豌豆白蛋白在制备缓解炎性肠病组合物中的应用的制作方法

1.本技术涉及蛋白质生物领域，特别是涉及豌豆白蛋白在制备缓解炎性肠病组合物中的应用。


背景技术：

2.根据世界胃肠组织的报告，炎性肠病(inflammatory bowel disease，ibd)已成为一个全球性的疾病，世界卫生组织将每年的5月19日定为炎症性肠病日。北美和欧洲炎性肠病患者数量分别高达150万和200万，中国每十万人中约有14例，并且近年来发病率逐年上升。ibd是一种慢性、反复发作、非特异性肠道炎症性疾病，临床上主要包括克罗恩病(crohn's disease，cd)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，uc)，主要特征为肠黏膜或结肠组织的复发性免疫反应和屏障功能缺陷，其发病受肠道微生物、免疫、遗传和环境等因素的影响，但病因和发病机制仍然不够清晰。
3.目前，ibd没有长期预防和有效的治疗方法，临床上治疗炎性肠病的主要方法有：传统药物及免疫抑制剂治疗、生物制剂治疗、微生态制剂治疗、抗生素治疗和手术治疗，这些治疗手段大多存在副作用以及潜在毒性。可见，ibd的防治是一个需要攻坚的难题。豌豆中含有丰富的蛋白质，豌豆白蛋白作为豌豆中的重要活性成分，目前对它的研究很少，尤其是其具有的作用和用途，目前还尚未被报道过。
4.目前，本领域亟需一种来源于食物的现有产品的替代产品，该替代品可以有效缓解炎性肠病，而不产生副作用。


技术实现要素：

5.本技术所要解决的技术问题是：
6.提供一种豌豆白蛋白在制备缓解炎性肠病组合物中的应用，可以有效地提高存活率，缓解炎症，保护肠黏膜，缓解免疫细胞在结肠组织中的浸润。
7.本技术技术方案如下：
8.一种豌豆白蛋白在制备预防/或治疗炎性肠病组合物中的应用。
9.一种豌豆白蛋白在制备缓解炎性肠病组合物中a1)-a5)中任一种的应用：
10.a1)制备缓解葡聚糖硫酸钠诱导的炎性肠病的组合物；
11.a2)制备下调肠道炎症因子il-6水平的组合物；
12.a3)制备缓解葡聚糖硫酸钠导致的结肠黏蛋白减少的组合物；
13.a3)制备降低葡聚糖硫酸钠诱导的免疫细胞向结肠固有层和黏膜下层浸润的组合物。
14.优选的，所述缓解葡聚糖硫酸钠诱导的炎性肠病体现为b1)-b5)中的任一种：
15.b1)提高葡聚糖硫酸钠诱导的动物个体的存活率；
16.b2)降低葡聚糖硫酸钠诱导的动物个体体重的丢失；
17.b3)提高葡聚糖硫酸钠诱导的动物个体的结肠长度；
18.b4)缓解葡聚糖硫酸钠诱导的动物个体的结肠免疫细胞浸润；
19.b5)缓解葡聚糖硫酸钠诱导的结肠组织黏蛋白的减少。
20.优选的，所述b4)缓解葡聚糖硫酸钠诱导的动物个体的结肠免疫细胞浸润，是指降低葡聚糖硫酸钠诱导的免疫细胞向结肠固有层和黏膜下层的浸润，减少结肠黏膜免疫细胞数量。
21.优选的，所述结肠黏膜免疫细胞为巨噬细胞和/或t细胞。
22.优选的，所述的炎性肠病由葡聚糖硫酸钠诱导产生。
23.优选的，所述炎性肠病包括溃疡性结肠炎和克罗恩病。
24.优选的，所述组合物包括食品、药品、营养补充剂、食品添加剂、饮料、动物饲料中的一种或多种。
25.优选的，所述组合物的剂型为片剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、丸剂或口服液。
26.本发明的有益效果是：
27.1.首次证实豌豆白蛋白在缓解炎性肠病组合物中的应用，能够有效缓解葡聚糖硫酸钠引起的死亡率增加、体重降低和结肠变短，显著降低血清中il-6的浓度。此外组织学的检测结果表明豌豆白蛋白能缓解结肠组织中炎性细胞浸润以及黏蛋白丰度的降低。
28.2.本发明发现的豌豆白蛋白的新用途，为缓解炎性肠病等又提供了一种新的代替品，其可广泛的应用于食品、药品、营养补充剂、食品添加剂、饮料、动物饲料中，能够起到作用的同时，没有任何副作用，具有良好的应用前景。
附图说明
