壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒在制备药品或保健食品中的应用的制作方法

1.本发明涉及药物制剂技术领域，更具体的说是涉及壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒在制备药品或保健食品中的应用。


背景技术：

2.研究表明，黄杞总黄酮兼具有降糖和降血脂的药理活性，与非酒精性脂肪肝的治疗机理契合，但用于治疗脂肪肝靶向性差，往往需要较大的剂量，而且其具有一定的苦味。


技术实现要素：

3.有鉴于此，为了减少黄杞总黄酮用药剂量和遮蔽其苦味，同时为了提高黄杞总黄酮的肝脏靶向性，本发明采用纳米粒作为药物载体，利用纳米粒的缓释和靶向等优良特性，进一步优化黄杞总黄酮对于非酒精性脂肪的治疗作用。黄杞总黄酮纳米粒的开发成功将为后续其他中草药纳米化制剂的研发带来新的方向。
4.为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
5.壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒在制备药品或保健食品中的应用。
6.进一步，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒粒径为100-300nm；药品或保健食品的功效为降血脂，或防治非酒精性脂肪肝。
7.进一步，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒的制备方法包括以下步骤：将壳聚糖溶液在搅拌下加入黄杞总黄酮水溶液中，然后注入三聚磷酸钠水溶液进行离子交换反应，出现蓝色乳光，即得到壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒混悬液，然后进行旋转蒸发浓缩、喷雾干燥，得壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒。
8.优选的，所述黄杞总黄酮水溶液浓度为0.5～1.5mg/ml；
9.将壳聚糖溶于1vt％醋酸中配置成所述壳聚糖溶液，所述壳聚糖溶液浓度为1-2.5mg/ml；
10.所述三聚磷酸钠水溶液浓度为0.8-2mg/ml。
11.优选的，所述黄杞总黄酮水溶液：壳聚糖溶液：三聚磷酸钠水溶液的质量比为1:(4-6):1。
12.优选的，所述搅拌的搅拌速率为400～600rpm，搅拌时间为40～70min。
13.优选的，所述离子交换反应的温度为20-30℃。
14.优选的，步骤(4)中所述喷雾干燥的进风温度为160-200℃，出风温度为70-100℃，进样流速为300-500ml/h，压力为12atm，风速为0.90m3/min。
15.优选的，黄杞总黄酮水溶液的制备步骤为：
16.(1)依次采用体积浓度为90～95％、70～75％、50～55％、20～30％的乙醇梯度提取黄杞的有效成分总黄酮，得黄杞总黄酮粗品；
17.(2)黄杞总黄酮粗品加水混匀，过滤，取上清液，加入壳聚糖溶液混匀，反复过滤，取上清液，高速离心，冷冻干燥，即得黄杞总黄酮提取物；
18.(3)用纯水将黄杞总黄酮提取物溶解后即得黄杞总黄酮水溶液。
19.黄杞的有效成分复杂，功效多，其中黄酮类成分具有抗氧化作用，对心血管系统疗效较好，而且黄杞黄酮的含量非常高。
20.本发明采用毒性较小的有机溶剂乙醇梯度提取黄杞，通过不同浓度的乙醇可以提取出不同极性的黄酮。该方法简单易行，且成本较低。然后利用壳聚糖本身的絮凝特性来纯化黄杞提取物，这样不仅不会引入新的杂质，还会使黄杞提取物的纯度得到提高。
21.优选的，所述旋转蒸发浓缩的温度低于60℃。
22.经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
23.1.离子交联法制备壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒呈球形，且表面光滑，大小比较均一，在100～300nm之间，且分布较为集中，分散度系数可达0.336。体外释药性能研究表明壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒有缓释的效果。
24.2.采用乙醇梯度提取出的黄杞总黄酮杂质少，不易霉变，优于用水提取。
25.3.本发明制得的壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒不仅具有降血脂作用，还具有抗氧化性，并能有效保护肝脏，为开发具有明显降脂效果的药品或者保健食品提供科学依据。
26.4.本发明为壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒防治非酒精性脂肪肝的后续研究开拓了新的思路。
