ml/min的流速注射2μl导入源中。
[0280]
esi电离参数如下：3.5kv和350℃转移离子毛细管。使用锁定质量以30000或60000的分辨率以正离子模式获得全部光谱。
[0281]
uplc-ms:
[0282]
带有二极管阵列uv检测器“pda”和“zq检测器2”质量装置和masslinks软件的a-级waters aquity。
[0283]
zq检测器2：ms扫描0.15-6min和100-2372da
[0284]
pda检测器：190-400nm
[0285]
柱：acquitybeh柱c
18
,1.7μm,2.1x50mm
[0286]
在40℃使用的柱，流速为0.6ml/min
[0287]
溶剂a：水+0.02％ tfa,溶剂b:乙腈+0.02％ tfa
[0288]
梯度2％ b-100％ b，5分钟，然后用100％ b洗涤0.3分钟，和0.5分钟，在2％ b中平衡，用于下一次注射(总梯度6分钟)
[0289]
制备型-hplc：
[0290]
interchim puriflash最大值为100巴，最大流速为250ml/min，或interchim puriflash最大值为250巴，最大流速为250ml/min
[0291]
可以同时使用4种溶剂可能性的四元溶剂泵，梯度uv：2个波长用于200至400nm之间的采集
[0292]
采集：8ml或32ml管s
[0293]
柱waters10μm
[0294]
使用3种制备型-hplc方法：
[0295]
1)tfa方法：溶剂：a＝水+0.05％ tfa,b＝乙腈+0.05％ tfa,梯度5-100％ b，15-30cv(柱体积)
[0296]
2)nh4hco3方法：溶剂：a＝水+0.02m nh4hco3，b＝乙腈/水80/20+0.02m nh4hco3,梯度5-100％ b，15-30cv
[0297]
3)中性方法：溶剂：a＝水，b＝乙腈,梯度5-100％ b，15-30cv
[0298]
将包含纯化合物的所有级分合并并直接冷冻干燥，得到化合物，为无定形粉末。
[0299]
制备型sfc纯化：
[0300]
在pic溶液prep200系统上进行制备型手性sfc。将样品以150mg/ml的浓度溶于乙醇。将流动相等度保持在40％乙醇/co2。仪器配备chiralpak ia柱和3ml的环路。将abpr(自动背压调节器)设定在100巴。
[0301]
iupac化学名称使用biovia draw版本18.1生成。net软件或使用acd/name 2018.2.2(文件版本n50e41，build 103230，2018年7月21日)软件。
[0302]
制备例1：1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨基甲酰基]环丁烷甲酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
[0303][0304]
步骤1：1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨基甲酰基]环丁烷甲酸叔丁酯
[0305]
向1-叔丁氧基羰基环丁烷甲酸(58.6mg；0.293mmol)在dcm(5.85ml)中的溶液中依次加入1-[2-(2-氨基乙氧基)乙基]吡咯-2,5-二酮(53.9mg；0.293mmol),edc(84.2mg；0.439mmol)、hobt(59.3mg；0.439mmol)和dipea(204μl；1.17mmol)。将该反应混合物在室温
搅拌18小时，然后浓缩至干，溶于dmf(1ml)。将残余物溶于dmf(1ml)后，将粗产物通过c18反相制备型-hplc，使得反应混合物直接沉积在柱上并且使用tfa方法纯化，得到标题化合物(57.3mg；0.156mmol)。ir(cm-1
):3390,1697/1666.1h nmr(400mhz,dmso-d6)δppm7.5(t,1h),7.02(s,2h),3.55/3.5(2t,4h),3.38(t,2h),3.17(q,2h),2.33(m,4h),1.77(m,2h),1.38(s,9h)。uplc-ms：ms(esi)：m/z[m+na]+＝389.26,[m+h-tbu]+＝311.22
[0306]
步骤2：1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨基甲酰基]环丁烷甲酸
[0307]
向1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨基甲酰基]环丁烷甲酸叔丁酯(7mg；0.0191mmol)在dcm(0.175ml)中的溶液中加入tfa(51.2μl；0.668mmol)。将该反应混合物在室温搅拌3.5小时，然后浓缩至干，得到标题化合物(5.8mg；0.0187mmol)，为无色油状物。将粗产物用于下一步。uplc-ms：ms(esi)：m/z[m+h]+＝311.35,[m+na]+＝333.37
[0308]
步骤3：制备例1
[0309]
向1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨基甲酰基]环丁烷甲酸(8.47mg；0.0273mmol)在dmf(0.560ml)中的溶液中依次加入tstu(9.04mg；0.030mmol)和dipea(9.5μl；0.0540mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2小时，得到制备例1在dmf中的溶液。将粗产物直接用于下一步。uplc-ms：ms(esi)：m/z[m+h]+＝408.43,[m+na]+＝430.38
[0310]
制备例2：3-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]氧杂环丁烷-3-甲酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯
[0311][0312]
步骤1 3-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]氧杂环丁烷-3-甲酸的合成
[0313]
向3-氨基氧杂环丁烷-3-甲酸(115mg；0.982mmol)在dmf(3.45ml)中的溶液中依次加入3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(274.3mg；0.883mmol)和dipea(855μl；4.91mmol)。将该反应混合物在室温搅拌18小时，然后浓缩至干，溶于dmf(1ml)。通过c
18
反相制备型-hplc，经使得反应混合物直接沉积在柱上并且使用tfa方法纯化粗产物，得到标题化合物(16mg；0.0512mmol)。uplc-ms：ms(esi)：m/z[m+h]+＝313.09,[m+na]+＝335.06。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δppm 8.92(s,1h),7.02(s,2h),4.8/4.45(2d,4h),3.57/3.48(2m,6h),2.32(t,2h).ir(cm-1
):3700-2300,1769/1740/1697,692
[0314]
步骤2：制备例2
[0315]
向3-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨基甲酰基]氧杂环丁烷-3-甲酸(5.8mg；0.0187mmol)在dmf(0.380ml)中的溶液中依次加入tstu(6.32mg；0.0210mmol)和dipea(6.7μl；0.0382mmol)。将该反应混合物在室温搅拌2小时，得到制备例2在dmf中的溶液。将粗产物直接用于下一步。uplc-ms：ms(esi)：m/z[m+h]+＝310.29,[m+na]+＝332.27
[0316]
实施例1：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠
[0317][0318]
步骤1：2-(羟甲基)-5-硝基-苯磺酸钠
[0319]
向5-硝基-2-[(e)-2-(4-硝基-2-磺基-苯基)乙烯基]苯磺酸钠(25.0g；52.7mmol；1eq.)在水(336ml)中的溶液中导入臭氧气流1.5小时。反应完成后，用氩气吹扫该混合物30分钟，以便去除过量的臭氧。然后加入碳酸钠(39.1g；368mmol)和碳酸氢钠(3.99g；105mmol)，将橙色溶液在室温搅拌16小时。将该反应混合物浓缩至干，得到标题化合物(39.9g；156mmol)，为棕色固体。1h nmr(dmso)：δ4.99(d,2h,j＝3.6hz),5.36(t,1h,j＝5.6hz),7.83(d,1h,j＝8.4hz),8.21(d,1h,j＝8.4hz),8.45(s,1h)。
[0320]
步骤2：5-氨基-2-(羟甲基)苯磺酸钠
[0321]
2-(羟甲基)-5-硝基-苯磺酸钠(26.9g；105mmol)溶于水(403ml)。然后用氩气吹扫该反应混合物。加入pd/c 10％(2.65g)，然后用氩气，然后用氢气吹扫黑色混悬液。将该反应混合物在室温在氢气气氛中搅拌3.5天。用过滤和用水和甲醇洗涤后，浓缩滤液至干，与甲苯一起共蒸发3次，以便去除剩余的痕量水。通过硅胶柱色谱法纯化，使用乙酸乙酯/甲醇(90/10-70/30)作为洗脱液，得到标题化合物(14.29g；63.46mmol)，为淡黄色固体。1h nmr(dmso)：δ4.52(d,2h,j＝5.2hz),4.95(t,1h,j＝5.2hz),5.04(s,2h),6.42(d,1h,j＝7.6hz),6.93(d,1h,j＝7.6hz),7.03(s,1h)。
[0322]
步骤3：5-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠
[0323]
向fmoc-l-cit-oh(cas no.133174-15-9；882mg；2.22mmol)在dmf(32.5ml)中的溶液中加入5-氨基-2-(羟甲基)苯磺酸钠(500mg；2.22mmol),hbtu(1.01g；2.66mmol)和dipea(917ml；5.55mmol)。将该反应混合物在室温搅拌16小时，然后浓缩至干，与水(2x100ml)共蒸发。通过c
18
柱色谱法、使用中性方法纯化粗产物，得到标题化合物(1.0g；1.40mmol)，为淡红色油状物。1h nmr(dmso)：δ4.30-4.12(m,4h),4.74(d,2h,j＝4.4hz),5.05(t,1h,j＝5.6hz),5.37(s,2h),5.97(t,1h,j＝4.8hz),7.34-7.42(m,4h),7.62-7.90(m,7h),8.15(s,1h),10.05(s,1h)。
[0324]
步骤4:5-[[(2s)-2-氨基-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠
[0325]
向5-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠(11.2g；15.73mmol)在dmf(224ml)中的溶液中加入哌啶(3.1ml；31.47mmol)。将该反应混合物在室温搅拌3小时，然后加入水(400ml)。用乙酸乙酯(2x300ml)和dcm(300ml)萃取水层。将碳酸钠(5.01g；47.1mmol；3eq.)加入到水层中，将该混合物在室温搅拌3小时。冻干该混合物，得到标题化合物(6.01g；15.73mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso)：δ1.55-1.64(m,4h),2.99-3.01(m,2h),3.58(m,1h),4.75(s,2h),5.06(s,1h),5.38(s,2h),5.98(t,1h,j＝5.6hz),7.38(d,1h,j＝8.4hz),7.72(dd,1h,j＝8.4and2.4hz),7.86(d,1h,
j＝2.4hz),10.17(s,1h)。
[0326]
步骤5:实施例1
[0327]
向5-[[(2s)-2-氨基-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠(6.01g；15.73mmol)在dmf(150ml)中的溶液中加入fmoc-l-val-osu(cas no.130878-68-1；6.85g；15.69mmol)。将浅褐色溶液在室温搅拌3小时，然后用饱和碳酸氢钠(100ml)和水(100ml)稀释该反应混合物，浓缩至干。用硅胶纯化残余物，使用乙酸乙酯/甲醇90/10-50/50作为洗脱液，得到标题化合物(4.44g；6.31mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso)：0.85-0.90(m,6h),1.31-1.76(m,4h),1.95-2.06(m,1h),2.91-3.05(m,2h),3.95(t,1h,j＝8.4hz),4.24-4.35(m,3h),4.37-4.45(m,1h),4.76(d,2h,j＝6hz),5.07(t,1h,j＝6.4hz,),5.40(s,2h),6.03(t,1h,j＝5.6hz),7.32-7.46(m,6h),7.67(d,1h,j＝8hz),7.76(t,2h,j＝7.2hz),7.88-7.91(m,3h),8.12(d,1h,j＝7.6hz),10.08(s,1h)。
13
c nmr(dmso)：18.25,19.24,26.70,29.56,30.45,39.50,46.67,53.17,60.01,60.96,65.66,117.85,119.15,120.05,125.36,127.06,127.62,128.09,134.39,136.79,140.67,143.89,145.34,156.08,158.82,170.37,171.16。lcms(2-100乙腈/h2o+0.1％甲酸)：93.85％ tr＝8.4min。正模式：检测值682.15(mh
