肽交联剂以及通过该交联剂交联的交联肽

本发明涉及一种交联肽的制备方法等。

背景技术：

1、蛋白质药物及肽药物是目前最受关注的生物药物产品之一。尤其是近年来，以igg抗体为中心的抗体药物或肽药物被用于药物领域，在工业、制药用途中的重要性日益提高。

2、此前，本发明人报告称，为了构建用作抗体药物产品的纯化用途的蛋白a柱的代替系统，可利用如下柱将igg纯化，所述柱是将由17个残基组成的igg肽利用二硫键环化而成的包含特定序列的肽配体固定化而得到的(专利文献1)。然而，igg肽柱存在如下问题：由于存在于肽内的二硫键对碱性的耐受性较低，因此无法重复利用。因此，本发明人为了解决肽或蛋白质中的二硫键对于碱洗涤的化学性质较弱的问题，对提高耐碱性的方法反复进行研究，结果发现如下igg结合肽，其通过使用1,3-二氯丙酮使肽或蛋白质中的半胱氨酸残基中的硫醇基团之间交联，飞跃性地提高了对于碱洗涤的耐受性(专利文献2)。然而，所述交联虽然耐碱性较强，但出现了对于igg的亲和性较低(kd＝4.9μm)，功能性受损的新的问题。因此，尝试改良交联结构，即，通过对交联结构进行再设计，能够不产生如二氯丙酮交联那样的较大的功能性的降低而保持耐碱性，结果发现，通过将二硫化物的硫醇基团一方变更为甲基，将ss键转换为ch3-s键，亲和性虽仍略低，但kd值达到340nm，接近具有耐碱性的实用的交联结构(专利文献3)。然而，所述方法由于暂时将肽中的高丝氨酸氯化后使其与半胱氨酸的硫醇基团反应，因此存在制作收率较低的问题。

3、现有技术文献

4、专利文献

5、专利文献1：国际公布第2013/027796号公报

6、专利文献2：国际公布第2018/092867号公报

7、专利文献3：国际公布第2020/075670号公报

技术实现思路

0、发明概述

1、发明所要解决的问题

2、因此，本发明的目的在于提供一种通过进一步对交联结构进行再设计，以较高的收率制作不伴随较大的亲和性的降低，耐碱性较高且保持功能性的交联结构的方法。

3、解决问题的技术手段

4、本发明人进一步反复进行与交联剂的结构相关的改良，结果通过使用由于反应性较高而通常不在水溶液中使用的1,1-二氯丙酮及其衍生物作为交联剂，成功制作出耐碱性以及对于igg保持较高的亲和性(kd＝45nm)的igg结合肽。通过本发明，成功提供了能够实用化为药物产品、收率较高、具有耐碱性、并且能够维持蛋白质和肽的功能的交联技术。

5、本发明的第1方面是一种蛋白质或肽用交联剂，其以下式(i)表示。

6、[化1]

7、

8、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、或苯基]

9、本发明的第2方面是一种制备交联的蛋白质或肽的方法，所述交联的蛋白质或肽是由单一或分离的蛋白质或肽具有的至少2个硫醇基团结合而得到的，以下式表示，

10、[化2]

11、

12、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同]

13、所述方法包括：

14、使所述蛋白质或肽与上述本发明的第1方面的交联剂反应，使所述2个硫醇基团经由以下的基团相互结合，

15、[化3]

16、

17、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基]。

18、也可设为：所述蛋白质或肽为所述至少2个硫醇基团的全部或一部分形成二硫键的蛋白质或肽，所述方法包括：通过将所述二硫键还原而产生2个硫醇基团。

19、本发明的第3方面是一种改善蛋白质或肽的耐碱性的方法，其包括：通过上述本发明的第2方面的方法，使所述蛋白质或肽内的硫醇基团结合而获得交联的蛋白质或肽。

20、本发明的第4方面是一种制备蛋白质或肽的方法，所述蛋白质或肽结合有反应性官能基，以下式表示，

21、[化4]

22、

23、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]

