用于反义寡核苷酸递送的脂质纳米颗粒组合物的制作方法

用于反义寡核苷酸递送的脂质纳米颗粒组合物的制作方法
【专利摘要】本发明描述了脂质纳米颗粒组合物，其包含与聚合物缀合的大分子和靶向剂。该组合物可包含治疗剂。所述治疗剂可以是反义寡核苷酸(ASO)。示例性ASO靶向编码Akt-1之核酸的一部分并且调节Akt-1的表达；或者靶向编码HIF-1之核酸的一部分并且调节HIF-1的表达。本发明还描述了包含与聚合物缀合之大分子和治疗剂的脂质纳米颗粒组合物，所述治疗剂是ASO，例如靶向编码Akt-1之核酸的一部分并且调节Akt-1之表达的ASO；或者靶向编码HIF-1之核酸的一部分并且调节HIF-1之表达的ASO。本发明还公开了药物制剂、制备所述脂质纳米颗粒的方法和使用所述脂质纳米颗粒的方法，例如用于治疗癌症。
【专利说明】用于反义寡核苷酸递送的脂质纳米颗粒组合物
[0001] 相关申请
[0002] 本申请要求于2012年5月23日提交的美国临时申请No. 61/650,729和2013年 3月14日提交的美国临时申请No. 61/784, 892的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
[0003] 关于联邦资助研究的声明
[0004] 本发明在美国国立卫生研究院授予的资助号R01CA135243、DK088076和CA152969 的政府支持下作出。政府享有本发明的某些权利。
[0005] 序列表
[0006] 本申请包含序列表，其已通过EFS网以ASCII形式提交，并且通过引用整体并入本 文。所述ASCII拷贝创建于2013年5月23日，命名为41890-349711_SL. txt，并且大小为 3, 404字节。

【技术领域】
[0007] 本公开内容描述了可用于递送核酸的脂质纳米颗粒及相关的化合物。

【背景技术】
[0008] SiRNA及其他治疗性寡核苷酸的递送是限制其临床转化（translation)之潜能的 主要技术挑战。
[0009] 脂质体是由一个或更多个脂质双层构成的囊泡，其能够在水性核心内携带亲水分 子或者在其脂双层内携带疏水分子。脂质纳米颗粒（LN)是用于描述亚微米范围的基于脂 质之颗粒的通用术语。它们可具有脂质体的结构特征和/或具有作为替代的非双层型结 构。通过LN经全身途径递送药物需要克服若干生理屏障。网状内皮系统（RES)可负责从 循环中清除LN。LN -旦逃离血管系统并达到靶细胞，即通常通过内吞作用而被摄取，并且 必须在酸性内体条件中降解之前将药物释放到胞质中。
[0010] 在制备LN时必须考虑4电位或表面电荷。对于全身递送而言，LN的4电位通 常不应过于正或过于负。带有过多正电荷的LN倾向于与靶细胞和循环血浆蛋白非特异性 地相互作用，并且可引起细胞毒性。或者，带有过多负电荷的LN不能有效并入同样带负电 的核酸中，而且可引起RES介导的迅速清除，从而降低治疗效力。中性至带有适度电荷的LN 最适于体内药物和基因递送。
[0011] LN构成了用于递送传统治疗性化合物和基于核酸之治疗剂的有前景的平台。使 用LN配制的药物通常可在体内表现出优越的药代动力学（PK)特性，例如血液循环时间提 高和由于增强的透性和滞留（EPR)效应在实体瘤处的积累提高。此外，LN可在表面包被聚 乙二醇以降低由血清蛋白引起的LN的调理作用以及所导致的RES介导的摄取。LN还可用 细胞特异性配体包被以提供靶药物递送。
[0012] 在过去的几十年中，对基于核酸的治疗剂出现了很大的关注。基于核酸的治疗 剂在引入核酸（NA)以促进或抑制基因表达的前提之下起作用。由于认为基因突变和 miRNA谱改变是癌症及其他疾病的根本原因，所以基于核酸的试剂可潜在地直接作用于该 根本病因，使治疗潜能最大化。基于核酸的治疗剂的几个实例包括质粒DNA(pDNA)、小干 扰 RNA(siRNA)、小发夹 RNA(shRNA)、微 RNA(miR)模拟物（mimic 或 mimetic)、anti-miR/ antagomiR/miR抑制剂和反义寡核苷酸（antisense oligonucleotide，ASO)，其均包括在 本公开内容所用术语核酸的范围内。基于核酸的治疗剂的临床转化在其实施中面临若干障 碍。将核酸运输至其胞内靶标特别有挑战性，因为核酸相对不稳定，并且易于被血清和细胞 核酸酶降解。此外，核酸上的大量负电荷也使其不能跨细胞膜运输，这限制了其实用性。已 经开发了病毒载体来解决这个问题，但是大多数都因为体内免疫应答的活化和在宿主基因 组中诱导了非期望的突变而失败。也对非病毒载体进行了广泛的研究，但是只有很少取得 了成功的临床结果，而且还需要进一步改进。
[0013] 传统上，已经使用阳离子LN作为非病毒载体用于基因递送。在一些实例中，用阴 离子脂质来代替阳离子脂质或者将阳离子脂质与阴离子脂质组合使用。阳离子LN的正电 荷有助于与带负电核酸的静电相互作用。可以将阴离子脂质与阳离子脂质或阳离子聚合物 组合，这将进而介导与核酸的相互作用。这些可通过本领域中已知的多种技术来制备，例 如，乙醇稀释、冻融、渗滤和薄膜水合。除了阳离子组分以外，LN通常还包含辅助脂质，其包 括形成双层的磷脂组分，例如磷脂酰胆碱及胆固醇。辅助脂质（例如二油酰基磷脂酰乙醇 胺（DOPE))并不利于双层相，反而有助于在靶部位处破坏脂质双层，以释放治疗剂。可以 添加稳定用组分，例如D-a-生育酚聚乙二醇1000琥珀酸酯（TPGS)(其为PEG化剂）或 mPEG-DSPE来稳定制剂并保护LN免受RES介导的摄取。
[0014] 开发高效递送载剂是寡核苷酸（ON)治疗剂之临床转化的关键。理想地，脂质纳米 颗粒制剂应能够（1)保护药物免受酶促降解；（2)穿过毛细血管内皮；（3)特异性地达到靶 细胞类型而不引起免疫原性或脱靶细胞毒性；(4)促进内吞作用和内体释放；以及（5)形成 具有胶体稳定性和长货架期（shelf-time)的稳定制剂。
[0015] 发明概述
[0016] 本文中提供了脂质纳米颗粒，其可高效包封治疗性寡核苷酸并且满足有效递 送的物理学和生物学标准。在本发明中，某些实施方案包括含RX〇2〇i( Archexiir5)和/或RX-0047的脂质纳米颗粒，其中所述rx〇2〇i ( Archexink )是20聚体硫代 磷酸酯反义寡核苷酸，其具有包含针对Akt-I之5' gctgcatgatctccttggcg3'（Seq. Id. No. :1)的序列，所述RX-0047是20聚体硫代磷酸酯反义寡核苷酸，其具有包 含 5' aatgagccaccagtgtccaa3'（Seq. Id.No. :2)的序列，RX-0047 是"缺氧诱导因 子-I a "（HIF-1 a )的强效抑制剂。
[0017] 在某些实施方案中，脂质纳米颗粒包含高度阳离子化和/或pH-响应的HSA聚合 物缀合物。在某些实施方案中，HSA-聚合物缀合物包括HSA-PEHA。在某些实施方案中，月旨 质纳米颗粒使白蛋白-聚合物缀合物（albumin-polymer conjugate, APC)高度阳离子化， 以提高脂质纳米颗粒制剂的转染效率。
[0018] 本文中还提供了药物组合物，制备脂质包被的白蛋白纳米颗粒的方法及治疗癌症 或其他疾病的方法。
[0019] 在一些实施方案中，本发明是脂质纳米颗粒组合物，其包含与聚合物缀合的大分 子和靶向剂。在一些实施方案中，所述脂质纳米颗粒组合物还包含治疗剂，例如核酸、蛋白 质、多糖、脂质、放射性物质、治疗剂、前药及其组合。在一些实施方案中，所述治疗剂是核 酸。在一些实施方案中，所述核酸是pDNA、反义寡核苷酸、11111?、3111：；[1]111?、8111?嫩、811?嫩或其 组合。在一些实施方案中，所述治疗剂是反义寡核苷酸（ASO)，其可以是靶向编码Akt-I之 核酸的一部分并且调节Akt-I之表达的ASO ;或者可以是靶向编码HIF-I之核酸的一部分 并且调节HIF-I之表达的AS0。
[0020] 本发明的一些实施方案还包括脂质纳米颗粒组合物，其包含与聚合物缀合的大分 子和治疗剂，所述治疗剂为AS0,例如靶向编码Akt-I之核酸的一部分并且调节Akt-I之表 达的ASO ;或者靶向编码HIF-I之核酸的一部分并且调节HIF-I之表达的AS0。
[0021] 在本发明的任意实施方案中，聚合物可以是带电的，例如，聚合物可以是带正电 的。在本发明的一些实施方案中，大分子包含白蛋白。在一些示例性实施方案中，与聚合物 缀合的大分子是白蛋白-聚阳离子缀合物。缀合可以例如通过交联剂。所述大分子或带正 电的聚合物可以是例如五亚乙基六胺（PEHA)、四亚乙基六胺和四亚乙基五胺（TEPA)。在一 些实施方案中，所述大分子包含五亚乙基六胺（PEHA)，并且所述聚合物包含人血清白蛋白 (HSA)。PEHA分子与HSA分子之比可为约11 : 1。本发明的脂质纳米颗粒可包含两种或更 多种低分子量聚合物的混合物。所述脂质纳米颗粒可包含D0TAP、SPC和TPGS，例如摩尔比 为约 25 : 70 : 5 的 DOTAP : SPC : TPGS。
[0022] 在包括ASO的一些实施方案中，所述反义寡核苷酸是具有包含 5' gctgcatgatctccttggcg3'（Seq.Id.No. :1)之序列的化合物，其革巴向编码人Akt-I的 核酸分子并且调节Akt-I的表达。在另一些实施方案中，所述反义寡核苷酸是具有包含 5'aatgagccaccagtgtccaa3'（Seq.Id.No. :2)之序列的化合物，其革巴向编码人HIF-1之核 酸分子并且调节HIF-I的表达。所述脂质纳米颗粒组合物还可包含融合肽。在一些实施方 案中，所述脂质纳米颗粒的颗粒大小小于约300nm或者小于约150nm。
