鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物的制作方法

本发明涉及一种鞘氨醇单胞菌(sphingomonas)属细菌的提取物和包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌的组合物，其用于预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应和用于调节免疫应答及可选地用于增强皮肤的屏障功能。

背景技术：

1、过敏是一种复杂的现象，其中生物体暴露于过敏原后发生过度的炎症反应。具体地，过敏依赖于两种效价：生物体和外部介质之间屏障的孔隙率和免疫系统的调节。

2、因此，过敏依赖于皮肤的渗透性，皮肤的渗透性是抵抗外部，特别是颗粒、化学品或化学侵蚀的屏障，但也是为了限制水和其他间质化合物的渗漏。皮肤的这种性质被称为屏障功能。具体地，屏障功能由紧密连接和相关蛋白来保证。通过刺激这些蛋白的表达和紧密连接的形成，toll 2(tlr2)型受体的激活允许增强屏障功能。

3、过敏还依赖于免疫系统的调节，具体是通过e型抗体(ige)、前列腺素e2(pge2)和各种白介素(il)。

4、ige参与可引起荨麻疹或血管性水肿的速发型过敏反应。

5、pge2和il-6/il-8也在嗜中性粒细胞的吸引中起作用。它们具有互补的作用模式，一方面，通过因pge2的血管渗透性的增加，另一方面，通过因il-6或il-8的趋化因子吸引嗜中性粒细胞的梯度。因此，这两种不同和组合的作用模式改善了免疫应答。

技术实现思路

1、发明人已经发现鞘氨醇单胞菌的提取物允许在体外激活htlr2受体，和促进与增强皮肤的屏障功能相关的基因的表达。他们还证实了，这种提取物允许抑制促炎介质pge2的分泌和调节促进白介素il-10(抗炎细胞因子)的表达，而不显著影响其他促炎白介素如il-12、il-6和il-8。最后，发明人已经证实该提取物允许限制人b淋巴细胞的ige生产。

2、因此，鞘氨醇单胞菌属细菌及其提取物具有与增强皮肤的屏障功能相结合的多种抗炎活性，从而能够预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应(cutaneous reaction)。

3、因此，本发明涉及一种用于预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物。

4、本发明还涉及一种用于预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的组合物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。

5、本发明还涉及一种用于调节免疫应答和可选地用于增强皮肤的屏障功能的鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物。

6、此外，本发明涉及一种用于调节免疫应答和可选地用于增强皮肤的屏障功能的组合物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。

7、一般定义

8、术语“细菌”是指活的、半活性的、灭活的或死亡的形式的原核微生物，优选变形菌门的(proteobacterium)。

9、根据本发明使用的细菌或根据本发明使用的提取物的细菌属于鞘氨醇单胞菌属。在一种实施方式中，所述细菌是选自sphingomonas abaci、sphingomonas adhaesiva、sphingomonas aerolata、sphingomonas aquatilis、sphingomonas asaccharolytica、sphingomonas aurantiaca、sphingomonas azotifigens、sphingomonas dokdonensis、sphingomonas echinoides、sphingomonas faeni、sphingomonas fennica、sphingomonashaloaromaticamans、sphingomonas jaspsi、sphingomonas koreensis、sphingomonasmali、sphingomonas melonis、sphingomonas natatoria、sphingomonas oligophenolica、sphingomonas panni、sphingomonas parapaucimobilis、sphingomonas paucimobilis、sphingomonas phyllosphaerae、sphingomonas pituitosa、sphingomonas pruni、sphingomonas roseiflava、sphingomonas sanguinis、sphingomonas soli、鞘氨醇单胞菌sp(sphingomonas sp)、sphingomonas suberifaciens、sphingomonas trueperi、sphingomonas wittichii、sphingomonas xenophaga、sphingomonas yabuuchiaesphingomonas yunnanensis和sphingomonas yanoikuyae的种。在本发明的一种实施方式中，细菌是sphingomonas xenophaga。在优选实施方式中，该细菌是由l’oréal,101avenuegustave eiffel,37390notre dame d’oé根据布达佩斯条约于2019年11月21日在国家微生物保藏中心((cncm)，巴黎，法国)以cncm i-5455号提交的sphingomonas xenophaga。

