一种聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂

1.本发明属于生物组织工程领域，具体涉及一种聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂。


背景技术：

2.胃出血是一种严重威胁患者生命的病症，据报道急性胃出血患者的死亡率约为10％。然而，目前的治疗方法，包括保守药物治疗、内镜介入治疗和手术治疗，存在治疗时间长、治疗费用多和诱发并发症等风险。
3.近年来，组织粘合剂已广泛应用于医学再生领域。现有的商业化的医用组织粘合剂主要以氰基丙烯酸酯类抗菌粘合剂为主，中国专利授权公开号cn103272263b，授权公告日为2014年10月22日，发明名称为“一种医用抗菌粘合剂”公开了一种α-氰基丙烯酸类的组织粘合剂，但抗菌粘合剂氰基丙烯酸酯类抗菌粘合剂在聚合过程中放出热量会灼伤伤口、有毒性并且在储存运输中还会释放甲醛损害人体健康。
4.针对氰基丙烯酸酸脂类存在的问题，研究人员开发了许多新兴的生物医用产品。如专利授权公告号cn110101898b，授权公告日为2020年5月22日，发明名称为“双组份原位注射型天冬酰胺仿生组织粘合剂及其制备方法”，公开了一种含有多官能团的聚天冬酰胺的粘合剂，但是其合成过程复杂、反应条件严格不适用于大规模生产。如专利授权公告号cn107158453b，授权公告日为2020年2月18日，发明名称为“一种透明质酸组织粘合剂的制备方法”。公开了一种多巴胺接枝醛基化马来酰胺透明质酸钠的粘合剂，但是其成胶时间长、需要在紫外光的照射下才能迅速交联。然而，上述粘合剂均不能适用于胃部的低酸性(ph＝1)环境，他们在酸性环境下的稳定性差以及对湿组织的低粘附性，使得组织粘合剂治疗胃部伤口仍然是一种挑战。
5.因此，非常需要开发新的功能性粘合剂，能在极端酸性条件下(ph＝1)稳定存在，并且可以粘合到伤口部位以快速封闭胃部伤口、抑制胃出血和促进伤口愈合。理想的耐胃酸组织粘合剂应具备在胃酸环境下稳定、生物相容性好、粘附强度大、粘附时间短、能被人体降解和吸收、无污染等性能。


技术实现要素：

6.针对上述现有技术的问题，本发明提供一种聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂，本发明通过氢键等物理交联方式，将功能化的聚谷氨酸和单宁酸交联，形成具有耐胃酸、湿粘附性强的止血粘合剂，其合成路径单一、交联方式温和、止血时间短以及止血效果良好，可以广泛应用于胃组织工程等领域。
7.为实现上述目的，本发明提出以下方案制备耐胃酸止血粘合剂用于胃部伤口封闭和止血的应用。
8.一种聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂的制备方法，包括如下步骤：
9.(1)将单宁酸溶解在去离子水中，使用磁力搅拌器搅拌水浴锅搅拌溶解后得到单宁酸溶液，使用盐酸调整ph值，得到低酸性的单宁酸溶液；
10.(2)将聚谷氨酸溶解去离子水中，使用磁力搅拌水浴锅搅拌溶解后得到聚谷氨酸溶液；然后加入活化剂和多酚类化合物，待反应结束后，使用透析袋在透析液中透析纯化，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得多酚类功能化的聚谷氨酸材料。
11.(3)将步骤(2)所述多酚类功能化的聚谷氨酸材料加入(1)中的低酸性单宁酸溶液，充分搅拌混合即得聚谷氨酸耐胃酸止血组织粘合剂。
12.优选的，步骤(1)所述的单宁酸的溶解温度为20-60℃。
13.优选的，步骤(1)所述单宁酸摩尔浓度为10-100mm。
14.优选的，步骤(1)所述单宁酸的ph值为1-4，盐酸摩尔浓度为0.1-1.0m。
15.优选的，其特征在于，步骤(2)所述聚谷氨酸溶液浓度为1-20％，溶解温度为20-70℃，聚谷氨酸的分子量为3-200万道尔顿。
16.优选的，步骤(2)所述活化剂包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基琥珀酰亚胺、n，n
′‑
羰基二咪唑、二环己基碳二亚胺、二异丙基碳二亚胺、2-(7-氮杂苯并三氮唑)-n，n，n
′
，n
′‑
四甲基脲六氟磷酸酯、o-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯，活化剂的添加量为聚谷氨酸的10％-200％，反应温度为20-70℃，反应时间为6-24小时。优选的，步骤(2)所述多酚类化合物包括但不限于4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐、3，4，5-三羟基苯丙氨酸、酪氨酸、3，4，5-三羟基苯甲酸，多酚类化合物的添加量为聚谷氨酸的10％-200％，反应温度为20-70℃，反应时间为6-24小时。
17.优选的，步骤(2)所述多酚类化合物功能化修饰后聚谷氨酸材料的透析温度为20-60℃，透析液为去离子水、超纯水以及磷酸盐缓冲溶液(ph＝7.4)，透析袋的截留量为1000-14000道尔顿，透析时间1-7天。
18.优选的，步骤(3)所述多酚类化合物功能化修饰后聚谷氨酸材料与单宁酸溶液的质量比为0.1∶1至1∶10。
19.本发明还提供由上述方法制得的聚谷氨酸和单宁酸耐胃酸止血粘合剂。
20.本发明还提供由上述方法制得的聚谷氨酸和单宁酸耐胃酸止血粘合剂在胃部伤口和皮肤伤口中的应用。
21.所述应用包括：制备聚谷氨酸和单宁酸耐胃酸止血粘合剂、胃部伤口或皮肤伤口的治疗。
22.本发明的有益效果在于：
