细胞膜结合功能微球的制备方法和分离装置

1.本发明涉及一种细胞膜结合功能微球的制备方法和分离装置，属于生物医药领域。


背景技术：

2.微球是一种由药物分散或者通过高分子或者聚合物基质制备的微粒分散系统，其大小介于微米和纳米之间，多为类似球状实体。纳米微球大多由高分子聚合形成，因其载体与包覆的内容，制备方式等因素的不同，可以制备出各种不同性质，功能各异的微球。
3.然而现有的细胞膜结合功能微球的制备过程中需要对细胞进行分离，细胞膜分离后要保证细胞膜的完整性，获得纯度较高的细胞膜，并且产率较高的同时活性还不受影响，现有技术中采用化学试剂诱导法分离细胞膜，虽然保证了细胞膜的纯度、产率和活性，但是对不同的细胞膜，诱导试剂需要做改进，因此适用性不好；在对细胞膜分离过程中，一般采用离心法，由于离心法需要多次对离心管内提取不同层次的溶液，导致离心过程的操作也十分复杂，因此细胞膜的分离效率也十分低下。


技术实现要素：

4.本技术提供了一种细胞膜结合功能微球的制备方法，具有细胞膜破碎简单、破碎效率高的功能，可解决现有的细胞膜结合功能微球的制备方法中细胞膜获取不方便的问题。
5.为解决以上技术问题，本发明包括如下技术方案：一种细胞膜结合功能微球的制备方法，包括以下步骤：步骤1：采集细胞，制备细胞溶液，所述细胞溶液用于制备细胞膜；步骤2：对步骤1中的细胞溶液进行破碎处理，再经过分离得到细胞膜；步骤3：制备聚合物溶液，所述聚合物溶液用于包覆在步骤2中细胞膜的内部，所述聚合物溶液具有生物相容性；步骤4：利用步骤2制备的破碎细胞与步骤3中制备的聚合物溶液制备功能微球；其中，步骤2中对细胞溶液的破碎处理采用静电喷雾技术或者超声波法破碎细胞溶液获得细胞膜。
6.进一步，步骤1中的细胞为红细胞，所述细胞溶液的制备包括以下步骤：1）取氯化钠与去离子水配置生理盐水并放于0-4
°
c的环境下预冷；2）将离心管洗净后取血，加预冷的生理盐水，放入高速离心机内离心，用吸管将上层血浆和绒毛状的沉淀吸出，将生理盐水与分离后的红细胞混合；3）用步骤2）中的速度离心洗涤2到4次，离心后上层呈清液，将清液吸出，红细胞收集存于离心管内，放置在0-4
°
c的环境下保存；其中，步骤3中的聚合物溶液是以二氯甲烷为溶剂与plga颗粒制备的plga内核溶液。
7.进一步，在采用超声波法破碎细胞时，将细胞溶液放入超声破碎仪内利用超声波进行破碎，再通过分离装置分离获取细胞膜。
8.进一步，所述静电喷雾技术的步骤为：（1）将配置好的细胞溶液吸入一次性注射器并连上针头；（2）在接收板上放上铝箔来导电，并在表面皿上放置载玻片接收溶液并观察；（3）在仪器上设置好参数，在针头和铝箔板上施加电压，调节完电压大小开始破碎细胞膜；（4）对接收板上接收的溶液通过分离装置制备细胞膜。
9.进一步，利用同轴静电喷雾技术制备功能微球，所述同轴静电喷雾技术为：利用两个共轴的针头固定在两个互相垂直的注射器上，两个针头分别装有细胞膜和plga内核溶液。
10.一种分离装置，包括外壳和离心筒，所述离心筒上设有多个储液管，所述离心筒用于带动储液管转动，所述储液管的下侧设有分液腔，所述分液腔与储液管连通，所述分液腔用于分离出细胞膜。
11.进一步，所述离心筒内还设有吸气泵，所述分液腔与储液管通过压力阀连通，所述离心筒内还设有通气环，多个所述分液腔通过通气环与吸气泵密封连接，通过吸气泵可以使分液腔内产生负压以便对储液管内的溶液吸取。
12.进一步，所述离心筒的侧壁还设有摄像头，所述摄像头用于观察储液管以及分液腔内液体的状态；所述压力阀与分液腔的出口之间还设有用于防止液体被吸气泵吸走的隔板。
13.进一步，所述离心筒靠近分液腔底部的部分设有多个承接板，所述承接板上设有卡接管，所述离心筒内还设有吸液泵，所述吸液泵通过多个卡接管与分液腔的底部密封连接，卡接管和分液腔用于将储液管内细胞膜下层的溶液吸取干净，再通过分液腔吸取纯净的细胞膜。
