一种经修饰的溶瘤病毒、包含经修饰的溶瘤病毒的组合物及其用途的制作方法

本发明涉及肿瘤治疗，具体涉及到一种经修饰的溶瘤病毒、包含经修饰的溶瘤病毒的组合物及其用途。

背景技术：

1、每年全世界超过1400万人被诊断为肿瘤。尽管医学研究中有许多进展，但肿瘤仍占所有死亡的约16％。

2、恶性肿瘤通常对常规疗法具有抗性，并代表颇具难度的治疗挑战。例如，微转移可在原发性肿瘤发展的极早期阶段建立。因此，在确诊时，许多肿瘤患者已经患有微小转移。肿瘤反应性t细胞可以找出和破坏微转移，并保护周围健康组织。然而，天然存在的抗恶性肿瘤t细胞应答通常不足以引起原发性或转移性肿瘤的消退。

3、溶瘤病毒已经显示出作为抗肿瘤剂的潜力。与常规基因治疗不同，溶瘤病毒能够借助于病毒复制和伴随的细胞裂解而扩散通过肿瘤组织。然而，溶瘤病毒本身也不足以治疗原发性或转移性肿瘤。

4、因此，特别急迫地需要增强溶瘤病毒的效力和清除转移性肿瘤细胞。

技术实现思路

1、在一方面，本公开涉及一种经修饰的溶瘤病毒，该溶瘤病毒包含病毒基因组，该病毒基因组具有编码能够抑制pd-1与pd-l1之间的相互作用的第一分子的第一异源多核苷酸和编码能够抑制tgf-β信号传导的第二分子的第二异源多核苷酸。

2、在某些实施方案中，溶瘤病毒选自痘苗病毒、腺病毒、呼肠孤病毒、麻疹病毒、单纯疱疹病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、细小病毒、鸡贫血病毒、麻疹病毒、柯萨奇病毒、水泡性口炎病毒、塞内加谷病毒、马拉巴病毒、新城疫病毒和粘液瘤病毒。在某些实施方案中，溶瘤病毒是痘苗病毒。

3、在某些实施方案中，经修饰的溶瘤病毒是减毒病毒，并且可以在肿瘤细胞中复制。

4、在某些实施方案中，病毒基因组包含至少一个缺失或破坏，使得病毒能够在肿瘤细胞中选择性复制。在某些实施方案中，缺失或破坏位于开放阅读框(orf)中，该开放阅读框编码既对于病毒的复制至关重要并且又在肿瘤细胞中比在非肿瘤细胞中优先表达的酶的至少一部分。在某些实施方案中，酶是激酶。在某些实施方案中，酶是胸苷激酶。

5、在某些实施方案中，溶瘤病毒源自western reserve毒株。

6、在某些实施方案中，将第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸插入以代替缺失。

7、在某些实施方案中，将第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸构造成使得它们在经修饰的溶瘤病毒的复制周期的相同或不同阶段中表达。

8、在某些实施方案中，第一分子是第一融合蛋白，并且第二分子是第二融合蛋白。在某些实施方案中，第一异源多核苷酸包含在有义链的5'至3'取向上的以下框内元件：第一启动子-编码第一融合蛋白的多核苷酸-第一终止密码子，并且第二异源多核苷酸包含在有义链的5'至3'取向上的以下框内元件：第二启动子-编码第二融合蛋白的多核苷酸-第二终止密码子。

9、在某些实施方案中，从第一异源多核苷酸表达的第一融合蛋白和从第二异源多核苷酸表达的第二融合蛋白作为单独的蛋白质表达。在某些实施方案中，第一异源多核苷酸紧邻第二异源多核苷酸的上游或紧邻其下游。在某些实施方案中，其中第一启动子能够驱动第一融合蛋白的表达，并且第二启动子能够驱动第二融合蛋白的表达，其中第一启动子和第二启动子处于头对头取向。

10、在某些实施方案中，第一启动子和第二启动子是相同或不同的。在某些实施方案中，第一启动子和第二启动子都是早期和晚期启动子。在某些实施方案中，早期和晚期启动子是pse/l。

11、在某些实施方案中，第一终止密码子和第二终止密码子是相同或不同的。

12、在某些实施方案中，第一融合蛋白包含pd-1胞外结构域(pd-1ecd)。在某些实施方案中，第一融合蛋白还包含第一免疫球蛋白fc区。在某些实施方案中，第一免疫球蛋白fc区是第一人igg1 fc区。

13、在某些实施方案中，pd-1ecd在pd-1ecd的c末端与第一免疫球蛋白fc区可操作地连接。

14、在某些实施方案中，第一融合蛋白还包含信号肽。

15、在某些实施方案中，信号肽在该信号肽的c末端与pd-1ecd可操作地连接。在某些实施方案中，信号肽是cd33信号肽。

16、在某些实施方案中，pd-1ecd包含seq id no:1的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施方案中，氨基酸序列由seq id no:7的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码。

17、在某些实施方案中，第一人igg1 fc区包含seq id no:3的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施方案中，氨基酸序列由seq id no:9的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码。

18、在某些实施方案中，cd33信号肽包含seq id no:4的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施方案中，氨基酸序列由包含seq id no:11的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码。

19、在某些实施方案中，第一融合蛋白包含seq id no:5的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施方案中，氨基酸序列由包含seq id no:13的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码。

