西洋参根部分、其制备方法及其用途与流程

本技术涉及来自西洋参(panax quinquefolius)植物根部分的级分。具体地，本发明涉及中性多糖级分、富含酸性多糖级分和酸性多糖级分以及它们的制备方法、包含它们的组合物以及它们在治疗中的用途。具体地，本发明涉及来自西洋参(panaxquinquefolius)植物的根部分的级分以及它们在治疗可通过激活先天性和适应性免疫反应可治疗的疾病、障碍或病症(例如病毒感染)中的用途。

背景技术：

1、哺乳动物免疫系统已经进化出多重、分层和交互的防御系统以防止感染。这些大致分为先天免疫和适应性免疫。先天免疫是对抗微生物病原体的第一道防线，几乎立即发挥作用，通过激活吞噬细胞和抗原呈递细胞(apc)，例如树突状细胞(dc)和巨噬细胞，来限制感染原的早期增殖和传播，通过释放多种细胞因子、趋化因子和抗微生物因子(例如干扰素(ifn))引发炎症反应和防御。先天免疫在进化上是古老的，多年来，它的研究由于相对非特异性而在很大程度上被免疫学家忽视。但在大多数情况下，我们的先天免疫系统可以保护人们免受感染。另一方面，如果传染性生物体穿透先天免疫防御，那么人们的先天防御就会促进和引导适应性免疫反应的产生，这些反应针对入侵病原体独特表达的高度特异性决定簇。这些反应依赖于b细胞和t细胞中特定抗原受体基因的重排，并导致高亲和力抗原特异性抗体(体液免疫)和t细胞或细胞介导的免疫的产生。一般来说，抗体有助于清除、破坏或中和细胞外病原体及其毒素，而t细胞介导的免疫反应有助于消除或控制细胞内病原体。与先天性免疫反应相比，适应性免疫反应具有特异性免疫记忆的特点。

2、直到最近几年，尚未解决的关键问题还涉及宿主先天免疫系统如何检测感染以及其如何区分自身和病原体或传染性非自身。toll样受体(tlr)家族的发现和表征为先天免疫识别提供了深入的见解，并确立了先天免疫系统在宿主防御感染中的关键作用(akira等人，2006年；hargreaves和medzhitov，2005年；kawai和akira，2006年；philpott和girardin，2004年；seth等人，2006年)。先天免疫系统使用多个种系编码模式识别受体(prr)家族来检测感染并触发各种抗菌防御机制(janeway和medzhitov，1998)。从植物、果蝇到哺乳动物，这些prr在进化上高度保守。先天免疫识别策略基于对多种微生物中存在但宿主细胞中不存在的高度保守和必需结构的检测(janeway，1992年；janeway和medzhitov，1999年)。由于先天免疫识别的目标是保守的分子模式，因此它们被称为病原体相关分子模式(pamp)。pamps具有三个重要特征，使其成为先天免疫传感的理想靶标。首先，pamp仅由微生物产生，而不是由宿主细胞产生。这是区分自身和传染性非自身的基础。其次，pamp在给定类别的微生物之间是保守的。这使得有限数量的prr能够检测到一大类入侵病原体的存在。例如，脂多糖(lps)中的模式允许单个prr检测任何革兰氏阴性细菌的存在。第三，pamp对于微生物的生存至关重要，pamp的任何突变或丢失要么对生物体致命，要么大大降低其适应性。这些对先天免疫识别的新见解正在彻底改变对免疫防御、发病机制以及传染病治疗和预防的理解。