14.进一步，所述分液腔的底部设有伸缩管，所述伸缩管与卡接管密封连接，所述分液腔上还设有入水口，伸缩管能够伸缩到分液腔内部，用于吸取分液腔内上部分的溶液，通过入水口能够对分液腔清洗以及添加溶剂；所述分液腔的底部还设有传震装置，所述传震装置震动伸缩管，以提高分液腔内部溶液的分离效率。
15.本发明由于采用以上技术方案，使之与现有技术相比，具有以下的优点和积极效果：本技术中的细胞膜结合功能微球的制备方法中利用静电喷雾技术对细胞破碎对细胞膜的破碎快速简单，且细胞膜破碎效率较高，且可以对不同细胞破碎，适用性强；通过分离装置可以在分离不同层次的溶液时不需要取下储液管，在储液管离心过程中通过分液腔吸取底层液体，吸取完毕后即可做进一步分离，因此整个离心分离的过程操作更加简单，而且本技术中的细胞膜结合功能微球的制备方法中通过同轴静电喷雾技术使细胞膜结合可降解功能微球，功能微球的核壳结构液滴快速成型。
附图说明
16.图1为本技术中的分离装置的结构示意图；图2为本技术中的分离装置的内部结构示意图；
图3为本技术中的离心筒的结构示意图；图4为本技术中的离心筒的内部结构示意图；图5为本技术中的储液管的结构示意图；图6为本技术中的储液管的内部结构示意图。
17.图中标号如下：1-外壳；2-离心筒；3-储液管；11-上盖；21-通气环；22-吸气泵；23-吸液泵；24-承接板；25-卡接管；26-摄像头；31-储液腔；32-分液腔；33-压力阀；34-隔板；35-入水口；36-伸缩管；37-传震装置。
具体实施方式
18.以下结合附图和具体实施例对本发明公开的一种细胞膜结合功能微球的制备方法和分离装置作进一步详细说明。应当注意的是，下述实施例中描述的技术特征或者技术特征的组合不应当被认为是孤立的，它们可以被相互组合从而达到更好的技术效果。在下述实施例的附图中，各附图所出现的相同标号代表相同的特征或者部件，可应用于不同实施例中。因此，一旦某一项在一个附图中被定义，则在随后的附图中不需要对其进行进一步讨论。
19.需说明的是，本说明书所附图中所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定发明可实施的限定条件，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应落在发明所揭示的技术内容所能涵盖的范围内。本发明的优选实施方式的范围包括另外的实现，其中可以不按所述的或讨论的顺序，包括根据所涉及的功能按基本同时的方式或按相反的顺序，来执行功能，这应被本发明的实施例所属技术领域的技术人员所理解。
20.对于相关领域普通技术人员已知的技术、方法和设备可能不作详细讨论，但在适当情况下，所述技术、方法和设备应当被视为授权说明书的一部分。在这里示出和讨论的所有示例中，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制。因此，示例性实施例的其它示例可以具有不同的值。
实施例
21.本实施例提供的一种细胞膜结合功能微球的制备方法和分离装置，包括以下步骤：步骤1：采集细胞，制备细胞溶液，所述细胞溶液用于制备细胞膜。
22.步骤2：对步骤1中的细胞溶液进行破碎处理，再经过分离得到细胞膜。
23.其中，步骤2中对细胞溶液的破碎处理采用静电喷雾技术或者超声波法破碎细胞溶液获得细胞膜。
24.作为优选的实施方式，所述静电喷雾技术的步骤为：（1）将配置好的细胞溶液吸入一次性注射器并连上针头。
25.（2）在接收板上放上铝箔来导电，并在表面皿上放置载玻片接收溶液并观察。
26.（3）在仪器上设置好参数，在针头和铝箔板上施加电压，调节完电压大小开始制备
细胞膜。
27.（4）对接收板上接收的溶液通过分离装置制备细胞膜。
28.步骤3：制备聚合物溶液，所述聚合物溶液用于包覆在步骤2中细胞膜的内部，所述聚合物溶液具有生物相容性。