24、所述方法包括：

25、通过上述本发明的第2方面的方法获得交联的蛋白质或肽；以及

26、通过使获得的交联的蛋白质或肽与nh2-l-z(l表示连接基，z表示反应性官能基)反应，向所述交联的蛋白质或肽的交联部分导入反应性官能基。

27、本发明的第5方面是一种制备蛋白质或肽的方法，所述蛋白质或肽结合有反应性官能基，以下式表示，

28、[化5]

29、

30、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]

31、所述方法包括：

32、通过使以下式表示的交联的蛋白质或肽与nh2-l-z(l表示连接基，z表示反应性官能基)反应，向所述交联的蛋白质或肽的交联部分导入反应性官能基，

33、[化6]

34、

35、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同]。

36、本发明的第6方面是一种制备蛋白质或肽与药物的复合物的方法，所述复合物以下式表示，

37、[化7]

38、

39、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，d表示药物]

40、所述方法包括：

41、通过本发明的第4或第5方面的方法获得结合有反应性官能基的蛋白质或肽；以及

42、通过使获得的结合有反应性官能基的蛋白质或肽与具有能够与所述反应性官能基反应的官能基的药物反应，使所述药物与所述交联的蛋白质或肽的交联部分结合。

43、本发明的第7方面是一种制备蛋白质或肽与药物的复合物的方法，所述复合物以下式表示，

44、[化8]

45、

46、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，d表示药物]

47、所述方法包括：

48、通过使以下式表示的结合有反应性官能基的蛋白质或肽与具有能够与所述反应性官能基反应的官能基的药物反应，使所述药物与交联的蛋白质或肽的交联部分结合，

49、[化9]

50、

51、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]。

52、在上述本发明的第4至第7方面的方法中，所述连接基也可以包含能够利用蛋白质分解酶切断的部分。

53、在上述本发明的第2至第7方面的方法中，所述蛋白质或肽也可以为5～50个氨基酸的肽。

54、在上述本发明的第2至第7方面的方法中，被交联的硫醇基团也可以为存在于单一蛋白质或肽内的硫醇基团。

55、在上述本发明的第2至第7方面的方法中，所述蛋白质或肽也可以为fc结合性肽。

56、在上述本发明的第2至第7方面的方法中，被交联的硫醇基团也可以为存在于分离的蛋白质或肽内的硫醇基团。

57、本发明的第8的方面是一种交联的蛋白质或肽，其以下式表示。

58、[化10]

59、

60、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同]

61、本发明的第9方面是一种蛋白质或肽，其结合有反应性官能基，以下式表示。

62、[化11]

63、

64、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，z表示反应性官能基]

65、本发明的第10方面是一种蛋白质或肽与药物的复合物，所述复合物以下式表示，

66、[化12]

67、

68、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，蛋白质/肽a与蛋白质/肽b可以相同或不同，l表示连接基，d表示药物]。

69、在本发明的第8及第9方面的蛋白质或肽、以及本发明的第10方面的复合物中，所述连接基也可以包含能够利用蛋白质分解酶切断的部分。

70、在本发明的第8及第9方面的蛋白质或肽、以及本发明的第10方面的复合物中，所述蛋白质或肽也可以为5～50个氨基酸的肽。

71、在本发明的第8及第9方面的蛋白质或肽、以及本发明的第10方面的复合物中，被交联的硫醇基团也可以为存在于单一蛋白质或肽内的硫醇基团。

72、在本发明的第8及第9方面的蛋白质或肽、以及本发明的第10方面的复合物中，所述蛋白质或肽也可以为fc结合性肽。

73、fc结合性肽中的赖氨酸残基、半胱氨酸残基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基、2-氨基辛二酸、二氨基丙酸、精氨酸残基或第1位氨基酸的氨基也可以用dsg(双琥珀酰亚胺戊二酸酯)、dss(双琥珀酰亚胺辛二酸酯)、dma(二亚胺代己二酸二甲酯二盐酸盐)、dmp(庚二酰亚胺酸二甲酯二盐酸盐)、dms(辛二亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、dtbp(3,3’-二硫代双丙亚氨酸二甲酯二盐酸盐)、或dsp(二硫代双琥珀酰亚胺丙酸酯)修饰。