+
)。负模式：检测值680.17(mh-)
[0328]
实施例2：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸
[0329][0330]
步骤1：5-[[(2s)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠
[0331]
向boc-l-ala-oh(cas no.15761-38-3；588mg；3.11mmol)在dmf(38.6ml)中的溶液中依次加入hatu(1.77g；4.67mmol)、5-氨基-2-(羟甲基)苯磺酸钠(771mg；3.42mmol)和dipea(1.29ml；7.78mmol)。将该反应混合物室温搅拌16小时，然后浓缩至干，与水一起共蒸发，得到粗反应混合物。通过硅胶柱色谱法纯化得到的残余物，使用乙酸乙酯/甲醇95:5-80:20作为洗脱液，得到标题化合物(1.17g；2.95mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso)：δ1.24(s,9h),1.38(m,3h),4.05-1.44(m,1h),4.73(d,2h,j＝4.8hz),5.04(t,1h,j＝5.6hz),6.97-7.02(m,1h),7.33(d,1h,j＝8hz),7.65-7.70(m,1h),7.83(s,1h),9.91(s,1h)。
[0332]
步骤2：5-[[(2s)-2-氨基丙酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸盐酸盐
[0333]
将5-[[(2s)-2-(叔丁氧基羰基氨基)丙酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠(1.17g；2.95mmol；1eq.)混悬于hcl 4n的二噁烷溶液(10ml)。将该混合物在室温搅拌2小时，然后浓缩至干，得到粗混合物(982mg；2.95mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso)：δ1.45(d,3h,j＝5.6hz),3.91-4.0(m,1h),4.76(s,2h),7.41(d,1h,j＝7.6hz),7.66(d,1h,j＝7.6hz),7.85(s,1h),8.17(s,2h),10.44(s,1h)
[0334]
步骤3：实施例2
[0335]
向5-[[(2s)-2-氨基丙酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸盐酸盐(981mg；2.95mmol)在dmf(34.5ml)中的溶液中加入fmoc-l-val-osu(cas no.130878-68-1；1.29g；2.95mmol；
1eq.)和dipea(975μl；5.9mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜，然后浓缩至干，与水共蒸发，得到粗混合物。通过硅胶柱色谱法纯化得到的残余物，使用乙酸乙酯/甲醇95:5-80:20作为洗脱液，得到实施例2(1.28g；2.072mmol)，为无色油状物。1h nmr(dmso)：δ0.80-0.92(m,6h),1.30(d,3h,j＝6.4hz),2.02-2.10(m,1h),4.17-4.31(m,3h),4.37-4.44(m,1h),4.73(d,2h,j＝5.6hz),5.04(t,1h,j＝6.4hz),7.28-7.36(m,3h),7.37-7.47(m,3h),7.66(d,1h,j＝8.4hz),7.71-7.77(m,2h),7.83-7.85(m,1h),7.88(d,2h,j＝7.6hz),8.14(d,1h,j＝6.4hz),9.99(s,1h)。
[0336]
实施例3:[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯基]甲磺酸钠
[0337][0338]
步骤1：(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酸
[0339]
在室温将fmoc-l-val-osu(cas no.130878-68-1；1.59g；3.64mmol；1.0eq.)加入到在1,2-二甲氧基乙烷(9.5ml)、水(9.5ml)和thf(4.7ml)的混合物中的l(+)-瓜氨酸(0.67g；3.82mmol；1.05eq.)和碳酸氢钠(0.32g；3.82mmol；1.05eq.)中。将该反应混合物在室温搅拌16小时，然后真空除去溶剂，用1n盐酸溶液酸化残余物至ph 1。过滤白色混悬液，用水(3x40ml)、乙醚(3x40ml)洗，与乙腈(2x150ml)共蒸发。通过硅胶快速色谱法纯化得到的白色固体，使用(dcm/乙酸(99/1))/甲醇(10/0-7/3)作为洗脱液，然后在乙醚(2x30ml)中研磨。将得到的固体溶于甲醇(50ml)和水(50ml)的混合物，浓缩至干，与乙腈(100ml)共蒸发，干燥，得到标题化合物(0.75g；1.5mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso)：δ0.84-0.88(m,6h),1.34-1.41(m,2h),1.51-1.73(m,2h),1.95-2.04(m,1h),2.91-2.96(m,2h),3.88-3.92(m,1h),4.06-4.11(m,1h),4.19-4.31(m,3h),5.36(s,2h),5.91-5.94(m,1h),7.30-7.34(m,2h),7.39-7.45(m,3h),7.75(t,2h,j＝7.3hz),7.89(d,2h,j＝7.4hz),8.02(brs,1h),12.56(brs,1h)
[0340]
步骤2：(2-甲氧基羰基-5-硝基-苯基)甲磺酸钠
[0341]
向亚硫酸钠(14.39g；114.17mmol)在水(228ml)中的溶液中加入2-(溴甲基)-4-硝基苯甲酸甲酯(10.43g；38.06mmol)在甲醇(37ml)中的混悬液。将该反应混合物在室温搅拌20小时，然后浓缩至干。通过硅胶快速色谱法纯化得到的粗产物，使用乙酸乙酯/甲醇(10/0-6/4)作为洗脱液，得到标题化合物(13.9g；31.07mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso)：δ3.82(s,3h),4.29(s,2h),7.87(d,1h,j＝8.6hz),8.16(dd,1h,j＝2.5and8.6hz),8.25(d,1h,j＝2.5hz)
[0342]
步骤3：[2-(羟甲基)-5-硝基-苯基]甲磺酸钠
[0343]
向(2-甲氧基羰基-5-硝基-苯基)甲磺酸钠(10.1g；22.09mmol)在thf(368ml)中的
混悬液中加入硼氢化锂(0.59g；24.3mmol)。将该反应混合物在室温搅拌16小时，然后再加入硼氢化锂(0.27g；11.04mmol)，将该反应混合物在室温搅拌24小时。用甲醇(50ml)稀释该反应混合物，浓缩至干。通过硅胶快速色谱法纯化粗产物，使用乙酸乙酯/甲醇(10/0-5/5)作为洗脱液，得到标题化合物(5.09g；6.52mmol)，为黄色固体。1h nmr(dmso)：δ3.90(s,2h),4.76(d,2h,j＝5.7hz),5.38(t,1h,j＝5.6hz),7.66(d,1h,j＝8.8hz),8.07-8.09(m,2h)
[0344]
步骤4：[5-氨基-2-(羟甲基)苯基]甲磺酸钠
[0345]
在氩气气氛中向[2-(羟甲基)-5-硝基-苯基]甲磺酸钠(2g；3.57mmol)在甲醇(102ml)中的溶液中加入pd/c 10％(0.56g；0.53mmol)。用氢气吹扫该反应混合物，在室温在氢气压力气氛中搅拌2小时。然后用过滤该反应混合物，用甲醇(3x50ml)洗涤，浓缩至干。通过c
18
快速色谱法、使用乙腈/水(2/98-50/50)纯化得到的粗产物，得到标题化合物(1.98g；3.46mmol)，为灰色固体。1h nmr(dmso)：δ3.72(s,2h),4.3(d,2h,j＝5.9hz),4.89(s,2h),4.96(t,1h,j＝5.9hz),6.38(dd,1h,j＝2.4and8.1hz),6.49(d,1h,j＝2.4hz),6.9(d,1h,j＝8.1hz)
[0346]
步骤5：实施例3
[0347]
向(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酸(543mg；1.09mmol)在干dmf(6ml)中的溶液中加入hatu(600mg；1.58mmol)、碳酸氢钠(102mg；1.22mmol)和[5-氨基-2-(羟甲基)苯基]甲磺酸钠(650mg；1.41mmol)在干dmf(14ml)中的混悬液。将该反应混合物在室温搅拌3小时，然后与二噁烷(200ml)共蒸发。通过硅胶快速色谱法纯化粗产物，使用dcm/甲醇(10/0-5/5)作为洗脱液，随后进行c
18
快速色谱，使用乙腈/水+0.1％甲酸(2/98-50/50)作为洗脱液，冻干后得到实施例3(233mg；0.32mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso):δ0.84-0.89(m,6h),1.32-1.49(m,2h),1.54-1.73(m,2h),1.94-2.04(m,1h),2.89-3.09(m,2h),3.81(s,2h),3.91-3.95(m,1h),4.20-4.33(m,3h),4.41-4.46(m,1h),4.47(s,2h),5.07(brs,1h),5.40(brs,2h),5.98(t,1h,j＝5.7hz),7.21(d,1h,j＝8.2hz),7.31-7.36(m,3h),7.39-7.45(m,3h),7.63(dd,1h,j＝2.2and8.3hz),7.75(t,2h,j＝7.5hz),7.89(d,2h,j＝7.4hz),8.08(d,1h,j＝7.6hz),10.01-10.8(m,1h)。lcms(2-100acn/h2o+0.1％ tfa)：93.75％ tr＝8.1min。负模式检测值694.14(m-h)
[0348]
实施例4：2-(氯甲基)-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸
[0349][0350]
在室温将5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸(实施例1的游离酸；300mg,0.4263mmol)
溶于无水nmp(6ml)。平行地，制备socl2(206μl)在nmp(6ml)中的溶液。向该反应体系中加入900μl所述socl2溶液，分6次，历时75分钟期限。最后一次添加后，将该反应混合物在室温搅拌15分钟。通过使反应混合物直接沉积在oasis柱上，使用tfa方法纯化粗产物，得到标题化合物(138mg；0.1971mmol)，为白色粉末。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δppm 10.15+8.1+7.42+6.0(s+2d+m,4h),7.9(m,3h),7.75(m,3h),7.42+7.31(2m,5h),5.23(s,2h),4.4(m,1h),4.3-4.2(m,3h),3.95(dd,1h),3.0(m,2h),2.0(m,1h),1.7+1.6(2m,2h),1.48+1.37(2m,2h),0.88(2d,6h)。hr-esi+：m/z[m+h]+＝700.2199/700.2202[测定值/理论值]
[0351]
实施例5：2-(氯甲基)-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]苯磺酸
[0352][0353]
向5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠(得自实施例2的磺酸盐；504.1mg,0.816mmol)在nmp(5ml)中的溶液中加入socl2(60μl 0.816mmol)在nmp(500μl)中的溶液，分6次，历时75分钟期限。将该反应混合物在室温搅拌15分钟。通过使反应混合物直接沉积在oasis柱上，使用tfa方法纯化粗产物，得到(337mg)，为白色粉末。ir波长(cm-1
):3600-2400,1688+1648,1599,1518,1022。uplc-ms：ms(esi)m/z[m+h]+＝614.17+616.18(cl)
[0354]
实施例6：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸钠
[0355][0356]
步骤1：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯磺酸钠
[0357]
向实施例1(450mg；0.64mmol)在dmf(6ml)中的溶液中加入diea(1.34ml；7.67mmol)和碳酸双(4-硝基苯基)酯(778mg；2.56mmol)。将该溶液在室温搅拌2小时，加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(390mg；1.28mmol)。1小时后，减压浓缩该溶液，通过硅胶色谱法纯
化残余物(甲醇和乙酸在dcm中的梯度)，得到标题化合物(523mg；0.45mmol)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δppm 10.2/8.1/5.95(m,3h),8.3(d,2h),7.95(s,1h),7.9(d,2h),7.75(dd,1h),7.75(m,2h),7.65(d,2h),7.4(d,4h),7.35(d,1h),5.7(s,2h),5.35(brs,2h),4.4(m,1h),4.3(t,1h),4.2(d,2h),3.95(m,1h),3(m,2h),2(m,1h),1.8-1.3(m,4h),0.85(2d,6h)