[0023] 所述靶向剂可通过直接连接或通过交联剂只与脂质纳米颗粒的外表面相结合。 所述靶向剂可以是抗体或抗体片段。所述靶向剂还可以是cRGD肽、含半乳糖的部分、转 铁蛋白、叶酸、低密度脂蛋白和表皮生长因子。在一些示例性实施方案中，所述靶向剂是 cRGDfC或叶酸。所述靶向剂可以是缀合物，例如叶酸-PEG-CHEMS (叶酸-聚乙二醇-半 琥珀酸胆固醇酯）、叶酸-PEG-DSPE(叶酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）或 cRGDfC-PEG-DSPE (环（RGDfC)-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）。
[0024] 在一些实施方案中，本发明是包含如上所述脂质纳米颗粒组合物和可药用赋形剂 的药物组合物。所述药物组合物可制备成无菌溶液或混悬液。
[0025] 在另一些实施方案中，本发明是制备脂质包被的白蛋白纳米颗粒（LCAN)的方法， 其中所述方法包括以下步骤：合成HSA-PEHA缀合物；制备脂质混合物；向HSA-PEHA缀合 物中添加脂质混合物；向脂质和HSA-PEHA缀合物的混合物添加反义寡核苷酸（ASO)以 得到LCAN前体；其中ASO选自：靶向编码Akt-I之核酸的一部分并且调节Akt-I之表达 的ASO ;和靶向编码HIF-I之核酸的一部分并且调节HIF-I之表达的AS0。在另一些实施 方案中，本发明是制备脂质包被的白蛋白纳米颗粒（LACN)的方法，其包括以下步骤：合成 HSA-PEHA缀合物；制备脂质混合物；以及向HSA-PEHA缀合物添加靶向剂和脂质混合物。所 述靶向剂可以是上述的任意靶向剂。在一些实施方案中，脂质混合物包含并且靶向剂包 括 DOTAP、soyPC、TPGS 和 cRGDfC-PEG-DSPE，例如，其中摩尔比为约 25 : 70 : 4 : 1 的 DOTAP : soyPC : TPGS : cRGD-PEG-DSPE。在另一些实施方案中，所述脂质混合物包含（例 如摩尔比为约 25 : 70 : 5 的）D0TAP、SP(^PTPGS。
[0026] 本发明还是通过向有此需要的患者施用有效量的本文中所述药物组合物来诊断 或治疗癌症或感染性疾病的方法。所治疗的癌症可以是例如脑癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、黑 素瘤、皮肤癌、表皮癌、结肠直肠癌（colon and rectal cancer)、非霍奇金淋巴瘤、子宫内 膜癌、胰腺癌（pancreatic cancer)、肾（肾细胞）癌、前列腺癌、白血病、甲状腺癌、头颈部 癌（head and neck)、卵巢癌、肝细胞癌、宫颈癌（cervical cancer)、肉瘤、胃癌、多发性骨 髓瘤、淋巴瘤、胃肠癌（gastrointestinal cancer)和子宫癌。在一些实施方案中，所述癌 症是乳腺癌、表皮癌或胰腺癌。
[0027] 考虑到下述描述、附图以及非限制性实施例，本发明的其他目的和优点以及优选 实施方案的结构和功能将变得明显。

【专利附图】

【附图说明】
[0028] 图 1 示出在用 L-RX-0047 和 cRGD-L-RX-0047 处理之后，MDA-MB-435 细胞中 HIF-I amRNA 下调。
[0029] 图2示出用游离的RX-0047、L-RX-0047和LCAN-RX-0047处理之后，KB细胞中 HIF-I amRNA 的表达。
[0030] 图3示出在用LCAN-RX-0201处理之后，KB细胞中Akt-ImRNA下调。
[0031] 图4示出在LCAN-RX-0201处理之后，Panc-I细胞中Akt-ImRNA下调。
[0032] 图5示出在KB异种移植物肿瘤模型中的体内肿瘤抑制。用3mg/kg的PBS、游离的 RX-0047、L-RX-0047或LCAN-RX-0047对小鼠（每组5只小鼠）进行静脉注射，每3天4次 (Q3DX4)。通过每3至4天用卡尺测量来测定肿瘤尺寸。
[0033] 图6示出在KB异种移植物肿瘤模型中的体内HIF-I a mRNA表达。用3mg/kg的 PBS、游离的RX-0047、L-RX-0047或LCAN-RX-0047对小鼠（每组5只小鼠）进行静脉注射， 每3天4次（030父4)。通过实时1?1'-?〇?来测定11正-1(11111?敵的肿瘤内（;[111:四1：111]1〇四1)表 达。
[0034] 图7示出在KB异种移植物肿瘤模型中用LCAN-RX-0047处理之后的动物存活。用 3mg/kg的PBS、游离的RX-0047或LCAN-RX-0047对小鼠（每组10只小鼠）进行静脉内注 射，每3天4次（Q3DX4)。
[0035] 发明详述
[0036] 本文中在脂质纳米颗粒的上下文中描述了许多实施方案。本领域普通技术人员将 认识到，以下实施方案的详细描述仅是示例性的，而非旨在以任何方式进行限制。在本公开 内容的教导下，对于本领域技术人员而言提出其他实施方案是容易的。在本文中提及"实施 方案"、"方面"或"实施例/实例"表示这样描述的本发明之实施方案可包括特定特征、结构 或特性，但并非每个实施方案都必然包括所述特定特征、结构或特性。此外，重复使用短语 "在一个实施方案中"尽管可以指同一实施方案，但并非必然指同一实施方案。
[0037] 为了清楚起见，本文中并未示出和描述本文所述实施或方法的全部常规特征。当 然将理解，在研发任何这样的实际实施时，将作出许多实施特异性的决定以实现具体目标， 例如依从施用、治疗和对象相关的限制，而且这些具体的目的将在实施之间不同并且在使 用者之间不同。此外，将理解，这样的开发工作可能是复杂且耗时的，但在本公开内容的教 导下，这对于本领域普通技术人员而言不过是常规工作。
[0038] 本文只不过提供了具有提高的转染活性的脂质纳米颗粒（LN)。所述脂质纳米颗粒 可以分隔脂质膜内的疏水分子和/或包封水性核心内的水溶性颗粒。LN制剂可包含单一脂 质或脂质混合物，一般包含带电脂质和中性脂质，并且任选地还包含PEG化脂质和/或胆固 醇。本公开内容的LN制剂可包含白蛋白-聚合物缀合物。在某些实施方案中，所述脂质纳 米颗粒包含高度阳离子化的白蛋白-聚阳离子缀合物（APC)。LN的直径可小于300nm，或者 通常为约50nm至约200nm。根据本发明的LN(尤其是在见于全身施用期间的高血清条件 下）可表现出一个或更多个优点，例如提高的转染和降低的细胞毒性。LN适用于范围广泛 的现有治疗剂和系统，并且可表现出血清稳定性、靶向递送和/或高转染效率。
[0039] 本文中使用的术语"脂质纳米颗粒"是指任何由一种或更多种脂质组分形成的囊 泡。本文中所述的LN制剂可包括阳离子脂质。阳离子脂质是在任何生理pH下均携带净 正电荷的脂质。正电荷用于通过静电相互作用与带负电的治疗剂（例如AS0)缔合。合适 的阳离子脂质包括但不限于3P-[N-(N'，N' -二甲基氨基乙烷）-氨基甲酰基]胆固醇盐 酸盐（DC-Chol) ;1，2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷（DOTAP) ;1，2-二油酰基-3-二甲基 铵-丙烷（DODAP);二甲基二（十八烷基）溴化铵盐（DDAB) ;1，2-二月桂酰基-sn-甘油 基-3-乙基磷酸胆碱氯化物（DL-EPC) ;N-[l-(2,3-二油酰基氧基）丙基]-N-N-N-三甲基氯 化铵（DOTM) ;N-[1-(2, 3-二油酰基氧基）丙基]-N-N-N-二甲基氯化铵（DODM) ;1，2-二 月桂酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱氯化物（DOTM) ;N，N-二（十八烷基）-N，N-二 甲基氯化铵（DODAC) ;N-(1_(2,3-二油酰基氧基）丙基）-N_2_(精胺羧酰胺）乙基）_N， N-二甲基铵三氟乙酸盐（DOSPA) ;1，2_二肉豆蘧基氧基丙基-3-二甲基羟乙基溴化铵 (DMRIE);二（十八烷基）酰胺基甘氨酰精胺（DOGS);与阳离子修饰基团缀合的中性脂质； 及其组合。此外，可以使用作为市售制剂的多种阳离子脂质，例如LIP0FECTIN(来自GIBCO/ BRL)、LIPOFECTAMINE(来自 GIBCO/MRL)、siPORT NEOFX(来自 Applied Biosystems)、 TRANSFECTAM(来自 Promega)和 TRANSFECTIN(来自 Bio-Rad Laboratories，Inc.)。本领 域中已知的或者以后开发的其他阳离子脂质也可在本发明中使用。本领域技术人员将认识 至IJ，有更多种阳离子脂质适合包含在本发明的LN制剂中。本公开内容的阳离子脂质可在制 剂中以脂质的约〇至约60. 0摩尔百分比的浓度存在，或者可在制剂中以脂质的约5. 0至约 50.0摩尔百分比的浓度存在。本文使用的"制剂"指脂质包被的白蛋白纳米颗粒（LCAN)， 其包含本文中限定的含核酸的脂质纳米颗粒和阳离子化的白蛋白-聚合物缀合物。所述制 剂还包含靶向剂（如果存在的话）。