29.步骤4：利用步骤2制备的破碎细胞与步骤3中制备的聚合物溶液制备功能微球。
30.优选的，步骤1中的细胞为红细胞，所述细胞溶液的制备包括以下步骤。
31.1）取氯化钠与去离子水配置生理盐水并放于0-4
°
c的环境下预冷。
32.2）将离心管洗净后取血，加预冷的生理盐水，放入高速离心机内离心，用吸管将上层血浆和绒毛状的沉淀吸出，将生理盐水与分离后的红细胞混合。
33.3）用步骤2）中的速度离心洗涤2到4次，离心后上层呈清液，将清液吸出，红细胞收集存于离心管内，放置在0-4
°
c的环境下保存。
34.其中，步骤3中的聚合物溶液是以二氯甲烷为溶剂与plga颗粒制备的plga内核溶液，plga水解即生成乳酸和羟基乙酸，无刺激性，具有较好的生物相容性。
35.在本实施例的优选实施方式中，所述细胞溶液的制备包括以下步骤：1）取氯化钠与去离子水配置0.9wt%的生理盐水放于4
°
c冰箱预冷。
36.2）将离心管洗净后取血，加预冷的生理盐水，放入高速离心机内2500r/min离心5分钟，用吸管将上层血浆和绒毛状的沉淀吸出，将3倍量的生理盐水与分离后的红细胞混合。
37.3）用步骤2）中的速度离心洗涤3次，离心后上层呈清液，将清液吸出，红细胞收集存于离心管内，放置在4
°
c冰箱保存。
38.优选的，在采用超声波法破碎细胞时，将细胞溶液放入超声破碎仪内利用超声波进行破碎，再通过分离装置分离获取细胞膜。
39.作为举例而非限制，超声波破碎仪中的所述细胞溶液为10ml且红细胞浓度为5wt%，超声功率为140w，超声时间为3.3min时细胞破碎程度较高，且破碎比较完整，形成粒径较为均一的细胞膜囊泡。
40.优选的，所述静电喷雾技术的步骤为：（1）将配置好的细胞溶液吸入一次性注射器并连上针头。
41.（2）在接收板上放上铝箔来导电，并在表面皿上放置载玻片接收溶液并观察。
42.（3）在仪器上设置好参数，在针头和铝箔板上施加电压，调节完电压大小开始破碎细胞膜。
43.（4）对接收板上接收的溶液通过分离装置制备细胞膜。
44.优选的，利用同轴静电喷雾技术制备功能微球，所述同轴静电喷雾技术为：利用两个共轴的针头固定在两个互相垂直的注射器上，两个针头分别装有细胞膜和plga内核溶液。
45.需要说明的是，所述同轴静电喷雾技术的其余步骤与静电喷雾技术中步骤（2）之后的步骤一致。
46.作为举例而非限制，在利用同轴静电喷雾技术制作功能微球时，细胞溶液浓度为5wt%，针头的推进速度为0.8ml/h，所述plga内核的溶液浓度为2wt%，推进速度为0.2ml/h，针头与接收板之间的电压为10kv，接收距离为10cm，此参数下接收到较多以细胞膜囊泡为
载体，承载plga内核的功能微球；同轴静电喷雾技术制备细胞负载纳米粒子粒径均一，粒径微粒在1.5um左右。
47.值得说明的是，在采用静电喷雾技术破碎细胞实验中，溶液浓度，电压，推进速度，接收距离等对细胞破碎程度都有或大或小的影响。
48.作为举例而非限制，静电喷雾技术中的细胞溶液浓度为5wt%，注射器的推进速度为0.8ml/h，注射器针头与接收板的接收距离为10cm时，细胞溶液经过电场力的作用使更多细胞破碎，能形成更多粒径较为均一，数量较多的细胞膜囊泡。
49.其它技术特征参考在前实施例，在此不再赘述。
50.参见图1和图2所示所示，本发明还给出了一个实施例，提供了一种分离装置，包括外壳1和离心筒2，所述离心筒2上设有多个储液管3，所述离心筒2用于带动储液管3转动，以此通过离心的方式对细胞膜分离，所述外壳1上还设有上盖11。
51.所述储液管3的下侧设有分液腔32，所述分液腔32与储液管3连通，所述分液腔32用于分离出细胞膜。在对细胞膜离心分离时，将破碎的细胞膜溶液放置到储液管3内，并将储液管3放置到离心筒2上，驱动离心筒2带动储液管3转动，以此对储液管3内破碎的细胞膜溶液离心，离心完成后可以通过使分液腔32产生负压，以此将离心后的含有细胞膜的溶液吸入分液腔32中，以此对细胞膜提纯。
