一种纳米颗粒复合水凝胶神经导管及其制备方法

1.本发明涉及生物医用材料的技术领域，尤其是指一种纳米颗粒复合水凝胶神经导管及其制备方法。


背景技术：

2.由于周围神经在人体内分布的广泛性，意外事故等引起的组织损伤往往会伴随着周围神经缺损。而周围神经缺损一旦发生很难实现自我修复，临床上常用的治疗方法如断端缝合术、自体或异体神经移植等目前又面临着各种问题，如难以修复长距离神经缺损和供体来源不足以及伦理限制等。近年来，人工神经导管的研究与开发为周围神经缺损修复提供了新的思路。具有生物相容性、生物活性、完全体内可降解的人工神经导管可以保护受损神经组织，引导并促进神经再生，且无需二次手术取出，极大的减轻了患者的负担。
3.目前对于人工神经导管主要有以下性能要求：1、合适的的生物降解性；2、良好的生物相容性；3、相匹配的力学性能；4、具有促组织再生功能。但是单一材料很难同时满足以上全部特性，使用兼具不同优点的多种材料共同构造复合人工神经导管是目前的发展趋势。
4.明胶是胶原的进一步水解产物，保留了一些如rgd的胶原蛋白信号序列，可以更好地支持细胞的黏附和生长，但因其降解速率快，力学性能差的缺点难以应用在神经组织工程上。丝素蛋白是经fda批准许可的生物材料，它主要是从家蚕丝中提取的，廉价又安全，且拥有足够的力学性能可以满足神经导管抗挤压扭折的要求。使用明胶和丝素蛋白材料可以兼具两者优点，制备出即拥有良好生物相容性又满足力学性能要求的人工神经导管。
5.为了提高人工神经导管的促神经再生能力，在支架上负载细胞、神经生长因子、富血小板血浆等相应活性因子都是常用的方法，这些生物活性物质可以营养神经元细胞，促进神经突起生长。microrna是一类丰富的小的非编码rna，作为基因表达和转录过程中的重要调节因子，在神经发育和神经再生中起着至关重要的作用。在周围神经系统损伤中，mirna-29a能够调控pten基因表达，促进神经元轴突的伸长。使用zif-8纳米颗粒作为mirna-29a的载体，将其与水凝胶导管复合，可以实现基因的有效递送增强导管的组织修复功能。同时 zif-8降解过程中的zn
2+
也具有促神经再生作用。另外zn
2+
和mirna-29a还可以引导巨噬细胞由m1表型向m2表型转变，通过免疫调节，促进雪旺细胞成熟，分泌神经生长因子，进一步作用于神经再生。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提出了一种纳米颗粒复合水凝胶神经导管及其制备方法，该方法制备的纳米颗粒复合水凝胶神经导管具有良好的生物相容性，满足周围神经修复所需要的力学性能，其释放的 mirna-29a@zif-8能够进一步加速神经修复过程，从而更好地治疗周围神经损伤。
7.为实现上述目的，本发明所提供的技术方案为：一种纳米颗粒复合水凝胶神经导
管的制备方法，包括以下步骤：
8.1)将mirna-29a溶解在depc水中，并与zif-8悬液混合后置于摇床上孵育，得到a溶液，随后将a溶液离心收集沉淀即得到mirna-29a@zif-8纳米颗粒；将二次脱胶蚕丝充分溶解于溴化锂溶液中，使用去离子水透析一段时间并离心以除去杂质后，得到丝素蛋白溶液；将明胶溶解在2-马啉乙磺酸缓冲水溶液中，随后加入酪胺盐酸盐溶解充分，最后加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺，搅拌反应，去离子水环境下透析一段时间后，冻干即得到海绵状的酪胺改性明胶；
9.2)将mirna-29a@zif-8纳米颗粒分散在丝素蛋白溶液中，得到b溶液；将酪胺改性明胶溶解在丝素蛋白溶液中，得到c溶液；将b溶液和c溶液混合搅拌均匀，加入辣根过氧化物酶得到混合溶液；将混合溶液注入管装模具中，置于特定温度的冰箱中，待形成热可逆水凝胶后，推出浸泡在双氧水中，交联一段时间后取出，切去导管两端，洗去未交联部分，即可得到纳米颗粒复合水凝胶神经导管。
10.进一步，zif-8悬液的浓度为1～3mg/ml，其中最佳浓度为1.5mg/ml。
11.进一步，mirna-29a与zif-8纳米颗粒的重量比为2～6：100，最佳比为 4:100。
12.进一步，溴化锂溶液的浓度为9.3m。