[0040] 本文公开的LN制剂可包含阴离子脂质。阴离子脂质是在生理pH下携带净负电荷 的脂质。这些脂质在与阳离子脂质组合时用于降低LN的总表面电荷，和引入LN双层结构 的pH依赖的破坏，通过在酸性pH下引起非薄层（nonlamellar)相或者引起与细胞膜融合 来促进核苷酸释放。合适的阴离子脂质的实例包括但不限于脂肪酸，例如油酸、亚油酸和亚 麻酸；半琥珀酸胆固醇酯（CHEMS) ;1，2-二-0-十四烷基-sn-甘油基-3-磷-(l'-rac-甘 油）（二醚PG) ;1，2_二肉豆蘧酰基-sn-甘油基-3-磷-(l'-rac-甘油）（钠盐）；1，2_二 肉S?蘧酰基-sn-甘油基-3-磷-L-丝氨酸（钠盐）；1_十六烧酰基，2_(9Z，12Z)十八碳 二烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸酯；1，2_二油酰基-sn-甘油基-3-[磷-rac-(l-甘油）] (DOPG);二油酰基磷脂酸（DOPA)和1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷-L-丝氨酸（DOPS); 与中性脂质缀合的阴离子修饰基团及其组合。本领域中已知或者以后开发的其他阴离子脂 质也可在本发明中使用。本公开内容的阴离子脂质以制剂的约0至约60. 0摩尔百分比的 浓度存在，或者以制剂的约5. 0至约25. 0摩尔百分比的浓度存在。
[0041] 带电LN有利于转染，但可能发生脱靶效应，例如细胞毒性和RES介导的摄取。为了 减弱细胞毒性和/或RES介导的摄取，可以使亲水性分子（例如，聚乙二醇（PEG))与脂质锚 定物（anchor)缀合，并且包含在本文所述的LN中以阻碍LN聚集或者与膜相互作用。亲水 性聚合物可与脂质组分共价键合或者使用交联剂与官能团（例如，胺）缀合。用于缀合的合 适的亲水性聚合物和亲水性聚合物缀合物包括但不限于：聚乙烯醇（PVA);聚山梨酯80 ;1， 2_二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-PEG2000 (DSPE-PEG2000);琥珀酸D- a -生 育酚聚乙二醇lOOO(TPGS);二肉豆蘧酰基磷脂酰乙醇胺-PEG2000(DMPE-PEG2000)和二棕 榈酰基磷脂酰乙醇胺-PEG2000 (DPPE-PEG2000)。本领域中已知的或者以后开发的其他亲水 性聚合物也可在本发明中使用。亲水性聚合物可以以制剂的约〇至约15. 0摩尔百分比的 浓度存在，或者制剂的约5.0至约10. 0摩尔百分比。所用亲水性聚合物（例如PEG)的分 子量可以为约IOODa至约10, OOODa、约IOODa至约5, OOODa或者约IOODa至约2, OOODa。
[0042] 本文所述LN还可包含中性脂质和/或两亲性脂质作为辅助脂质。这些脂质用于 稳定制剂，降低体内清除，或者提高转染效率。LN可配制于糖类溶液中以促进冷冻稳定性 (Iyostability)和低温稳定性（cryostability)，所述糖类例如但不限于葡萄糖、山梨醇、 蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖、纤维二糖、棉子糖、麦芽三糖、葡聚糖或其组合。
[0043] 中性脂质在生理pH下具有零净电荷。本文中公开的任何LN制剂均可包含 一种中性脂质或数种中性脂质的组合。合适的中性脂质包括但不限于：磷脂酰胆碱 (PC)、磷脂酰乙醇胺、神经酰胺（ceramide)、脑苷脂（cerebroside)、前列腺素、鞘磷脂 (sphingomyelin)、脑磷脂、胆固醇、甘油二酯、糖基化的甘油二酯、异戊二烯醇（prenol)、溶 酶体PLA2底物、N-酰基甘氨酸及其组合。
[0044] 其他合适的脂质包括但不限于：磷脂酰胆碱、磷脂酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰 甘油、磷脂酰胆碱和溶血磷脂酰乙醇胺；固醇，例如胆固醇、链留醇（demosterol)、谷甾 醇、酵母留醇、薯蓣皂苷配基、羊毛留烯醇、豆留醇、烯胆固烷醇（lathosterol)和脱氢 表雄酮；和鞘脂类，例如鞘氨醇、神经酰胺、鞘磷脂、神经节甘脂、鞘糖脂、磷酸神经鞘脂 (phosphosphingolipid)、植物鞘胺醇（phytoshingosine);及其组合。
[0045] 本文所述的LN制剂还可包含融合脂质或融合包衣以促进膜融合。合适的融合 脂质的实例包括但不限于甘油单油酸酯、油酸、棕榈酸、磷脂酸、磷酸肌醇4, 5-二磷酸 (PIP2)，及其组合。本领域中已知的或者以后开发的其他融合脂质也可在本发明中使用。
[0046] 本文中所述的LN制剂还可包含阳离子聚合物或阳离子聚合物的缀合物。阳离子 聚合物或其缀合物可单独使用或者与脂质纳米载体组合使用。合适的阳离子聚合物包括但 不限于：聚乙烯亚胺（PEI)、五亚乙基六胺（PEHA);精胺；亚精胺；聚（L-赖氨酸）；聚（酰 氨基胺）（PAMAM)树状聚合物；聚亚丙基亚胺树状聚合物；聚（二甲氨基乙基）-甲基丙烯酸 酯（pDMAEMA);壳聚糖；三（2-氨乙基）胺及其甲基化衍生物；及其组合。本领域中已知或 以后开发的其他阳离子聚合物或缀合物也可在本发明中使用。在聚合物递送系统的实施中 考虑链长度和分支。使用高分子量聚合物（例如，分子量为约25, 000的PEI)作为转染剂， 但会遭受细胞毒性。低分子量聚合物（例如，分子量为约600的PEI)可能不会引起细胞毒 性，但可能由于无法促进与核酸的稳定缩合而使用受限。因此，将低分子量聚合物与较大颗 粒（例如白蛋白）缀合是可用于在制剂中提高核酸缩合的活性同时降低细胞毒性的方法。
[0047] 阴离子聚合物也可并入本文所公开的LN制剂中。合适的阴离子聚合物包括但不 限于：聚（丙基丙烯酸）（PPAA);聚（谷氨酸）（PGA);藻酸类；葡聚糖；黄原胶；衍生的聚合 物；及其组合。本领域中已知的或者以后开发的其他阴离子聚合物也可在本发明中使用。
[0048] 在某些实施方案中，LN制剂包含聚合物的缀合物。所述缀合物可以与靶向剂、亲 脂性部分、肽、蛋白质或提高总体治疗效力的其他分子相交联。合适的交联剂包括但不限 于：N-琥珀酰亚胺基3-[2_吡啶基二硫基]-丙酸酯（STOP) ;3,3'_二硫代双丙酸亚胺酸酯 (dimethyl 3, 3' -dithiobispropionimidate，DTBP);二环己基碳二亚胺（DCC);二异丙基 碳二亚胺（DIC) ;1_乙基-3-(3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺（EDC) ;N-羟磺基琥珀酰亚胺 (Sulfo-NHS) ;N' -N' -羰基二咪唑（CDI) ;N-乙基-5-苯基异唑-3' 磺酸酯（Woodward 的试剂K);及其组合。
[0049] 多种制备LN的方法适于合成本公开内容的LN，包括本领域中已知的方法。例 如，可以采用乙醇稀释、冻融、薄膜水化、超声处理、挤压、高压均质化、洗涤剂透析、微流化 (microfIuidzation)、切向流渗滤、无菌过滤和/或冻干。此外，可采用数种方法来减小LN 的尺寸。例如，可以在适于脂质均质化的任何装置上进行均质化，例如Avestin Emulsiflex C5。经均质化的LN可再循环回到循环中用于进一步均质化。挤出可以在使用合适孔径 (0. 05 y m至0. 2 y m)之聚碳酸酯膜的Lipex Biomembrane挤出机上进行。可以进行多个颗 粒大小减小循环来使样品内的尺寸差异最小化并实现期望的尺寸。然后，可使所得LN通过 Sepharose CL4B以除去过量的反应剂或者通过切向流渗滤来处理。
[0050] 本文所述LN的任意实施方案还可在LN混悬剂中包含乙醇。在LN制剂中并入约 10 %至40 %的乙醇使脂质双层透化。破坏脂质双层有助于与带电部分（例如，ASO和siRNA) 缩合。以此方式制备的LN在施用之前稀释以减小由于乙醇的存在而导致的细胞膜裂解。或 者，可以通过透析和渗滤除去乙醇，而这也会除去未包封的核酸。
[0051] 可以对LN进行灭菌。这可通过使LN通过0.2 iim或0.22 iim的无菌滤器来实现， 进行或者不进行预过滤。
[0052] LN的物理表征可通过许多方法来实现。可以使用动态光散射（DLS)或原子力显 微镜（AFM)来确定平均直径及其标准偏差。理想地，LN应落在200nm的直径以下。用4 电位计来测量（电位可用于测定颗粒的相对稳定性。动态光散射分析和（电位分析二 者均可使用去离子水或合适的缓冲液中的稀释样品来进行。可以使用低温透射电子显微镜 (Cryo-TEM)和扫描电子显微镜（SEM)来确定LN的详细形态。
[0053] 本文所述的LN在冷藏条件下可稳定数月。在LN的合成与施用之间的时间需要延 长的情况下，可使用标准方法来冷冻LN。可以在冷冻之前向LN混悬液中添加冷冻保护剂 (例如，10%蔗糖）以维持制剂的完整性。冷冻干燥的加载的LN制剂因其长期稳定性而被 推荐。
[0054] APC