附图说明
27.为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
28.图1为不同样品对大鼠肝脏的影响；
29.图2为大鼠肝脏he染色结果；
30.图3为各组大鼠肝组织中fas蛋白表达的免疫组化显微图；
31.图4为各组大鼠肝组织中fas蛋白表达水平检测结果；
32.图5为各组大鼠肝组织中fasl蛋白表达的免疫组化显微图；
33.图6为各组大鼠肝组织中fasl蛋白表达水平检测结果；
34.图7为各组大鼠肝组织中ck18蛋白表达的免疫组化显微图；
35.图8为各组大鼠肝组织中ck18蛋白表达水平检测结果；
36.图9为各组大鼠肝组织中rbp4蛋白表达的免疫组化显微图；
37.图10为各组大鼠肝组织中rbp4蛋白表达水平检测结果；
38.图11为各组大鼠肝组织中srebp-1c蛋白表达的免疫组化显微图；
39.图12为各组大鼠肝组织中srebp-1c蛋白表达水平检测结果；
40.图13为各组大鼠肝组织中pparα蛋白表达的免疫组化显微图；
41.图14为各组大鼠肝组织中pparα蛋白表达水平检测结果。
具体实施方式
42.下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施
例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
43.实施例1
44.壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒在制备药品或保健食品中的应用，其中，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒的制备方法包括以下步骤：
45.(1)黄杞总黄酮的提取：称取黄杞(经广西中医药研究院副研究员鉴定为胡桃科黄杞属植物黄杞engelhardia roxburghiana wall的干燥叶)适量，粉碎成粗粉，加10倍量95％乙醇浸提2d，过滤，滤渣加10倍量75％乙醇浸提2d，过滤，滤渣加10倍量50％乙醇浸提2d，过滤，滤渣加10倍量20％乙醇浸提2d，合并上述所有滤液，过滤后获得黄杞总黄酮样品，然后浓缩得黄杞总黄酮粗品；
46.(2)黄杞总黄酮的纯化：将提取出的黄杞总黄酮粗品加水混匀，过滤，取上清液，加入壳聚糖溶液混匀，反复过滤，取上清液，13000r/min高速离心30min，冷冻干燥，即得黄杞总黄酮提取物；用紫外-分光光度法测定黄杞总黄酮的含量；
47.(3)黄杞总黄酮水溶液的制备：用纯水将黄杞总黄酮提取物溶解后即得黄杞总黄酮水溶液；
48.(4)黄杞总黄酮水溶液的制备：将壳聚糖溶于1vt％醋酸中配置成壳聚糖溶液，在600rpm的搅拌速度下缓缓加入黄杞总黄酮水溶液，然后缓缓注入stpp(三聚磷酸钠)溶液进行离子交换反应，20℃反应50min，出现蓝色乳光，即得到壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒混悬液，然后进行旋转蒸发浓缩、喷雾干燥，得壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒；
49.黄杞总黄酮水溶液浓度为0.5mg/ml，壳聚糖溶液浓度为1.0mg/ml，stpp水溶液浓度为1.0mg/ml；壳聚糖溶液体积为10ml，stpp水溶液体积为2.5ml；黄杞总黄酮水溶液体积为5ml；
50.喷雾干燥的进风温度为180℃，出风温度为80℃，进样流速为500ml/h，压力为12atm，风速为0.90m3/min。
51.性能测试
52.一、壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒的降脂活性研究
53.采用高脂饮食，制备非酒精性脂肪肝大鼠模型。实验将大鼠随机分为空白对照组、高脂模型组、普罗布考组、黄杞总黄酮组、壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒高、中、低剂量组。连续灌胃4周后量体重、肝湿重、肾周及附睾脂肪重量，计算肝指数(肝重/体重)；测定各组大鼠的谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、血清总胆固醇(tc)、血清甘油三酯(tg)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)、高密度脂蛋白胆固醇(hdl-c)、血清和肝脏的丙二醛(mda)含量、超氧化物歧化酶(sod)活性的变化。各组大鼠肝脏做he病理切片在电子显微镜下观察。
54.1、高脂饲料
55.高脂饲料配方：由8％猪油、5％蛋黄粉、3％胆固醇、2％胆酸钠、1.8％吐温、0.2％丙硫氧嘧啶和80％普通饲料混合而成。