10、如本文所用，术语“预防”(“prevent”或“prevention”)是指旨在防止病症发生或与该病症相关的一种或多种症状的任何作用。因此，这个术语也涉及症状的减缓、停止或限制。

11、如本文所用，术语“治疗”(“treat”或“treatment”)是指旨在抑制、减轻或防止病症(该病症相关的一种或多种症状)进展任何行为。因此，这个术语覆盖了症状的减轻、缓解或抑制。

12、“预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应”应该理解为由过敏反应引起的受试者的皮肤症状的减缓、停止、限制、减轻、缓解或抑制。一般来说，这些症状包括荨麻疹、皮疹和/或出现发红。

13、“受试者”，这里应该理解为人，优选患有过敏症的人。在本发明的实施方式中，受试者已经有已引起皮肤反应的过敏反应。

14、“皮肤(cutaneous)”应该在皮肤(skin)的水平下，且更具体在暴露于或有可能暴露于过敏原的皮肤(skin)区域的水平下进行理解。根据本发明的实施方式，由过敏反应引起的皮肤反应包括荨麻疹、皮疹和/或出现发红。

15、在优选的实施方式中，本发明上下文中使用的提取物和组合物被局部地使用。在优选的实施方式中，本发明上下文中使用的提取物和组合物旨在应用于皮肤上。

16、在本发明的上下文中，术语“皮肤(skin)”是指身体的任何皮肤表面，优选面部的皮肤、颈部的皮肤、乳沟的皮肤，更特别地是面部的皮肤。

17、“过敏反应”应该理解为本领域技术人员通常使用的含义，即在生物体暴露于过敏原后发生的过度的炎症反应。这种反应是生物体对环境中通常无害且存在的物质(过敏原)过敏的迹象。这些物质可能存在于空气、化妆品等中。

18、所谓的速发过敏反应的特征是最常在接触过敏原后几分钟(不到两小时)出现症状。在这种情况下，这有可以扩散和涉及ige的荨麻疹组成。所谓的迟发性过敏反应的特征是通常在接触过敏原48小时后出现症状。在这种情况下，它由接触部位的涉及化学分子的局部湿疹组成。

19、在优选的实施方式中，在本发明的上下文中应用的提取物和组合物用于预防和/或治疗由速发型过敏反应引起的皮肤反应。

20、“调节免疫应答”，本文中应该理解为减缓、停止或减轻免疫应答。具体地，根据本发明调节免疫应答是降低促炎细胞因子的活性和/或提高抗炎细胞因子的活性。

21、在本发明的优选实施方式中，通过提高il-10的活性，而不显著影响促炎性白介素il-12、il-6和/或il-8来实现调节免疫应答。

22、“增强皮肤的屏障功能”，本文中应理解为改善皮肤的屏障功能，具体是在皮肤水平上通过增加紧密连接的数量和/或通过增加相关蛋白诸如紧密连接蛋白-1(claudin-1)、角化蛋白和/或闭塞小带1(zonula occludens 1)。

23、鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物

24、本发明涉及一种用于预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物。

25、在本发明的上下文中，术语“细菌(的)提取物”是指：由细菌生产和/或分泌并因此存在于细菌培养物的培养基(也称为细胞外培养基)中的一系列化合物；和/或包含在细菌中并因此存在于离心后的细菌培养物的细菌沉淀物的一系列化合物，如细胞内基质和/或细胞壁和/或膜的成分。

26、本发明的提取物可以通过本领域技术人员公知的任何常规方法制备。通常，这些方法包括发酵、分离和纯化步骤。

27、通常，鞘氨醇单胞菌属的细菌在合适的培养基中培养并以期望的密度培养。优选地，细菌本身被通过任何已知的方法(诸如离心)浓缩。之后，浓缩的细菌可以直接用作原始制剂，或者可以进行本领域技术人员公知的其它处理步骤诸如冻干、脱水、过滤、纯化、冷冻(可能随后解冻)、灭菌、柱层析、压碎、裂解等。

