包含经修饰的核苷酸的脂质纳米颗粒的制作方法

背景技术：

1、由于其激活nk细胞和细胞毒性t细胞的能力，il12蛋白自1994年以来一直被研究作为一种有前途的抗癌治疗剂。参见nastala,c.l.et al.,j immunol 153:1697-1706(1994)。但尽管寄予厚望，然而早期的临床研究并没有取得令人满意的结果。lasek w.etal.,cancer immunol immunother 63:419-435,424(2014)。在大多数患者中，重复施用il12会导致适应性反应和血液中il12诱导的干扰素γ(ifn-γ)水平逐渐下降。同前。此外，虽然人们认识到il12诱导的抗癌活性主要由ifnγ的二次分泌介导，但由il12伴随诱导ifn-γ与其他细胞因子(例如tnf-α)或趋化因子(ip-10或mig)引起严重毒性。同前。

2、除了负反馈和毒性之外，il12疗法在临床环境中的边际功效可能是由人体中强烈的免疫抑制环境引起的。同前。为了最大限度地减少ifn-γ的毒性并提高il12的疗效，科学家们尝试了不同的方法，例如il12治疗的不同剂量和时间方案。参见sacco,s.et al.,blood 90:4473-4479(1997)；leonard,j.p.et al.,blood 90:2541-2548(1997)；coughlin,c.m.et al.,cancer res.57:2460-2467(1997)；asselin-paturel,c.et al.,cancer 91:113-122(2001)；和saudemont,a.et al.,leukemia 16:1637-1644(2002)。尽管如此，这些方法并未显著影响患者的生存。kang,w.k.,et al.,human gene therapy 12:671-684(2001)。因此，本技术领域需要使用il12的改进治疗方法以治疗肿瘤。

技术实现思路

1、本公开提供了一种脂质纳米颗粒，其包含：(i)一种或多种类型的脂质；和(ii)经修饰的mrna，其包含编码白细胞介素(il)-12分子的序列；其中所述脂质纳米颗粒能够触发免疫原性细胞死亡。在一些方面，所述一种或多种类型的脂质包括阳离子脂质。在一些方面，所述阳离子脂质是式i化合物：

2、

3、及其盐；其中每个r1独立地是未经取代的烷基；每个r2独立地是未经取代的烷基；每个r3独立地是氢或经取代或未经取代的烷基；并且每个m独立地为3、4、5、6、7或8。在一些方面，至少一个r1是c11h23。在一些方面，至少一个r3是氢。在一些方面，至少一个m为3。

4、在一些方面，所述阳离子脂质是具有以下结构的n1,n3,n5-三(3-(双十二烷基氨基)丙基)苯-1,3,5-三甲酰胺(tt3)：

5、

6、及其盐，其中m为3。在一些方面，所述脂质纳米颗粒包含tt3、1,2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺(dope)、胆固醇和c14-peg2000。

7、在一些方面，所述经修饰的rna包含经修饰的5'-帽。在一些方面，所述经修饰的5'-帽选自m27,2′-ogppspgrna、m7gpppg、m7gppppm7g、m2(7,3′-o)gpppg、m2(7,2′-o)gppspg(d1)、m2(7,2′-o)gppspg(d2)、m27,3’-ogppp(m12’-o)apg、(m7g-3′mppp-g；其可等效地表示3′o-me-m7g(5′)ppp(5′)g)、n7,2′-o-二甲基鸟苷-5'-三磷酸-5'-鸟苷、m7gm-ppp-g、n7-(4-氯苯氧乙基)-g(5′)ppp(5′)g、n7-(4-氯苯氧乙基)-m3′-og(5′)ppp(5′)g、7mg(5′)ppp(5′)n、pn2p、7mg(5′)ppp(5′)nlmpnp、7mg(5′)-ppp(5′)nlmpn2 mp、m(7)gpppm(3)(6,6,2′)apm(2′)apm(2′)cpm(2)(3,2′)up、肌苷、n1-甲基鸟苷、2′氟鸟苷、7-脱氮杂-鸟苷、8-氧代-鸟苷、2-氨基-鸟苷、lna-鸟苷、2-叠氮基-鸟苷、n1-甲基假尿苷、m7g(5')ppp(5')(2'omea)pg及其组合。

8、在一些方面，所述经修饰的rna是环状rna。

9、在一些方面，所述经修饰的rna还包含半衰期延长部分。在一些方面，所述半衰期延长部分包括fc、白蛋白或其片段、白蛋白结合部分、pas序列、hap序列、转铁蛋白或其片段、xten或其任何组合。

10、在一些方面，所述il-12分子选自由il-12、il-12亚基或保留免疫调节功能的突变il-12分子组成的群组。在一些方面，所述il-12包含与seq id no:1有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述il-12分子包含il-12α和/或il-12β亚基。在一些方面，所述il-12a亚基包含与seq id no:2有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％，至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述il-12β亚基包含与seqid no:3有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。

