包含嗜乳脂蛋白的同二聚体和异二聚体蛋白的制作方法

本公开涉及发现可用于治疗疾病如用于癌症和自身免疫的免疫疗法的异二聚体蛋白。以电子方式提交的文本文件的说明以电子方式提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读格式副本(文件名：shk-033pc_116981-5033_st25；创建日期：2021年4月13日；文件大小：354,746字节)。

背景技术：

1、γδt细胞占人体所有t细胞的多达5％，但它们在抗癌方面发挥着重要作用。最近的研究表明，浸润肿瘤的γδt细胞的数量是对患者有利结果的极好预测指标。此外，与car-t疗法中常用的αβt细胞不同，γδt细胞在先天免疫应答中发挥作用。γδt细胞在癌症中的预后意义促使人们努力操纵γδt细胞作为癌症的治疗策略。目前的方法仅限于离体策略，其中收获和修饰患者的γδt细胞以表达嵌合抗原受体，和/或将其在细胞培养中扩增到更多数量，然后将修饰的γδt细胞输注回癌症患者体内(front immunol.2018年6月26日；9:1409)。直接在癌症患者体内操纵γδt细胞的策略因无法最终鉴定由γδt细胞受体直接识别的分子实体而受阻(nat immunol.20(2):121-128(2019))。事实上，最广泛接受的γδt细胞活化剂主要包括细胞内分子，如热休克蛋白、焦磷酸异戊酯(ipp)生物合成的非甲羟戊酸途径的中间体(包括hmb-pp)、细胞内细菌(例如分枝杆菌和李斯特菌)、病毒(例如巨细胞病毒)和其他脂质抗原。

2、因此，仍然需要不需要使用上述分子的γ-δt细胞接合的新组合物和方法。

技术实现思路

0、发明概述

1、因此，在一个方面，本公开提供了一种异二聚体蛋白，其包含：(a)包含btn2a1和/或btn3a1嗜乳脂蛋白家族蛋白或其片段的第一结构域；(b)包含特异性结合cd19的靶向结构域的第二结构域；和(c)连接第一结构域和第二结构域并促进异二聚化的接头。

2、在一个方面，本公开涉及包含α链和β链的异二聚体蛋白，其中α链包含：(a)包含btn2a1蛋白或其片段的第一结构域；(b)包含特异性结合cd19的靶向结构域的第二结构域；和(c)连接第一结构域和第二结构域的接头；并且其中β链包含：(a)包含btn3a1蛋白或其片段的第一结构域；(b)包含特异性结合cd19的靶向结构域的第二结构域；和(c)连接第一结构域和第二结构域的接头。

3、在一个方面，本公开涉及包含α链和β链的异二聚体蛋白，其中α链包含：(a)(i)包含btn2a1蛋白或其片段和(ii)btn3a1蛋白或其片段的第一结构域；(b)包含特异性结合cd19的靶向结构域的第二结构域；和(c)连接第一结构域和第二结构域的接头；并且其中β链包含：(a)(i)包含btn2a1蛋白或其片段和(ii)btn3a1蛋白或其片段的第一结构域；(b)包含特异性结合cd19的靶向结构域的第二结构域；和(c)连接第一结构域和第二结构域的接头。在实施方案中，第二接头连接(i)btn2a1蛋白或其片段，和(ii)btn3a1蛋白或其片段。在实施方案中，第二接头是柔性氨基酸序列。

4、在一个方面，本公开涉及异二聚体蛋白，其包含：(a)(i)包含btn2a1蛋白或其片段和(ii)btn3a1蛋白或其片段的第一结构域；(b)包含特异性结合cd19的靶向结构域的第二结构域；和(c)连接第一结构域和第二结构域的接头。在实施方案中，第二接头连接(i)btn2a1蛋白或其片段和(ii)btn3a1蛋白或其片段。在实施方案中，第二接头是柔性氨基酸序列。在实施方案中，两个异二聚体蛋白缔合形成异二聚体。