[0358]
步骤2：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸三氟乙酸盐
[0359]
向mmae(200mg；0.28mmol)在dmf(5.6ml)中的溶液中加入diea(0.19ml；1.39mmol)，随后加入5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯磺酸钠(472mg；0.55mmol)和hobt(75mg；0.56mmol)。将该溶液在室温搅拌3.5小时，然后加入dea(0.19ml；1.39mmol)。2小时后，减压浓缩该溶液，通过反相制备型-hplc，使用tfa方法纯化残余物，得到标题化合物(99mg；0.08mmol)。1h nmr(400mhz,dmso-d6)δppm 10.2/10(2s,1h),8.56/8.35(2m,1h),8.1(d,1h),7.9(brs,1h),7.88/7.6(2d,1h),7.68(brs,1h),7.35-7.13(m,5h),7.3(brs,1h),6/5.96(2t,1h),5.5(m,2h),5.4(brs,2h),4.8-4.15(m,5h),4.05-3.85(m,2h),3.8-3.6(5s,9h),3.62-3.5(m,2h),3.1-2.8(m,5h),3(brs,3h),2.4/2.3(d+dd,2h),2.2-1.9(m,3h),1.9-1.75(m,11h),1.05/1(2d,9h),1-0.75(m,21h)
[0360]
步骤3:实施例6
[0361]
向5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸tfa盐(22mg；0.018mmol)在dmf(0.18ml)中的溶液中加入diea(6.3μl ml；36μmmol)和1-[2-[3-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-3-氧代丙氧基]乙基]吡咯-2,5-二酮(6.2mg；20μmol)。将该溶液在室温搅拌4.5小时。通过c
18
反相制备型-hplc，使用nh4hco3方法纯化该反应体系，得到实施例6(9.6mg；6.8μmol)。hrms(esi)[m+h]
+
测定值＝1420.7041(δ＝-0.3ppm)
[0362]
实施例7：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸钠
苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸tfa盐(30mg；0.025mmol)在dmf(0.15ml)中的溶液。将该溶液在室温搅拌2小时。通过c
18
反相制备型-hplc，使用nh4hco3方法纯化该反应体系，得到实施例8(16mg；11.10μmol)。hrms(esi)[m+h]
+
测定值＝1440.7382(δ＝-2.6ppm)
[0368]
实施例9：5-[[(2s)-2-[[1-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨基甲酰基]环丁烷羰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸
[0369][0370]
步骤1：5-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯磺酸钠
[0371]
向5-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸钠(261mg；0.448mmol)在dmf(5.75ml)中的溶液中依次加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(1.09g；3.58mmol)和dipea(1.87ml；10.75mmol)。将该反应混合物在室温搅拌16小时，然后浓缩至干，得到粗混合物。通过硅胶色谱法纯化粗产物(包含2％ acoh的dcm溶液的甲醇梯度)，得到标题化合物(137mg；0.183mmol)，为白色固体。uplc-ms：ms(esi)：m/z[m+h]+＝748.48
[0372]
步骤2：5-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸钠
[0373]
向5-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯磺酸(64.5mg；0.0863mmol)在dmf(1.42ml)中的溶液中依次加入mmae(61.9mg；0.0863mmol)、dipea(75.1μl；0.431mmol)和hobt(23.3mg；0.173mmol)。将该反应混合物在室温搅拌16小时。通过c
18
反相制备型-hplc，经使反应混合物直接沉积在
柱上，使用tfa方法纯化粗产物，得到标题化合物(33.5mg；0.0253mmol)。uplc-ms：ms(esi)：m/z[m+h]+＝1326.88,[m+na]+＝1348.09
[0374]
步骤3：5-[[(2s)-2-氨基-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸,tfa盐
[0375]
向5-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸钠(36.8mg；0.0292mmol)在dmf(750μl)中的溶液中加入哌啶(23.1μl；0.234mmol)。将该反应混合物在室温搅拌17小时。通过c
18
反相制备型-hplc，经使反应混合物直接沉积在柱上，使用tfa方法纯化粗产物，得到标题化合物(17mg；0.0139mmol)。uplc-ms：ms(esi)：m/z[m+h]+＝1038.10,[m+na]+＝1059.85
[0376]
步骤4：实施例9
[0377]
向5-[[(2s)-2-氨基-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸tfa盐(24.5mg；0.0215mmol)在dmf(735μl)中的溶液中依次加入制备例1(10.5mg；0.0258mmol)和dipea(19μl；0.108mmol)。将该反应混合物在室温搅拌16小时。通过c
18
反相制备型-hplc，经使反应混合物直接沉积在柱上，使用tfa方法纯化粗产物，得到实施例9(19.3mg；0.0147mmol)，为白色粉末。hr-esi+：m/z[m+h]+＝1396.7040/1396.7074[测定值/理论值]
[0378]
实施例10：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸
[0379][0380]
步骤1：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯磺酸
[0381]
向实施例2(1.28g；2.07mmol)在thf(65ml)中的混悬液中加入吡啶(875μl；10.8mmol)，随后加入氯甲酸4-硝基苯酯(1.09g；5.41mmol)。将该混合物在室温搅拌过夜。然后再加入氯甲酸4-硝基苯酯(1.09g；5.41mmol；2.5eq.)。在室温搅拌5小时后，将该混合物浓缩至干，然后通过c
18
柱色谱法纯化，使用水/乙腈90/10-0/100作为洗脱液，历时30分钟。除去合并管中的乙腈，冻干剩余物质，得到标题化合物(650mg；0.83mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso)：δ0.88(m,6h),1.31(d,3h,j＝4.8hz),1.97-2.03(m,1h),3.92(t,1h,j＝6.8hz),4.23(s,2h),4.24-4.34(m,1h),4.42(t,1h,j＝5.6hz),5.69(s,2h),7.30-7.48(m,6h),7.62(d,2h,j＝8hz),7.72-7.76(m,3h),7.89(d,2h,j＝6.4hz),7.94(s,1h),8.18(d,1h,j＝5.6hz),8.33(d,2h,j＝7.6hz),10.11(s,1h)。
13
c nmr(dmso)：δ18.01,18.26,19.21,30.4,46.66,49.05,59.91,65.67,67.82,117.7,119.1,120.06,122.66,125.37,126.33,127.05,127.62,128.0,138.06,140.67,143.77,143.86,145.1,146.23,151.96,155.47,156.12,171.0,171.15。lcms(2-100acn/h2o+0.05％ tfa)：90.41％tr＝12.7min。正模式检测值578.41。负模式检测值759.17
[0382]
步骤2：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸
[0383]
向5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯磺酸(29.3mg；0.0374mmol)在dmf(1.20ml)中的溶液中依次加入mmae(26.9mg；0.0374mmol)、dipea(32.6μl；0.187mmol)和hobt(10.1mg；0.075mmol)。将该反应混合物在室温搅拌16小时。通过c
18
反相制备型-hplc，经使反应混合物直接沉积在柱上，使用tfa方法纯化粗产物，得到标题化合物(35.4mg；0.0264mmol)。uplc-ms：ms(esi)：m/z[m+h]+＝1340.9
[0384]
步骤3：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸,tfa盐
[0385]
向5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸(50.1mg；0.0374mmol)在dmf(1.5ml)中的溶液中加入哌啶(29.6μl；0.299mmol)。将该反应混合物在室温搅拌1小时。通过c
18
反相制备型-hplc，经使反应混合物直接沉积在柱上，使用tfa方法纯化粗产物，得到标题化合物(23mg；0.0187mmol)，为白色粉末。hr-esi+：m/z[m+h]+＝1117.6235/1117.6218,[m+2h]/2+＝559.3146/559.3148[测定值/理论值]
[0386]
步骤4：实施例10
[0387]
向5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]丙酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸tfa盐(10.4mg；0.00845mmol)在dmf(0.34ml)中的溶液中依次加入3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(2.9mg；0.00929mmol)和dipea(7.36μl；0.0422mmol)。将该反应混合物在室温搅拌16小时。通过c
18
反相制备型-hplc，经使反应混合物直接沉积在柱上，使用tfa方法纯化粗产物，得到实施例10(7.7mg；0.0059mmol)，为白色粉末。hr-esi+：m/z[m+h]+＝1312.6701/1312.6750,[测定值/理论值]
[0388]
实施例11：5-[[(2s)-2-[[3-[2-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]乙基氨基甲酰基]氧杂环丁烷-3-羰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸
[0389][0390]
向5-[[(2s)-2-氨基-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸；2,2,2-三氟乙酸(16mg；0.0131mmol)在dmf(480μl)中的溶液中依次加入制备例2(10.24mg；0.0250mmol)和dipea(11.4μl；0.0657mmol)。将该反应混合物在室温搅拌16小时。通过c
18
反相制备型-hplc，经使反应混合物直接沉积在柱上，使用tfa方法纯化粗产物，得到实施例11(4.4mg；0.0031mmol)，为白色粉末。hr-esi+：m/z[m+2h]2+＝699.8477/699.8472[测定值/理论值]
[0391]
实施例12:[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酰
基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯基]甲磺酸
[0392][0393]
步骤1：[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯基]甲磺酸钠
[0394]
向实施例3(30mg；0.0418mmol)在dmf(0.4ml)中的溶液中加入diea(87μl；70.501mmol)和碳酸双(4-硝基苯基)酯(51mg；0.167mmol)。将该溶液在室温搅拌2小时，再加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(25mg；0.08mmol)。在室温1小时后，减压浓缩该溶液，通过硅胶色谱法纯化残余物(甲醇在dcm中的梯度)，得到标题化合物(25mg；0.030mmol).