56.2、造模和实验过程
57.sd大鼠60只，适应性喂养5天，随机分为2组，空白对照组9只和高脂模型组51只。空白对照组给以普通饲料，其余高脂模型组给以高脂饲料，每天定时定量投喂饲料，饮用水不
限量。8周后，取血测总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白(hdl-c)和低密度脂蛋白(ldl-c)，随机选取1只空白对照组大鼠和3只高脂模型组大鼠，取其肝组织做病理学检查。
58.he染色结果显示，与空白对照组比较，高脂模型组大鼠肝细胞出现严重的脂肪变性，脂肪空泡明显且呈气球样变，汇管区存在明显的炎性和嗜酸性坏死细胞。上述病理特征变化表明非酒精性脂肪肝大鼠模型复制成功。
59.随后将高脂模型组大鼠随机分为6组，每组8只大鼠给药：高脂对照组给生理盐水灌胃、普罗布考组为100mg/kg/d、壳聚糖黄杞总黄酮组为200mg/kg/d、壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒高剂量为300mg/kg/d、壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒中剂量组为200mg/kg/d、壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒低剂量组为100mg/kg/d。空白对照组给生理盐水灌胃。除空白对照组均给以普通饲料外，其他组继续给以高脂饲料。然后连续给药4周，并定期称量体重。
60.于实验结束后大鼠禁食16小时，眼球取血，离心后，取血清测定tc、tg、hdl-c、ldl-c、谷草转氨酶(ast)、谷丙转氨酶(alt)、sod和mda。解剖大鼠尸体，取出肝脏，称其湿重。每1g肝湿重加入生理盐水20ml，研成匀浆，4000rpm离心20min(全程冰浴上操作)，测定肝匀浆液的sod、mda。同时取肾周、睾周脂肪，称重。计算肝指数＝(肝湿重/体重)*100％。将各实验组和模型组sd大鼠的肝脏进行固定-取材-4％甲醛脱水-二甲苯透明-浸蜡-包埋-切片-he染色，置于光镜下观察、拍照。
61.3、指标测定
62.(1)血脂指标的测定
63.取离心后的血清和肝匀浆液，测定tc、tg、hdl-c、ldl-c。
64.①
胆固醇的测定：采用酶法进行测定。
65.在胆固醇酯酶(ce)的作用下，酯型胆固醇转化为游离型胆固醇。游离型胆固醇被胆固醇氧化酶(cod)氧化后产生过氧化氢。在过氧化物酶(pod)的存在下，过氧化氢与4-氨基安替比林与n-乙基-n-磺丁基-m-甲苯胺钠(esbmt)氧化缩合，产生红紫色色素，测定色素的吸光度即可得出总胆固醇的含量。
[0066][0067][0068][0069]
在500nm波长下比色测定，可求得标本内总胆固醇含量。
[0070]
②
甘油三酯的测定：采用酶法进行测定。
[0071]
第一反应：在腺苷三两酸二钠(atp)的存在下，游离甘油在甘油激酶(gk)的作用下生成甘油-3-磷酸。在甘油-3-磷酸氧化酶(gpo)的作用下产生过氧化氢，并在过氧化氢酶作用下分解成水和氧气后被消除。
[0072]
第二反应：甘油三酯在脂蛋白脂肪酶(lpl)作用下，迅速被水解成甘油及脂肪酸。在atp的存在下，甘油在gk的作用下，转化成甘油-3-磷酸，再在gpo的作用下产生过氧化氢。在过氧化物酶(pod)的存在下，过氧化氢与4-氨基安替比林与n-乙基-n-磺丁基-m-甲苯胺钠(esbmt)氧化缩合，产生红紫色色素，测定色素的吸光度即可得出总胆固醇的含量。
[0073][0074][0075][0076][0077][0078][0079][0080]
在500nm波长处比色可求得tg含量。
[0081]
③
高密度脂蛋白胆固醇的测定：采用反应促进剂-过氧化物酶消除法测定。
[0082]
加入反应促进剂，血清中的cm、vldl、ldl形成可溶性复合物，表层的游离胆固醇在chod的催化下生成h2o2，在pod的作用下，h2o2被清除。加入一种特殊的选择性表面活性剂除hdl以外的脂蛋白(cm、vldl、ldl)在聚阴离子作用下被抑制，hdl在表面活性剂作用下是可溶的，所释放的胆固醇与cher和chod反应，生成h2o2，并作用于esbmt色原体产生颜色反应。
[0083][0084][0085][0086]
在500nm处测定吸光度。
[0087]
④
低密度脂蛋白胆固醇的测定：采用表面活性剂清除法测定。
[0088]
第一反应：表面活性剂1可改变ldl以外的脂蛋白(cm、vldl、hdl)的结构，促使cod、ce与cm、vldl、hdl反应，但与ldl不反应。即除ldl之外的脂蛋白均被消除。
[0089]
第二反应：表面活性剂2于没有消除的ldl-胆固醇反应显色。
[0090][0091][0092][0093][0094]
在500nm处测定吸光度。