11、在一些方面，所述il-12α亚基和所述il-12β亚基通过接头连接。在一些方面，所述接头包含至少约2个、至少约5个、至少约6个、至少约7个、至少约8个、至少约9个、至少约8个、至少约约10个、至少约11个、至少约12个、至少约13个、至少约14个、至少约15个、至少约16个、至少约17个、至少约18个、至少约19个或至少约20个氨基酸的氨基酸接头。在一些方面，所述接头包含(gs)接头。在一些方面，所述gs接头具有通式(gly4ser)n或s(gly4ser)n，其中n是选自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、30、40、50、60、70、80或100组成的群组的正整数。在一些方面，所述(gly4ser)n接头是(gly4ser)3或(gly4ser)4。

12、在一些方面，所述il12分子包含与seq id no:4或seq id no:5有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。在一些方面，所述经修饰的mrna包含与seq id no:6有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述经修饰的rna包含与seq id no:7有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％同一性的核苷酸序列。

13、在一些方面，所述经修饰的rna还包含调控元件。在一些方面，所述调控元件选自由至少一个翻译增强子元件(tee)、翻译起始序列、至少一个微rna结合位点或其种子、连接的核苷的3'尾区、富含au的元件(are)、转录后控制调节剂及其组合组成的群组。在一些方面，所述连接的核苷的3'尾区包含poly-a尾、polya-g四联体或茎环序列。

14、在一些方面，所述经修饰的rna包含至少一个经修饰的核苷。在一些方面，所述至少一个经修饰的核苷选自由6-氮杂-胞苷、2-硫代-胞苷、α-硫代-胞苷、假-异-胞苷、5-氨基烯丙基-尿苷、5-碘-尿苷、n1-甲基-假尿苷、5,6-二氢尿苷、α-硫代-尿苷、4-硫代-尿苷、6-氮杂-尿苷、5-羟基-尿苷、脱氧-胸苷、假-尿苷、肌苷、α-硫代-鸟苷、8-氧代-鸟苷、o6-甲基-鸟苷、7-脱氮杂-鸟苷、n1-甲基腺苷、2-氨基-6-氯-嘌呤、n6-甲基-2-氨基-嘌呤、6-氯-嘌呤、n6-甲基-腺苷、α-硫代-腺苷、8-叠氮基-腺苷、7-脱氮-腺苷、吡咯并胞苷、5-甲基-胞苷、n4-乙酰-胞苷、5-甲基-尿苷、5-碘-胞苷及其组合组成的群组。

15、在一些方面，所述经修饰的rna包含与seq id no:8有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、或约100％同一性的核苷酸序列。在一些方面，所述经修饰的rna包含与seq idno:9有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的核苷酸序列。

16、在一些方面，所述脂质纳米颗粒具有约30-500nm的直径。在一些方面，所述脂质纳米颗粒具有约50-400nm的直径。在一些方面，所述脂质纳米颗粒具有约70-300nm的直径。在一些方面，所述脂质纳米颗粒具有约100-200nm的直径。在一些方面，所述脂质纳米颗粒具有约100-175nm的直径。在一些方面，所述脂质纳米颗粒具有约100-120nm的直径。在一些方面，所述脂质纳米颗粒和所述经修饰的rna具有约1:2至约2:1的质量比。在一些方面，所述脂质纳米颗粒和所述经修饰的rna具有1:2、1:1.5、1:1.2、1:1.1、1:1、1.1:1、1.2:1、1.5:1或2:1的质量比。在一些方面，所述脂质和所述经修饰的rna具有约1:1的质量比。

17、本公开还提供了一种药物组合物，其包含本文公开的脂质纳米颗粒和药学上可接受的载体。在一些方面，所述药物组合物被配制成用于瘤内、鞘内、肌肉内、静脉内、皮下、吸入、皮内、淋巴内、眼内、腹膜内、胸膜内、脊柱内、血管内、鼻腔、经皮、舌下、粘膜下、透皮或经粘膜施用。

18、本公开还提供了一种治疗有需要的受试者的癌症的方法，其包括向受试者施用有效量的本文公开的所述脂质纳米颗粒或所述药物组合物。在一些方面，所述受试者是患有或疑似患有癌症的人类患者。在一些方面，所述人类患者患有选自黑色素瘤、鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌、肺鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃肠道癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、原发性肝癌(hepatic carcinoma)、胃癌和头颈癌组成的群组的癌症。在一些方面，所述脂质纳米颗粒或药物组合物以单次剂量施用于受试者。在一些方面，所述药物组合物通过瘤内注射、肌内注射、皮下注射或静脉内注射施用于受试者。