74、在本发明的第8及第9方面的蛋白质或肽、以及本发明的第10方面的复合物中，被交联的硫醇基团也可以为存在于分离的蛋白质或肽内的硫醇基团。

75、本发明的第11方面是一种具有igg的fc区的分子的制备方法，所述具有igg的fc区的分子结合有交联的fc结合性肽，所述方法包括：使具有igg的fc区的分子与本发明的第8或第9方面的蛋白质、肽或本发明的第10方面的复合物接触。

76、本发明的第12方面是一种具有igg的fc区的分子的制备方法，所述具有igg的fc区的分子结合有交联的fc结合性肽，所述方法包括：

77、使与具有igg的fc区的分子结合的fc结合性肽与本发明的第1方面的交联剂反应，使所述fc结合性肽中的2个硫醇基团经由以下的基团相互结合，

78、[化13]

79、

80、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基]。

81、本发明的第13方面是一种具有igg的fc区的分子的制备方法，所述具有igg的fc区的分子结合有fc结合性肽，所述fc结合性肽结合有反应性官能基z，以下式表示，

82、[化14]

83、

84、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，l表示连接基，z表示反应性官能基]

85、所述方法包括：

86、通过使结合有以下式表示的交联的fc结合性肽的具有igg的fc区的分子与nh2-l-z(l表示连接基，z表示反应性官能基)反应，向所述交联的fc结合性肽中的交联部分导入反应性官能基，

87、[化15]

88、

89、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基]。

90、本发明的第14方面是一种具有igg的fc区的分子的制备方法，所述具有igg的fc区的分子结合有fc结合性肽，所述fc结合性肽结合有药物d，以下式表示，

91、[化16]

92、

93、所述方法包括：

94、通过使结合有以下式表示的结合有反应性官能基z的fc结合性肽的具有igg的fc区的分子与具有能够与所述反应性官能基z反应的官能基的药物反应，使药物与交联的蛋白质或肽的交联部分结合，

95、[化17]

96、

97、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，l表示连接基，z表示反应性官能基]。

98、上述本发明的第11～14方面的方法还可以进一步包括：使所述fc结合性肽与所述具有igg的fc区的分子共价结合。

99、本发明的第15方面是一种具有igg的fc区的分子，其结合有本发明的第8及第9方面的蛋白质或肽、或本发明的第10方面的复合物。

100、关于本发明的第15方面的分子，所述fc结合性肽与所述具有igg的fc区的分子也可以共价结合。

101、本发明的第16方面是一种载体，其结合有本发明的第8或第9方面的肽。

102、本发明的第17方面是一种具有igg的fc区的分子的纯化方法，其包括：

103、使含有具有igg的fc区的分子的液体与上述本发明的第16方面的载体接触；

104、通过洗涤将不与所述载体结合的成分去除；以及

105、与所述载体结合的成分洗脱，回收所述具有igg的fc区的分子。

106、本发明的第18方面是一种制备交联的蛋白质或肽的方法，所述交联的蛋白质或肽是由蛋白质或肽具有的至少2个硫醇基团结合而得到的，以下式表示，

107、[化18]

108、

109、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽]

110、所述方法包括：

111、通过fmoc法合成所述蛋白质或肽；以及

112、在所述合成中，使用以下式表示的化合物代替至少1个半胱氨酸残基，

113、[化19]

114、

115、本发明的第19方面是一种制备蛋白质或肽的方法，所述蛋白质或肽结合有反应性官能基，以下式表示，

116、[化20]

117、

118、[式中，a为氢原子、可用苯基或卤素原子取代的c1～6烷基、苯基、c1～6烷基，蛋白质/肽表示蛋白质或肽，l表示连接基，z表示反应性官能基，d表示药物]

119、所述方法包括：

120、通过fmoc法合成所述蛋白质或肽；以及

121、在所述合成中，使用以下式表示的化合物代替至少1个半胱氨酸残基，

122、[化21]

123、

124、发明效果

125、通过本发明的方法获得的氨基酸中的sh彼此的键可收率较高地形成交联结构。另外，由于耐碱性优异，因此即便暴露于碱性条件下键也不会被切断。因此，可提供一种耐碱性较强的蛋白质及肽，且可用于在碱性条件下使用或洗涤的蛋白质及肽。另外，由于利用交联结构维持原始的蛋白质及肽具有的结构，功能不会受损，因此可用于各种肽及蛋白质的稳定化。