[0395]
步骤2：[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯基]甲磺酸
[0396]
向mmae(10mg；0.0139mmol)在dmf(0.6ml)中的溶液中加入diea(12μl；0.0696mmol)，随后加入[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯基]甲磺酸钠(24mg；0.028mmol)和hobt(3.77mg；0.0279mmol)。将该溶液在室温搅拌3.5小时，通过c
18
反相制备型-hplc，使用tfa方法纯化该溶液，得到标题化合物(5.4mg；0.003mmol)。hrms(esi)[m+h]+测定值＝1439.7558(δ＝1.9ppm)
[0397]
步骤3：[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯基]甲磺酸,tfa盐
[0398]
将[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯基]甲磺酸(5mg；3.4μmol)溶于
[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-二甲基-铵；碘化物
[0407]
向(2s)-2-[[(2s)-2-(二甲基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-n-[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-n,3-二甲基-丁酰胺(澳瑞他汀e)(42.1mg；57.5μmol)在dmf(10ml)中的溶液中依次加入实施例13(152mg；95.8μmol)和dipea(83.4μl；365μmol)。将该反应体系在室温搅拌17小时。通过uplc-ms测定期望的产物，将该溶液不经后处理用于下一步。uplc-ms：[m+h]+1396.31；[m+na]+1418.37
[0408]
步骤2：[4-[[(2s)-2-[[(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基-[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-二甲基-铵；2,2,2-三氟乙酸盐；2,2,2-三氟乙酸
[0409]
向[4-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基-[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-二甲基-铵；碘化物在dmf中的溶液中加入哌啶(45.4μl；460μmol)，将该反应体系在室温搅拌1小时。通过c18反相制备型-hplc，经使反应混合物直接沉积在柱上，使用tfa方法纯化粗产物，得到期望的产物(15mg；10.7μmol)，为白色固体。uplc-ms：[m+h]+1174.51；[m+na]+1197.03
[0410]
步骤3：实施例14
[0411]
向[4-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-磺基-苯基]甲基-[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-二甲基-铵；碘化物(15mg；10.7μmol)在dmf(450μl)中的溶液中依次加入丙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)-3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]酯(3.7mg；11.8μmol)和dipea(9.3μl；53.5μmol)。将该溶液在室温搅拌1小时。通过c18反相制备型-hplc，经使反应混合物直接沉积在柱上，使用tfa方法纯化粗产物，得到实施例14(15.7mg；12.1μmol)，为白色固体。hrms(esi)[m-cf3co2]+1368.7460(δ＝-1.7ppm)
[0412]
实施例23：n-({[4-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-l-丙氨酰基}氨基)-2-磺基苯基]甲氧基}羰基)-n-甲基-l-缬氨酰基-n-[(3r,4s,5s)-1-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s,2r)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-3-甲氧基-5-甲基-1-氧代庚-4-基]-n-甲基-l-缬氨酰胺
丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸
[0420]
向来自上述步骤的化合物的溶液(8ml)中加入diea(102μl；0.5866mmol)和6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(99.4mg；0.3226mmol)。将该反应体系在室温搅拌18小时。通过使用柱的c
18
反相制备型-hplc，使用tfa方法纯化该反应体系，冻干后得到预期的化合物。ir(cm-1
)：3674-2999,1768(弱)+1699+1641,1238/1141,825和694。rmn 1
h(400mhz,dmso-d6)δppm 9.97(s,1h),8.04(d,1h),7.85(d,1h),7.77(d,1h),7.65(dd,1h),7.32(d,1h),6.99(s,2h),6.02(m,1h),5.18(m,1h),4.72(s,2h),4.36(m,1h),4.21(dd,1h),3.37(t,2h),2.98(m,2h),2.16(m,2h),1.97(m,1h),1.65(m,2h),1.39(m,8h),0.83(dd,6h)。hrms(esi)[m+h]+测定值＝653.2572(δ＝-4.2ppm)
[0421]
步骤3：[(19s)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二氧代-17-氧杂-3,13-二酮氮杂五环[11.8.0.02,11.04,9.015,20]二十一碳-1(21),2,4(9),5,7,10,15(20)-庚-7-基]碳酸叔丁酯
[0422]
向(19s)-10,19-二乙基-7,19-二羟基-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.02,11.04,9.015,20]二十一碳-1(21),2,4(9),5,7,10,15(20)-庚-14,18-二酮(220mg；0.5607mmol)在dcm(22ml)中的混悬液中加入作为粉末的碳酸叔丁氧基羰基叔丁酯(128.5mg；0.5887mmol)和哌啶(91μl；1.121mmol)。将黄色混悬液在室温搅拌18小时。真空蒸发出溶剂和过量的吡啶，通过硅胶色谱法纯化粗产物(dcm/meoh)，得到预期的化合物，为黄色粉末。ir(cm-1
)：3700-3000,1753,1659,1254/1142。rmn 1
h(400mhz,dmso-d6)δppm 8.21(d,1h),8.09(d,1h),7.74(dd,1h),7.33(s,1h),6.5(s,1h),5.38(2s,4h),3.2(q,2h),1.86(m,2h),1.54(s,9h),1.3(t,3h),0.88(t,3h)
[0423]
步骤4：[(19s)-19-氯羰基氧基-10,19-二乙基-14,18-二氧代-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.02,11.04,9.015,20]二十一碳-1(21),2,4(9),5,7,10,15(20)-庚-7-基]碳酸叔丁酯
[0424]
向[(19s)-10,19-二乙基-19-羟基-14,18-二氧代-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.02,11.04,9.015,20]二十一碳-1(21),2,4(9),5,7,10,15(20)-庚-7-基]碳酸叔丁酯(30mg；0.0609mmol)在dcm(2ml)中的溶液中加入dmap(22.3mg；0.1827mmol)，随后加入三光气(7.2mg；0.0244mmol)。将该反应体系在室温搅拌30分钟，将该溶液照此用于下一步。
[0425]
步骤5：2-[[(19s)-7-叔丁氧基羰基氧基-10,19-二乙基-14,18-二氧代-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.02,11.04,9.015,20]二十一碳-1(21),2,4(9),5,7,10,15(20)-庚-19-基]氧基羰基氧基甲基]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸
[0426]
向[(19s)-19-氯羰基氧基-10,19-二乙基-14,18-二氧代-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.02,11.04,9.015,20]二十一碳-1(21),2,4(9),5,7,10,15(20)-庚-7-基]碳酸叔丁酯在dcm(2ml)中的溶液中加入dmap(22.3mg；0.1827mmol)，随后加入5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-(羟甲基)苯磺酸(31.80mg；0.04873mmol；根据上述步骤2得到)。将该反应体系在室温搅拌14小时。通过使用柱的c
18
反相制备型-hplc纯化该反应体系，使用tfa方法纯化该反应体系，冻干后得到预期的化合物。
[0427]
步骤6：实施例24
[0428]
向2-[[(19s)-7-叔丁氧基羰基氧基-10,19-二乙基-14,18-二氧代-17-氧杂-3,13-二氮杂五环[11.8.0.02,11.04,9.015,20]二十一碳-1(21),2,4(9),5,7,10,15(20)-庚-19-基]氧基羰基氧基甲基]-5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]苯磺酸(12.5mg；1.66μmol)在dcm(2.5ml)中的溶液中加入tfa(0.3ml)，将该溶液在室温搅拌1.5小时。通过使用柱的c
18
反相制备型-hplc，使用tfa方法纯化该反应体系，冻干后得到实施例24。hrms(esi)[m+h]+测定值＝1071.3768(δ＝0.4ppm)
[0429]
实施例25：(1s,3s)-3,5,12-三羟基-3-(羟基乙酰基)-10-甲氧基-6,11-二氧代-1,2,3,4,6,11-六氢-并四苯-1-基2,3,6-三脱氧-3-[({[4-({n-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)己酰基]-l-缬氨酰基-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰基}氨基)-2-磺基苯基]甲氧基}羰基)氨基]-α-l-来苏型-吡喃己糖苷
[0430][0431]
步骤1：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[(2s,3s,4s,6r)-3-羟基-2-甲基-6-[[(1s,3s)-3,5,12-三羟基-3-(2-羟基乙酰基)-10-甲氧基-6,11-二氧代-2,4-二氢-1h-并四苯-1-基]氧基]四氢吡喃-4-基]氨基甲酰基氧基甲基]苯磺酸
[0432]
向5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯磺酸钠(157mg；0.1854mmol；得自实施例6的步骤1)在dmf(11ml)中的溶液中加入(7s,9s)-7-[(2r,4s,5s,6s)-4-氨基-5-羟基-6-甲基-四氢吡喃-2-基]氧基-6,9,11-三羟基-9-(2-羟基乙酰基)-4-甲氧基-8,10-二氢-7h-并四苯-5,12-二酮(107.5mg；0.1853mmol)，随后加入diea(323μl；1.854mmol)。红色混合物变成深紫色，2小时转化后完成。将该溶液照此用于下一步。
[0433]
步骤2：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[(2s,3s,4s,6r)-3-羟基-2-甲基-6-[[(1s,3s)-3,5,12-三羟基-3-(2-羟基乙酰基)-10-甲氧基-6,11-二氧代-2,4-二氢-1h-并四苯-1-基]氧基]四氢吡喃-4-基]氨基甲酰基氧基甲基]苯磺酸
[0434]