29.图1：不同浓度豌豆白蛋白对葡聚糖硫酸钠引起结肠炎的影响；
30.其中，图a：生存曲线；b：体重变化曲线；c：小鼠结肠代表性图片；d：小鼠结肠长度统计图；数据表示为平均值
±
标准误；n＝9；*代表与对照组相比差异显著，#代表与葡聚糖硫酸钠组相比差异显著，p＜0.05。
31.图2：不同浓度豌豆白蛋白对葡聚糖硫酸钠引起il-6和il-10浓度的影响；
32.其中，图a：血清中il-6的浓度；图b：血清中il-10的浓度；数据表示为平均值
±
标准误；n＝9；*代表与对照组相比差异显著，#代表与葡聚糖硫酸钠组相比差异显著，p＜0.05。
33.图3：不同浓度豌豆白蛋白对葡聚糖硫酸钠引起结肠组织形态和黏蛋白的影响。
34.其中，图a：结肠组织he染色；b：结肠组织中阿利新蓝染色；n＝9次独立的试验；标尺为上图为500μm，下图为100μm。
35.图4：不同浓度豌豆白蛋白对小鼠结肠组织中t淋巴细胞和巨噬细胞的影响；
36.图a：结肠中t淋巴细胞(cd4+，cd8+)；图b：结肠组织中巨噬细胞(cd11b+，f4/80+)；n＝9次独立的试验；标尺为100μm。
具体实施方式
37.以下将结合本实施例中的附图来详细说明本发明的实施方式，借此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题，并达成技术效果的实现过程能充分理解并据以实施。需要说明的是，只要不构成冲突，本发明中的各个实施例中的各个特征可以相互结合，所形成的
技术方案均在本发明的保护范围之内。
38.本发明所述豌豆白蛋白可以根据专利：2020101549083一种从豌豆豆清废水中提取抗菌肽及白蛋白的方法，制备得到。
39.一种豌豆白蛋白在缓解炎性肠病组合物中的应用，所述豌豆白蛋白在制备预防/或治疗炎性肠病的药物中的应用；所述豌豆白蛋白在制备预防/或治疗肠道炎性细胞浸润的药物中的应用；所述组合物包括食品、药品、营养补充剂、食品添加剂、饮料、动物饲料中的一种或多种；所述的豌豆白蛋白可制作成制剂，制剂包括片剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液；所述豌豆白蛋白能够缓解炎性肠病、降低炎症、减少结肠组织中免疫细胞浸润和保护结肠黏蛋白；所述豌豆白蛋白可以缓解葡聚糖硫酸钠(dss)诱导的结肠炎，豌豆白蛋白可显著缓解dss处理引起的肠道形态破坏和肠道黏蛋白减少。
40.根据本发明的实施例，为评价豌豆白蛋白缓解炎性肠病的功效，试验采用2％dss饮水诱导的小鼠结肠炎模型，处理组(dss+p)按照小鼠体重每日分别灌胃0.375g/kg(dss+p1)、0.750g/kg(dss+p2)和1.5g/kg(dss+p3)的豌豆白蛋白，模型组(dss)和对照组(control)灌胃相同体积生理盐水，试剂对照组(control+p)灌胃1.50g/kg的豌豆白蛋白，所有小鼠的灌胃体积为200μl，预处理7天，处理7天后再让老鼠恢复3天，整个试验周期为17天。记录体重及采食量，试验结束前采集血液分离血清用于指标的检测，收集结肠组织用于后续的分析。
41.1.试验动物
42.试验选用6周龄spf级雄性c57bl/6n小鼠(购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：scxk(京)2019-0009)，在22-25℃鼠房内进行饲养，每日12h光照/黑暗循环，自由饮水和采食，小鼠颗粒饲料购自北京华阜康生物科技股份有限公司。
43.2.试剂和材料
44.dss：购自美国mp公司；
45.小鼠维持日粮：购自北京华阜康生物实验动物技术有限公司，货号1022；
46.多聚甲醛、苏木精和伊红染料：均购自北京中杉金桥生物技术有限公司；
47.cd4+、cd8+、cd11b+、f4/80+抗体和alexa fluor 594二抗：购自美国biolegend公司；