[0055] 除了阳离子脂质以外，阳离子聚合物也可用于核酸递送系统。单独使用阳离子聚 合物或者组合使用阳离子聚合物与LN作为转染剂常常有益于转染效率。最良好表征的聚 合物转染剂是高分子量的聚乙烯亚胺（分子量为约25kDa的大聚合物，其在本文中被成为 PEI25LPEI25在将pDNA递送至细胞方面已经取得了很大的成功；然而，细胞毒性限制了其 使用。也对分子量为约600kDa的毒性较低的低分子量PEI进行了研究，但这示出缩合与递 送核酸的能力消失。据此，本文提供了高度阳离子化的白蛋白-聚合物缀合物（APC)。APC 可单独用于递送试剂（例如PDNA)或者与基于脂质的制剂组合用来递送试剂（例如SiRNA 或ASO)。白蛋白因其疏水核心还具有内体裂解活性，一旦发生构象变化所述疏水核心即可 暴露并可引起双层破坏或膜融合。白蛋白-PEI600缀合物具有响应于pH变化的离子化特 征谱（profile)。电荷密度在内体pH下增加。
[0056] 在一个实施方案中，APC与阳离子脂质组合进行结合从而装配成阳离子脂 质-APC-核酸纳米颗粒。在另一个实施方案中，APC与阴离子脂质组合进行结合从而装配 成脂质-APC-核酸纳米颗粒。在某些实施方案中，所述脂质纳米颗粒包含高度阳离子化的 白蛋白-聚阳离子缀合物。这些脂质纳米颗粒具有高转染效率而没有额外的细胞毒性。在 另一个实施方案中，低分子量的五亚乙基六胺（PEHA)通过交联剂与人血清白蛋白缀合，产 生高度阳离子化的响应于pH的APC，在本文中也被称为HSA-PEHA。就HSA-PEHA而言，PEHA 与HSA之比为1至30,优选5至20,更优选8至15,更优选10至12。当并入纳米颗粒时， 所得的包含脂质纳米颗粒和并入的高度阳离子化的响应pH之缀合物（例如HSA-PEHA)的 制剂在本文中被称为脂质包被的白蛋白纳米颗粒（LCAN)。示例性LCAN是脂质包被的白蛋 白纳米颗粒，其包含 DOTAP/sPC/TPGS/HSA-PEHA。
[0057] LCAN尤其可用于递送NA,例如反义寡核苷酸，pDNA、siRNA、shRNA、miR和 anti-miR。不希望受到理论限制，认为HSA-PEHA提高了纳米颗粒的稳定性和生物学活 性。在某些实施方案中，此制剂中的脂质是DOTAP、SPC和TPGS。在一些实施方案中， DOTAP : SPC : TPGS之比为约25 : 70 : 5 (m/m)。在一些示例性实施方案中，总脂质与 HSA-PEHA的重量比为20至1，例如15至2或12. 5至2. 5。
[0058] 靶向剂
[0059] 向LN中添加靶向剂可提供超过被动靶向方法的提高的效力。靶向涉及并入特异 性靶向部分，其例如但不限于：配体或抗体、细胞表面受体、肽、脂蛋白、糖蛋白、激素、维生 素、抗体、抗体片段、前药和缀合物，或者这些部分的组合。靶向剂的一些非限制性实例包 括叶酸、cRGD(例如，环（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys) (RGDfC)肽、含半乳糖的部分、转铁蛋白、 EPPTl肽、低密度脂蛋白、表皮生长因子和抗体。cRGD可指相关的cRGD肽或其任何衍生物， 例如，cRGDfC、cRGDfK、cRGDfE等。在一些示例性实施方案中，所述cRGD肽是cRGDfC(环 (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys))。在一些实施方案中，可通过用合适的祀向部分包被LN的表面 而非包封靶向剂来实现靶向效率的最大化。该方法可使LN与细胞表面受体的相互作用最 优化。靶向剂可以在合成过程中直接并入LN中，或者在后续步骤中添加。靶向部分上的官 能团及具体的治疗应用（例如，可降解连接）可有助于确定合适的并入LN中的方法。不具 有亲脂区的靶向部分无法容易地直接插入LN的脂质双层中，并且可能需要在插入之前事 先与脂质缀合，或者可以与LN形成静电复合物。在某些情况下，靶向配体可能不能直接与 亲脂性锚定物结合。在这些情况下，可以利用交联剂形式的分子桥来促进相互作用。在锚 定的靶向部分的空间限制阻止与预期生理学靶标充分相互作用的情况下可以使用交联剂。 此外，如果祀向部分只在某些定向（orientations)情况下（例如，单克隆抗体）起作用，贝U 经交联剂与脂质锚定物连接可能是有益的。可以使用常规的生物缀合方法来连接靶向剂与 LN。可以使用可还原（reducible)或可水解的连接来防止制剂在体内积累以及防止后续的 细胞毒性。
[0060] 在本申请的一些示例性实施方案中，并入RGD(或cRGD)或叶酸靶向剂作为靶向缀 合物，例如，叶酸-PEG-CHEMS (叶酸-聚乙二醇-半琥珀酸胆固醇酯）或叶酸-PEG-DSPE (叶 酸-聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）或cRGDfC-PEG-DSPE(环（RGDfC)-聚乙二醇-二 硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）。在一些靶向缀合物中，最少5摩尔％的缀合物包含靶向剂。在一 些实施方案中，所述缀合物包含至少约50摩尔％、至少约80摩尔％、至少约90摩尔％、或 者至少约95摩尔％的靶向剂。在另一些示例性实施方案中，所述缀合物包含约50摩尔％、 约80摩尔％、约90摩尔％或约95摩尔％的靶向剂。在一些示例性实施方案中，在总脂质 中靶向缀合物的摩尔百分比为约0. 05摩尔％至20摩尔％，例如约0. 5摩尔％至5摩尔％。
[0061] 治疗剂
[0062] 多种治疗剂或诊断剂可与本文所述的LN组合使用。这样的治疗剂和诊断剂的 非限制性实例包括核酸、蛋白质、多糖、脂质、放射性物质、治疗剂、前药及其组合。治疗 剂包括但不限于抗肿瘤剂、抗感染剂、局部麻醉剂、抗过敏剂、抗贫血剂、血管发生抑制剂 (angiogenesis, inhibitor)、￠-肾上腺素能受体阻滞剂、興通道拮抗剂、抗高血压剂、 抗抑郁剂、抗惊厥剂、抗菌剂（anti-bacterial)、抗真菌剂、抗病毒剂、抗风湿剂、驱肠虫 剂（anthelminithics)、抗寄生虫剂、皮质类固醇、激素、激素拮抗剂、免疫调节剂、神经递 质拮抗剂、抗糖尿病剂、抗癫痫剂、抗出血剂、抗高渗剂（anti-hypertonics)、抗青光眼 剂（antiglaucoma agent)、免疫调节细胞因子、镇静剂、趋化因子、维生素、毒素、麻醉剂 (narcotic)、成像剂，及其组合。
[0063] 基于核酸的治疗剂非常适用于本公开内容的LN制剂。这样的基于核酸之治疗剂 的实例包括但不限于pDNA、siRNA、miRNA、anti-miRNA、反义寡核苷酸（ASO)、及其组合。为 了保护免受血清核酸酶和稳定治疗剂，可以对取代核酸和/或磷酸二酯键进行修饰。这样 的修饰包括但不限于：骨架修饰（例如，硫代磷酸酯键）；2'修饰（例如，2'-0_甲基取代的 碱基）；两性离子修饰（6'_氨基己基修饰的0DN);添加亲脂性部分（例如，脂肪酸、胆固醇 或胆固醇衍生物）及其组合。
[0064] 在本发明的一个示例性实施方案中，治疗剂是靶向编码Akt-I之核酸的一部 分并且调节Akt-I之表达的AS0。寡核苷酸化合物设计成特异性地与一个或更多个编 码Akt-I的核酸杂交。这样的ASO公开于美国专利7, 122,527中，其内容通过引用整体 并入本文。一个示例性的aso(rx-〇2〇irArchexin?^)，其是2〇聚体硫代磷酸酯反义 寡核苷酸）靶向Akt-I基因之编码区中具有如下序列的位点：Akt-I基因第1，478位的 5' cgccaaggagatcatgcagc3' (Seq.Id.No. :3)。RX-0201 的骨架序列与该位点互补。
[0065] 另一个AS0(RX-0194)靶向Akt-I基因中具有如下序列的位点：Akt-l基因的第 1,271 位的 5' agtggactggtgggggctgg3' (Seq.Id.No. :4)。RX-0194 骨架的序列与该位 点互补。包含来自取得20聚体RX-0194之序列的上游和下游5或10个核苷酸的寡聚物示 出可测量的Akt-ImRNA表达抑制。RX-0194和RX-0201的截短变体也示出抑制癌细胞增殖。 除了上述2种ASO以外，下调Akt-ImRNA表达并且引起对癌细胞系之细胞毒性的另外5个 反义寡核苷酸化合物包括：
[0066] RX-0616,其包含可与Akt-I基因的在第2101位起始的位点杂交的 5' agatagctggtgacagacag3' （Seq. Id. No. :5)，所述 Akt-I 基因的在第 2101 位起始的位 点具有如下序列：5' ctgtctgtcaccagctatct3' （Seq.Id.No. :6);
[0067] RX-0627,其包含可与Akt-I基因的在第2473位起始的位点杂交的 5' cgtggagagatcatctgagg3' (Seq. Id. No. :7)，所述 Akt-I 基因的在第 2473 位起始的位 点具有如下序列：5' cctcagatgatctctccacg3' (Seq.Id.No. :8);
[0068] RX-0628,其包含可与Akt-I基因的在第2493位起始的位点杂交的 5' tcgaaaaggtcaagtgctac3' (Seq.Id.No. :9)，所述 Akt-I 基因的在第 2493 位起始的位 点具有如下序列：5' gtagcacttgaccttttcgaS' (Seq.Id.No. :10);
[0069] RX-0632,其包含可与Akt-I基因的在第2603位起始的位点杂交的 5' tggtgcagcggcagcggcag3'（Seq.Id.No. :11)，所述 Akt-I 基因的在第 2603 位起始的位 点具有如下序列：5' ctgccgctgccgctgcacca3' （Seq.Id.No. :12);