向如上述步骤中制备的5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[(2s,3s,4s,6r)-3-羟基-2-甲基-6-[[(1s,3s)-3,5,12-三羟基-3-(2-羟基乙酰基)-10-甲氧基-6,11-二氧代-2,4-二氢-1h-并四苯-1-基]氧基]四氢吡喃-4-基]氨基甲酰基氧基甲基]苯磺酸中加入dea(96μl；0.9268mmol)。将该反应体系在室温搅拌1小时。部分蒸发出溶剂，通过使用柱的c
18
反相制备型-hplc，使用tfa方法纯化粗产物，冻干后得到预期的化合物。ir(cm-1
)：3357,
2661,1666/1608,1585/1531,1201,1082,1020,763/709。rmn 1
h(500mhz,dmso-d6)δppm 14.06(s,1h),13.29(s,1h),10.15(s,1h),8.62(d,1h),8.04(m,3h),7.93(d,1h),7.93(t,1h),7.89(d,1h),7.66(dd,1h),7.61(dd,1h),7.26(d,1h),6.88(d,1h),5.99(t,1h),5.49(brs,1h),5.37(m,2h),5.25(brs,1h),4.97(t,1h),4.79(brm,2h),4.58(s,2h),4.46(q,1h),4.18(q,1h),3.99(s,3h),3.75(m,1h),3.63(m,1h),3.51(brs,1h),2.99(m,2h),2.99(m,2h),2.16(m,2h),2.07(m,1h),1.87(td,1h),1.72(m,1h),1.61(m,1h),1.5(dt,1h),1.45(m,1h),1.37(m,1h),1.14(d,3h),0.93(2d,6h)
[0435]
步骤3：实施例25
[0436]
向5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[(2s,3s,4s,6r)-3-羟基-2-甲基-6-[[(1s,3s)-3,5,12-三羟基-3-(2-羟基乙酰基)-10-甲氧基-6,11-二氧代-2,4-二氢-1h-并四苯-1-基]氧基]四氢吡喃-4-基]氨基甲酰基氧基甲基]苯磺酸(5mg；4.7μmol)在dmf(1ml)中的溶液中加入diea(1.6μl；5.2μmmol)和6-(2,5-二氧代吡咯-1-基)己酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(1.6mg；5.2μmol)。将该溶液在室温搅拌12小时。通过使用柱的c
18
反相制备型-hplc，使用tfa方法纯化该反应体系，得到实施例25.hrms(esi)[m+h]+测定值＝1222.4153(δ＝1.7ppm)
[0437]
实施例26：n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n
5-氨基甲酰基-n-[4-(羟甲基)-3-(2-磺酸根合乙基)苯基]-l-鸟氨酰胺钠
[0438][0439]
步骤1：(2-烯丙基-4-硝基-苯基)甲氧基-叔丁基-二甲基-硅烷
[0440]
用氩气吹扫叔丁基-[(2-碘-4-硝基-苯基)甲氧基]-二甲基-硅烷(6.56g；16.68mmol)和烯丙基三丁基锡(7.76ml；25.02mmol)在1,4-二噁烷(165ml)中的溶液(3次)。加入四(三苯膦)钯(0)(1.93g；1.67mmol)，并用氩气再次吹扫该混合物(3次)，在100℃搅拌18小时。用过滤该反应混合物，浓缩至干。将残余物溶于dcm(150ml)，用1m氢氧化钠水溶液洗涤。用dcm萃取水层，用盐水洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶快速色谱法纯化得到的粗产物，使用环己烷/etoac(10/0-95/5)作为洗脱液，得到预期的化合物(4.91g；15.97mmol)，为橙色油状物。1h nmr(dmso)：δ0.11(s,6h),0.92(s,9h),3.49(d,2h,j＝6.5hz),4.84(s,2h),5.04-5.15(m,2h),5.92-6.02(m,1h),7.69(d,1h,j＝8.5hz),8.02(d,1h,j＝2.5hz),8.13(dd,1h,j＝2.5和8.5hz)
[0441]
步骤2：3-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]丙-1,2-二醇
[0442]
向(2-烯丙基-4-硝基-苯基)甲氧基-叔丁基-二甲基-硅烷(4.91g；15.97mmol)在
丙酮(147ml)和水(20ml)的混合物中的溶液中加入4-甲基吗啉n-氧化物(3.74g；31.94mmol)和锇酸钾(vi)二水合物(0.29g；0.8mmol)，将该混合物在室温搅拌20小时。用硫代硫酸钠饱和水溶液(40ml)和水(40ml)使该反应混合物淬灭，用etoac萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶快速色谱法纯化得到的粗产物，使用环己烷/etoac(10/0-5/5)作为洗脱液，得到预期的化合物(4.65g；13.62mmol)，为黄色油状物。1h nmr(dmso)：δ0.11(s,6h),0.93(s,9h),2.58(dd,1h,j＝8.8和14.2hz),2.9(dd,1h,j＝3.5和14.2hz),3.26-3.30(m,1h),3.36-3.41(m,1h),3.61-3.68(m,1h),4.7(t,1h,j＝5.7hz),4.75(d,1h,j＝5.4hz),4.84-4.93(m,2h),7.65-7.67(m,1h),8.08-8.11(m,2h)
[0443]
步骤3：2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]乙醛
[0444]
在0℃向3-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]丙-1,2-二醇(3.05g；8.22mmol)在水(18ml)和thf(51ml)的混合物中的溶液中逐步加入高碘酸钠(5.27g；24.65mmol)。将该反应混合物从0℃搅拌至10℃ 2小时，然后用硫代硫酸钠饱和水溶液(50ml)和水(50ml)淬灭。用etoac萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤，在30℃浓缩至干，得到预期的化合物(2.61g；8.22mmol)，为黄色油状物，照此用于下一步。1hnmr(dmso)：δ0.08(s,6h),0.90(s,9h),4.04(s,2h),4.72(s,2h),7.7(d,1h,j＝8.8hz),8.13(d,1h,j＝2.5hz),8.18(dd,1h,j＝2.4和8.5hz),9.69(s,1h)
[0445]
步骤4：2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]乙醇
[0446]
在0℃向2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]乙醛(2.61g；)在meoh(40ml)中的溶液中加入硼氢化钠(0.47g；12.33mmol)。将该反应混合物温热至室温，搅拌1小时，然后通过添加盐水(25ml)和水(25ml)淬灭。用etoac萃取水层，然后用盐水洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶快速色谱法，使用环己烷/etoac(10/0-6/4)纯化得到的粗产物，得到预期的化合物(1.36g；4.36mmol)，为黄色固体。1h nmr(dmso)：δ0.11(s,6h),0.92(s,9h),2.82(t,2h,j＝6.4hz),3.67(q,2h,j＝5.9hz),4.74(t,1h,j＝5.1hz),4.87(d,2h),7.66(d,1h,j＝8.6hz),8.08-8.11(m,2h)
[0447]
步骤5：[2-(2-溴乙基)-4-硝基-苯基]甲氧基-叔丁基-二甲基-硅烷
[0448]
在0℃向2-[2-[[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基甲基]-5-硝基-苯基]乙醇(1.26g；4.05mmol)在thf(25ml)中的溶液中加入tea(1.12ml；8.09mmol)和甲磺酰氯(0.47ml；6.07mmol)。将该反应混合物缓慢地温热至室温，搅拌5小时，然后过滤，用thf冲洗。在0℃将滤液加入到在thf(25ml)中的溴化锂(1.76g；20.23mmol)中。将该反应混合物缓慢地温热至室温，搅拌4天，然后用氯化铵饱和水溶液(50ml)淬灭。用etoac萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，得到预期的化合物(1.38g；4.03mmol)，为黄色油状物，照此用于下一步。1h nmr(dmso)：δ0.12(s,6h),0.92(s,9h),3.27(t,2h,j＝7.2hz),3.81(t,2h,j＝7.2hz),4.87(s,2h),7.68(d,1h,j＝8.4hz),8.13-8.16(m,1h),8.18-8.19(m,1h)
[0449]
步骤6：[2-(2-溴乙基)-4-硝基-苯基]甲醇
[0450]
在0℃向[2-(2-溴乙基)-4-硝基-苯基]甲氧基-叔丁基-二甲基-硅烷(1.38g)在thf(28ml)和水(14ml)中的溶液中加入乙酸(42ml；737.28mmol)。将该反应混合物缓慢地温热至室温，搅拌4天，然后用水(100ml)稀释。用etoac萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶快速色谱法纯化得到的粗产物，使用环己烷/
etoac(10/0-6/4)作为洗脱液，得到预期的化合物(0.73g；2.81mmol)，为浅褐色固体。1h nmr(dmso)：δ3.27(t,2h,j＝7.2hz),3.8(t,2h,j＝7.2hz),4.67(s,2h),5.51(brs,1h),7.7(d,1h,j＝8.4hz),8.11-8.14(m,1h),8.15-8.16(m,1h)
[0451]
步骤7：2-[2-(羟甲基)-5-硝基-苯基]乙基磺酰氧基钠
[0452]
向[2-(2-溴乙基)-4-硝基-苯基]甲醇(188mg；0.72mmol)在etoh(750μl)中的溶液中依次加入亚硫酸钠(273mg；2.17mmol)在水(1.1ml)中的溶液和碘化四丁基铵(13mg；0.036mmol)。将该反应混合物在70℃在微波照射下加热35分钟。用水(20ml)稀释该反应混合物，用etoac洗涤。浓缩水层至干，通过硅胶快速色谱法纯化得到的粗产物，使用dcm/meoh(10/0-6/4)作为洗脱液，然后通过c
18
快速色谱法纯化，使用acn/水(2/98-34/66)作为洗脱液，得到预期的化合物(80mg；0.28mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso)：δ2.66-2.70(m,2h),2.94-2.98(m,2h),4.64(d,2h,j＝5.3hz),5.47(t,1h,j＝5.3hz),7.68(d,1h,j＝8.5hz),7.99(d,1h,j＝2.3hz),8.06(dd,1h,j＝2.4和8.4hz)
[0453]
步骤8：2-[5-氨基-2-(羟甲基)苯基]乙基磺酰氧基钠
[0454]
在氩气气氛中向[2-(2-溴乙基)-4-硝基-苯基]甲醇(293mg；1.03mmol)在meoh(11ml)和水(2ml)中的溶液中加入pd/c 10％(55mg；0.052mmol)。用氢气吹扫该反应体系，在室温在氢气压力气氛中搅拌16小时。用40μm ptfe滤器过滤该反应混合物，用meoh/水(1/1)的混合物冲洗，浓缩至干，得到预期的化合物(274mg；1.03mmol)，为黄色固体，照此用于下一步。1h nmr(dmso)：δ2.55-2.59(m,2h),2.75-2.79(m,2h),4.32(d,2h,j＝5.3hz),5.66(t,1h,j＝5.2hz),4.86(brs,2h),6.33-6.35(m,2h),6.93(d,1h,j＝7.8hz)
[0455]
步骤9：实施例26
[0456]
向2-[5-氨基-2-(羟甲基)苯基]乙基磺酰氧基钠(304mg；1.15mmol)在dmf(6ml)中的溶液中加入(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酸(474mg；0.96mmol)、hatu(472mg；1.24mmol)和碳酸氢钠(160mg；1.91mmol)。将该反应混合物在室温搅拌20小时，用水(50ml)稀释，用etoac洗涤。浓缩水层至干，通过使用c
18