48.il-6和il-10试剂盒均购自上海碧云天生物技术有限公司。
49.3.主要仪器设备
50.超低温冰箱，mlt：购自美国thermo公司；
51.石蜡切片机：rm2233，购自德国leica公司；
52.数码成像系统：dp72，购自日本olympus公司；
53.4.试验处理
54.试验处理过程分为适应期(7天)、预处理期(7天)、dss诱导急性结肠炎期(7天)和恢复期(3天)，根据小鼠体重将小鼠分为六组：
55.(1)对照组(control，n＝9，灭菌水饮水，每天灌胃200μl的生理盐水)；
56.(2)对照+豌豆白蛋白组(control+p，n＝9，灭菌水饮水，预处理期和诱导期每天灌胃1.5g/kg体重的豌豆白蛋白溶液，灌胃体积为200μl)；
57.(3)dss组(dss，n＝9，每天2％dss饮水，预处理期和诱导期每天灌胃200μl的生理
盐水)；
58.(4)dss+豌豆白蛋白1(dss+p1，n＝9，每天2％dss饮水，预处理期和诱导期每天灌胃0.375g/kg体重的豌豆白蛋白溶液，灌胃体积为200μl)；
59.(5)dss+豌豆白蛋白2(dss+p2，n＝9，每天2％dss饮水，预处理期和诱导期每天灌胃0.75g/kg体重的豌豆白蛋白溶液，灌胃体积为200μl)；
60.(6)dss+豌豆白蛋白3(dss+p3，n＝9，每天2％dss饮水，预处理期和诱导期每天灌胃1.50g/kg体重的豌豆白蛋白溶液，灌胃体积为200μl)，试验周期为7天，恢复期为3天，每天测定一次体重、采食量及饮水量。
61.5.血清中il-6和il-10的测定
62.血清中il-6和il-10的测定采用酶联免疫试剂盒进行测定。
63.6.小鼠结肠长度的测定
64.小鼠眼眶采血后，脱颈处死。立即用手术刀剖开腹腔，取出结肠并用游标卡尺测定结肠长度。
65.7.组织切片
66.①
组织切片的制备：
67.(1)结肠的脱水、透明和浸蜡：将结肠从70％乙醇中取出，依次浸入80％乙醇40分钟；95％乙醇60分钟；无水乙醇i 30分钟；无水乙醇ii 30分钟；二甲苯i 5分钟；二甲苯ii 5分钟；蜡溶液i 60分钟；蜡溶液ii 60分钟。
68.(2)包埋：将蜡溶液倒入包埋盒中，置入组织块后，安装持蜡器。
69.(3)切片：用手动切片机将蜡块切成连续的4μm的蜡带，然后将蜡条放入43℃水浴中并使其粘附于载玻片表面。
70.(4)烤片：37℃保温过夜，62℃烤片60分钟。
71.②
结肠组织学检查(苏木精-伊红染色)：
72.(1)脱蜡：将切片依次浸入二甲苯i 10分钟；二甲苯ii 10分钟；无水乙醇8分钟；95％乙醇5分钟；70％乙醇5分钟；50％乙醇5分钟；蒸馏水5分钟。
73.(2)染色：滴加苏木精染液染色1分钟；蒸馏水洗涤3次，每次2分钟；1％盐酸酒精溶液分化5秒；蒸馏水洗涤3次，每次5分钟；滴加伊红染液染色1分钟；蒸馏水洗涤3次，每次2分钟。
74.(3)脱水、透明、封片：将切片依次浸入70％乙醇2秒；95％乙醇5秒；无水乙醇5分钟；二甲苯i 5分钟；二甲苯ii 5分钟；载玻片上滴加1滴中性树胶，盖玻片封片，干燥过夜。显微镜下观察拍照。
75.8.黏蛋白分泌检测
76.(1)脱蜡：将组织切片依次浸入二甲苯i 10分钟；二甲苯ii 10分钟；无水乙醇8分钟；95％乙醇2分钟；70％乙醇2分钟；蒸馏水2分钟；
77.(2)滴加3％乙酸溶液室温孵育3分钟；
78.(3)甩掉乙酸溶液，滴加阿尔新蓝溶液(ph 2.5)37℃孵育15分钟；
79.(4)将切片置于3％乙酸溶液漂洗10秒；
80.(5)蒸馏水洗涤3次，每次洗涤时间分别为2分钟，1分钟，1分钟；
81.(6)用核固红染料溶液染色5分钟，然后蒸馏水洗涤3次，每次洗涤时间分别为2分
钟，1分钟，1分钟；
82.(7)脱水、封片。
83.9.免疫荧光原位检测t淋巴细胞和巨噬细胞
84.(1)组织切片方法同7
①
部分；