[0070] RX-0638,其包含可与Akt-I基因的在第170位起始的位点杂交的 5' ggcgcgagcgcgggcctagc3' (Seq.Id.No. :2)，所述 Akt-I 基因的在第 170 位起始的位点 具有如下序列：5' gctaggcccgcgctcgcgcc3' (Seq.Id.No. :13)。
[0071] 在另一些实施方案中，治疗剂是靶向编码HIF-I之核酸的一部分并且调节HIF-I 之表达的AS0。寡核苷酸化合物设计成特异性地与一个或更多个编码HIF-I的核酸杂交。 这样的ASO公开于美国专利7, 205, 283中，其内容通过引用整体并入本文。一个示例性的 AS0(RX_0047,包含 5' aatgagccaccagtgtccaa 3' （Seq.Id.No. :2)的 20 聚体硫代憐酸 酯反义寡核苷酸）是"缺氧诱导因子-I a "（HIF-1 a )的强效抑制剂，并且靶向HIF-I基 因中具有如下序列的位点：HIF-I基因第2, 772 Id. No. : 14)。RX-0047的骨架序列与该位点互补。根据本实施方案的另一个示例性ASO(包 含 5' ggagctaacatctccaagtc3' (Seq.Id.No. :15)的 RX-0149)革巴向 HIF-1 基因的编码区 中具有如下序列的位点：HIF-I基因的第1，936 Id. No. : 16)。RX-0149骨架的序列与该位点互补。包含来自取得20聚体RX-0047和RX-0149 之序列的上游和下游5或10个核苷酸的寡聚物示出可测量的HIF-ImRNA表达抑制和癌细 胞增殖抑制。RX-0047和RX-0149的示出一些HIF-ImRNA表达抑制的截短变体也示出癌细 胞增殖的抑制。
[0072] 本发明包括另一些寡聚反义化合物，包括但不限于寡核苷酸模拟物 (oligonucleotide mimetic)。反义化合物可包括约10至约30个核酸碱基，例如，寡核苷 酸具有约20个核苷碱基（nucleobases)(即，约20个相连的核苷）。如本领域中已知的，核 苷是碱基-糖组合。核苷的碱基部分通常是杂环碱基。这样的杂环碱基的两个最常见的类 别是嘌呤和嘧啶。核苷酸是包括与核苷的糖部分共价连接之磷酸基团的核苷。就包含呋喃 戊糖基糖的那些核苷而言，磷酸基团可与糖的2'、3'或5'羟基部分连接。在形成寡核苷酸 时，相邻的核苷彼此之间通过磷酸基团共价连接从而形成线性聚合物化合物。进而，该线性 聚合物结构的各端可进一步相连以形成环结构，然而，一般优选开放的线性结构。在寡核苷 酸结构中，磷酸基团通常指形成寡核苷酸之核苷间的骨架。RNA和DNA通常的键或骨架是 3'或5'磷酸二酯键。
[0073] 本发明的反义化合物包括任何可药用盐、酯或这些酯的盐或者在施用于动物（包 括人）之后能够（直接或间接）提供生物活性代谢物或其残余物的任何其他化合物。因 此，例如，本公开内容还包括本发明化合物的前药和可药用盐，这些前药的可药用盐以及其 他生物等价物（bioequivalent)。
[0074] 应用
[0075] 根据应用，本文中公开的脂质纳米颗粒可设计成有利的特性，例如提高的与核酸 的相互作用、提高的血清稳定、降低的RES介导的摄取、靶向递送或内体内pH敏感性释放。 由于LN制剂的不同性质，本文提供的数种方法中的任意一种可用于实现特定治疗目的。可 以使用阳离子脂质、阴离子脂质、PEG脂质、中性脂质、融合脂质、阳离子聚合物、阴离子聚合 物、聚合物缀合物、肽、靶向部分及其组合来满足具体目的。
[0076] 本文中所述的脂质纳米颗粒可用作治疗性递送寡核苷酸（ON)治疗剂的平台，所 述ON治疗剂例如cDNA、siDNA、shDNA、miRNA、anti-miR和反义寡核苷酸（ASO)。该治疗剂 可用于治疗多种疾病，例如多种类型的癌症、白血病、病毒感染以及其他疾病。当然，根据本 发明可治疗的特定疾病取决于并入本发明之LN中的治疗剂。本发明特别适于包封核酸，例 如反义寡核苷酸。核酸（特别是反义寡核苷酸）尤其可用于治疗肿瘤和癌症。根据本发明 可治疗的肿瘤和癌症的实例包括例如脑癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、黑素瘤、皮肤癌、表皮癌、 结肠直肠癌、非霍奇金淋巴瘤、子宫内膜癌、胰腺癌、肾（肾细胞）癌、前列腺癌、白血病、甲 状腺癌、头颈部癌、卵巢癌、肝细胞癌、宫颈癌、肉瘤、胃癌、多发性骨髓瘤、淋巴瘤、胃肠癌和 子宫癌。具体实例包括表皮癌、胰腺癌和乳腺癌。
[0077] 许多肿瘤在其细胞表面过表达受体。靶向部分（例如cRGD肽、叶酸、转铁蛋白 (Tf)、抗体、低密度脂蛋白（LDL)及表皮生长因子）可通过使得能够进行靶向的药物递送而 大大提高活性。多靶向的系统是另一个可能，并且可进一步用于明确特定靶细胞亚型。
[0078] 单独或者彼此组合实施本文中所述LN制剂的实施方案与现有范例脂质纳米颗粒 设计协同作用。
[0079] 根据治疗应用，本文所述的LN可通过以下方法施用：经口、肠胃外，静脉内、肌内、 皮下、腹膜内、经皮、肿瘤内、动脉内、全身或传递增强的递送。在一些特定实施方案中，LN经 静脉内、肌内、皮下或肿瘤内递送。可使用替代性施用途径来进行不同或类似LN的后续给 药。
[0080] 本公开内容的药物组合物包含有效量的本文公开的脂质纳米颗粒制剂和/或溶 解或分散于可药用载体中的额外的试剂。术语"药学"或"可药用"指在施用于动物（例如， 人）后不产生不良反应、变态反应或其他不希望的反应的分子实体和组合物。在本公开内 容的教导下，制备包含至少一种化合物或另外的活性成分的药物组合物对于本领域技术人 员而言将是已知的，如Remingtor^ s Pharmaceutical Sciences, 2003中所示，其通过引用 并入本文。此外，对于动物（例如，人）施用，将理解，所述制剂应满足FDA局之生物标准所 要求的无菌、致热原性（pyrogenicity)、一般安全性和纯度标准。
[0081] 本文中所公开的组合物可包含不同类型的载体，取决于其以固体、液体还是气雾 剂形式施用以及其用于诸如注射施用等途径是否需要灭菌。本文中所公开的组合物可以通 过以下方式施用：静脉内、皮内、经皮、鞘内、动脉内、腹膜内、鼻内、阴道内、直肠内、表面、肌 内、皮下、经粘膜、子宫内、经口、表面、局部、经吸入（例如，气雾剂吸入）、通过注射、通过输 注、通过连续输注、通过局部灌注直接洗浴靶细胞、经导管、经灌洗、以乳膏剂、以脂质组合 物（例如，脂质体）或者通过本领域普通技术人员已知的其他方法或前述的任意组合（参 见，例如，Remington' s Pharmaceutical Sciences，2003,其通过引用并入本文）。
[0082] 施用于动物或人患者的本文中所述公开之组合物的实际给药量可通过物理因素 和生理因素来确定，例如体重、病症的严重程度、被治疗疾病的类型、之前或同时进行的治 疗干预、患者的特发性疾病（idiopathy)以及施用途径。根据该剂量和施用途径，有效量和 /或优选剂量的施用次数可根据对象的响应而变化。在任何情况中，负责施用的医学工作者 将确定组合物中活性成分的浓度和对于个体对象而言合适的剂量。
[0083] 在某些实施方案中，药物组合物可包含例如至少约0. 1 %的活性化合物。在另一些 实施方案中，活性化合物可占单位重量的约2 %至约75 %，或者约25 %至约60 %，例如其间 可得出的任何范围。自然而言，可以这样的方式制备的每种可治疗用组合物中活性化合物 的量为将在任何给定单位剂量的化合物中得到的合适的剂量。制备这样的药物制剂的本领 域技术人员将考虑到例如以下因素：溶解度、生物利用度、生物半衰期、施用途径、产品货架 期以及其他药理学考虑因素，因此，可期望多种剂量和治疗方案。
[0084] 在另一些非限制性实例中，一次投药还可包含每次施用约1微克/kg/体重、约5 微克/kg/体重、约10微克/kg/体重、约50微克/kg/体重、约100微克/kg/体重、约200 微克/kg/体重、约350微克/kg/体重、约500微克/kg/体重、约1毫克/kg/体重、约5毫 克/kg/体重、约10毫克/kg/体重、约50毫克/kg/体重、约100毫克/kg/体重、约200毫 克/kg/体重、约350毫克/kg/体重、约500毫克/kg/体重、约1000mg/kg/体重或者更多， 以及其间可得出的任何范围。从本文所列举的数值可得出范围的非限制性实例中，基于上 述数值，可施用如下范围：约5mg/kg/体重至约100mg/kg/体重、约5微克/kg/体重至约 500毫克/kg/体重等。
[0085] 在某些实施方案中，本文的组合物和/或另外的试剂配制成经消化途径施用。消 化途径包括其中组合物与消化道直接接触的所有可能的施用途径。具体地，本文公开的药 物组合物可经口、口腔（bucal Iy)、经直肠或经舌下施用。因此，这些组合物可以与惰性稀释 剂或者与可吸收的可食用载体一起配制。
[0086] 在另一些实施方案中，本文中所述的组合物可以通过肠胃外途径施用。本文使用 的术语"肠胃外"包括绕开消化道的途径。特别地，本文中公开的药物组合物可以经例如 但不限于以下途径施用：静脉内、皮内、肌内、动脉内、鞘内、皮下或腹膜内施用（美国专利 6, 753, 514、6, 613, 308、5, 466, 468、5, 543, 158、5, 641，515 和 5, 399, 363 各自特别地通过引 用整体并入本文）。