13.进一步，酪胺盐酸盐的浓度为0.01g/ml，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺的浓度为0.74mg/ml、0.22mg/ml。
14.进一步，mirna-29a@zif-8纳米颗粒在丝素蛋白溶液中的浓度为质量分数 0.12％～0.2％，其中最佳浓度为0.16％。
15.进一步，酪胺改性明胶在丝素蛋白溶液中的浓度为30w/v％。
16.进一步，辣根过氧化物酶的浓度为60～240unit/ml，最佳浓度为60unit/ml；双氧水的浓度为5～20mm，最佳浓度为10mm。
17.进一步，在步骤2)中，热可逆水凝胶浸泡双氧水交联的时间为5-20min，其中最佳时间为10min。
18.本发明也提供了一种由上述方法制备得到的纳米颗粒复合水凝胶神经导管，用于周围神经组织再生修复。
19.本发明与现有技术相比，具有如下优点与有益效果：
20.1、本发明提供的纳米颗粒复合水凝胶神经导管，为负载mirna-29a@zif-8 的复合水凝胶人工神经导管，能够很好地解决目前人工神经导管存在的问题。
21.2、本发明采用的明胶材料具有良好的生物相容性，体内降解性能和粘附细胞能力，丝素蛋白廉价又安全，力学性能好，可以满足人工神经导管的力学要求。
22.3、利用辣根过氧化物酶催化和浸泡双氧水交联的方式可以得到兼具两者优点的复合水凝胶神经导管，并通过控制浸泡双氧水的时间，可以方便快捷地调控神经导管的内径。
23.4、使用表面zeta电位为正的zif-8纳米颗粒，可以通过静电相互作用吸附带负电的mirna-29a，将其与水凝胶神经导管复合，通过mirna-29a的调控作用促进神经元轴突的伸长，加速神经修复过程，此外mirna-29a@zif-8还能够调节受损神经处的免疫反应，通过引导巨噬细胞表型的转变，促进雪旺细胞成熟并髓鞘化，进一步作用于神经再生。
附图说明
24.图1为实施例1中纳米颗粒复合水凝胶神经导管(即人工神经导管)的整体形貌图。
25.图2为实施例3中，mirna-29a@zif-8和mirna-29a在胎牛血清中孵育不同时间点的电泳条带深浅对比图。
具体实施方式
26.下面结合附图和实施例对本发明做进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
27.实施例1
28.1)将mirna-29a以110μg/ml的浓度溶解在depc水中，然后加入zif-8 悬液至zif-8浓度为1mg/ml，mirna-29a与zif-8的质量比为2：100。随后将混合物置于500rpm/min的摇床上孵育30min。最后溶液在12000rpm下离心10 min收集沉淀即得到mirna-29a@zif-8纳米颗粒。
29.2)明胶以0.02g/ml的浓度溶解在50mm的2-马啉乙磺酸缓冲水溶液中，随后加入0.01g/ml的酪胺盐酸盐，50℃下溶解充分，在溶液冷却至室温后加入 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺(0.37g/0.11 g)，搅拌反应12h，去离子水环境下透析4天后，冻干即得到海绵状明胶改性产物，为酪胺改性明胶。
30.3)称量4g二次脱胶蚕丝充分溶解于20ml，浓度为9.3m的溴化锂溶液中，透析三天后，溶液在11000rpm下，30min离心两次以除去杂质，得到浓度为6wt％左右的丝素蛋白溶液。
31.4)酪胺改性明胶以30w/v％的浓度在60℃下溶解于质量分数为5％wt的丝素蛋白溶液中，并加入辣根过氧化物酶至浓度为60unit/ml。mir-29a@zif-8以 0.12％的浓度溶解在同等体积的丝素蛋白溶液中，超声30分钟，使其分散均匀。随后将两种溶液混合搅拌均匀注入高为14mm，外径为5mm，内径为4mm的管状模具中，并置于4℃冰箱3h，待热可逆水凝胶形成后，从模具中推出，浸泡在5mm双氧水中。交联20分钟后取出，将导管两端切去1mm，使用40℃热水洗去未交联部分，即得到高为10mm，外径为3mm，内径为2.5mm的人工神经导管，其宏观形态如图1所示。
32.实施例2