28、优选地，细菌提取物是细菌裂解物。这样的裂解物具体包括包含在细菌中并因此存在于离心后的细菌培养物的细菌沉淀物的化合物。优选地，细菌提取物是包括细胞内基质和/或细胞壁和/或膜的成分的细菌裂解物。

29、裂解物通常表示通过称为细胞裂解的现象来完成生物细胞的破坏或分解后获得的物质，从而导致天然包含在所考虑的微生物的细胞中的细胞内生物成分的释放。

30、在本发明的上下文中，术语“裂解物”不加区别地用于指通过裂解所考虑的微生物获得的全部裂解物或仅其一部分。

31、因此，所实施的裂解物全部地或部分地由细胞内生物成分以及由细胞壁和膜的成分形成。

32、因此，优选地，所实施的裂解物基本上全部地或部分地由细胞内生物成分和由细胞壁和膜的成分形成。

33、在优选的实施方式中，裂解物包括小于1％干重的细胞外培养基，更好的是裂解物包括0.5％至1％干重的细胞外培养基，更优选的是裂解物包括0.7％至0.8％干重的细胞外培养基。

34、这种细胞裂解可以通过以下不同的技术来完成：诸如渗透冲击，热冲击如冷冻后解冻、超声、高压处理或在离心型机械应力下。

35、优选地，通过包括以下步骤的方法获得在本发明上下文中实施的裂解物：

36、i)离心步骤；

37、ii)回收沉淀物的步骤；

38、iii)冷冻沉淀物的步骤；

39、iv)解冻沉淀物的步骤；

40、v)可选地通过高压灭菌，具体是在121℃下的灭菌步骤。

41、在本发明的具体实施方式中，细菌提取物包括灭活的细菌。

42、“灭活的”应该理解为本领域技术人员通常使用的含义，即在各种因素(热、化学物质、机械的、酶的)的作用下抑制细菌的活性。具体地，细菌通过加热灭活，更具体地是通过高压灭菌灭活。

43、优选地，根据本发明的所述提取物具有如下的活性：激活htlr2受体和/或促进与增强皮肤屏障功能相关的基因的表达。

44、优选地，所述提取物具有抑制促炎介质pge2分泌的活性。

45、优选地，所述提取物具有刺激il-10表达，而不显著影响il-12、il-6和il-8的表达的活性。

46、优选地，所述提取物具有抑制b淋巴细胞生产ige的活性。

47、所有这些活性都可以通过本领域技术人员已知的技术，包括下文实施例中描述的具体实施例来检测和/或分析。

48、因此，鞘氨醇单胞菌属细菌及其提取物具有与增强皮肤的屏障功能相结合的多种抗炎活性，从而能够预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应。

49、本发明还涉及一种用于调节免疫应答和可选地用于增强皮肤的屏障功能的根据本发明的细菌提取物。

50、组合物

51、本发明还涉及一种用于预防和/或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的组合物，该组合物具体旨在用于局部应用，包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。

52、本发明还涉及一种用于调节免疫应答和可选地用于增强皮肤的屏障功能的组合物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。

53、在一种实施方式中，该组合物包括如上文描述的提取物。

54、在一种实施方式中，该组合物包括至少一种如一般定义部分所描述的鞘氨醇单胞菌属细菌。

55、根据本发明的组合物中细菌或细菌提取物的量根据所考虑的组合物类型而变化。优选地，微生物或提取物的量，相对于组合物的总重量，以干重计介于0.0001和30％之间，相对于组合物的总重量，以干重计在0.001和15％之间，相对于组合物的总重量，以干重计介于0.01和10％之间，相对于组合物的总重量，以干重计优选介于0.01和5％之间，或相对于组合物的总重量，以干重计介0.01和3％之间。

56、在细菌以活的形式配制在组合物中的情况下，活细菌的量可以每克组合物从103至1015ufc/g，特别是从105至1015ufc/g，更特别是从107至1012ufc/g变化。