[0087] 作为游离碱或可药用盐的本文所公开之组合物的溶液可在水中合适地与表面活 性剂（例如，羟丙基纤维素）混合制备。分散体还可在如下中制备：甘油、脂质聚乙二醇及 其混合以及油。在常规储存和使用条件下，这些制剂包含防腐剂以防止微生物生长。适于 注射用的药物形式包括无菌水溶液或或分散体以及用于临时制备无菌注射液或分散体的 无菌散剂（美国专利5, 466, 468,其特别地通过引用整体并入本文）。在所有情况下，剂型 (form)都必须是无菌的并且必须是以易于注射的流动程度存在。其在制造和储存条件下 必须是稳定的，并且必须保存为免受微生物（例如细菌和真菌）的污染作用。载体可以是 含以下的溶剂或分散介质，例如水、乙醇、多元醇（即，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等）、其 合适的混合物和/或植物油。可以例如通过以下来保持合适的流动性：使用包衣，例如卵磷 脂；在分散体的情况下保持所需的颗粒大小以及使用表面活性剂。可以通过多种抗菌剂和 抗真菌剂（例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞等）来防止微生物的作用。 在许多情况下，优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收的试 剂（例如，单硬脂酸铝或明胶）来实现可注射组合物的延长的吸收。
[0088] 就水溶液的肠胃外施用而言,例如,如果必要的话,应合适地缓冲溶液,首先用足 量的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。这些特定水溶液尤其适于静脉内、肌内、皮下和腹膜 内施用。就此而言，在本公开内容的教导下，本领域技术人员将知晓可使用的无菌水性介 质。例如，可以将1个剂量溶解于等渗的NaCl溶液中，或者添加到IOOOml的皮下灌注术流 体中或者在推荐的输注部位注射（参见例如，"RemingtoY s Pharmaceutical Sciences" 第15版，第1035至1038和1570至1580页）。根据接受治疗之对象的病症，剂量必然会 发生一些变化。在任何情况下，负责施用的人将确定对于个体对象而言合适的剂量。此外， 就人施用而言，制剂应满足FDA局生物标准所要求的无菌、致热原性、一般安全性及纯度标 准。
[0089] 无菌注射溶液通过如下所述来制备：向具有多种上文列举的其他成分（根据需 要）的合适溶剂中添加需要量的组合物，接着进行过滤除菌。一般而言，分散体通过如下 所述来制备：向含基本分散介质和所需的上文所列举之其他成分的无菌载剂中添加多种无 菌组合物。在用于制备无菌注射溶液的无菌散剂的情况下，一些制备方法是真空干燥和冷 冻干燥技术，其产生活性成分加上来自其此前的经过滤无菌溶液之任何其他期望成分的散 齐U。在使用或者不使用稳定剂的情况下，将粉末化的组合物与液体载体（例如，水或盐水溶 液）组合。
[0090] 在另一些实施方案中，所述组合物可配制成经多种混杂途径施用，例如表面（即， 经皮）施用、经粘膜施用（鼻内、经阴道等）和/或经吸入。
[0091] 用于局部施用的药物组合物可包括配制用于给药应用的组合物，例如软膏、糊剂、 乳膏剂或散剂。软膏包括所有用于局部施用的油质的吸收性乳剂和基于水溶性的组合物， 而乳膏剂和洗剂是仅包括乳剂基质的那些组合物。局部施用的药物可包含渗透增强剂以促 进活性成分通过皮肤吸收。合适的渗透增强剂包括甘油、醇类、烷基甲基亚砜、吡咯烷酮及 luarocapram。对于用于表面施用的组合物而言的可用的基质包括聚乙二醇、羊毛脂、冷霜 和矿脂以及任何其他合适的吸收、乳剂或水溶性软膏基质。表面制剂在必要时还可包含乳 化剂、凝胶化剂和抗微生物防腐剂以保存该组合物和提供均匀的混合物。所述组合物的经 皮施用还可包括使用"贴剂（patch)"。例如，贴剂可以预定速率和连续的方式在固定时间 段提供一种或更多种组合物。
[0092] 在某些实施方案中，所述组合物可通过滴眼剂、鼻内喷雾剂（intranasal spray)、 吸入剂和/或其他气雾剂递送载体来递送。用于将组合物经鼻内气雾喷雾直接递送至肺 的方法描述于美国专利5, 756, 353和5, 804, 212中（均特别地通过引用整体并入本文）。 同样，使用鼻内微颗粒树脂（Takenaga等，1998)和溶血磷脂酰甘油化合物（美国专利 5, 725, 871，其特别地通过引用整体并入本文）进行药物递送在药学领域是公知的，并且可 用于递送本文所述的组合物。同样，以聚四氟乙烯支持物基质的形式进行透粘膜药物递送 描述于美国专利5, 780, 045 (其特别地通过引用整体并入本文）中，并且可用于递送本文所 述的组合物。
[0093] 还考虑，本文公开的组合物可经气雾剂递送。术语气雾剂指分散于液化或加压气 体抛射剂中的微细固体或液体颗粒的胶体系统。用于吸入的典型气雾剂由活性成分在液体 抛射剂或者液体抛射剂与合适溶剂之混合物中的悬浮液组成。合适的抛射剂包括烃和烃 醚。合适的容器将根据抛射剂的压力要求而不同。气雾剂的施用将根据对象的年龄、体重 以及症状的严重程度和响应而不同。 实施例
[0094] 实施例1.脂质体制剂和LCAN制剂的制备
[0095] 1.制备和表征用于反义寡核苷酸的脂质体制剂
[0096] 通过乙醇扩散方法来制备用于RX-0047的脂质体制剂（L-RX-0047)。脂质体组合 物为摩尔比为45 : 50 : 5的D0TAP/D0PE/TPGS或DOTAP/soyPC/TPGS。简言之，将脂质 溶解于含有或不含EPI2K(即，分子量为约2000的PEI)的乙醇中。脂质与PEI2K之比为 12. 5 : 1。将RX-0047溶解于柠檬酸盐缓冲液（20mM，pH4)中，然后在涡旋下添加到脂质溶 液或脂质/PEI2K溶液中，从而在40% (v/v)的乙醇浓度自发形成预脂质体。RX-0047与脂 质的重量比为12.5 : 1。然后在室温下用柠檬酸盐缓冲液（20mM，pH4)对该复合物进行透 析2小时，接着在室温下用HEPES缓冲盐水（HBS，20mM HEPES，145mM NaCl，pH 7. 4)透析过 夜，使用 MWCO IOOOODalton Spectra/Por Float-A-Lyzer 仪（SDectrum Laborato ries， Rancho Dominguez，CA)除去游离的 RX-0047。
[0097] 按照与如上所述相同的方法制备用于RX-0047的叶酸靶向的脂质体制剂 (F-L-RX-0047)。该脂质体包含摩尔比为 45/50/4. 5/0. 5 或 45/50/4/1 的 DOTAP/sPC/TPGS/ F-PEG-CHEMS。
[0098] 按照与如上所述相同的方法制备用于RX-0047的R⑶靶向的脂质体制剂 (cRGD-L-RX-0047)。该脂质体包含摩尔比为 45/50/4. 5/0. 5 或 45/50/4/1 的 DOTAP/sPC/ TPGS/cRGD-PEG-DSPE〇
[0099] 2. HSA-PEHA缀合物的合成
[0100] 通过用EDC活化HSA上的羧基并与PEHA上的胺形成酰胺键来合成HSA-PEHA缀 合物。在合成期间使用的HSA : PEHA : EDC摩尔比为1 : 1500 : 200(mol/mol)。通过 使HSA与大幅过量的PEHA在50mM硼酸缓冲液或水（pH 8. 0)中的1-乙基-3- (3-二甲氨 基）_丙基碳二亚胺（EDC)和磺基-N-羟基琥珀酰亚胺的存在下反应来使HSA(25%，购自 Octapharma)与五亚乙基六胺缀合（PEHA，购自Sigma-Aldrich)。简言之，将5g的PEHA(MW 232. 37,工业级）溶解于80mL CldH2O中，然后使用IM HCl调节至pH 8.0。然后，在搅拌下向 PEHA溶液中添加 Ig (4mL)的HSA和562. 5mg的1-乙基-3-(3-二甲氨基）-丙基碳二亚胺 (EDC，溶解于DMSO中）。反应在室温持续3至4小时。通过凝胶膜色谱在ro-10脱盐柱上 纯化HSA-PEHA产物，或者使用MWCO 10, 000色谱膜用CldH2O (双蒸水）在4°C进行透析以除 去未反应的PEHA和副产物。每3至4小时更换透析缓冲液一次，直到通过标准的茚三酮或 三硝基苯磺酸（TNBS)胺测定在透析循环结束时的3小时时间点的外部缓冲液中检测不到 来自PEHA的胺。对于大规模合成，应当用切向流渗滤来代替透析方法，例如使用MiIlipore Pellicon盒系统或Spectropor中空纤维系统。该方法可用于将产物浓缩至期望的浓度。 使产物通过0. 22 y m无菌滤器进入无菌容器中，并且在4°C保存。对于长期储存而言，产物 可在-20°C保存。还可以将产物冻干。
[0101] 通过BCA蛋白质测定来测定产物蛋白质浓度，并使用基于PEHA的标准曲线通过 TNBS胺含量测定来测定产物中的PEHA含量。通过基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱 法（MADLI TOF MS)来测定HSA-PEHA缀合物的分子量。平均上，基于示出m/z为66405. 756 的结果，每个HSA连接有11个PEHA。SDS-PAGE分析示出，缀合物作为一个单独的条带迁移， 表明HSA-PEHA产物中缺少分子间交联。
