用于调节强直性肌营养不良1型的方法和化合物与流程

本文公开了新的嵌合杂环状聚酰胺化合物和组合物及其作为药物用于治疗疾病的应用。还提供了调节人类或动物受试者的包含cag三核苷酸重复序列的靶基因的表达的方法，该方法用于治疗诸如强直性肌营养不良1型(“dm1”)、脊髓小脑性共济失调、亨廷顿病、亨廷顿病样综合征、脊髓延髓肌萎缩症和齿状核红核苍白球路易体萎缩症。

背景技术：

1、本公开涉及以mrna的过量产生为特征的遗传性遗传病的治疗。

2、强直性肌营养不良(“dm”)为被称为肌营养不良的疾病类别中的一员，大约每8000人中有1人受到影响。dm为成年发病患者中最常见的肌营养不良形式，大多数dm病例在20岁之后被诊断出来。dm以持续的肌肉收缩为特征，并与多种症状相关联，包括肌肉疾患和白内障，以及心脏和呼吸系统病患，这两种疾患通常出现在该疾病进展的后期。尽管可以通过治疗来改善相关联的症状，但目前尚无可阻止或逆转dm进展的治愈方法。呼吸衰竭和心律失常为dm患者最常见的死亡原因。

3、最严重的dm形式为1型强直性肌营养不良(“dm1”)。dm1是一种常染色体显性遗传病，由dmpk基因突变引起。该基因编码强直性肌营养不良蛋白激酶(mdpk)蛋白，该蛋白也称为肌强直蛋白激酶。mdpk蛋白可见于肌肉、心脏和神经组织中。

4、dm1由dm1受试者中有缺陷的dmpk基因的转录诱导。正常情况下，该基因含有具有5-37个ctg三核苷酸重复序列的3'非翻译区。在dm1基因型中，该三核苷酸被扩展到50至超过3,000个重复序列的计数，其中大多数具有ctg序列的超过1,000个重复序列。该计数具有在后裔中增加的趋势，导致后代的发病年龄较早。此外，已经观察到该计数在受试者的一生中增加，这可能是由于异常的dna修复。

5、dm1的进展归因于来自具有扩展的ctg区域的dmpk mrna的“rna毒性”。该mrna与某些蛋白质形成聚集体，并且这些聚集体干扰正常的细胞功能。有缺陷的mrna与肌盲蛋白的结合可能是导致dm1症状的一种机制，特别是因为蝇类的正常肌肉发育需要肌盲蛋白活性。

6、脊髓小脑性共济失调是指以神经元变性(特别是在小脑中)为特征的遗传病家族。症状通常与运动功能丧失有关，并且包括步态不协调、手眼运动协调不良、构音障碍(言语不清)和有关并发症，诸如吞咽困难引起的营养不良。

7、已经鉴定了脊髓小脑性共济失调的几个亚类，其中一些与寡核苷酸重复序列的存在联系起来。这些亚类中，有几个与cag三核苷酸重复序列的多个拷贝相关联。在该亚类中的六个中：sca1、sca2、sca3、sca6、sca7和sca17，cag三核苷酸重复序列在编码的蛋白质中产生聚谷氨酰胺(poly-q)重复序列。sca的这些亚类，连同亨廷顿病、齿状核红核苍白球路易体萎缩症和脊髓延髓肌萎缩症，统称为“多谷氨酰胺扩张疾患”。将有缺陷的poly-q蛋白与观察到的病理联系起来的确切机制并不总是很清楚；已经提出了蛋白质的聚集以及泛素化包涵体的形成。

8、与上述疾病组相反，sca12的cag三核苷酸重复序列位于该基因的编码区之外。因此，虽然mrna含有cag三核苷酸重复序列，但mrna的翻译不产生poly-q链。与这种缺陷相关联的病理可能是由于正常细胞机制未能分解异常mrna，可能是由于存在稳定的发夹结构，导致mrna在细胞中积累。

9、1型脊髓小脑性共济失调(“sca1”)与atxn1基因中cag三核苷酸重复序列的存在相关联。患病个体具有39个或更多个三核苷酸重复序列；症状发病的年龄与较高的三核苷酸重复序列的计数呈负相关。该病症通常会在10至30年内致命；目前尚无治愈性措施。在mrna中以及在基因组dna中观察到cag三核苷酸重复序列。基因编码一种名为atxn1的蛋白质，该蛋白质含有来自该cag三核苷酸重复序列的poly-q链。动物研究表明，蛋白质毒性而非功能丧失是对有缺陷的atxn1的病理负责的主要机制。蛋白酶体对有缺陷的atxn1的降解受损，导致蛋白质积累。