3、toll样受体(tlr)是一种识别pamp的prr。tlr的信号传导非常复杂，已在其他地方进行过综述(akira和takeda，2004年；o'neill，2006年)。简而言之，除tlr3之外的所有tlr均通过接头分子骨髓分化因子88(myd88)发出信号，这是一种含有toll-il-1受体(tir)结构域和死亡结构域的细胞质蛋白。最终，nf-κb和mapk在traf6下游被激活，导致促炎细胞因子和趋化因子，例如tnf-α、il-6、il-1β和il-12，的产生。除了myd88之外，tlr3和tlr4还通过trif发出信号，trif是产生i型干扰素和i型干扰素依赖性基因所需的另一种含有tir的接头。tlr在多种免疫和非免疫细胞上表达。小鼠巨噬细胞表达tlr1-9，反映了它们在促炎反应启动中的重要性。浆细胞样树突状细胞(pdc)在病毒感染期间产生大量i型干扰素，表达tlr7和9。小鼠中所有常规树突状细胞(dc)均表达tlr1、2、4、6、8和9，而tlr3仅限于cd8+和cd4-cd8-dc亚群(iwasaki和medzhitov，2004年)。在人类中，tlr9表达仅限于pdc和b细胞(bauer等，2001年；krug等，2001年)。tlr3在小鼠或人类的pdc中不表达。除了关注免疫细胞上的表达之外，人们对了解粘膜上皮细胞(ec)上tlr的表达也很感兴趣，粘膜上皮细胞是抵抗大多数感染的第一道防线。

4、tlr诱导一系列反应，具体取决于它们被激活的细胞类型(ashkar和rosenthal，2002年；iwasaki和medzhitov，2004年)。例如，用通过tlr9发挥作用的cpgdna处理dc，可激活dc成熟，包括上调ii类mhc和共刺激分子，以及产生促炎细胞因子、趋化因子和增强抗原呈递。类似地，用cpg处理b细胞会诱导其活化和增殖，分泌抗体以及il-6和il-10，并且b细胞对细胞凋亡具有抵抗力。通过cpgdna激活免疫细胞会诱导th1主导的反应。

5、prr介导宿主防御病原体的机制是深入研究的焦点。由于其增强先天免疫反应的能力，使用prr配体、天然或合成激动剂或拮抗剂的新策略，即所谓的“先天免疫学”，可单独使用或与其他抗病毒剂联合使用，以提供针对细胞内细菌、寄生虫和病毒感染的保护或治疗。此外，通过prr(例如tlr)使用各自的配体或激动剂激活先天免疫系统，代表了一种增强针对特定病原体的免疫反应的策略，使通过prr的信号传导成为极好的疫苗佐剂。

6、韩国红参已被证明通过免疫调节具有抗病毒作用(nguyen和nguyen，2019年)。

技术实现思路

1、申请人已经开发了从西洋参(panax quinquefolius)植物的根部分制备多糖提取物和级分的方法。具体地，申请人已经生产了中间多糖级分，由其生产了中性多糖级分和富含酸性多糖级分以及酸性多糖级分。

2、因此，本技术包括一种从西洋参(panax quinquefolius)植物的根部分制备中间多糖级分的方法，该方法包括：

3、在约10℃至约90℃的温度下，用包含约50％(v/v)至约95％(v/v)c1-3烷基oh和水的溶剂混合物从西洋参(panax quinquefolius)植物的根部分提取所述根部分以产生溶剂混合物级分和第一残余物，其中所述溶剂混合物与所述根部分的比率为约20比约1(v/w)至约1比约1(v/w)；

4、将所述第一残余物与所述溶剂混合物级分分离；

5、在约10℃至约100℃的温度下，用水提取所述第一残余物以产生包含所述中间多糖级分的含水级分和第二残余物，其中所述水与所述根部分的比率为约20(v/w)比约1(v/w)至约1(v/w)比约1(v/w)；和

6、将包含所述中间多糖级分的所述含水级分与所述第二残余物分离；和

7、可选地，干燥或浓缩所述含水级分以产生所述中间多糖级分。

8、本技术还包括一种制备中性多糖级分的方法，该方法包括：

9、提供通过上述方法生产的中间多糖级分；

10、将所述中间多糖级分溶解在水中以产生中间多糖级分的溶液，其中所述中间多糖级分的溶液为约1％(w/w)至约10％(w/w)；

11、将c1-3烷基oh添加到所述中间多糖级分的溶液中以产生中性多糖级分和第一上清液，其中所述c1-3烷基oh与所述中间多糖级分的溶液的比率为约1比约1(v/v)至约0.5比约1(v/v)；