的快速色谱法纯化，使用acn/水+tfa(0.1％)(2/98-50/50)作为洗脱液，冻干后得到实施例26(83mg；0.11mmol)，为淡黄色固体。1h nmr(dmso)：δ0.84-0.88(m,6h),1.32-1.49(m,2h),1.54-1.74(m,2h),1.94-2.04(m,1h),2.58-2.62(m,2h),2.83-2.87(m,2h),2.90-3.05(m,2h),3.93(t,1h,j＝8hz),4.23-4.34(m,3h),4.37-4.43(m,1h),4.45(s,2h),5.34(brs,2h),5.98(brs,1h),7.25(d,1h,j＝8.1hz),7.30-7.34(m,2h),7.39-7.44(m,4h),7.74(t,2h,j＝7.2hz),7.89(d,2h,j＝7.5hz),8.08(d,1h,j＝7.5hz),9.90(s,1h)。lcms(2-100acn/h2o+0.1％ tfa)：76.60％ tr＝8.1min。负模式检测值708.45(m-h)
[0457]
实施例27：n-{3-[2-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1h-吡咯-1-基)乙氧基]丙酰基}-l-缬氨酰基-n-{4-[(5s,8s,11s,12r)-11-[(2s)-丁-2-基]-12-(2-{(2s)-2-[(1r,2r)-3-{[(1s,2r)-1-羟基-1-苯基丙-2-基]氨基}-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代丙基]吡咯烷-1-基}-2-氧代乙基)-4,10-二甲基-3,6,9-三氧代-5,8-二(丙-2-基)-2,13-二氧杂-4,7,10-三氮杂十四烷-1-基]-3-(2-磺乙基)苯基}-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺
[0458][0459]
步骤1：2-[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯基]乙磺酸
[0460]
向实施例26(32mg,0.0436mmol)在dmf(0.5ml)中的溶液中加入碳酸双(4-硝基苯基)酯(53.1mg；0.1747mmol)和diea(91μl；0.5240mmol)。将该溶液在室温搅拌4小时。真空蒸发至干后，通过硅胶色谱法纯化粗产物，得到预期的化合物。
[0461]
步骤2：2-[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯基]乙磺酸
[0462]
向mmae(17mg,0.02368mmol)在dmf(6ml)中的溶液中加入2-[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[(4-硝基苯氧基)羰基氧基甲基]苯基]乙磺酸(41.4mg；0.0473mmol)、diea(20μl；0.1184mmol)和hobt(6.4mg；0.047mmol)。将该反应体系在室温搅拌过夜，将该溶液照此用于下一步。
[0463]
步骤3：2-[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯基]乙磺酸,tfa
[0464]
向2-[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-(9h-芴-9-基甲氧基羰基氨基)-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯基]乙磺酸的溶液中加入dea(24μl；0.2338mmol)，将该溶液在室温搅拌1.5小时。通过使用柱的c
18
反相制备型-hplc，使用tfa方法纯化该反应体系，冻干后得到预期的化合物。
[0465]
步骤4：实施例27
[0466]
向2-[5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯基]乙磺酸,tfa(9.5mg；7.1mmol)在dmf(0.2ml)中
的溶液中加入diea(2.5μl；0.014mmol)，随后加入3-[2-(2,5-二氧代吡咯-1-基)乙氧基]丙酸(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)酯(2.4mg；7.8μmol)。将该反应体系在室温搅拌过夜。通过使用柱的c
18
反相制备型-hplc，使用tfa方法纯化该反应体系，冻干后得到实施例27。hrms(esi)[m+h]
+
测定值＝1426.7443(δ＝-6.7ppm)
[0467]
实施例28：5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[6-(3,4-二溴-2,5-二氧代-吡咯-1-基)己酰基氨基]-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸
[0468][0469]
向6-(3,4-二溴-2,5-二氧代-吡咯-1-基)己酸在dmf(0.2ml)中的溶液中加入作为粉末的hatu(11.3mg；29.8μmol)。将该反应体系在室温搅拌10分钟，加入卢剔淀(6.3μl；54.2mmol)。将该反应体系在室温搅拌2小时。然后加入5-[[(2s)-2-[[(2s)-2-氨基-3-甲基-丁酰基]氨基]-5-脲基-戊酰基]氨基]-2-[[[(1s)-1-[[(1s)-1-[[(1s,2r)-4-[(2s)-2-[(1r,2r)-3-[[(1r,2s)-2-羟基-1-甲基-2-苯基-乙基]氨基]-1-甲氧基-2-甲基-3-氧代-丙基]吡咯烷-1-基]-2-甲氧基-1-[(1s)-1-甲基丙基]-4-氧代-丁基]-甲基-氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]氨基甲酰基]-2-甲基-丙基]-甲基氨基甲酰基]氧基甲基]苯磺酸(10mg；8.3μmol；得自实施例6的步骤2)，将该反应体系在室温搅拌15小时。通过使用柱的c
18
反相制备型-hplc，使用tfa方法纯化该反应体系，冻干后得到预期的化合物。hrms(esi)[m+h]
+
测定值＝1552.5595(δ＝-2.5ppm)
[0470]
实施例34：n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n
5-氨基甲酰基-n-[4-(羟甲基)-3-(3-磺酸基丙基)苯基]-l-鸟氨酰胺
[0471][0472]
步骤1：2-碘-4-硝基苯甲酸
[0473]
向2-氨基-4-硝基苯甲酸(10.0g；54.9mmol)在acn(280ml)中的溶液中加入对甲苯磺酸一水合物(32.0g；168mmol)。将该混合物在室温搅拌15分钟，然后滴加亚硝酸钠(8.00g；115.9mmol)和碘化钾(24.0g；144.6mmol)在水(140ml)中的溶液，历时15分钟。将该反应混合物搅拌19小时。反应完成后，用硫代硫酸钠(13.02g；82.36mmol)使该混合物淬灭，用氯化氢水溶液3n(25ml)酸化。用dcm萃取水层，用1n氯化氢水溶液洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，得到标题化合物(15.0g；51.2mmol)，为橙色粉末。1h nmr(dmso)：7.86(d,1h,j＝8.4hz),8.27(d,1h,j＝8.4hz),8.64(s,1h),13.8(brs,1h)
[0474]
步骤2：(2-碘-4-硝基苯基)甲醇
[0475]
向2-碘-4-硝基苯甲酸(5.00g；17.1mmol)在thf(70ml)中的溶液中加入硼烷的1n的thf溶液(85ml；85.0mmol)。将该反应混合物在65℃搅拌4小时。反应完成后，将该反应混合物冷却至室温，用meoh(200ml)淬灭。将该混合物在室温搅拌30分钟，然后浓缩至干。通过硅胶柱色谱法纯化得到的残余物，使用环己烷/etoac(80/20-50/50)作为洗脱液，得到标题化合物(3.38g；12.1mmol)，为黄色固体。1h nmr(dmso)：δ4.47(d,2h,j＝5.2hz),5.82(t,1h,j＝5.2hz),7.70(d,1h,j＝8.8hz),8.29(dd,1h,j＝8.8和2.0hz),8.54(d,1h,j＝2.0hz)
[0476]
步骤3：(4-氨基-2-碘苯基)甲醇
[0477]
向(2-碘-4-硝基苯基)甲醇(3.70g；13.3mmol)在etoh(100ml)和水(25ml)中的溶液中依次加入铁(3.70g；66.3mmol)和氯化铵(800mg；15.0mmol)。将该反应混合物在80℃搅拌3小时。反应完成后，用过滤该反应混合物，用etoh洗涤，浓缩至干。将得到的残余物溶于etoac，用饱和碳酸氢钠溶液洗涤。用硫酸钠干燥有机层，过滤，浓缩至干，得到标题化合物(2.48g；9.95mmol)，为黄色油状物。1h nmr(dmso)：δ4.28(d,2h,j＝5.2hz),4.97(t,1h,j＝5.2hz),5.16(s,2h),6.57(d,1h,j＝8.4hz),7.02-7.10(m,2h)
[0478]
步骤4：4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-3-碘苯胺
[0479]
向(4-氨基-2-碘苯基)甲醇(3.51g；13.4mmol)在dcm(150ml)中的溶液中加入咪唑(0.95g；14.0mmol)。将该混合物冷却至0℃，然后滴加叔丁基氯二甲基硅烷(2.40ml；13.85mmol)在dcm(150ml)中的溶液，历时15分钟。除去冰浴，将该反应混合物在室温搅拌16小时。反应完成后，用meoh(20ml)使该反应混合物淬灭，浓缩至干。通过硅胶柱色谱法纯化得到的残余物，使用环己烷/etoac(100/0-90/10)作为洗脱液，得到标题化合物(3.64g；10.0mmol)，为黄色油状物。1h nmr(dmso)：δ0.06(s,6h),0.88(s,9h),4.46(s,2h),5.24(s,2h),6.55(d,1h,j＝8.4hz),7.03(d,1h,j＝8.4hz),7.05(s,1h)
[0480]
步骤5：n-[4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-3-碘苯基]-n
5-氨基甲酰基-n
2-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-鸟氨酰胺
[0481]
向4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-3-碘苯胺(10.0g；27.5mmol)在meoh(70ml)和dcm(140ml)中的溶液中依次加入fmoc-cit-oh(12.0g；30.28mmol)和eedq(8.17g；33.0mmol)。将该反应混合物室温搅拌14小时。反应完成后，通过硅胶柱色谱法纯化得到的残余物，使用dcm/meoh(100/0-88/12)作为洗脱液，得到标题化合物(17.09g；22.0mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso)：δ0.09(s,6h),0.91(s,9h),1.38-1.48(m,2h),1.59-1.68(m,2h),2.93-3.05(m,2h),4.06-4.15(m,1h),4.20-4.29(m,3h),4.56(s,2h),5.41(s,2h),5.98(t,1h,j＝5.5hz),7.30-7.43(m,5h),7.55(dd,1h,j＝8.8和2.1hz),7.69
(d,1h,j＝7.8hz),7.74(dd,2h,j＝7.2和3.4hz),7.89(d,2h,j＝7.5hz),8.25(d,1h,j＝1.5hz),10.12(s,1h)
[0482]
步骤6：n-[4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-3-碘苯基]-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺
[0483]
向n-[4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-3-碘苯基]-n
5-氨基甲酰基-n
2-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-鸟氨酰胺(17.1g；23.0mmol)在thf(120ml)中的溶液中加入二甲胺的2m的thf溶液(44.5ml；89.0mmol)。将该反应混合物在室温搅拌15小时。浓缩至干后，通过c
18
柱色谱法纯化得到的残余物，使用水/acn(98/02-0/100)作为洗脱液，得到标题化合物(5.47g；10.5mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso)：δ0.0(s,6h),0.81(s,9h),1.27-1.38(m,3h),1.47-1.53(m,1h),2.83-2.89(m,2h),3.16-3.19(m,1h),4.46(s,2h),5.26(s,2h),5.82(t,1h,j＝5.6hz),7.24(d,1h,j＝8.5hz),7.50(dd,1h,j＝8.3和2.0hz),8.17(d,1h,j＝2.0hz)