5、在实施方案中，靶向结构域能够结合癌细胞表面上的cd19。在实施方案中，靶向结构域是抗体样分子或其抗原结合片段。在实施方案中，抗体样分子是scfv。

6、在实施方案中，异二聚体蛋白能够接合γ-δt细胞。在实施方案中，γδt细胞是vγ9δ2t细胞。

7、在实施方案中，该蛋白调节γδt细胞的功能。在实施方案中，γδt细胞是vγ9δ2t细胞。

8、在实施方案中，α链和β链自缔合形成异二聚体。

9、在多个方面，本公开的异二聚体蛋白用于同时活化γδt细胞并将其靶向肿瘤细胞，调节患者的免疫应答，和/或在体内刺激γδt细胞的增殖。因此，在各个方面，本公开的异二聚体蛋白用于治疗癌症、感染性疾病或自身免疫性疾病的方法，包括向有需要的患者施用有效量的包含异二聚体蛋白的药物组合物。

10、在多个方面，本公开的异二聚体蛋白用于通过向有需要的受试者施用有效量的本公开的药物组合物从而引起γδt细胞的体内增殖和/或使有效量的本公开的药物组合物与来源于有需要的受试者的细胞接触从而引起γδt细胞的离体增殖来刺激γδt细胞的增殖。

11、在多个方面，本公开的异二聚体蛋白用于在不存在热休克蛋白、焦磷酸异戊酯(ipp)生物合成的非甲羟戊酸途径的中间体(包括hmb-pp)、细胞内细菌(例如分枝杆菌和李斯特菌)、病毒(例如巨细胞病毒)和其他脂质抗原的情况下刺激γδt细胞的增殖。

12、同样在多个方面，本发明的异二聚体蛋白用于治疗自身免疫性疾病的方法中，该方法包括向有需要的患者施用有效量的包含异二聚体蛋白的药物组合物。在又一些方面，本发明的异二聚体蛋白用于治疗感染的方法中，所述感染包括但不限于病毒或其他细胞内病原体感染。在另一些方面，本发明的异二聚体蛋白用于治疗癌症的方法中。

13、在多个方面还提供了药物组合物，其包含本文公开的任何实施方案的异二聚体蛋白、包含编码本文公开的任何实施方案的异二聚体蛋白的核酸的表达载体或包含表达载体的宿主细胞，所述表达载体包含编码本文公开的任何实施方案的异二聚体蛋白的核酸。本文公开的任何方面或实施方案可以与本文公开的任何其他方面或实施方案组合。

14、在一个方面，本公开提供了异二聚体蛋白：(a)第一结构域，其包含(i)btn2a1蛋白或其片段和(ii)btn3a1蛋白或其片段；(b)包含特异性结合cd19的靶向结构域的第二结构域；和(c)连接第一结构域和第二结构域的接头，其中btn2a1蛋白或其片段与btn3a1蛋白或其片段通过第二接头连接。在实施方案中，第二接头是柔性氨基酸序列。

15、在一个方面，本公开提供了包含α链和β链的异二聚体蛋白，其中α链包含：(a)第一结构域，其包含(i)btn2a1蛋白或其片段和(ii)btn3a1蛋白或其片段；(b)包含特异性结合cd19的靶向结构域的第二结构域；和(c)连接第一结构域和第二结构域的接头；并且其中β链包含：(a)第一结构域(i)btn2a1蛋白或其片段和(ii)btn3a1蛋白或其片段；(b)包含特异性结合cd19的靶向结构域的第二结构域；和(c)连接第一结构域和第二结构域的接头。在实施方案中，第二接头是柔性氨基酸序列。

16、在一个方面，本公开涉及具有以下通用结构的嵌合蛋白：n末端-(a)-(b)-(c)-c末端，其中：(a)是包含通用结构(a1)-sl-(a2)的第一结构域，其中(a1)是嗜乳脂蛋白家族蛋白的胞外结构域(ecd)或其片段，(a2)是嗜乳脂蛋白家族蛋白的胞外结构域(ecd)或其片段，并且sl是连接(a1)和(a2)的第二接头，其包含约4至约50个氨基酸长度的柔性氨基酸序列，并且(c)是包含靶向结构域的第二结构域，该靶向结构域选自(i)抗体、抗体样分子或其抗原结合片段，和(ii)膜蛋白的胞外结构域。(b)是连接第一结构域和第二结构域的接头，其中接头包含至少一个能够形成二硫键的半胱氨酸残基。