12、从所述第一上清液中分离所述中性多糖级分以产生所述中性多糖级分；和

13、可选地，除了使用所述中性多糖级分之外，通过重复前面的三个步骤以进一步纯化所述中性多糖级分。

14、本技术包括一种制备富含酸性多糖级分的方法，该方法包括：

15、提供通过上述方法生产的中间多糖级分；

16、将所述中间多糖级分溶解在水中以产生中间多糖级分的溶液，其中所述中间多糖级分(pbg-002)的溶液为约1％(w/w)至约10％(w/w)；

17、将c1-3烷基oh添加到所述中间多糖级分的溶液中以产生中性多糖级分和第一上清液，其中所述c1-3烷基oh与所述中间多糖级分的溶液的比率为约1比约1(v/v)至约0.5比约1(v/v)；

18、将所述第一上清液与所述中性多糖级分分离；

19、将c1-3烷基oh添加到所述第一上清液中以产生富含酸性多糖级分和第二上清液，其中所述c1-3烷基oh与第一上清液的比率为约0.5比约1(v/v)至约8比约1(v/v)；

20、将所述富含酸性多糖级分与所述第二上清液分离以产生所述富含酸性多糖级分。

21、本技术还包括一种制备酸性多糖级分的方法，该方法包括：

22、提供通过上述方法生产的富含酸性多糖级分；

23、将所述富含酸性多糖级分溶解在水中以产生富含酸性多糖级分的溶液，其中所述富含酸性多糖级分的溶液为约1％(w/w)至约10％(w/w)；

24、将c1-3烷基oh添加到所述富含酸性多糖级分的溶液中以产生沉淀物和包含所述酸性多糖级分的第三上清液，其中c1-3烷基oh与所述富含酸性多糖级分的溶液的比率为约1比约1(v/v)至约0.5比约1(v/v)；

25、将包含所述酸性多糖级分的所述第三上清液与所述沉淀物分离；和

26、可选地，干燥或浓缩所述第三上清液以产生所述酸性多糖级分。

27、或者，使用柱色谱法纯化所述富含酸性多糖级分以产生所述酸性多糖级分。因此，本技术还包括一种制备酸性多糖级分的方法，该方法包括：

28、提供通过上述方法生产的富含酸性多糖级分；

29、从包含二乙氨基乙基(deae)阴离子交换树脂的色谱柱中分级分离出所述富含酸性多糖级分以产生酸性多糖洗脱级分，其中所述分级分离包括：

30、(i)将所述富含酸性多糖级分溶解在水中以产生富含酸性多糖级分的溶液；

31、(ii)将所述富含酸性多糖级分的溶液装载到包含所述阴离子交换树脂的色谱柱上；和

32、(iii)使用乙酸铵缓冲液从所述阴离子交换树脂洗脱所述富含酸性多糖洗脱级分以产生所述酸性多糖洗脱级分，其中所述洗脱包含其中所述缓冲液为约10mm至约100mm乙酸铵的第一步骤，和其中所述缓冲液为约0.5m至约1.5m乙酸铵的第二步骤；和

33、可选地，干燥或浓缩所述酸性多糖洗脱级分以产生所述酸性多糖级分。

34、本技术还包括通过上述方法生产的中间多糖级分。

35、在一个实施例中，本技术包括中间多糖级分，其碳水化合物含量包含约0.5摩尔％至约4摩尔％鼠李糖(rha)、约13摩尔％至约17摩尔％半乳糖醛酸(gala)、约70摩尔％至约74摩尔％葡萄糖(glc)、约3摩尔％至约7摩尔％半乳糖(gal)和约3摩尔％至约7摩尔％阿拉伯糖(ara)。

36、在一个实施例中，本技术还包括通过上述方法生产的中性多糖级分。

37、本技术还包括中性多糖级分，其碳水化合物含量包含约0.1摩尔％至约3摩尔％鼠李糖(rha)、约3摩尔％至约7摩尔％半乳糖醛酸(gala)、约87摩尔％至约92摩尔％葡萄糖(glc)、约1摩尔％至约4摩尔％半乳糖(gal)和约1摩尔％至约5摩尔％阿拉伯糖(ara)。