[0484]
步骤7：n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n-[4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-3-碘苯基]-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺
[0485]
向n-[4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-3-碘苯基]-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺(3.00g；5.76mmol)在2-甲基四氢呋喃(240ml)中的溶液中依次加入fmoc-val-osu(8.65g；8.65mmol)和dipea(1.90ml；11.5mmol)。将该反应混合物在室温搅拌15小时。通过烧结漏斗过滤该反应混合物，用2-甲基四氢呋喃洗涤回收的固体，然后高度真空干燥，得到标题化合物(3.57g；4.24mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso)：δ0.10(s,6h),0.83-0.95(m,15h),1.27-1.52(m,2h),1.52-1.75(m,2h),1.93-2.07(m,1h),2.88-3.09(m,2h),3.93(t,1h,j＝8.0hz),4.17-4.49(m,4h),4.56(s,2h),5.40(s,2h),5.96(t,1h,j＝5.6hz),7.27-7.37(m,3h),7.37-7.48(m,3h),7.54(d,1h,j＝8.0hz),7.74(t,2h,j＝7.2hz),7.88(d,2h,j＝7.6hz),8.13(d,1h,j＝7.6hz),8.22(s,1h),10.11(s,1h)
[0486]
步骤8：n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n-[4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-3-(3-羟基丙-1-炔-1-基)苯基]-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺
[0487]
向n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n-[4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-3-碘苯基]-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺(4.0g；4.55mmol)和2-丙炔-1-醇(0.54ml；9.10mmol)在干dmf(36ml)中的溶液中加入dipea(2.26ml；13.66mmol；3.0eq.)。用氩气吹扫该反应混合物，然后加入双(三苯膦)钯(ii)二氯化物(0.64g；0.91mmol)和碘化亚铜(i)(0.17g；0.91mmol)。再次用氩气吹扫该反应混合物，在室温搅拌16小时。加入饱和氯化铵溶液(80ml)，用etoac萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶快速色谱法纯化粗产物，使用dcm/meoh(10/0-85/15)作为洗脱液，得到标题产物(2.7g；3.52mmol)，为棕色固体。1h nmr(dmso-d6)：0.08(s,6h),0.85-0.89(m,6h),0.90(s,9h),1.32-1.48(m,2h),1.54-1.74(m,2h),1.94-2.03(m,1h),2.89-3.06(m,2h),3.93(dd,1h,j＝7.0and 9.1hz),4.22-4.33(m,5h),4.36-4.41(m,1h),4.74(s,2h),5.35(t,1h,j＝5.9hz),5.40(s,2h),5.96(t,1h,j＝6.0hz),7.32(t,2h,j＝7.4hz),7.36-7.43(m,4h),7.48(dd,1h,j＝2.3和8.8hz),7.74(t,2h,j＝7.7hz),7.78(s,1h),7.89(d,2h,j＝7.8hz),8.14(d,1h,j＝7.1hz),10.09(s,1h)
[0488]
步骤9：n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n-[4-({[叔丁基(二甲基)
甲硅烷基]氧基}甲基)-3-{3-[(甲磺酰基)氧基]丙-1-炔-1-基}苯基]-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺
[0489]
在0℃向n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n-[4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-3-(3-羟基丙-1-炔-1-基)苯基]-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺(1.0g；1.3mmol)在干dmf(9ml)中的溶液中依次加入dipea(0.64ml；3.9mmol)和甲磺酰氯(0.15ml；1.95mmol)。将该反应混合物缓慢地温热至室温，搅拌1小时。加入氯化铵的饱和溶液(25ml)，用etoac萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干，得到标题产物(1.1g；1.3mmol)，为橙色树胶状物，照此用于下一步。1h nmr(dmso-d6)：0.08(s,6h),0.84-0.89(m,6h),0.90(s,9h),1.32-1.49(m,2h),1.54-1.74(m,2h),1.94-2.03(m,1h),2.91-3.05(m,2h),3.29(s,3h),3.93(dd,1h,j＝7.1和9.0hz),4.20-4.33(m,3h),4.37-4.42(m,1h),4.75(s,2h),5.23(s,2h),5.4(s,2h),5.96(t,1h,j＝5.8hz),7.32(t,2h,j＝7.2hz),7.39-7.43(m,4h),7.56(dd,1h,j＝2.3和8.8hz),7.74(t,2h,j＝7.4hz),7.83(d,1h,j＝2.3hz),7.89(d,2h,j＝7.3hz),8.14(d,1h,j＝7.3hz),10.15(s,1h)
[0490]
步骤10：n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n-{3-[3-(乙酰基硫烷基)丙-1-炔-1-基]-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)苯基}-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺
[0491]
向n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n-[4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)-3-{3-[(甲磺酰基)氧基]丙-1-炔-1-基}苯基]-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺(1.1g；1.3mmol)在干dmf(10ml)中的溶液中加入硫代乙酸钾(0.3g；2.6mmol)。将该反应混合物在室温搅拌16小时。加入饱和碳酸氢钠溶液(35ml)，用etoac萃取水层。用盐水洗涤合并的有机层，用硫酸钠干燥，过滤，浓缩至干。通过硅胶快速色谱法纯化粗产物，使用dcm/meoh(10/0-9/1)作为洗脱液，得到标题产物(0.52g；0.62mmol)，为淡黄色固体。1h nmr(dmso-d6)：0.08(s,6h),0.84-0.89(m,6h),0.90(s,9h),1.31-1.49(m,2h),1.54-1.73(m,2h),1.95-2.02(m,1h),2.4(s,3h),2.89-3.06(m,2h),3.93(dd,1h,j＝6.9和9.1hz),3.97(s,2h),4.20-4.33(m,3h),4.36-4.41(m,1h),4.69(s,2h),5.39(s,2h),5.96(t,1h,j＝5.8hz),7.32(t,2h,j＝7.2hz),7.35-7.43(m,4h),7.49(dd,1h,j＝2.2和8.5hz),7.72-7.76(m,3h),7.89(d,2h,j＝7.5hz),8.12(d,1h,j＝7.4hz),10.08(s,1h)
[0492]
步骤11：n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n
5-氨基甲酰基-n-[4-(羟甲基)-3-(3-磺基丙-1-炔-1-基)苯基]-l-鸟氨酰胺
[0493]
在0℃向35％过氧化氢溶液(1.08ml；12.57mmol)中加入甲酸(9.68ml；256.5mmol)。将该溶液搅拌1小时，然后在r.t加入到n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n-{3-[3-(乙酰基硫烷基)丙-1-炔-1-基]-4-({[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}甲基)苯基}-n
5-氨基甲酰基-l-鸟氨酰胺(367mg；0.44mmol)中。将该反应混合物搅拌2小时，用水(20ml)稀释，在35℃浓缩至干。将残余物混悬于盐酸1n(25ml)，用dcm/meoh(7/3)洗涤。在35℃浓缩水层至干。通过c
18
快速色谱法纯化粗产物，使用acn/水+tfa(0.1％)(2/98-50/50)作为洗脱液，冻干后得到标题产物(117mg；0.13mmol)，为白色固体。1h nmr(dmso-d6)：δ0.84-0.88(m,6h),1.33-1.50(m,2h),1.55-1.75(m,2h),1.95-2.02(m,1h),2.89-3.05(m,2h),3.58(s,2h),3.91-3.95(m,1h),4.20-4.33(m,3h),4.37-4.42(m,1h),4.55(s,2h),5.22(brs,1h),5.38(s,2h),5.96(t,1h,j＝5.6hz),7.32(t,2h,j＝7.2hz),7.36-7.43
(m,4h),7.48(dd,1h,j＝2.4and 9.2hz),7.65(d,1h,j＝1.6hz),7.74(t,2h,j＝6.8hz),7.89(d,2h,j＝7.4hz),8.12(d,1h,j＝7.6hz),10.03(s,1h)。lcms(2-100acn/h2o+0.05％ tfa)：77.27％,rt＝8.3min。正模式检测值720.26(m+h
+
)
[0494]
步骤12：实施例34
[0495]
在氩气气氛中向n-{[(9h-芴-9-基)甲氧基]羰基}-l-缬氨酰基-n
5-氨基甲酰基-n-[4-(羟甲基)-3-(3-磺基丙-1-炔-1-基)苯基]-l-鸟氨酰胺(10mg；0.014mmol)在thf(600μl)和乙酸(60μl)中的混悬液中加入pt/c干5％(7mg；0.0018mmol)。用氢气将该反应混合物吹扫3次，然后在室温搅拌64小时。用45μm ptfe滤器过滤该反应混合物，用meoh和meoh/水(1/1)洗涤，然后浓缩至干，得到实施例34(7mg)，为橙色油状物。lcms(2-100acn/h2o+0.05％fa)：6.93％,rt＝8.8min。负模式检测值722.19(m-h)
[0496]
如实施例6-12、实施例14-25、实施例27或实施例28、实施例34所进行的，式(i)的对-氨基-苄基接头化合物可以用于制备式(ii)的接头-药物化合物和用于制备本发明的式(iii)的抗体-药物缀合物。
[0497]
实施例a：adc的缀合和分析表征
[0498]
如本技术通篇所用，抗体药物缀合物可以使用命名惯例以“靶抗原/抗体-接头-药物”的一般形式鉴定。仅作为实例，如果抗体-药物缀合物称作“靶标x-实施例y”，则此类缀合物包含结合靶标x的抗体和实施例y中示例的接头-药物。
[0499]
1.缀合
[0500]
使用下述方法之一合成示例性adc。示例性adc合成中使用的抗体由缩写ab t tg和ab t定义(表1)。
[0501]
表1.用于本发明目的的抗体
[0502][0503]
