一种猪圆环病毒2型（PCV2）的复合水佐剂疫苗及其制备方法与流程

no.1所示。
12.seq id no.1：
13.mtyprrryrrrrhrprshlgqilrrrpwllhprhryrwrrkngifntrlsrtigytvkkttvrtpswnvdmmrfnindflppgggsnpltvpfeyyrirkvkvefwpcspitqgdrgvgstavilddnfvtkanaltydpyvnyssrhtitqpfsyhsryftpkpvldgtidyfqpnnrrnqlwlrlqttgnvdhvglgtafensiydqdyniritmyvqfrefnlkdpplnpk
14.所述的抗原和水佐剂的比例为：25:1。
15.所述的复合水佐剂和所述的疫苗的ph值分别为5.8和6.5。
16.所述的黄姜皂素材料中，皂素含量大于90％)；
17.三七总皂苷材料中：人参皂苷rd总量大于80.0％)；
18.枸杞多糖材料中，多糖含量大于50％。
19.本发明还涉及所述的猪圆环病毒2型(pcv2)疫苗的制备方法，所述方法包括如下步骤：
20.(1)将黄姜皂素、三七总皂苷、枸杞多糖加入水相溶解；
21.(2)100r/min转速下缓慢加入peg e 400继续搅拌至无大颗粒不溶物后，将转速调至500r/min连续搅拌至泡沫消失得到复合水佐剂，水佐剂过滤除菌；
22.(3)按比例缓慢将水佐剂加入到水相抗原中，500r/min连续搅拌至澄清。
23.步骤(2)得到的复合水佐剂和步骤(3)得到的疫苗的ph分别为5.8和6.5。
24.本发明还涉及所述的猪圆环病毒2型(pcv2)疫苗在制备预防或治疗猪圆环病毒传染的制剂中的应用。
25.本发明的有益效果在于，
26.1、本发明涉及一种针对猪圆环病毒2型(pcv2)疫苗免疫的新型复合水佐剂，通过加入皂素和皂苷以及多糖类物质来提高机体非特异性免疫能力，增强猪圆环病毒2型(pcv2)抗原的免疫原性，
27.2、水佐剂不同于传统油佐剂，能够在疫苗注射后快速激活机体的体液免疫和细胞免疫，让免后的抗体产生速度快于传统油佐剂，并且免疫刺激性小，在免疫后不会对仔猪在保育过程中产生影响。
28.3、本发明作为一种针对猪圆环病毒2型疫苗(pcv2)复合中药提取物水佐剂，与目前业界大量使用的油佐剂相比，既能够快速刺激机体的体液和细胞免疫应答，还能使断奶仔猪迅速产生大量抗体以应对外界病毒感染，减小因母源抗体产生的免疫抑制。水佐剂疫苗易于注射，而且疫苗注射后，会被机体快速吸收，注射部位安全无残留。黄姜皂素、三七总皂苷、枸杞多糖作为中药提取物，免疫刺激性小，让免疫后的仔猪不会出现发烧和厌食等影响保育的症状，并极大地降低疫苗免疫的死淘率，减少养殖户的经济损失。
附图说明
29.图1、复合水佐剂疫苗对小鼠的免疫效力试验，图中显示的为复合水佐剂疫苗、isa206佐剂疫苗、生理盐水抗体滴度对比图。
30.图2、复合水佐剂疫苗对小鼠的免疫效力试验复合水佐剂疫苗、isa206佐剂疫苗、生理盐水抗体滴度对比图。
具体实施方式
31.关键材料：
32.黄姜皂素(陕西亿昊川生物科技，hplc检测含量：皂素95.0％)；
33.三七总皂苷(楚雄云植药业，hplc检测含量：人参皂苷rd总量为86.0％)；
34.枸杞多糖(陕西亿昊川生物科技，hplc-uv检测含量：多糖≥50％)
35.实施例1、猪圆环病毒2型(pcv2)复合水佐剂疫苗配制方法的确定和制备
36.1、猪圆环病毒2型(pcv2)复合水佐剂疫苗配方确定
37.选取黄姜皂素、三七总皂苷、枸杞多糖作为水佐剂的主要成分，使用kollisolv peg e 400(美国sigma公司，货号:06855,cas号：25322-68-3)作为非离子表面活性剂稳定水相。
38.设计正交试验，黄姜皂素、三七总皂苷、枸杞多糖分别设定三个浓度，peg e 400与生理盐水配比量设定三组比例，按照正交试验原理分别配置成混合溶液，对其进行物理性状和稳定性指标检测，筛选出符合质量标准的疫苗复合水佐剂配方；将物理性状和稳定性合格的组注射6周龄balb/c小鼠，观察各组小鼠的健康表现和存活状况，连续观察三天。
39.配制筛选结果为：黄姜皂素的添加量为1mg/ml，三七总皂苷的添加量为5mg/ml，枸杞多糖的添加量为1mg/ml，peg e 400以重量计为1％。
[0040][0041]
表1、复合水佐剂各组分配比浓度设计
[0042]
2.猪圆环病毒2型(pcv2)复合水佐剂疫苗制备
[0043]
按照筛选结果量取一定量的黄姜皂素、三七总皂苷、枸杞多糖、peg e 400，将黄姜皂素、三七总皂苷、枸杞多糖加入水相，
[0044]
100r/min转速下缓慢加入peg e 400继续搅拌至无大颗粒不溶物后，将转速调至500r/min连续搅拌10分钟后等待泡沫消失，