38、在一个实施例中，本技术还包括通过上述方法生产的富含酸性多糖级分。

39、在一个实施例中，本技术还包括通过上述方法生产的酸性多糖级分。

40、本技术包括一种酸性多糖级分，其碳水化合物含量包含约2摩尔％至约6摩尔％鼠李糖(rha)、约43摩尔％至约47摩尔％半乳糖醛酸(gala)、约10摩尔％至约14摩尔％葡萄糖(glc)、约18摩尔％至约22摩尔％半乳糖(gal)和约16摩尔％至约20摩尔％阿拉伯糖(ara)。

41、本技术还包括一种组合物，其包含本技术的一种或多种级分及载体。

42、本技术包括一种用于激活生物样品或患者细胞中toll样受体(tlr)功能的方法，其包括向所述细胞施用有效量的本技术的一种或多种级分。

43、本技术进一步包括用于刺激生物样品或患者细胞中一种或多种趋化因子的产生的方法，其包括向所述细胞施用有效量的本技术的一种或多种级分。

44、本技术还包括一种通过激活tlr功能来治疗疾病、障碍或病症的方法，该方法包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本技术的一种或多种级分。

45、本技术还包括一种用于激活生物样品或患者细胞中的先天和/或适应性先天反应的方法，其包括向所述细胞施用有效量的本技术的一种或多种级分。

46、本技术还包括一种治疗病毒感染的方法，其包括向对其有需要的受试者施用治疗有效量的本技术的一种或多种级分。

47、本技术的其他特征和优点将从以下详细描述中变得显而易见。然而，应当理解，详细描述和具体示例虽然指示了本技术的实施例，但仅以说明的方式给出，并且权利要求的范围不应受到这些实施例的限制，而应给予与整个说明书一致的最广泛的解释。

48、附图的简要说明

49、现结合附图对本技术实施例进行更加详细的描述，其中：

50、图1是显示中间多糖级分(pbg-002)的制备过程以及由此而来的中性多糖级分(pbg-005)、富含酸性多糖级分(pbg-003)和酸性多糖级分(pbg-007)的纯化过程的流程图。

51、图2显示tlr2表达细胞刺激il-8的产生。

52、图3显示tlr4表达细胞刺激il-8的产生。

53、图4a显示了本技术级分对巨噬细胞培养物中h1n1病毒滴度的影响。*p<0.05，**p<0.001。图4b显示了本技术级分对巨噬细胞培养物中h1n1病毒滴度的影响。*p<0.05，**p<0.001。

54、图5显示了本技术级分对小鼠真皮成纤维细胞培养物中hsv-1病毒滴度的影响。*p<0.05，**p<0.001。

55、图6显示了本技术级分对人皮肤成纤维细胞系培养物中hsv-1病毒滴度的影响。*p<0.05，**p<0.001。

56、图7显示了本技术级分对小鼠真皮成纤维细胞培养物中hsv-2病毒滴度的影响。*p<0.05，**p<0.001。

57、图8显示了本技术级分对人皮肤成纤维细胞系培养物中hsv-2病毒滴度的影响。*p<0.05，**p<0.001。

58、图9a和图9b显示了本技术级分对人皮肤成纤维细胞系培养物中hsv-2病毒滴度的影响。*p<0.05，**p<0.001。

59、图10显示了hsv-2 ivag攻击后，本技术级分对豚鼠阴道洗液病毒滴度的影响。

60、图11显示了在初次hsv-2感染期间本技术级分对阴道损伤评分的影响。

61、图12a显示了本技术级分对hsv-2初次感染后总累积复发性阴道损伤评分的影响。图12b显示了本技术级分对hsv-2初次感染后个体累积复发性阴道损伤数量的影响。

62、图13显示了hsv-3 ivag攻击后，本技术级分对豚鼠存活百分比的影响。

63、图14显示了hsv-2 ivag攻击后，本技术级分对豚鼠每日体重的影响。