[0095]
(2)超氧化物歧化酶(sod)活力的测定
[0096]
超氧化物歧化酶(sod)对机体的氧化与抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基(o
2-)保护细胞免受损伤。本实验采用黄嘌呤氧化酶法测定sod活力。
通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(o
2-)，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用可见光分光光度计在550nm处测其吸光度。当被测样品中含sod时，则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用，使形成的亚硝酸盐减少，比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值，通过公式计算可求出被测样品中的sod活力。
[0097]
测定方法：在550nm波长下，测定样品管od值和空白管od值，如样品浓度过高可在测试前进行稀释，稀释倍数为d，反应体系的稀释倍数为r，反应总体积为c，取样量为a。
[0098]
定义：每毫升反应液中sod抑制率达50％时所对应的sod量为一个sod活力单位(u)。
[0099]
血清酶活力计算公式：
[0100][0101]
肝匀浆酶活力计算公式：
[0102][0103]
(3)血清丙二醛(mda)活力的测定
[0104]
mda是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤因此在植物衰老生理和抗性生理研究中mda含量是一个常用指标，可通过mda了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。
[0105]
本实验采用tba法来测定mda。丙二醛(mda)是常用的膜脂过氧化指标，在酸性和高温度条件下，可以与硫代巴比妥酸(tba)反应生成红棕色的三甲川(3，5，5-三甲基恶唑-2，4-二酮)，在532nm有最大吸收峰。
[0106]
测定方法：在532nm波长下，测定样品管od值、标准管od、对照管od和空白管od值，如样品不溶血可不测对照管od，用空白管od来代替；若样品浓度过高可在测试前进行稀释，稀释倍数为d，反应体系的稀释倍数为r，反应总体积为c，取样量为a，标准品浓度为10nmol/ml。
[0107]
血清酶活力计算公式：
[0108][0109]
肝匀浆酶活力计算公式：
[0110][0111]
(4)肝功能指标的测定
[0112]
①
谷草转氨酶的测定：采用速率法检测。
[0113]
谷草转氨酶催化l-天冬氨酸的氨基转移与mdh催化的反应偶联，使nadh氧化成nad
+
。nadh在340nm处有特异吸收峰，其被氧化的速率与血清中ast的活性成正比，在340nm出测
定nadh的下降速率，即可测出ast活性。
[0114][0115][0116]
②
谷丙转氨酶的测定：采用速率法检测。
[0117]
谷丙转氨酶催化l-丙氨酸的氨基转移，生成丙酮酸。丙酮酸与nadh在ldh的催化下反应生成乳酸和nad
+
。nadh在340nm处有特异吸收峰，其被氧化的速率与血清中alt的活性成正比，在340nm出测定nadh的下降速率，即可测出alt活性。
[0118][0119][0120]
4、数据统计
[0121]
以上结果的计量资料经spss22.0统计软件进行处理，配对分析采用t检验，方差分析，多样本均数比较的显著性检验用q检验，p《0.05表示差异有统计学意义。
[0122]
5、结果
[0123]
(1)血清血脂生化
[0124]
表1大鼠血清血脂生化
[0125][0126]
注：+p＜0.05与高脂对照组比较。
[0127]
由表1可知，高脂模型组与空白对照组比较，tc，tg均明显升高，证明动物造模基本成功。所有给药组与高脂组对比，tg、tc明显下降，差异具有显著性(p《0.05)，尤其是壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒高剂量组的tg、tc水平下降最为明显。hdl-c和ldl-c各组无差异(p＞0.05)。实验结果表明，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒有降低tg、tc的效果。
[0128]
(2)血清肝功能生化
[0129]
表2大鼠血清肝功能生化
[0130][0131]
由表2可知，各组间的谷草转氨酶和谷丙转氨酶均无组间差异(p＞0.05)，说明短时间内给与高脂乳剂和药物对大鼠的肝功能几乎没有影响。
[0132]
(3)血清抗氧化指标
[0133]
表3大鼠血清抗氧化指标
[0134]