[0045]
将配置好的复合水佐剂用0.22μm过滤器过滤除菌，然后按比例缓慢加入到水相抗原中，500r/min连续搅拌10分钟，猪圆环病毒2型(pcv2)复合水佐剂疫苗(最终抗原量和佐剂量的比是24:1)配置完成。
[0046]
实施例2、猪圆环病毒2型(pcv2)复合水佐剂疫苗质量评价
[0047]
1、检测离心后复合水佐剂疫苗的稳定性
[0048]
10000r/min离心30分钟后仍维持均一、透明、澄清的外观，未出现有物质析出以及分层现象，与离心前对比颜色、澄清度、流动性均无变化，该猪圆环病毒2型(pcv2)复合水佐剂疫苗稳定性良好。
[0049]
2、测定复合水佐剂和复合水佐剂疫苗的ph
[0050]
各取一定量复合水佐剂和复合水佐剂疫苗至干净烧杯中，所使用的ph计品牌及型号为梅特勒-托利多(fe28)，分别测定三次，取平均值，复合水佐剂和复合水佐剂疫苗ph分
别为5.8和6.5，在疫苗ph允许范围之内。
[0051]
3、复合水佐剂疫苗稳定考察
[0052]
各取三份疫苗分别于4℃、25℃放置6个月，37℃放置一个月，复合水佐剂疫苗外观均保持均一、透明、澄清的外观；10000r/min离心30分钟后仍维持均一、透明、澄清的外观，其稳定良好。
[0053]
实施例3、猪圆环病毒2型(pcv2)复合水佐剂疫苗安全性试验
[0054]
1、复合水佐剂疫苗对小鼠的安全性实验
[0055]
20只体重18-22克的6周龄balb/c小鼠，随机分成2组每组10只，分别皮下注射复合水佐剂疫苗500μl和生理盐水500μl，每日观察小鼠的健康表现和存活情况，连续观察7日，均未出现因疫苗注射而引起的不良反应和死亡。
[0056]
2、复合水佐剂疫苗对仔猪的安全性实验
[0057]
10只28-35日龄健康仔猪，经pcr和elisa检测体内没有猪圆环病毒2型(pcv2)病毒和抗体，随机分成2组每组5只，检测并记录注射前2天的体温数据，每天检测2次；将2组仔猪分别颈部肌肉注射复合水佐剂疫苗4ml和生理盐水4ml，注射后每隔6小时测温，连续检测3天；观察仔猪的健康表现和存活状况，连续观察7日。其中疫苗组在注射疫苗后6小时体温较生理盐水组高出0.6℃，免后24小时逐渐恢复到免前体温水平；免后7天并未出现其他不良反应以及死亡情况。
[0058]
实施例4、猪圆环病毒2型(pcv2)复合水佐剂疫苗免疫效力试验
[0059]
1、复合水佐剂疫苗对小鼠的免疫效力试验
[0060]
将复合水佐剂和猪圆环病毒2型(pcv2)抗原配制成疫苗，将isa206佐剂(seppic公司montanidelmisa 206vg)猪圆环病毒2型(pcv2)抗原配制成疫苗做为阳性对照。
[0061]
30只体重18-22克的6周龄balb/c小鼠，随机分成3组每组10只，分别皮下注射复合水佐剂疫苗100μl、isa206佐剂疫苗100μl、生理盐水100μl，在免后7天、14天、21天、28天进行断尾采血，对血清进行间接elisa实验，通过测定各组抗体滴度来判定各组抗体的消长情况，结果如图1所示，14-21天采血结果显示复合水佐剂组抗体提升明显，21-28天采血结果显示复合水佐剂组较isa206佐剂组有显著优势。
[0062]
2、复合水佐剂疫苗对仔猪的免疫效力试验
[0063]
将复合水佐剂和猪圆环病毒2型(pcv2)抗原配制成疫苗，将isa206佐剂猪圆环病毒2型(pcv2)抗原配制成疫苗。15只28-35日龄健康仔猪，经pcr和elisa检测体内没有猪圆环病毒2型(pcv2)病毒和抗体，随机分成3组每组5只，分别皮下注射复合水佐剂疫苗2ml、isa206佐剂疫苗2ml、生理盐水2ml，在免后14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天、63天进行前腔静脉采血，对对血清进行间接elisa实验，通过测定各组抗体滴度来判定各组抗体的消长情况，结果如图2所示，采血结果显示复合水佐剂组在免后14-21天抗体提升明显，在28天达到顶峰并在63天还未出现衰减趋势；而isa206佐剂组在免后42天抗体才达到顶峰，且在63天出现抗体衰减趋势。
[0064]
可见，本技术采用中药提取物黄姜皂素、三七总皂苷、枸杞多糖配合非离子表面活性剂的方法，成功制备出一种有效针对猪圆环病毒2型(pcv2)疫苗的免疫复合水佐剂。本技术作为水佐剂和猪圆环病毒2型(pcv2)抗原配制成疫苗后，相比传统油佐剂免疫刺激性更小，免疫效果明显高于传统油佐剂，随着免疫后时间的延续，这种效应更加明显，可以有效
提高养殖户的经济效益。
[0065]
最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明的实质，不用于限定本发明的保护范围。