[0102] 3. cRGDfC-PEG-DSPE 缀合物的合成
[0103] cRGDfC (环（Arg-Gly-Asp-D-Phe-Cys))和 PEG-DSPE-马来酰亚胺通过-SH 和-马 来酰亚胺反应形成的硫醚键缀合。反应期间使用的cRGDfC和PEG-PSPE-马来酰亚胺摩尔比 为1. 5 : 1。合并分别溶解于含5mM EDTA (pH = 7. 0)的PBS缓冲液中的cRGDfC和PEG-DSPE 溶液，并伴随搅拌于室温反应6小时。通过在ro-io柱上凝胶过滤来纯化产物以从产物中 除去未反应的/过量的cRGDfC。对于大规模反应，可以用GPC (使用MWCO 2000膜的透析） 或切向流渗滤来代替凝胶过滤。可以将产物冷冻或冻干以保持长期稳定性。通过HPLC和 LC-MS来确认产物纯度。按照说明书可以建立最低的cRGDfC缀合水平（例如，80% )和游 离肽含量（例如，< 1% )。可以通过BCA蛋白质测定来确定产物中的cRGDfC含量。
[0104] 4.叶酸-PEG-DSPE缀合物的合成
[0105] 使IOmg叶酸与在具有少量三乙胺（20 ill)之DMSO (0. 5ml)中的7mg的N， N'-二环己基碳二亚胺（DCC)和2. 87mg的N-羟基琥珀酰亚胺（NHS)以叶酸/DCC/NHS = 1/1. 5/1. 1的摩尔比在室温反应3小时。对反应混合物进行离心以出去副产物二环己基脲。 将77mg的DSPE-PEG-胺溶解于具有少量三乙胺（20 yl)的DMSO (0.5ml)中，然后与以上合 成的叶酸-NHS以I : 1的摩尔比在室温反应3小时。通过用IOX体积丙酮沉淀来纯化叶 酸-PEG-DSPE。通过离心来收集沉淀物，然后在真空下干燥。使用MWCO 2000膜用CldH2O通 过透析进一步纯化产物，接着进行冻干。通过HPLC来确认产物纯度。按照说明书建立相对 于全部PEG化脂质的最低叶酸缀合水平（例如，80%)并且检测不到的游离叶酸含量。通 过UV光谱在37 Inm处或者通过HPLC测定产物中的叶酸含量
[0106] 5?叶酸-PEG-DSPE缀合物的合成
[0107] 通过使叶酸-PEG-胺与CHEMS-NHS反应来进行叶酸-PEG-CHEMS的合成。叶 酸-PEG-胺与CHEMS-NHS二者均通过先前所述方法来合成（Xiang等，Int J Pharm.， 356(2008)29-36)。简言之，对于叶酸-PEG-双-胺的合成，将叶酸（26. 5mg)和PEG-双-胺 (167. 5mg)溶解于ImL DMSO中。然后，向溶液中添加8. 6mg的NHS和15. 5mg的DCC，使反 应在室温过夜进行。然后通过Sephadex G-25凝胶过滤色谱来纯化产物叶酸-PEG-胺。对 于CHEMS-NHS的合成，使CHEMS(Ig)与四氢呋喃中的475mg NHS和I. 25g DCC在室温反应 过夜。通过重结晶纯化产物CHEMS-NHS。最后，对于F-PEG-CHEMS的合成，将叶酸-PEG-胺 (13711^，4011111〇1)和(：冊]^-順3(29.211^，5011111〇1)溶解于〇1(：13(501^)中，并在室温下反应 过夜。然后通过旋转蒸发除去溶剂（CHCl3),并在50mM Na2CO3(IOmL)中水合残余物以形成 F-PEG-CHEMS胶束。然后使用分子量截止（MWCO)为14kDa的谱透析膜用去离子水来透析 胶束，以除去低分子量副产物。然后通过冻干来干燥产物F-PEG-CHEMS，其产生黄色粉末产 物（130mg)，产率为76. 5%。通过薄层色谱（TLC)以及通过DMS0-d6中的1H NMR来确认产 物的身份。
[0108] 6.制备与表征用于反义寡核苷酸的LCAN制剂
[0109] 通过乙醇稀释方法来制备脂质包被的白蛋白纳米颗粒（LCAN)。将脂质1，2-二油 酰基-3-三甲基铵-丙烧（DOTAP) (Avanti Polar Lipids)、来自大豆的L-a-磷脂酰胆碱 (SPC) (Avanti Polar Lipids)以及 d_ a-生育酌?聚乙二醇 1000 玻拍酸酯（TPGS) (Eastman Chemical)溶解于乙醇中。以25 : 70 : 5(m〇l/m〇l)组合脂质。将HSA-PEHA与脂质溶液 以12.5 : 3的重量比混合。反义组合物/总脂质/HSA-PEHA的重量比为I : 10 : 3。简 言之，在涡旋下将H印es缓冲剂（20mM，pH 7. 4)中的HSA-PEHA与溶解于EtOH中的脂质混 合，所得的EtOH浓度为60%。将RX-0047或RX-0201溶解于H印es缓冲液（20mM，pH 7. 4) 中，然后在涡旋下添加到脂质和HSA-PEHA溶液中，从而在40 % (v/v)的EtOH浓度自发形 成预LCAN。然后在室温用Ifepes缓冲液（20mM，pH 7. 4)对该复合物进行透析2小时，然后 在室温使用JEPES缓冲盐水（HBS，20mM HEPES，145mM NaCl，pH 7. 4)对复合物进行透析过 夜，使用MWCO IOOOODalton Snakeskin透析管除去游离的AS0。
[0110] 将LCAN制剂浓缩到20倍然后用Ifepes缓冲液（5mM，pH 7. 4)洗涤以除去NaCl。 将产物稀释至期望的浓度并添加10 %蔗糖。然后经〇. 45 y m滤器过滤终产物，然后储存 在-70。。。
[0111] 7.制备和表征用于反义寡核苷酸的靶向LCAN制剂
[0112] 按照与实施例5所述相似的方法制备RGD靶向的LCAN制剂。对于该RGD靶向的 LCAN 制剂，脂质由 DOTAP/soyPC/TPGS/cRGDfC-PEG-DSPE 以 25 : 70 : 4 : 1 的摩尔比构 成，并且反义组合物/总脂质/HSA-PEHA的重量比为I : 10 : 3。通过以25 : 70.4 : 1 的比例混合DOTAP、soyPC、TPGS和cRGDfC-PEG-DSPE来制备含靶向剂的脂质混合物。通 过两个泵和Y连接器将60%乙醇中的脂质混合物组分（溶液A)和20%乙醇中的等体积 hsa-peha (溶液B)合并以得到4〇 %乙醇溶液（溶液O。将rx-〇2〇i (Archexin?])溶解 于具有40%乙醇的HEPES缓冲液（20mM，pH 7. 4)中，以形成溶液D。通过两个泵和Y连接 器将等体积的溶液C和溶液D合并以得到40%乙醇溶液（溶液E)，并且边搅拌边用CldH2O 将溶液E稀释四倍得到10%乙醇。向溶液E中添加等体积的0. 5M NaCl以产生含250mM NaCl和5%乙醇浓度的溶液（溶液F)。通过切向流渗滤来纯化R⑶靶向的LCAN产物溶液 F，MWCO 30kDa膜中包括将溶液F中RX-0201浓缩为0. 5mg/mL的浓度作为第一步，用5mM 磷酸缓冲液（PH7.4)进行渗滤直至渗透液滴中的RX-0210浓度降低至低于lOyg/ml作为 第二步骤，而产物的浓度达到RX-0201浓度为2. 5mg/mL为最终步骤。向产物中添加1/4体 积的50%蔗糖以产生10%的蔗糖溶液，并经过0. 22 无菌滤器过滤；如果必要的话采用 预过滤。对于冻干，在无菌条件下，将经过滤的产物（IOmL)转移到50mL小瓶中，采用2阶 段程序冷冻和冻干：将托架（shelf)冷却到0°C，以0. 5°C /分钟冷却到_40°C，将压力降低 至0. 12-0. 16个大气压（atm)，在-25°C初始干燥30小时。以5°C /分钟加热到25°C，进行 6小时最大真空干燥。将最终的cRGD靶向LCAN产物储存在4°C，并在使用时用水重新构建 用于注射。
[0113] 其他靶向的 LCAN 产物例如叶酸-LCAN-RX-0201、cRGD-LCAN-RX-0047 和叶 酸-LCAN-RX-0047按照与如上所述相同的方法来制备。
[0114] 实施例2 :脂质体制剂和LCAN制剂的表征
[0115] R⑶靶向的脂质体制剂由 DOTAP/sPC/TPGS/cRGDfC-PEG-DSPE 以 45/50/4. 5/0. 5 或 45/50/4/1的摩尔比组成。颗粒大小和4电位示于表1中。cRGDfC-PEG-DSPE浓度不改变 脂质体颗粒大小和（电位。
[0116] 表I. RGD靶向脂质体制剂的表征
[0117]

【权利要求】
1. 脂质纳米颗粒组合物，其包含与聚合物缀合的大分子和靶向剂。
2. 脂质纳米颗粒组合物，其包含与聚合物缀合的大分子和治疗剂，所述治疗剂包含选 自以下的反义寡核苷酸（ASO): 靶向编码Akt-1之核酸的一部分并且调节Akt-1之表达的ASO ;和 靶向编码HIF-1之核酸的一部分并且调节HIF-1之表达的ASO。
3. 根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒组合物，其还包含治疗剂，所述治疗剂包含选 自以下的反义寡核苷酸（ASO): 靶向编码Akt-1之核酸的一部分并且调节Akt-1之表达的ASO ;和 靶向编码HIF-1之核酸的一部分并且调节HIF-1之表达的ASO。
4. 根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述聚合物是带电荷的。
5. 根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述聚合物是带正电荷的。