组别sod(u/ml)mda(nmol/ml)1(空白对照组)299.61
±
10.13+7.26
±
0.24+2(高脂对照组)250.28
±
12.549.99
±
0.413(普罗布考组)263.25
±
20.318.85
±
0.264(黄杞总黄酮组)332.36
±
18.58+*8.52
±
0.375(黄杞总黄酮纳米粒低剂量组)358.75
±
20.11+*7.01
±
0.25+6(黄杞总黄酮纳米粒中剂量组)369.29
±
19.53+*6.75
±
0.19+7(黄杞总黄酮纳米粒高剂量组)389.14
±
12.25+*6.31
±
0.24+
[0135]
注：+p＜0.05与高脂对照组比较，*p＜0.05与空白对照组比较。
[0136]
由表3可知，黄杞总黄酮组、壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒低、中、高剂量组的血清sod活性明显增强，且均高于高脂组。壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒低、中、高剂量组血清mda值均比高脂组有所降低，均优于普罗布考组和黄杞总黄酮组。综上所述，高脂饮食能降低大鼠血清的抗氧化性，停止高脂乳剂后大鼠的血清抗氧化性并未明显恢复，实验表明，黄杞总黄酮和壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒均能提高大鼠的血清的抗氧化性，以壳聚糖包载黄杞成为纳米粒后抗氧化性提高最为显著。
[0137]
(4)肝脏抗氧化指标
[0138]
表4大鼠肝脏抗氧化指标
[0139]
组别sod(u/ml)mda(nmol/ml)1(空白对照组)193.21
±
11.380.99
±
0.16+2(高脂对照组)182.14
±
13.213.12
±
0.393(普罗布考组)173.75
±
10.611.65
±
0.41+4(黄杞总黄酮组)200.17
±
21.131.37
±
0.19+5(黄杞总黄酮纳米粒低剂量组)207.33
±
25.141.49
±
0.27+6(黄杞总黄酮纳米粒中剂量组)251.54
±
38.26+*1.38
±
0.24+7(黄杞总黄酮纳米粒高剂量组)289.22
±
53.94+*1.11
±
0.35+
[0140]
注：+p＜0.05与高脂对照组比较，*p＜0.05与空白对照组比较。
[0141]
由表4可知，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒中、高剂量组与高脂对照组相比，肝脏sod活性明显增强。给药后各组的mda值均比高脂对照组有所下降，差异具有显著性(p＜0.05)。综上所述，表明中、高剂量的壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒对大鼠肝脏具有很好的抗氧化性。
[0142]
(5)体重增量
[0143]
表5大鼠体重增重
[0144]
组别给药前后体重增量(g)1(空白对照组)200.21
±
14.582(高脂对照组)161.35
±
29.123(普罗布考组)179.79
±
21.354(黄杞总黄酮组)158.45
±
30.285(黄杞总黄酮纳米粒低剂量组)161.21
±
20.776(黄杞总黄酮纳米粒中剂量组)160.25
±
21.547(黄杞总黄酮纳米粒高剂量组)131.08
±
31.81+*
[0145]
注：+p＜0.05与高脂对照组比较，*p＜0.05与空白对照组比较。
[0146]
由表5可知，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒高剂量组与其他各对照组相比，均使体重增量减少，差异有显著性(p＜0.05)。其余各组差异没有显著性(p》0.05)。表明壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒高剂量能降低大鼠的体重。
[0147]
(6)肝重、肝指数、体脂
[0148]
表6大鼠肝重和体脂的影响
[0149]
组别肝重(g)肝指数体脂(g)1(空白对照组)14.01
±
1.360.040
±
0.00298.32
±
1.562(高脂对照组)15.98
±
1.750.041
±
0.003810.75
±
2.983(普罗布考组)13.62
±
1.120.039
±
0.00417.98
±
3.024(黄杞总黄酮组)10.15
±
1.09+*0.038
±
0.00285.45
±
1.51+5(黄杞总黄酮纳米粒低剂量组)10.19
±
1.35+*0.037
±
0.00255.69
±
1.09+6(黄杞总黄酮纳米粒中剂量组)10.29
±
1.02+*0.036
±
0.00286.03
±