23.本发明以安全无毒、生物相容性优异且生物全降解的高分子聚合物材料——聚谷氨酸为分子骨架，在其高分子侧链修饰多巴胺基团，引入单宁酸通过氢键等物理交联形成组织粘合剂。该发明能在胃酸条件下保持稳定并快速封闭伤口，胃部伤口部位或皮肤伤口部位的治疗领域具有重要的临床应用前景。
24.本发明提出制备可注射水凝胶支架具有临床使用方便、操作简便，便于微创治疗且其自适应性能便于贴合不规则的伤口区域，达到修复与重建的目的。
附图说明
25.图1是本发明所述聚谷氨酸和单宁酸耐胃酸止血粘合剂的扫描电镜图片。
26.图2是本发明所述聚谷氨酸和单宁酸耐胃酸止血粘合剂的流变学测试结果。
27.图3是本发明所述聚谷氨酸和单宁酸耐胃酸止血粘合剂的粘合组织能力。
28.图4是本发明所述聚谷氨酸和单宁酸耐胃酸止血粘合剂在人工胃液中的体外降解示意图。
29.图5本发明所述明聚谷氨酸和单宁酸耐胃酸止血粘合剂的细胞毒性示意图。
30.图6本发明所述聚谷氨酸和单宁酸耐胃酸止血粘合剂的皮肤伤口修复数据示意图。
31.图7本发明所述聚谷氨酸和单宁酸耐胃酸止血粘合剂的胃部止血数据示意图。
32.以下是对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
33.实施例1
34.(1)将单宁酸溶解在去离子水中得到50mm的单宁酸溶液，然后使用0.1m盐酸调整ph值为2.0，低酸性的单宁酸溶液；所有的溶解步骤均在30℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
35.(2)将10.0g聚谷氨酸(70万道尔顿)溶解在去离子水中得到10％的聚谷氨酸溶液中，使用30℃的磁力搅拌水浴锅加热；然后加入14.8g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和8.9g的n-羟基琥珀酰亚胺，使用30℃的磁力搅拌水浴锅持续搅拌2h后，加入14.7g的盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐，待反应结束后，使用3500道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度20℃，透析时间7天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸材料。
36.(3)将步骤(2)所述盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸加入(1)中单宁酸溶液中，温度为37℃，盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸与单宁酸溶液质量比为1∶2，充分搅拌后即得聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂。
37.实施例2
38.(1)将单宁酸溶解在去离子水中得到50mm的单宁酸溶液，然后使用0.1m盐酸调整ph值为3.0，低酸性的单宁酸溶液；所有的溶解步骤均在30℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
39.(2)将20.0g聚谷氨酸溶解在去离子水中得到15％的聚谷氨酸溶液中，使用20℃的磁力搅拌水浴锅加热；然后加入29.6g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和18.8g的n-羟基琥珀酰亚胺，使用30℃的磁力搅拌水浴锅持续搅拌1h后，加入20.0g的盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐，待反应结束后，使用5000道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度20℃，透析时间7天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸材料。
40.(3)将步骤(2)所述盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸加入(1)中单宁酸溶液中，温度为20℃，盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸与单宁酸溶液质量比为1∶1，充分搅拌后即得聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂。
41.将制备的粘合剂冻干、切断、镀金后使用扫描电子显微镜镜(15kv)进行微观形貌表征，本实施例所制备的明胶偶联的可注射电传导水凝胶支架的扫描电镜图片如图1所示。
42.实施例3
43.(1)将单宁酸溶解在去离子水中得到100mm的单宁酸溶液，然后使用0.1m盐酸调整ph值为1.0，低酸性的单宁酸溶液；所有的溶解步骤均在30℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
44.(2)将10.0g聚谷氨酸溶解(200万道尔顿)在去离子水中得到5％的聚谷氨酸溶液中，使用50℃的磁力搅拌水浴锅加热；然后加入20.0g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10.0g的n-羟基琥珀酰亚胺，使用30℃的磁力搅拌水浴锅持续搅拌1h后，加
入15.7g的盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐，待反应结束后，使用6500道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度20℃，透析时间7天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸材料。