57、优选地，根据本发明的组合物包括水相。

58、优选地，根据本发明的组合物具有相对于组合物总重量按重量计20％至95％，优选按重量计30％至70％的范围内的水含量。

59、根据本发明的组合物可以进一步以以下浓度包括一种或几种水混溶性有机溶剂：相对于组合物的总重量，按重量计在0.5％至25％，优选按重量计5％至20％，更优地按重量计10％至15％的范围内的浓度。

60、如前所述，在本发明上下文中使用的组合物优选被局部地应用。

61、如本领域技术人员所公知的，用于局部应用的组合物还可以含有常见的添加剂，诸如亲水性或亲脂性胶凝剂、不同于根据本发明的提取物的亲水性或亲脂性活性物质、防腐剂、抗氧化剂、不混溶于水的溶剂、香味剂、气味吸收剂、着色剂。这些不同添加剂的量是在所考虑的领域中通常使用的量，例如为组合物总重量的0.01至20％。

62、当然，本领域技术人员会选择这些可选的附加成分和/或活性物质，和/或它们的量，例如根据本发明的提取物的有利性质没有或基本上没有被考虑的添加物所改变。

63、在一种实施方式中，鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或鞘氨醇单胞菌属细菌是组合物的唯一活性物质。

64、在另一种实施方式中，本发明的组合物可以进一步含有不同于本发明的细菌或提取物的其他活性物质。这些活性物质可能对皮肤有作用，特别是舒缓作用。

65、在本发明的一种具体实施方式中，根据本发明的组合物进一步包括选自以下项的至少一种活性物质：乙酰基二肽-1鲸蜡酯；丹参根提取物；活泉水(thermal water)，诸如理肤泉水(la roche posay water)；及它们的混合物。

66、根据本发明的组合物可以是通常用于局部应用的任何盖伦制剂，特别是以水状物、水-醇溶液、水包油(o/w)或油包水(w/o)或多重(三重：w/o/w或o/w/o)乳液、水凝胶或使用小球的脂肪相在水相中的分散体的形式，这些小球可以由离子型和/或非离子型脂质囊泡(脂质体、囊泡、油质体)组成。这些组合物是用常规方法制备的。

67、有利地，根据本发明的组合物是凝胶、乳液(emulsion)或糊剂的形式。此外，根据本发明的组合物可以或多或少是流体，并具有白色或有色霜剂、软膏、乳剂(milk)、洗液、精华液、糊剂、发泡或不发泡凝胶、去角质剂、面膜、护理剂、爽肤水(tonic)或泡沫的外观。它可能以喷雾的形式应用皮肤上。它也可以是固体形式，例如是棒或皂的形式。

68、根据本发明的组合物可以包括脂肪相，特别是油相。

69、作为适用于根据本发明的组合物的油，可以提及例如：

70、-烃油，

71、-合成的酯和醚，特别是脂肪酸的酯和醚，如式r’coor2和r’cor2的油，其中r’表示包括8至29个碳原子的脂肪酸残基，r2表示含有3至30个碳原子的支链或非支链的烃链；

72、-矿物或合成来源的直链或支链碳氢化合物；

73、-具有8至26个碳原子的脂肪醇；

74、-部分烃化和/或硅化氟化油；

75、-硅油；

76、-它们的混合物。

77、上面引用的油列表中的烃油，应该理解为主要包括碳原子和氢原子的任何油。

78、油相可以包括：可存在于该油相中的其它脂肪体，例如包括8至30个碳原子的脂肪酸；蜡、硅树脂；和硅弹性体。这些脂肪可由本领域技术人员以各种方式选择，以制备具有所寻求的性质(例如，黏稠度性质或质地性质)的组合物。

79、根据本发明的具体实施方式，根据本发明的组合物是油包水(w/o)或水包油(o/w)乳液。相对于组合物的总重量，乳液中油相的比例可以按重量计在5至80％，优选30至70％的范围内。乳液通常含有：至少一种乳化剂，该乳化剂选自单独使用或混合使用的两性型、阴离子型、阳离子型或非离子型乳化剂；以及可选的助乳化剂。乳化剂根据要获得的乳液(w/o或o/w)来适当选择。一般而言，相对于组合物的总重量，乳化剂和助乳化剂在组合物中以按重量计0.3％至30％，优选按重量计0.5％至20％的范围内的比例存在。