10、2型脊髓小脑性共济失调(“sca2”)与atxn2基因中cag三核苷酸重复序列的存在相关联。患病个体具有32个或更多个三核苷酸重复序列；症状发病的年龄与较高的三核苷酸重复序列的计数呈负相关。基因编码一种名为atxn2的蛋白质，该蛋白质含有来自该cag三核苷酸重复序列的poly-q链。atxn2蛋白的功能尚未充分了解：它存在于细胞质中并且与高尔基体和内质网相关联。atxn2的rna结合特性表明了mrna翻译的调控。

11、3型脊髓小脑性共济失调(“sca3”)与atxn3基因中cag三核苷酸重复序列的存在相关联。患病个体具有三核苷酸重复序列的50个或更多个拷贝；症状发病的年龄与较高的三核苷酸重复序列的计数呈负相关。基因编码一种名为atxn3的蛋白质，该蛋白质含有来自该cag三核苷酸重复序列的poly-q链。atxn3蛋白在蛋白质代谢的泛素/蛋白酶体机制中发挥作用：在蛋白质通过泛素化被标记为进行代谢后并且在蛋白酶体降解蛋白质之前，atxn3去除泛素以进行回收。含有poly-q链的有缺陷的atxn3失去这种催化特性，从而导致不希望的蛋白质堆积。

12、6型脊髓小脑性共济失调(“sca6”)与cacna1a基因中cag三核苷酸重复序列的存在相关联。患病个体具有20个或更多个三核苷酸重复序列。平均发病年龄为45岁；病情进展缓慢，并且病程可达25年以上。针对该疾病的治疗为支持性的，其中乙酰唑胺可缓解共济失调。该基因编码cav2.1钙通道的α-1亚基，该亚基对于正常的神经元功能至关重要。患病个体中有缺陷的cacna1a基因产生的α-1亚基迁移到细胞质以及细胞膜，在那里它形成聚集体。导致所观察到的症状的机制尚不清楚，尽管怀疑是钙通道的功能障碍，以及扩展蛋白的翻译后裂解形成有毒的c末端片段。

13、7型脊髓小脑性共济失调(“sca7”)与atxn7基因中cag三核苷酸重复序列的存在相关联。患病个体具有36个至超过300个三核苷酸重复序列。通常在二十岁到四十岁期间观察到症状的发病，且较早的发病与更严重的症状相关。除了针对sca类疾病观察到的症状外，患有sca7的受试者，特别是早期发病的受试者，可能会出现视力下降和失明。针对该疾病的治疗仅为支持性的。该基因编码ataxin-7蛋白，这是一种在转录中起作用的核蛋白。此外，有缺陷的基因产物干扰锥杆同源盒蛋白，这为针对这种综合征观察到的视网膜病变提供了解释。突变体ataxin-7的蛋白水解裂解和跨神经元应答可能对sca7的发病机制负责。

14、17型脊髓小脑性共济失调(“sca17”)与tata盒结合蛋白(tbp)基因中具有caa中断的cag三核苷酸重复序列的存在相关联。tbp基因产物在转录起始中起作用。患病个体通常具有47个或更多个三核苷酸重复序列。症状通常在50岁时发病，且吞咽困难通常会导致误吸和死亡。扩展的cag序列与所观察到的病理之间的联系尚不清楚，其中在不同的重复序列长度下表明功能获得和功能丧失两者。

15、亨廷顿病(“hd”)于19世纪末首次被确定为常染色体显性神经退行性疾患。hd的症状包括一系列运动、认知和精神疾患，通常在成年期出现。hd与htt基因中cag三核苷酸重复序列的存在相关联，该基因编码一种称为亨廷顿蛋白的蛋白质。具有多于约36个三核苷酸重复序列的受试者通常表现出hd症状，其中更多数量的三核苷酸重复序列与较早出现的症状相关联。病理源于一系列步骤：poly-q亨廷顿蛋白的产生，随后伸长的亨廷顿蛋白分裂成更小的肽，这些肽结合在一起并在神经元中积累。这种级联的效应在大脑的基底神经节和皮质中很明显。

16、亨廷顿病样综合征是指一组症状与亨廷顿病相似但缺乏htt基因特征性突变的疾病。亨廷顿病样2综合征(“hdl2”)与亲联蛋白3(jph3)基因中约40个或更多个cag三核苷酸重复序列的计数相关联。hdl2为一种遗传性疾患，已在具有非洲血统的受试者中发现。发病年龄与三核苷酸重复序列的数量呈负相关。这种综合征的症状包括肌张力障碍和舞蹈病(不受控制的运动)、情绪障碍、构音障碍、运动迟缓、无法融入新的学习以及难以做出决定。预期寿命可以从诊断后几年到超过十年不等。目前的理论认为，由jph3基因编码的poly-q蛋白在神经元细胞中形成聚集体，这种聚集体对疾病的病理负责。然而，还发现了表明mrna的有毒功能获得的证据，表明针对病理的可能的双重途径。