45.(3)将步骤(2)所述盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸加入(1)中单宁酸溶液中，温度为27℃，盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸与单宁酸溶液质量比为1∶5，充分搅拌后即得聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂。
46.实施例4
47.(1)将单宁酸溶解在去离子水中得到50mm的单宁酸溶液，然后使用0.1m盐酸调整ph值为1.0，低酸性的单宁酸溶液；所有的溶解步骤均在30℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
48.(2)将5.0g聚谷氨酸溶解在去离子水中得到10％的聚谷氨酸溶液中，使用30℃的磁力搅拌水浴锅加热；然后加入15.0g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10.0g的n-羟基琥珀酰亚胺，使用30℃的磁力搅拌水浴锅持续搅拌2h后，加入10.0g的盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐，待反应结束后，使用5000道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度30℃，透析时间7天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸材料。
49.(3)将步骤(2)所述盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸加入(1)中单宁酸溶液中，温度为20℃，盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸与单宁酸溶液质量比为1∶1，充分搅拌后即得聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂。置于流变仪帕尔贴平板中央进行应力应变扫描、频率扫描以及剪切稀化测试，本实施例所制备的明胶偶联的可注射电传导水凝胶支架的流变测试结果如图2所示。
50.实施例5
51.(1)将单宁酸溶解在去离子水中得到100mm的单宁酸溶液，然后使用0.5m盐酸调整ph值为2.0，低酸性的单宁酸溶液；所有的溶解步骤均在30℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
52.(2)将10.0g聚谷氨酸(110万道尔顿)溶解在去离子水中得到5％的聚谷氨酸溶液中，使用30℃的磁力搅拌水浴锅加热；然后加入15.0g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和15.0g的n-羟基琥珀酰亚胺，使用30℃的磁力搅拌水浴锅持续搅拌1h后，加入20.0g的盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐，待反应结束后，使用1000道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度20℃，透析时间7天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸材料。
53.(3)将步骤(2)所述盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸加入(1)中单宁酸溶液中，温度为37℃，盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸与单宁酸溶液质量比为1∶2，充分搅拌后即得聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂。将所制备的与不同湿组织器官进行粘合，本实施例所制备的聚谷氨酸耐胃酸组织粘合剂不同湿组织粘合性能如图3所示。
54.实施例6
55.(1)将单宁酸溶解在去离子水中得到50mm的单宁酸溶液，然后使用0.3m盐酸调整ph值为1.0，低酸性的单宁酸溶液；所有的溶解步骤均在30℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
56.(2)将10.0g聚谷氨酸溶解在去离子水中得到10％的聚谷氨酸溶液中，使用30℃的磁力搅拌水浴锅加热；然后加入14.8g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和
8.9g的n-羟基琥珀酰亚胺，使用30℃的磁力搅拌水浴锅持续搅拌1h后，加入14.7g的盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐，待反应结束后，使用5000道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度25℃，透析时间3天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸材料。