1.75+7(黄杞总黄酮纳米粒高剂量组)10.15
±
1.74+*0.038
±
0.00314.01
±
2.23+*
[0150]
注：+p＜0.05与高脂对照组比较，*p＜0.05与空白对照组比较。
[0151]
由表6可知，黄杞总黄酮组、壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒低、中、高剂量组的大鼠肝重与高脂组、空白对照组比均有所降低，差异均有显著性(p＜0.05)。肝指数则各组无差异(p》0.05)。黄杞总黄酮组、壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒低、中、高剂量组的大鼠体脂均比高脂对照组有所降低，差异均有显著性(p＜0.05)。表明黄杞总黄酮、壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒低、中、高剂量能降低大鼠的肝重和体内脂肪。
[0152]
(7)肝脏图片
[0153]
对大鼠进行解剖，观察肝脏颜色的变化，结果如图1所示。
[0154]
图1为不同样品对大鼠肝脏的影响。由图1可知，正常大鼠的肝脏体积较小，边缘清晰，颜色较深，呈红褐色，表面光滑，并具有一定的组织弹性。高脂模型组大鼠肝脏呈棕黄
色，稍隆起，质地略软，触之有油腻感，且组织易碎、肿大。其他给药组的大鼠肝脏形态上基本接近于正常肝脏，但是颜色稍浅，偏黄。
[0155]
以上试验结果表明，壳聚糖纳黄杞米粒有较好的肝脏保护功能。
[0156]
(8)肝脏病理切片
[0157]
大鼠肝脏he切片分别在40
×
的电镜下观察，结果如图2所示。
[0158]
图2为大鼠肝脏he染色结果。由图2可知，正常大鼠的肝脏细胞大小基本一致，细胞边界清晰，形状呈多边形。肝索以中央静脉为中心呈放射状整齐排列，肝小叶清晰整齐有规则，细胞中央有清晰且圆的核，核结构清晰，胞质均匀，少见脂滴，汇管区清晰，肝窦排列规则。高脂模型组大鼠的肝脏细胞肿胀变形，可见许多大小不等的脂滴空泡，肝细胞核被脂滴挤得偏位变形，有的与脂滴融合成大脂滴，肝索紊乱，肝细胞出现明显的脂肪变性。其他给药组的肝细胞基本接近正常，但是还是能看到少许的大小不等的脂滴空泡，细胞核不够清晰和圆润，核结构不明显，细胞边界不够清晰，肝索排列较为整齐。黄杞总黄酮纳米粒中、高剂量组的肝脏已经基本接近正常大鼠肝脏细胞，细胞核位于细胞中央，清晰且圆，基本看不到脂滴空泡，细胞边界清晰。表明壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒对于高脂大鼠的肝脏有很好的保护和恢复作用。
[0159]
6、讨论
[0160]
(1)动物实验表明，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒能够明显降低非酒精性脂肪肝大鼠的tg、tc水平。壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒高剂量组大鼠体重增量与各个对照组相比均有所减少，动物体内的脂肪大大降低。说明壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒具有降脂活性。
[0161]
(2)抗氧化实验表明，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒组大鼠与各个对照组相比，血清和肝脏的sod水平明显升高，mda水平降低。说明壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒具有一定的抗氧化活性。
[0162]
(3)通过对大鼠肝脏进行解剖，he染色切片观察，发现壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒能使非酒精性脂肪肝大鼠的脂肪肝病变有很好的改善，说明壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒有保护肝脏脂肪化的作用。
[0163]
7、结论
[0164]
综上，动物实验表明壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒能够降低非酒精性脂肪肝大鼠的tg、tc水平和大鼠体内脂肪，并且能使非酒精性脂肪肝大鼠的肝脏sod水平升高，mda降低。
[0165]
以上试验结果表明，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒能够降低血脂，提高机体的抗氧化性能，并且有保护肝脏的作用。
[0166]
二、壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒降脂机理研究
[0167]