20、在某些实施方案中，第一分子是抗pd-1抗体，并且第二分子是第二融合蛋白。

21、在某些实施方案中，抗pd-1抗体包含：具有seq id no:23的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列的hcdr1、具有seq id no:24的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列的hcdr2、具有seq id no:25的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列的hcdr3、具有seq id no:26的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列的lcdr1、具有seq id no:27的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列的lcdr2和具有seq id no:28的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列的lcdr3。

22、在某些实施方案中，hcdr1由seq id no:31的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码，hcdr2由seq id no:32的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码，hcdr3由seq id no:33的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码，lcdr1由seq id no:34的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码，lcdr2由seq id no:35的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码，并且lcdr3由seq id no:36的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码。

23、在某些实施方案中，抗pd-1抗体包含具有seq id no:29的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列的重链可变区和具有seq id no:30的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列的轻链可变区。

24、在某些实施方案中，抗pd-1抗体重链可变区由seq id no:37的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码，并且抗pd-1抗体轻链可变区由seq id no:38的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码。

25、在某些实施方案中，抗pd-1抗体包含具有seq id no:21的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列的全长重链和具有seq id no:20的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列的全长轻链。

26、在某些实施方案中，抗pd-1抗体全长重链由seq id no:39的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码，并且抗pd-1抗体全长轻链由seq id no:40的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码。

27、在某些实施方案中，第一异源多核苷酸还包含第三异源多核苷酸和第四异源多核苷酸，其中第三异源多核苷酸包含在有义链的5'至3'取向上的以下框内元件：第三启动子-编码抗pd-1抗体重链的多核苷酸-第三终止密码子，并且其中第四异源多核苷酸包含在有义链的5'至3'取向上的以下框内元件：第四启动子-编码抗pd-1抗体轻链的多核苷酸-第四终止密码子；并且第二异源多核苷酸还包含在有义链的5'至3'取向上的以下框内元件：第二启动子-编码第二融合蛋白的多核苷酸-第二终止密码子。

28、在某些实施方案中，第三异源多核苷酸紧邻第四异源多核苷酸的上游或紧邻其下游。在某些实施方案中，第一异源多核苷酸紧邻第二异源多核苷酸的上游或紧邻其下游。

29、在某些实施方案中，第三启动子能够驱动抗pd-1抗体重链的表达，并且第四启动子能够驱动抗pd-1抗体轻链的表达，其中第三启动子和第四启动子处于头对头取向。

30、在某些实施方案中，从第一异源多核苷酸表达的抗pd-1抗体和从第二异源多核苷酸表达的第二融合蛋白作为单独的蛋白质表达。

31、在某些实施方案中，第二启动子、第三启动子和第四启动子是相同或不同的。在某些实施方案中，第二启动子、第三启动子和第四启动子都是早期和晚期启动子。在某些实施方案中，早期和晚期启动子是pse/l。

32、在某些实施方案中，第二终止密码子、第三终止密码子和第四终止密码子是相同或不同的。

33、在某些实施方案中，第二融合蛋白包含tgf-β受体ii胞外结构域(tgfbrii ecd)。在某些实施方案中，第二融合蛋白还包含第二免疫球蛋白fc区。在某些实施方案中，免疫球蛋白fc区是第二人igg1 fc区。

34、在某些实施方案中，tgfbrii ecd在tgfbrii ecd的c末端与第二免疫球蛋白fc区可操作地连接。

35、在某些实施方案中，第二融合蛋白还包含信号肽。在某些实施方案中，信号肽在该信号肽的c末端与tgfbrii ecd可操作地连接。在某些实施方案中，信号肽是cd33信号肽。

36、在某些实施方案中，tgfbrii ecd包含seq id no:2的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施方案中，氨基酸序列由seq id no:8的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码。

37、在某些实施方案中，第二人igg1 fc区包含seq id no:3的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施方案中，氨基酸序列由seq id no:10的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码。

38、在某些实施方案中，cd33信号肽包含seq id no:4的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施方案中，氨基酸序列由包含seq id no:12的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码。

39、在某些实施方案中，第二融合蛋白包含seq id no:6的氨基酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列。在某些实施方案中，氨基酸序列由包含seq id no:14的核酸序列或其具有至少80％序列同一性的同源序列编码。

40、在某些实施方案中，第一融合蛋白和第二融合蛋白能够形成二聚体。在某些实施方案中，该二聚体是通过第一免疫球蛋白fc区与第二免疫球蛋白fc区的缔合形成的。

41、在某些实施方案中，本专利提供的经修饰的溶瘤病毒具有seq id no:17或seq idno:22的核酸序列。

42、在一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本专利提供的经修饰的溶瘤病毒和药学上可接受的载体。

43、在一方面，本发明提供了一种药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗肿瘤，在使用时，向受试者施用有效量的经修饰的溶瘤病毒或药物组合物，其中，所述受试者是人，施用途径是局部的，所述施用途径是瘤内注射；

44、其中，所述肿瘤是实体瘤，所述肿瘤是黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、霍奇金淋巴瘤、头颈部鳞状细胞癌、膀胱癌、结肠直肠癌、三阴性乳腺癌、肝细胞癌、胰腺癌、卵巢癌、结肠癌、咽部鳞状细胞癌或卵巢畸胎瘤。

45、与现有技术相比，本发明的有益效果如下：

46、本发明将第一异源多核苷酸和第二异源多核苷酸引入经修饰的溶瘤病毒中，使得溶瘤病毒被修饰，经修饰的溶瘤病毒能够在肿瘤细胞中选择性复制，在肿瘤细胞中，经修饰的溶瘤病毒的复制速率显著高于非肿瘤细胞中的复制速率，从而增强了溶瘤病毒的效力，更好地清除转移性肿瘤细胞。