17、脊髓延髓肌萎缩症，也称为肯尼迪病，是一种在男性中观察到的x连锁遗传病，其症状包括肌肉萎缩、构音障碍和由于面部和喉部延髓肌肉引起的吞咽困难、肌束震颤(不自主抽搐)和不育。该疾病与雄激素受体(ar)基因中cag三核苷酸重复序列的存在有联系。病理被认为是由于雄激素受体蛋白片段在大脑和脊髓的神经细胞中的积累。治疗仅限于控制症状；抗雄激素药物、睾酮或类似物均无功效。最近的研究表明，poly-q雄激素受体的病理是由于泛素连接酶后期促进复合物/细胞周期体(apc/c)受到抑制，随后神经突形成和细胞周期被中断。

18、齿状核红核苍白球路易体萎缩症(“drpla”)是一种常染色体显性遗传性疾患，主要在日本血统的受试者中观察到，其症状通常在成年期出现，包括癫痫发作、共济失调和肌阵挛(不自主痉挛性肌肉收缩)。在成年受试者中还观察到痴呆和精神疾患。drpla与肌萎缩蛋白-1(atn1)基因中的cag三核苷酸重复序列相连接。健康个体具有少于约34个三核苷酸重复序列；患病个体通常具有多于约50个三核苷酸重复序列。肌萎缩蛋白-1蛋白(“atn1”)在所有组织中均有表达，但在神经元中被蛋白水解地裂解，表明其在神经活动中发挥作用。毒性被认为是由于atn1蛋白的积累。

19、fuchs角膜内皮营养不良(“fecd”)的fuchs内皮营养不良是一种涉及角膜内皮层的非炎症性、散发性或常染色体显性遗传性营养不良。伴随fuchs营养不良，角膜开始肿胀，引起眩光、光晕和视力下降。fuchs内皮营养不良对角膜的损伤可能非常严重，以致引起角膜性失明。fuchs营养不良已分为早发性(十岁以下)和晚发性(四十岁至五十岁)，其中后者以女性为主。早发性fuchs有8型胶原蛋白α2链受累。晚发以转录因子4、转录因子8(tcf8)、atp/gtp结合蛋白样1(agbl1)、脂氧合酶同源域1(loxhd1)、溶质载体家族4成员11(slc4a11)基因和转化生长因子β诱导以及凝聚素参与为特征。

20、在某些实施例中，上述机制提供对以靶基因中存在过量计数的cag或ctg三核苷酸重复序列为特征的疾病或疾患的有效治疗。在一些实施例中，该疾病或疾患的病理是由于含有过量计数的cag或ctg三核苷酸重复序列的mrna的存在。在一些实施例中，该疾病或疾患的病理是由于含有过量计数的谷氨酰胺氨基酸残基的翻译产物的存在。在一些实施例中，该疾病或疾患的病理是由于翻译产物的功能丧失。在一些实施例中，该疾病或疾患的病理是由于翻译产物的功能获得。在一些实施例中，该疾病或疾患的病理可以通过增加有缺陷的基因的转录率来减轻。在一些实施例中，该疾病或疾患的病理可以通过减少有缺陷的基因的转录率来减轻。

21、在某些实施例中，上述机制将提供针对由dmpk的过度表达引起的dm1的有效治疗。因此，纠正有缺陷的dmpk基因的过表达代表了治疗dm1的有前途的方法。

技术实现思路

1、本公开利用存在于控制基因表达的细胞核中的调控分子。真核细胞提供几种用于控制基因复制、转录和/或翻译的机制。通过细胞内各种生化机制产生的调控分子可以调节遗传信息向细胞组分转化中所涉及的各种过程。已知有几种调控分子可调节mrna的产生，如果针对靶基因(诸如dmpk、atxnl、atxn2、atxn3、cacna1a、atxn7、ppp2r2b、tbp、htt、jph3、ar或atn1)，将会调节引起疾病诸如例如脊髓小脑性共济失调、亨廷顿病、亨廷顿病样综合征、脊髓延髓肌萎缩症和齿状核红核苍白球路易体萎缩症、fuchs角膜内皮营养不良的靶基因mrna的产生，并因此逆转进展这些疾病。

2、本公开提供用于将调控分子募集到紧邻包含cag或ctg三核苷酸重复序列的靶基因的化合物和方法。本文公开的化合物含有：(a)将与靶基因选择性结合的dna结合部分，任选地连接至(b)将与调控分子结合的募集部分。该化合物将以下列方式抵消有缺陷的靶基因的表达：