17、在实施方案中，(a1)和(a2)是两个相同的嗜乳脂蛋白家族蛋白。在实施方案中，(a1)和(a2)是不同的嗜乳脂蛋白家族蛋白。在实施方案中，(a1)和/或(a2)是包含可变结构域的嗜乳脂蛋白家族蛋白的片段。在实施方案中，(a1)和(a2)包含独立选自btn1a1、btn2a1、btn2a2、btn2a3、btn3a1、btn3a2、btn3a3、btnl2、btnl3、btnl8、btnl9、btnl10和skintl的嗜乳脂蛋白家族蛋白。在实施方案中，嗜乳脂蛋白家族蛋白独立地选自人btn1a1、人btn2a1、人btn2a2、人btn2a3、人btn3a1、人btn3a2、人btn3a3、人btnl2、人btnl3、人btnl8、人btnl9、人btnl10和人skintl。

18、在实施方案中，靶向结构域能够结合癌细胞表面上的抗原。在实施方案中，靶向结构域包含选自lag-3、pd-1、tigit、cd19或psma的膜蛋白的胞外结构域。

19、在实施方案中，靶向结构域是抗体或其抗原结合片段。在实施方案中，结合片段包含fv结构域。在实施方案中，靶向结构域是抗体样分子或其抗原结合片段。在实施方案中，结合片段包含scfv结构域。

20、在实施方案中，靶向结构域特异性结合以下中的一种：clec12a、cd307、gpa33、间皮素(mesothelin)、cdh17、cdh3/p-钙黏着蛋白(cadherin)、ceacam5/cea、epha2、ny-eso-1、gp100、mage-a1、mage-a4、msln、cldn18.2、trop-2、ror1、cd123、cd33、cd20、gprc5d、gd2、cd276/b7-h3、dll3、psma、cd19、cmet、her2、a33、tag72、5t4、ca9、cd70、muc1、nkg2d、cd133、epcam、muc17、egfrviii、il13r、cpc3、gpc3、fap、bcma、cd171、sstr2、folr1、muc16、cd274/pdl1、cd44、kdr/vegfr2、pdcd1/pd1、tem1/cd248、ley、cd133、celec12a/cll1、flt3、il1rap、cd22、cd23、cd30/tnfrsf8、fcrh5、slamf7/cs1、cd38、cd4、prame、egfr、psca、steap1、cd174/fut3/ley、l1cam/cd171、cd22、cd5、lgr5、lgr5、cll-1和gd3。在实施方案中，靶向结构域特异性结合cd19。在实施方案中，靶向结构域特异性结合psma。在实施方案中，靶向结构域特异性结合cd33。在实施方案中，靶向结构域特异性结合cll-1。

21、在实施方案中，接头包含铰链-ch2-ch3 fc结构域。在实施方案中，铰链-ch2-ch3fc结构域来源于igg1，任选地人igg1。在实施方案中，铰链-ch2-ch3 fc结构域来源于igg4，任选地人igg4。

22、在实施方案中，嵌合蛋白是同二聚体。

23、在一个方面，本公开涉及药物组合物，其包含本文公开的任何实施方案的嵌合蛋白。

24、在一个方面，本公开涉及表达载体，其包含编码本文公开的任何实施方案的嵌合蛋白的第一多肽链和/或第二多肽链的核酸。在实施方案中，表达载体是哺乳动物表达载体。在实施方案中，表达载体包含dna或rna。

25、在一个方面，本公开涉及宿主细胞，其包含本文公开的任何实施方案的表达载体。

26、在一个方面，本公开涉及同时活化γδt细胞并将其靶向肿瘤细胞的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的任何实施方案的药物组合物给有需要的受试者。

27、在一个方面，本公开涉及一种调节患者的免疫应答的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的任何实施方案的药物组合物。

28、在一个方面，本公开涉及一种刺激γδt细胞增殖的方法，包括：向有此需要的受试者施用有效量的本文公开的任何实施方案的药物组合物，从而引起γδt细胞的体内增殖和/或使有效量的本文公开的任何实施方案的药物组合物与来源于有需要的受试者的细胞接触，从而引起γδt细胞的离体增殖。

29、在实施方案中，受试者的t细胞被第一结构域活化。在实施方案中，受试者具有肿瘤并且γδt细胞调节肿瘤细胞。

30、在一个方面，本公开涉及一种治疗癌症的方法，包括向有需要的受试者施用有效量的本文公开的任何实施方案的药物组合物给有需要的受试者。在实施方案中，癌症是淋巴瘤。在实施方案中，癌症是白血病。