80、对于w/o乳液，作为乳化剂，可以提及例如二甲硅烷共聚多元醇(dimethiconecopolyols)和烷基二甲硅烷共聚多元醇(alkyl-dimethicone copolyols)。作为w/o乳液的表面活性剂，也可以使用包括至少一个氧化烯基团的交联弹性固体有机聚硅氧烷。

81、对于o/w乳液，作为乳化剂，可以提及例如非离子型乳化剂。

82、组合物在已经施用到皮肤上之后，可以冲洗或不冲洗。

83、方法

84、本发明还涉及一种用于预防或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的方法，该方法包括施用，优选在皮肤的表面局部地施用：鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物；或组合物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。

85、还提出了以下提取物或组合物在生产用于预防或治疗由过敏反应引起的皮肤反应的药物中的用途：鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。

86、本发明还涉及一种调节免疫应答和可选地增强皮肤屏障功能的方法，该方法包括施用，优选在皮肤的表面局部地施用：鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物；或组合物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。

87、还提出了以下提取物或组合物在生产用于调节免疫应答和可选地增强皮肤屏障功能的药物中的用途：鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物，该组合物包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。

88、在具体实施方式中，包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌的组合物如上文组合物部分所描述。

89、在具体实施方式中，鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物如下文鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物部分所描述。

90、优选地，在有需要的受试者上以有效量应用至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种组合物，该组合包括鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物或至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌。

91、如本文所用，术语“有效量”是指这样的鞘氨醇单胞菌属细菌的提取物的量：其作为整体允许预防和/或减少由过敏反应引起的皮肤反应；或指鞘氨醇单胞菌属细菌的量，其作为整体允许预防和/或减少由过敏反应引起的皮肤反应。

92、有效量自然取决于所考虑的活性物质、施用方式、治疗适应症、患者年龄和他/她的状况。

93、有利地，该组合物或该提取物具体以皮肤病学组合物的形式使用，可能进一步包括生理上可接受的赋形剂。

94、“生理上可接受的”，在本文中应理解为当施用于受试者时不产生不希望的继发反应、过敏反应或其他反应的组合物和分子实体。因此，生理上可接受的赋形剂或载体是封装材料、稀释剂、支持物或任何其它液体、半固体或固体的无毒制剂助剂。

95、通常制备本发明上下文中使用的皮肤病学组合物以适合施用方式。生理上可接受的赋形剂通常部分地由施用的组合物以及用于施用组合物的具体技术决定。

96、要施用的化合物的剂量(dosage)取决于个体情况，并且如本领域技术人员所熟知的，应该适合于个体情况，以便获得有效量和最佳效果。有效剂量水平对每个受试者都是特定的，并且具体取决于各种因素，这些因素包括所治疗的疾病和疾病的严重性、所用具体化合物的活性；所用的具体组合。例如，本领域技术人员公知的是，从低于达到所需效果所需水平的化合物的剂量(dose)开始，并逐渐增加剂量，直到获得所需效果。

97、优选地，根据本发明的方法包括局部应用至少一种鞘氨醇单胞菌属细菌或至少一种鞘氨醇单胞菌属的提取物，或包括其的组合物。

98、在优选实施方式中，本发明上下文中的局部应用是皮肤上的应用。

99、本发明的方法可以包括一次施用。在另一种实施方式中，施用每天重复例如2至3次，持续一天或更长时间，或者连续几天的或不连续的几天的每天应用，并且通常持续至少4周或4至15周的延长的持续时间，或者根据需要尽可能长时间，其中在需要时可能中断。

100、在另一种实施方式中，本发明的方法可以包括在皮肤区域暴露于过敏原之前和/或之后在该区域上施用。

101、在说明书和以下实施例中，除非另有说明，百分比是按重量计算的百分比，值范围表述为“在……和……之间”包括指定的上限和下限。在包装之前，在本领域技术人员容易确定的条件下，按顺序混合这些成分。

102、下面将通过实施例进一步说明本发明。