3、(1)dna结合部分将会选择性地结合靶基因的特征性cag三核苷酸重复序列；

4、(2)连接至dna结合部分的募集部分将因此被保持在靶基因附近；

5、(3)现在位于靶基因附近的募集部分将调控分子募集到该靶基因附近；和

6、(4)调控分子将调节靶基因的表达，并因此通过与该基因的直接相互作用来抵消有缺陷的mrna的表达。

7、dna结合部分将选择性地结合atxnl、atxn2、atxn3、cacna1a、atxn7、ppp2r2b、tbp、htt、jph3、ar或atn1的特征性cag三核苷酸重复序列，或者该dna结合部分将选择性地结合dmpk的特征性ctg三核苷酸重复序列。因此，与dna结合部分相连的募集部分将保持在靶基因附近；将调控分子募集到基因附近；并且调控分子将调节表达，因此通过与靶基因的直接相互作用抵消有缺陷的靶基因的产生。

8、该机制提供针对由有缺陷的dmpk的表达引起的dm1的有效治疗。此外，该机制还提供针对脊髓小脑性共济失调、亨廷顿病、亨廷顿病样综合征、脊髓延髓肌萎缩症和齿状核红核苍白球路易体萎缩症的有效治疗方法，这些疾病是由有缺陷的atxnl、atxn2、atxn3、cacna1a、atxn7、ppp2r2b、tbp、htt、jph3、ar和/或atn1的表达引起的。因此，纠正有缺陷的靶基因的表达代表针对这些疾病进行治疗的有效方法。

9、本公开提供与调控分子结合的募集部分。调控分子的小分子抑制剂用作设计募集部分的模板，因为这些抑制剂通常通过与调控分子的非共价结合起作用。

10、本公开进一步提供与作为有缺陷的靶基因的特征的cag或ctg三核苷酸重复的一个或多个拷贝选择性地结合的dna结合部分。由于与有缺陷的靶基因相关联的高cag或ctg计数，dna结合部分与靶基因的选择性结合成为可能，将募集部分引导至基因附近，并将调控分子募集到位以调节基因转录。

11、dna结合部分包含聚酰胺片段，它将与靶cag或ctg序列选择性地结合。由例如dervan(美国专利号9,630,950和8,524,899)和其他人设计的聚酰胺可以与选定的dna序列选择性地结合。这些聚酰胺位于双螺旋dna的小沟中，并与watson-crick碱基对形成氢键相互作用。可以根据已建立的化学规则通过连接单酰胺构建块来设计与特定dna序列选择性地结合的聚酰胺。为每个dna碱基对提供一个构建块，其中每个构建块与以下dna碱基对中的一个碱基对非共价地并选择性地结合：a/t、t/a、g/c和c/g。遵循这一准则，三核苷酸与具有三个酰胺单元的分子(即三酰胺)结合。通常，这些聚酰胺可以定向在dna序列的任一方向上。

12、原则上，通过将较大数量的单酰胺构建块组合成较长的聚酰胺链，可以以较高的特异性和/或较高的亲和力靶向较长的dna序列。理想情况下，聚酰胺的结合亲和力将简单地等于每个单独的单酰胺/dna碱基对相互作用的和。然而在实践中，由于相当刚性的聚酰胺与dna结构之间的几何不匹配，较长的聚酰胺序列与较长的dna序列的结合并不像简单的加性贡献所预期的那样紧密。较长的聚酰胺序列与较长的dna序列之间的几何不匹配诱导不利的几何应变，从而降低预期的结合亲和力。

13、本公开提供转录调节剂分子，其包含由柔性间隔子(例如将dna结合部分连接至蛋白质结合部分的接头部分)连接的dna结合部分(例如包含多胺次单元的聚酰胺)。间隔子减轻几何应变，否则几何应变降低较大聚酰胺序列的结合亲和力。

14、本文公开包含聚酰胺部分的化合物，该聚酰胺部分可以与cag或ctg三核苷酸重复序列的一个或多个拷贝结合，并且可以调节包含cag或ctg三核苷酸重复序列的靶基因的表达。用这些化合物治疗受试者将会调节有缺陷的靶基因的表达，并且这可以减少与疾病相关联的症状的发生、严重程度或频率。本文所公开的某些化合物将会提供比先前针对此类化合物观察到的更高的结合亲和力和选择性。

15、然而，应当理解尽管详细描述和具体实例表示特定实施例，然而它们仅以说明的方式给出，因为根据此详细描述，处于本公开的精神和范围内的不同变化和修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见的。

16、通过引用并入

17、本说明书中所提到的所有公开、专利和专利申请均通过相同的程度引用结合在此，如同特定且单独地指示每个单独的公开、专利或专利申请是通过引用并入的。