33.1)将mirna-29a以110μg/ml的浓度溶解在depc水中，然后加入zif-8 悬液至zif-8浓度为3mg/ml，mirna-29a与zif-8的质量比为6：100。随后将混合物置于500rpm的摇床上孵育30min。最后溶液在12000rpm下离心10min 收集沉淀即得到mirna-29a@zif-8纳米颗粒。
34.2)明胶以0.02g/ml的浓度溶解在50mm的2-马啉乙磺酸缓冲水溶液中，随后加入0.01g/ml的酪胺盐酸盐，50℃下溶解充分，在溶液冷却至室温后加入 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺(0.37g/0.11 g)，搅拌反应12h，去离子水环境下透析4天后，冻干即得到海绵状明胶改性产物，为酪胺改性明胶。
35.3)称量4g二次脱胶蚕丝充分溶解于20ml，浓度为9.3m的溴化锂溶液中，透析三天后，溶液在11000rpm条件下，30min离心两次以除去杂质，得到浓度为6wt％左右的丝素蛋白溶液。
36.4)酪胺改性明胶以30w/v％的浓度在60℃下溶解于质量分数为5wt％的丝素蛋白
溶液中，并加入辣根过氧化物酶至浓度为240unit/ml。mir-29a@zif-8以 0.16％的浓度溶解在同等体积的丝素蛋白溶液中，超声30分钟，使其分散均匀。随后将两种溶液混合搅拌均匀，注入高为14mm，外径为5mm，内径为3mm的管状模具中，并置于4℃冰箱3h，待热可逆水凝胶形成后，从模具中推出，浸泡在20mm双氧水中。交联5分钟后取出，将导管两端切去1mm，使用40℃热水洗去未交联部分，即得到高为10mm、外径为3mm、内径为2.5mm负载了 0.08％mirna-29a@zif-8的人工神经导管。
37.实施例3
38.1)将mirna-29a以110μg/ml的浓度溶解在depc水中，然后加入zif-8 悬液至zif-8浓度为1.5mg/ml，mirna-29a与zif-8的质量比为4：100。随后将混合物置于500rpm的摇床上孵育30min。最后溶液在12000rpm下离心10 min收集沉淀即得到mirna-29a@zif-8纳米颗粒。mirna-29a@zif-8的稳定性，通过其电泳条带随着在血清中孵育时间的变化来判断，如图2所示。
39.2)明胶以0.02g/ml的浓度溶解在50mm的2-马啉乙磺酸缓冲水溶液中，随后加入0.01g/ml的酪胺盐酸盐，50℃下溶解充分，在溶液冷却至室温后加入 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺(0.37g/0.11 g)，搅拌反应12h，去离子水环境下透析4天后，冻干即得到海绵状明胶改性产物，为酪胺改性明胶。
40.3)称量4g二次脱胶蚕丝充分溶解于20ml，浓度为9.3m的溴化锂溶液中，透析三天后，溶液在11000rpm条件下，30min离心两次以除去杂质，得到浓度为6wt％左右的丝素蛋白溶液。
41.4)酪胺改性明胶以质量分数30w/v％的浓度在60℃下溶解于质量分数为 5wt％的丝素蛋白溶液中，并加入辣根过氧化物酶至浓度为60unit/ml。 mirna-29a@zif-8以0.2％的浓度溶解在同等体积的丝素蛋白溶液中，超声30 分钟，使其分散均匀。随后将两种溶液混合搅拌均匀，注入高为14mm，外径为 5mm，内径为4mm的管状模具中，并置于4℃冰箱3h，待热可逆水凝胶形成后，从模具中推出，浸泡在10mm双氧水中。交联10分钟后取出，将导管两端切去 1mm，使用40℃热水洗去未交联部分，即得到高为10mm，外径为3mm，内径为2.5mm负载了0.1％zif-8的人工神经导管。
42.本发明的实施例仅仅是为清楚地说明本发明所举的例子，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的专业人员而言，在上述实施例的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改，等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。