52.优选的，所述离心筒2内还设有吸气泵22，所述分液腔32与储液管3通过压力阀33连通，所述离心筒2内还设有通气环21，多个所述分液腔32通过通气环21与吸气泵22密封连接，参见图3到图6所示。通过吸气泵22可以使分液腔32内产生负压以便对储液管3内的溶液吸取。
53.优选的，所述离心筒2的侧壁还设有摄像头26，所述摄像头26用于观察储液管3以及分液腔32内液体的状态；所述压力阀33与分液腔32的出口之间还设有用于防止液体被吸气泵22吸走的隔板34，参见图6所示。
54.作为举例而非限制，可以在每个储液管3的附近都设置摄像头26，观察所有储液管3内的液体状态，也可以仅在一个储液管3的附近设置摄像头26通过观察一个储液管3内液体的状态来判断其他储液管3内的液体状态。
55.优选的，结合图3和图4所示，所述离心筒2靠近分液腔32底部的部分设有多个承接板24，所述承接板24上设有卡接管25，所述离心筒2内还设有吸液泵23，所述吸液泵23通过多个卡接管25与分液腔32的底部密封连接，卡接管25和分液腔32用于将储液管3内细胞膜下层的溶液吸取干净，再通过分液腔32吸取纯净的细胞膜。
56.作为本实施例的优选实施方式，在进行密度梯度离心时，可以通过吸液泵23对分液腔32产生负压，使储液管3内细胞膜以下的多层溶液被分液腔32吸走；细胞膜以下的溶液被分液腔32吸收完毕后，吸液泵23继续吸取分液腔32内的溶液，此时让分液腔32与外界连通，不让分液腔32产生负压，利用吸液泵23将分液腔32内的溶液吸收干净；分液腔32内的溶液被吸液泵23吸取完毕后，再通过吸气泵22对分液腔32再次吸气，分液腔32再次形成负压，从而将储液管3下部含有细胞膜的纯净溶液吸入，以此对细胞膜分离，整个分离过程均可以在离心过程完成，且可以同时对多个储液管3同时操作，使用更加方便快捷。
57.优选的，如图6所示，所述分液腔32的底部设有伸缩管36，所述伸缩管36与卡接管25密封连接，所述分液腔32上还设有入水口35，伸缩管36能够伸缩到分液腔32内部，用于吸
取分液腔32内上部分的溶液，通过入水口35能够对分液腔32清洗以及添加溶剂；所述分液腔32的底部还设有传震装置37，所述传震装置37震动伸缩管36，以提高分液腔32内部溶液的分离效率。
58.作为优选的实施例，在进行差速离心时，通过吸气泵22将储液管3底部沉淀的溶液吸入分液腔32，然后通过入水口35加入适量相应的溶剂，再调整不同的转速做进一步离心分离，离心过程中传震装置37带动伸缩管36震动，从而使溶液发生震动，以便更好的使溶液分层，提高溶液分层效率，差速分离对应的时间后将伸缩管36伸入分液腔32的上层清液，通过吸液泵23和伸缩管36对分液腔32的上层清液吸取，从而使分液腔32内保存纯净的细胞膜，完成细胞膜的分离。在密度梯度离心时，吸液泵23吸取分液腔32内的溶液后，可通过入水口35加入适量的溶剂将分液腔32清洗干净，以保证细胞膜的纯净度。
59.其它技术特征参考在前实施例，在此不再赘述。
60.在上面的描述中，在本公开内容的目标保护范围内，各组件可以以任意数目选择性地且操作性地进行合并。另外，像“包括”、“囊括”以及“具有”的术语应当默认被解释为包括性的或开放性的，而不是排他性的或封闭性，除非其被明确限定为相反的含义。所有技术、科技或其他方面的术语都符合本领域技术人员所理解的含义，除非其被限定为相反的含义。在词典里找到的公共术语应当在相关技术文档的背景下不被太理想化或太不实际地解释，除非本公开内容明确将其限定成那样。
61.虽然已出于说明的目的描述了本公开内容的示例方面，但是本领域技术人员应当意识到，上述描述仅是对本发明较佳实施例的描述，并非对本发明范围的任何限定，本发明的优选实施方式的范围包括另外的实现，其中可以不按所述出现或讨论的顺序来执行功能。本发明领域的普通技术人员根据上述揭示内容做的任何变更、修饰，均属于权利要求书的保护范围。