6. 根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述大分子包含白蛋白。
7. 根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述与聚合物缀合的大分子 包含白蛋白-聚阳离子缀合物。
8. 根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述缀合是通过交联剂缀合。
9. 根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述大分子包含五亚乙基六 胺（PEHA)，并且所述聚合物包含人血清白蛋白（HSA)。
10. 根据权利要求5所述的脂质纳米颗粒组合物，其中PEHA分子与HSA分子的比为约 11 ： 1〇
11. 根据权利要求5所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述带正电的聚合物包含四亚 乙基六胺。
12. 根据权利要求5所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述带正电的聚合物包含四亚 乙基五胺。
13. 根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含两种 或更多种低分子量聚合物的混合物。
14. 根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述脂质纳米颗粒包含 DOTAP、SPC和 TPGS。
15. 根据权利要求14所述的脂质纳米颗粒组合物，其中DOTAP : SPC : TPGS的摩尔比 为约 25 : 70 : 5。
16. 根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒还包含选自以下 的治疗剂：核酸、蛋白质、多糖、脂质、放射性物质、治疗剂、前药及其组合。
17. 根据权利要求14所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述治疗剂是核酸。
18. 根据权利要求17所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述核酸选自pDNA、反义寡核 苷酸、miR、antimiR、shRNA、siRNA 或其组合。
19. 根据权利要求2或18所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述反义寡核苷酸是具有 包含5'gctgcatgatctccttggcg 3'（Seq.Id.No. :1)之序列的化合物，其革巴向编码人Akt-1 的核酸分子并调节Akt-1的表达。
20. 根据权利要求2或18所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述反义寡核苷酸是具有 包含5'aatgagccaccagtgtccaa 3'（Seq.Id.No. :2)之序列的化合物，其革巴向编码人HIF-1 的核酸分子并调节HIF-1的表达。
21. 根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒组合物，其还包含基因融合肽。
22. 根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述脂质纳米颗粒的颗粒大 小小于约300nm。
23. 根据权利要求1或2所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述脂质纳米颗粒的颗粒大 小小于约150nm。
24. 根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述靶向剂通过直接连接或者 通过交联剂与所述脂质纳米颗粒的外表面相结合。
25. 根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述靶向剂包含抗体或抗体片 段。
26. 根据权利要求1所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述靶向剂包含选自以下的部 分：cRGD肽、含半乳糖的部分、转铁蛋白、叶酸、低密度脂蛋白、表皮生长因子和抗体。
27. 根据权利要求26所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述靶向剂包含cRGDfC或叶 酸。
28. 根据权利要求27所述的脂质纳米颗粒组合物，其中所述靶向剂包含选自以下的缀 合物：叶酸-PEG-CHEMS (叶酸-聚乙二醇-半琥珀酸胆固醇酯）、叶酸-PEG-DSPE (叶酸-聚 乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）和cRGDfC-PEG-DSPE (环（RGDfC)-聚乙二醇-二硬脂 酰基磷脂酰乙醇胺）。
29. 药物组合物，其包含根据前述权利要求中任一项所述的脂质纳米颗粒组合物和可 药用赋形剂。
30. 根据权利要求29所述的药物组合物，其中所述药物组合物是无菌溶液或混悬液。
31. -种制备脂质包被的白蛋白纳米颗粒（LCAN)的方法，所述方法包括： 合成HSA-PEHA缀合物； 制备脂质混合物； 向所述HSA-PEHA缀合物中添加该脂质混合物；以及 向所述脂质混合物和所述HSA-PEHA缀合物中添加反义寡核苷酸（ASO)，以得到LCAN前 体；其中所述ASO选自靶向编码Akt-1之核酸的一部分并且调节Akt-1之表达的ASO ;和靶 向编码HIF-1之核酸的一部分并且调节HIF-1之表达的ASO。
32. -种制备脂质包被的白蛋白纳米颗粒（LCAN)的方法，所述方法包括： 合成HSA-PEHA缀合物； 制备脂质混合物；和 向所述HSA-PEHA缀合物中添加靶向剂和所述脂质混合物。
33. 根据权利要求32所述的方法，其中所述靶向剂包含选自以下的部分：cRGD肽、含半 乳糖的部分、转铁蛋白、叶酸、低密度脂蛋白、表皮生长因子和抗体。
34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述靶向剂包含cRGDfC或叶酸。
35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述靶向剂包括选自以下的缀合物：叶 酸-PEG-CHEMS (叶酸-聚乙二醇-半琥珀酸胆固醇酯）、叶酸-PEG-DSPE (叶酸-聚乙二 醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺）和cRGDfC-PEG-DSPE (环（RGDfC)-聚乙二醇-二硬脂酰基 磷脂酰乙醇胺）。
36. 根据权利要求32所述的方法，其中所述脂质混合物包含DOTAP、soyPC、TPGS和 cRGDfC-PEG-DSPE〇
37. 根据权利要求36所述的方法，其中DOTAP : soyPC : TPGS : cRGDfC-PEG-DSPE的 摩尔比为约25 : 70 : 4 : 1。
38. 根据权利要求31或32所述的方法，其中所述脂质混合物包含D0TAP、SPC和TPGS。
39. 根据权利要求38的方法，其中DOTAP : SPC : TPGS的摩尔比为约25 : 70 : 5。
40. 根据权利要求32所述的方法，其还包括向所述脂质混合物和靶向剂中添加治疗 齐U，其中所述治疗剂是选自以下的核酸：PDNA、反义寡核苷酸、miR、antimiR、shRNA、siRNA 或其组合。
41. 根据权利要求40所述的方法，其中所述治疗剂包含选自以下的反义寡核苷酸 (AS0):祀向编码Akt-1之核酸的一部分并且调节Akt-1之表达的AS0 ;和靶向编码HIF-1 之核酸的一部分并且调节HIF-1之表达的AS0。
42. 根据权利要求31或41所述的方法，其中所述反义寡核苷酸是具有包含 5'gctgcatgatctccttggcg 3'（Seq.Id.No. :1)之序列的化合物，其革巴向编码Akt-1的核酸 分子并且调节Akt-1的表达。
43. 根据权利要求31或41所述的方法，其中所述反义寡核苷酸是具有包含 5'aatgagccaccagtgtccaa 3'（Seq.Id.No. :2)之序列的化合物，其革巴向编码人HIF-1的核 酸分子并且调节HIF-1的表达。
44. 一种诊断或治疗癌症或感染性疾病的方法，所述方法包括向有此需要的患者施用 有效量的权利要求29所述的药物组合物。
45. 根据权利要求44所述的方法，其中所述癌症选自：脑癌、膀胱癌、肺癌、乳腺癌、黑 素瘤、皮肤癌、表皮癌、结肠直肠癌、非霍奇金淋巴瘤、子宫内膜癌、胰腺癌、肾（肾细胞）癌、 前列腺癌、白血病、甲状腺癌、头颈部癌、卵巢癌、肝细胞癌、宫颈癌、肉瘤、胃癌、多发性骨髓 瘤、淋巴瘤、和胃肠癌以及子宫癌。
46. 根据权利要求44所述的方法，其中所述癌症选自乳腺癌、表皮癌和胰腺癌。
【文档编号】A61K47/48GK104428005SQ201380026005
【公开日】2015年3月18日 申请日期:2013年5月23日 优先权日:2012年5月23日
【发明者】罗伯特·J·李, 李永福, 金德中, 安昌浩 申请人:俄亥俄州立大学