85.(2)将组织切片置于室温平衡30分钟并彻底晾干；
86.(3)冰甲醇固定切片10秒，并迅速使用pbs洗涤切片三次，每次5分钟；
87.(4)使用10％山羊血清(二抗同源，溶于pbs中)覆盖切片上的组织样品，室温湿盒中封闭30分钟，pbs洗涤切片三次，每次5分钟；
88.(5)1∶100溶解一抗于封闭液中，覆盖样品，4℃湿盒中孵育过夜，pbs洗涤切片三次；
89.(6)1∶200溶解荧光二抗于封闭液中，覆盖样品，室温湿盒中避光孵育1h，pbs洗涤切片三次；
90.(7)1∶1000稀释hoechst 33342细胞核染料，覆盖样品，室温湿盒中避光孵育3分钟，pbs洗涤切片三次；
91.(8)晾干切片，滴加防荧光淬灭封片剂进行封片，使用荧光显微镜观察、拍照。
92.10.统计分析
93.数据以平均值
±
sems表示，并通过单因素方差分析进行分析。采用graphpad prism 7.0版(美国加利福尼亚州圣地亚哥市graphpad软件公司)进行邓肯式多重比较以确定差异，p＜0.05被认为差异显著。
94.11.结果
95.如图1所示，与dss组相比，每日灌胃豌豆白蛋白0.375g/kg和0.75g/kg显著提高(p＜0.05)小鼠的存活率(图1a)，而每日灌胃豌豆白蛋白1.5g/kg组不能显著提高小鼠的存活率；与dss组相比，每日灌胃豌豆白蛋白0.375g/kg和0.75g/kg显著缓解dss处理引起的体重丢失(图1b)(p＜0.05)，而1.5g/kg处理不具有缓解效果(图1b)；与dss组相比，灌胃豌豆白蛋白(0.375g/kg和0.75g/kg)显著(p＜0.05)提高小鼠结肠的长度(图1c和d)，而灌胃1.5g/kg的豌豆白蛋白则不具有效果；因此，从表观指标看，豌豆白蛋白可以有效缓解dss诱导引起的炎性肠病。
96.由图2可知，与dss组相比，酶联免疫检测血清炎性因子的结果表明豌豆白蛋白(0.375g/kg和0.75g/kg)处理显著降低(p＜0.05)dss处理引起的il-6水平的升高(图2a)；另外，豌豆白蛋白处理对血清中il-10的浓度无显著影响(图2b)。结果表明，豌豆白蛋白能有效减低血清中il-6的含量。
97.由图3可知，与dss组相比，每日灌服豌豆白蛋白能够有效缓解(p＜0.05)因dss处理引起的免疫细胞浸润增加及肠道形态改变；与dss组相比，阿利新蓝染色的结果表明，每日灌服豌豆白蛋白能够(p＜0.05)提高肠黏膜蛋白的含量，保护肠道。结果表明：豌豆白蛋白可显著缓解dss处理引起的肠道形态破坏和肠道黏蛋白的减少。
98.由图4可知，与对照组相比，dss处理引起小鼠的结肠上皮炎性细胞浸润显著增多，如cd4+、cd8+t淋巴细胞、cd11b+、f4/80+巨噬细胞，豌豆白蛋白显著缓解因dss处理引起的t淋巴细胞(cd4+和cd8+)和巨噬细胞(cd11b+和f4/80+)的增加及浸润。结果表明，豌豆白蛋白处理有效缓解dss处理引起的小鼠结肠组织炎性细胞的浸润。
99.综上所述，豌豆白蛋白可以显著改善dss处理引起的小鼠死亡、体重丢失和结肠长度的缩短，显著降低dss处理引起的血清中il-6水平的升高，显著改善结肠组织形态的改变及黏蛋白含量的减少，显著降低t淋巴细胞和巨噬细胞在结肠组织中的浸润。
100.因此，豌豆白蛋白可应用在制备改善炎性肠病组合物中，例如在制备预防/或治疗结肠炎的药物中的应用、在制备预防/或治疗炎性肠病炎性反应中的应用、在制备预防和/或治疗结肠炎性细胞浸润的药物中的应用。所述组合物包括食品、药品、营养补充剂、食品添加剂、饮料、动物饲料中的一种或多种。所述的豌豆白蛋白可制作成制剂，制剂包括片剂、胶囊、颗粒剂、粉剂、丸剂、口服液。
101.在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
102.尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。