抗体t tg赋予细菌转谷氨酰胺酶(btg)-反应性谷氨酰胺，其被含环辛炔的胺bcn(或n-[(1r,8s,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲基氧基羰基]-1,8-二氨基-3,6-二氧杂辛烷)特异性官能化。使用细菌转谷氨酰胺酶与bcn部分的位点特异性抗体缀合如innate pharma 2013(呈现在adc summit,san francisco,california,2013年10月15日)、wo 2017/059160a1和wo 2016/144608a1中所述进行。这些修饰允许使用以下方法a缀合所述含叠氮化物的前体(图1)。
[0504]
通过完全还原四个链间二硫键，然后与过量的药物缀合，获得ab t的缀合物(图2)。为了本发明的目的，使用水溶性叔膦如三-(2-羧乙基)膦(tcep)作为还原剂。完全还原和缀合主要产生具有8种药物/抗体的完全负载的种类，并且最终产生小比例的7.1和7.7的6种药物加载的mab说明性平均dar值(表2)。
[0505]
通过下文方法d中所述的再桥接技术产生ab t的一些缀合物。ab t的四个链间二硫键用tcep完全还原，并使用二溴马来酰亚胺官能化的接头-有效负载重新形成(图3)。由
于涉及抗体的每条重链上的链间二硫桥的半胱氨酸的接近性，缀合产生两种构象。
[0506]
方法a(dar2)
[0507]
将二甲亚砜(dmso,619μl,20％的偶联体积)加入到ab溶液(11.8mg/ml；2.5ml,4.5mg)中。将混合物在涡旋中搅拌30秒，然后加入4倍摩尔过量的接头-弹头有效负载(20mm,6μl,在dmso中)。将该反应体系在室温以64rpm搅拌过夜。为了除去未缀合的接头-有效负载，加入10倍摩尔过量的含dbco的tentagel树脂(0.1-0.2mmol/g,iris biotech,cs-0477.0500)，将该混合物在室温搅拌6小时。使用vivaspin 20,50kd,pes(sartorius stedim,vs2031)，通过3个过滤循环将缓冲液与pbs 1x(sigma life science,p3813,10pak)交换，然后通过0.2μm无菌pes滤器，25mm(whatmann,g896-2502)无菌过滤并储存在4℃。
[0508]
方法b(dar8)
[0509]
在包含pbs缓冲液ph7.4(10mm；0.5ml)的edta中稀释ab溶液(10.3mg/ml；0.5ml)，以在偶联反应中固定5mm的最终edta浓度。然后将tcep(1mm，在ph 7.4的pbs缓冲液中，849μl)加入到抗体中，随后在37℃孵育2小时。还原后，将抗体溶液冷却至2-8℃，加入20倍摩尔过量的接头-有效负载(5mm,141μl,在dmso中)。将该反应体系在4℃孵育1.5小时。将该溶液离心(14000g，4℃)20分钟，将其加载到hiload 26/600 superdex 200pg(ge healthcare,28989336)sec色谱柱上。用20％dma的pbs溶液(sigma life science,p3813,10pak)洗脱adc，然后在pbs 1x ph 7.4(sigma life science,p3813,10pak)中进行2个循环的透析(16和4小时)。使用vivaspin 20,50kd,pes(sartorius stedim,vs2031)浓缩缀合物，通过0.2μm无菌pes滤器，25mm(whatmann，g896-2502)无菌过滤，并储存在4℃。
[0510]
方法c(dar8)
[0511]
在包含pbs缓冲液ph7.4(10mm；0.5ml)的edta中稀释ab溶液(10.3mg/ml；0.5ml)，以在偶联反应中固定5mm的最终edta浓度。然后将tcep(1mm，在ph 7.4的pbs缓冲液中，849μl)加入到抗体中，随后在37℃孵育2小时。还原后，将抗体溶液冷却至2-8℃，加入20倍摩尔过量的接头-有效负载(5mm,141μl,在dmso中)。将该反应体系在4℃孵育1.5小时。然后使用rmp蛋白质a树脂(ge healthcare,17-5138-01)纯化缀合物，随后在pbs 1x ph 7.4(sigma life science,p3813,10pak)中进行2个循环的透析(16和4小时)。使用vivaspin20,50kd,pes(sartorius stedim,vs2031)浓缩adc，通过0.2μm无菌pes滤器，25mm(whatmann，g896-2502)无菌过滤，并储存在4℃。
[0512]
方法d(dar4)
[0513]
向在ph 8的bbs缓冲液(如下所述制备)中的ab溶液(5mg/ml,0.5ml)中加入8倍摩尔过量的tcep(1mm在ph 8的bbs中，137μl)，将该反应体系在37℃孵育2小时。然后，加入7.5倍摩尔过量的接头-有效负载(1mm，129μl，在dmf中)，将所得溶液室温以600rpm混合1小时。将所得adc在pbs 1x ph 7.4(sigma life science,p3813,10pak)中在4℃透析16小时。然后使用rmp蛋白质a树脂(ge healthcare,17-5138-01)纯化缀合物，随后在pbs 1xph 7.4(sigma life science,p3813,10pak中在室温透析2小时。使用vivaspin 20,50kd,pes(sartorius stedim,vs2031)浓缩adc，通过0.2μm无菌pes滤器，25mm(whatmann，g896-2502)无菌过滤并储存在4℃。
[0514]
bbs缓冲液ph 8的制备：将na2b4o7.10h2o(528mg)溶于去离子水(27.7ml)。将氯化
钠(63mg，25mm)和edta(16mg，1mm)溶于22.3ml 0.1m盐酸。然后，将两种溶液混合在一起，将所得溶液直接用于缀合步骤。
[0515]
2.lc-ms一般方法
[0516]
通过液相色谱与质谱联用(lc-ms)，用下列方法lc-i或lc-ii测定示例性adc的药物与抗体比率(dar)。对于lc-i方法，流动相a通过ms级水(biosolve，dieuze，france，00232141b1bs)纯化，流动相b通过ms级乙腈(biosolve,dieuze,france,0001204101bs)纯化，流动相d通过补充1％甲酸(fa)(honeywell/fluka,bucharest,romania,56302)的ms级水纯化。将流动相d固定在10％以维持0.1％ fa流动相组成，并将柱温设定在80℃。针对合成的所有adc优化一般ms方法(表2)。对于lc-ii方法，流动相a通过ms级水(biosolve,dieuze,france,00232141b1bs))纯化，流动相b通过ms级乙腈(biosolve,dieuze,france,0001204101bs)纯化，两者均包含0.1％甲酸(fa)(honeywell/fluka,bucharest,romania,56302)。将柱温设定在80℃。针对合成的所有adc优化一般ms方法(表2)。
[0517]
方法lc-i：将adc加载到bioresolve rp mab poly苯基,450a,2.7μm,2.1x150mm(waters,saint-quentin-en-yvelines,france,186008946)上。对于在完整和还原条件下的分析，在20％的b下以0.6ml/min的流速进行脱盐步骤1.5分钟。洗脱步骤以从20％b下1.5分钟至70％b下16.5分钟的梯度进行，流速为0.3ml/min。洗涤步骤在90％b下设定为16.8分钟至18.8分钟，流速为0.6ml/min。最终，在19.1分钟使用20％b持续1.9分钟的适应步骤，流速为0.6ml/min(总运行时间＝21分钟)。
[0518]
方法lc-ii：将adc加载到bioresolve rp mab poly苯基,450a,2.7μm,2.1x150mm(waters,saint-quentin-en-yvelines,france,186008946)上。对于在完整和还原条件下的分析，在20％的b下以0.6ml/min的流速进行脱盐步骤1.5分钟。然后以相同的流速进行洗脱步骤，梯度为20％b 1.5分钟至50％b 16.5分钟。随后的洗涤步骤设定为以100％b 16.8分钟至18.8分钟，流速为0.6ml/min。最终，使用适应步骤，在18.8分钟至19.2分钟从100％至20％b，用上述流速在20％b下另外1.9分钟稳定柱(总运行时间＝21min)。
[0519]
使用waters uplc h-class bio色谱系统进行lc-ms分析，该系统与xevo g2 xs q-tof esi质谱仪(waters,manchester,uk))连接。在完整条件下(无初步处理)或在用5mm(最终浓度)的二硫苏糖醇dtt(thermo scientific,rockford,il,20291)还原后分析adc。随后，使用上述lc-i和lc-ii分析处理的adc(表2)。使用masslynx
tm
采集软件(waters,manchester,uk)采集分析物的电喷雾电离飞行时间质谱。然后，使用masslynx
tm
软件的最大熵(maxent)方法对提取的强度对m/z光谱进行去卷积，以便根据所使用的处理的不同确定每种完整抗体种类或每种还原的抗体片段的质量。最终，通过对未缀合和缀合的给定种类(mah或相关片段)的积分ms(总离子电流)或uv(280nm)峰面积求和，从去卷积光谱或uv色谱图确定dar。对于通过uv色谱图的dar测定，将每一种类的相对面积百分比乘以连接药物的数量。将每一种类的总和加权面积除以总相对面积百分比的总和，并且结果产生完整adc的最终平均dar值的估计值。对于通过去卷积光谱的dar测定，通过来自去卷积光谱的强度峰值计算鉴定的每一种类的百分比。将获得的百分比乘以所连接的药物数量。求和的结果产生了完整adc的最终平均dar值的估计值。
[0520]
3.尺寸排阻色谱法
[0521]
进行尺寸排阻色谱(sec)以确定adc的质量，其在纯化后的聚集百分比。在分析型
柱superdex 200 increase 5/150 gl(ge healthcare,28990945)上，在等度条件100％ pbs ph7.4(sigma life science,p3813,10pak)下，流速0.45ml/min，持续12分钟进行分析。基于280nm处的峰面积吸光度定量缀合物样品中聚集体部分的百分比。其计算基于280nm处的高分子量洗脱液之间的比率除以高分子量和单体洗脱液在相同波长处的峰面积吸光度的总和乘以100。
[0522]
4.疏水作用色谱法
[0523]
进行疏水作用色谱(hic)以确定接头-有效负载和生物缀合技术对抗体的疏水性影响。使用tskgel butyl-npr column(tosoh bioscience,0014947)，用流动相a(1.5m硫酸铵(nh4)2so4，25mm磷酸氢二钾(k2hpo4)，调节至ph 7)和b(25mm磷酸氢二钾(k2hpo4)，20％异丙醇，调节至ph 7)进行分析。以0.6ml/min的流速在5％b下开始洗脱。在17分钟内梯度从5％升至100％b，然后在100％b下洗涤5分钟。最终适应步骤在100％-5％b下进行2分钟，然后在5％b下进行2分钟。
[0524]
出于本发明的目的，使用adc保留时间(rt)除以抗体rt来计算每种adc的相对保留时间(rrt)(表3)。
[0525]
5.结果
[0526]
表2概括了示例性adc的表征(命名为实施例15-22和实施例29-33；偶联和lc-ms方法，聚集情况和dar)。使用上述lc-ms方法lc-i或lc-ii测定平均dar值(第2小节)，并通过上述尺寸排阻色谱法(sec)测量聚集体的百分比(第3小节)。
[0527]
表2.adc分析表征和偶联方法
[0528]
[0529]
通过使用上述hic色谱法计算相对保留时间来比较示例性adc的疏水性(第4小节)。表3概括了缀合物的rrt值。
[0530]
表3.使用rrt通过hic色谱法比较adc疏水性
[0531][0532][0533]
对所有示例性adc进行稳定性研究，其中缀合物在pbs缓冲液中在+37℃的加速降解条件下孵育1周。利用sec色谱法测量缀合物的聚集情况。所得结果示例在表4中。
[0534]
表4.adc在pbs缓冲液中在加速降解条件下的稳定性研究
[0535][0536][0537]
实施例b：使用ctg测定法检测示例性adc对细胞活力的作用
[0538]
将hcc1954(her+)和molt4(her-)细胞系在补充了10％热灭活的胎牛血清、青霉素(100iu/ml)、链霉素(100μg/ml)和l-谷氨酰胺(2mm)的rpmi中培养。将细胞系在37℃下在包含5％co2的加湿气氛中培养。将细胞接种在96微孔板中并暴露于adc 120小时(5倍连续稀释；各9个浓度，一式三份)。在37℃/5％ co2下孵育5天后，通过使用75μl试剂/孔的celltiterglo定量细胞atp水平来评估adc对细胞活力的影响。所有条件一式三份进行测试。在多用途平板读数器上定量发光。使用标准四参数曲线拟合计算ic
50
。将ic
50
定义为ctg信号降低至对照测量的ctg信号的50％时的化合物浓度。每个实验进行至少两次，结果可再现。
[0539]
如表5中所示，在ctg测定中，所有示例的adc在抗原阳性细胞中都具有活性。
[0540]
表5.使用ctg测定法的示例性adc对细胞活力的作用
[0541]