非酒精性脂肪肝病(nafld)是一种无过量饮酒史的肝内脂质积聚超过肝湿重的5％的脂肪代谢异常疾病。非酒精性脂肪肝病会引起肝细胞肿胀、变性、凋亡和坏死，进一步演变为肝纤维化、肝硬化，甚至肝功能衰竭的严重后果。细胞角蛋白18(cytokeratinl8，ckl8)作为一种从凋亡肝细胞的释放蛋白，与肝脏损伤密切相关。fas是肿瘤坏死因子受体超家族的成员，它与fasl结合可以启动凋亡信号的转导引起细胞凋亡，导致肝细胞坏死。本实验通过研究壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒对非酒精性脂肪肝大鼠ckl8、fas及其配体fasl的影响迸一步了解其对非酒精性脂肪肝的作用机制。
[0168]
有效减少肝脏脂肪堆积是治疗脂肪肝的有效方法。脂肪因子视黄醇结合蛋4
(retinol binding protein 4，rbp4)，与非酒精性脂肪肝的形成密切相关。过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome prolifer ateractivated receptor pparα)主要功能是参与肝脂肪代谢和脂肪细胞的分化，与糖尿病、肥胖病、脂肪肝、高血脂有着密切关系。而srebp-1c能调节脂肪酸及糖类代谢。本实验拟从脂质调节方面探讨壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒对非酒精性脂肪肝大鼠rbp4、pparα、srebp-lc等蛋白表达的影响，从而探讨其作用机制。
[0169]
1、肝组织中蛋白表达检测
[0170]
利用免疫组织化学法检测，按照抗体及免疫组化试剂盒说明书方法操作:取肝组织适量，经石蜡包埋后，切成厚度为5μm的切片，先将切片置于二甲苯中进行脱蜡，再依次用100％、95％、80％、60％乙醇进行水化；然后进行抗原修复、内源性过氧化物酶灭活、10％山羊血清封闭，分别滴加一定稀释比例的fas、fasl、ck18、rbp4、srebp-1c、pparα一抗，4℃孵育过夜；次日用磷酸盐缓冲液(pbs，ph 7.4～7.6)清洗3次，每次1min，滴加对应生物素标记的抗兔/鼠辣根过氧化物酶标记聚合物，37℃孵育30min后，pbs清洗3次，每次1min；滴加dab工作液显色，用水清洗后，经苏木精复染2min，乙醇脱水，置于二甲苯中透明2次，每次10min，干燥后，用中性树脂封片，置于光学显微镜下拍照(棕黄色区域表示阳性)，每张照片随机拍摄5个视野(
×
40)，利用image proplus 6.0软件进行分析，以组化图中的累积光密度值占总区域的比值表示蛋白的表达水平。
[0171]
2、结果
[0172]
(1)黄杞总黄酮纳米粒对大鼠肝组织中fas蛋白表达的影响
[0173]
各组大鼠肝组织中fas蛋白表达的免疫显微图(40
×
)如图3所示，蛋白表达水平检测结果如图4所示(注：+p＜0.05与高脂对照组比较，*p＜0.05与空白对照组比较)。
[0174]
图3为各组大鼠肝组织中fas蛋白表达的免疫组化显微图，图4为各组大鼠肝组织中fas蛋白表达水平检测结果。由图3和图4可知，与空白对照组比较，高脂对照组大鼠肝组织中fas蛋白的表达水平显著升高(p＜0.05)。与高脂对照组比较，各给药组大鼠肝组织中fas蛋白的表达水平均显著降低(p＜0.05)。
[0175]
(2)黄杞总黄酮纳米粒对大鼠肝组织中fasl蛋白表达的影响
[0176]
各组大鼠肝组织中fasl蛋白表达的免疫显微图(40
×
)如图5所示，蛋白表达水平检测结果如图6所示(注：+p＜0.05与高脂对照组比较，*p＜0.05与空白对照组比较)。
[0177]
图5为各组大鼠肝组织中fasl蛋白表达的免疫组化显微图，图6为各组大鼠肝组织中fasl蛋白表达水平检测结果。由图5和图6可知，与空白对照组比较，高脂对照组大鼠肝组织中fasl蛋白的表达水平显著升高(p＜0.05)。与高脂对照组比较，各给药组大鼠肝组织中fasl蛋白的表达水平均显著降低(p＜0.05)。
[0178]
(3)黄杞总黄酮纳米粒对大鼠肝组织中ck18蛋白表达的影响
[0179]
各组大鼠肝组织中ck18蛋白表达的免疫显微图(40
×
)如图7所示，蛋白表达水平检测结果如图8所示(注：+p＜0.05与高脂对照组比较，*p＜0.05与空白对照组比较)。
[0180]
图7为各组大鼠肝组织中ck18蛋白表达的免疫组化显微图，图8为各组大鼠肝组织中ck18蛋白表达水平检测结果。由图7和图8可知，与空白对照组比较，高脂对照组大鼠肝组织中ck18蛋白的表达水平显著升高(p＜0.05)。与高脂对照组比较，各给药组大鼠肝组织中ck18蛋白的表达水平均显著降低(p＜0.05)。
[0181]
(4)黄杞总黄酮纳米粒对大鼠肝组织中rbp4蛋白表达的影响
[0182]
各组大鼠肝组织中rbp4蛋白表达的免疫显微图(40
×
)如图9所示，蛋白表达水平检测结果如图10所示(注：+p＜0.05与高脂对照组比较，*p＜0.05与空白对照组比较)。
[0183]
图9为各组大鼠肝组织中rbp4蛋白表达的免疫组化显微图，图10为各组大鼠肝组织中rbp4蛋白表达水平检测结果。由图9和图10可知，与空白对照组比较，高脂对照组大鼠肝组织中rbp4蛋白的表达水平显著升高(p＜0.05)。与高脂组对照比较，各给药组大鼠肝组织中rbp4蛋白的表达水平均显著降低(p＜0.05)。
[0184]
(5)黄杞总黄酮纳米粒对大鼠肝组织中srebp-1c蛋白表达的影响
[0185]
各组大鼠肝组织中srebp-1c蛋白表达的免疫显微图(40
×
)如图11所示，蛋白表达水平检测结果如图12所示(注：+p＜0.05与高脂对照组比较，*p＜0.05与空白对照组比较)。
[0186]
图11为各组大鼠肝组织中srebp-1c蛋白表达的免疫组化显微图，图12为各组大鼠肝组织中srebp-1c蛋白表达水平检测结果。由图11和图12可知，与空白对照组比较，高脂对照组和黄杞总黄酮组大鼠肝组织中srebp-1c蛋白的表达水平显著升高(p＜0.05)。与高脂对照组比较，除了黄杞总黄酮组外，其余各给药组大鼠肝组织中srebp-1c蛋白的表达水平均显著降低(p＜0.05)。
[0187]
(6)黄杞总黄酮纳米粒对大鼠肝组织中pparα蛋白表达的影响
[0188]
各组大鼠肝组织中pparα蛋白表达的免疫荧光显微图(40
×
)如图13所示，蛋白表达水平检测结果如图14所示(注：+p＜0.05与高脂对照组比较，*p＜0.05与空白对照组比较)。
[0189]
图13为各组大鼠肝组织中pparα蛋白表达的免疫组化显微图，图14为各组大鼠肝组织中pparα蛋白表达水平检测结果。由图13和图14可知，与空白对照组比较，高脂对照组和黄杞总黄酮纳米粒低剂量组大鼠肝组织中pparα蛋白的表达水平显著降低(p＜0.01)。与高脂对照组比较，除黄杞总黄酮纳米粒低剂量组外各给药组大鼠肝组织中pparα蛋白的表达水平均显著升高(p＜0.05或p＜0.01)。
[0190]
3、结论
[0191]
综上，与空白组比较，高脂组大鼠肝组织rbp4、srebp-1、ck18、fas、fas-l蛋白表达增高(p《0.05)，ppara蛋白表达降低(p《0.05)；与高脂组比较，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒使得rbp4、srebp-1、ck18、fas、fas-l蛋白在肝脏上的表达降低(p《0.05)，ppara蛋白表达增高(p《0.05)。
[0192]
以上试验结果说明，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒可能是通过调控肝脏上的fas、fas-l、ck18、ppara、rbp4和srebp1蛋白使得肝脏脂肪含量降低。
[0193]
三、结论
[0194]
1、通过动物实验研究壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒降脂作用和抗氧化。结果表明，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒能够降低非酒精性脂肪肝大鼠的tg、tc水平，升高sod水平，降低mda水平。通过解剖大鼠肝脏发现壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒可以有效保护肝脏。
[0195]
综上所述，壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒不仅具有降血脂作用，还具有抗氧化性，并能有效保护肝脏。为开发具有明显降脂效果的药品或者保健食品提供科学依据。
[0196]
2、壳聚糖黄杞总黄酮纳米粒对非酒精性脂肪肝大鼠有一定的改善作用，其机制可能是通过改善脂质代谢紊乱、调节氧化应激、减轻脂质过氧化反应、增强机体抗氧化能力，下调fas、fasl、ck18、rbp4、srebp-1c和上调pparα蛋白表达等有关，本发明为壳聚糖黄杞总
黄酮纳米粒防治非酒精性脂肪肝的后续研究开拓了新的思路。
[0197]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
[0198]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本发明中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本发明所示的这些实施例，而是要符合与本发明所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。