57.(3)将步骤(2)所述盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸加入(1)中单宁酸溶液中，温度为37℃，盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸与单宁酸溶液质量比为1∶1，充分搅拌后即得聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂。将所制备的水凝胶支架置于37℃的人工模拟胃液中进行体外降解评价，结果如图4所示。
58.实施例7
59.(1)将单宁酸溶解在去离子水中得到50mm的单宁酸溶液，然后使用0.1m盐酸调整ph值为2.0，低酸性的单宁酸溶液；所有的溶解步骤均在30℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
60.(2)将10.0g聚谷氨酸溶解在去离子水中得到10％的聚谷氨酸溶液中，使用30℃的磁力搅拌水浴锅加热；然后加入10.0g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和10.0g的n-羟基琥珀酰亚胺，使用30℃的磁力搅拌水浴锅持续搅拌1h后，加入14.7g的盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐，待反应结束后，使用5500道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度50℃，透析时间7天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸材料。
61.(3)将步骤(2)所述盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸加入(1)中单宁酸溶液中，温度为37℃，盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸与单宁酸溶液质量比为1∶3，充分搅拌后即得聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂。将所制备的粘合剂前聚体溶液使用mtt的测试方法评价其细胞相容性，结果如图5所示。
62.实施例8
63.(1)将单宁酸溶解在去离子水中得到100mm的单宁酸溶液，然后使用0.5m盐酸调整ph值为2.0，低酸性的单宁酸溶液；所有的溶解步骤均在30℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
64.(2)将20.0g聚谷氨酸溶解在去离子水中得到10％的聚谷氨酸溶液中，使用30℃的磁力搅拌水浴锅加热；然后加入12.0g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和12.0g的n-羟基琥珀酰亚胺，使用30℃的磁力搅拌水浴锅持续搅拌1h后，加入20.0g的盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐，待反应结束后，使用3500道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度20℃，透析时间7天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸材料。
65.(3)将步骤(2)所述盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸加入(1)中单宁酸溶液中，温度为20℃，盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸与单宁酸溶液质量比为1∶2，充分搅拌后即得聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂。通过大鼠背部皮肤缺损模型评价了制备的粘合剂促皮肤伤口修复能力，其测试结果如图6所示。
66.实施例9
67.(1)将单宁酸溶解在去离子水中得到50mm的单宁酸溶液，然后使用0.2m盐酸调整ph值为1.0，低酸性的单宁酸溶液；所有的溶解步骤均在30℃的磁力搅拌水浴锅中进行。
68.(2)将10.0g聚谷氨酸溶解在去离子水中得到10％的聚谷氨酸溶液中，使用30℃的磁力搅拌水浴锅加热；然后加入15.0g的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和
20.0g的n-羟基琥珀酰亚胺，使用30℃的磁力搅拌水浴锅持续搅拌1h后，加入25.0g的盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐，待反应结束后，使用7000道尔顿的透析袋在去离子水中透析除杂，透析温度37℃，透析时间5天，使用冷冻干燥机冷冻干燥即得盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸材料。
69.(3)将步骤(2)所述盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸加入(1)中单宁酸溶液中，温度为20℃，盐酸4-(2-氨基乙基)-1，2-苯二酚盐酸盐修饰的聚谷氨酸与单宁酸溶液质量比为1∶1，充分搅拌后即得聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂。通过大鼠胃出血模型评价了制备的粘合剂胃酸条件下伤口封闭能力和止血能力，其测试结果如图7所示。
70.综上表明，我们提供了一种聚谷氨酸耐胃酸止血粘合剂，不仅具有优异粘合强度，可粘附于不同的湿组织器官上，还能在胃酸环境下可长期稳定存在，并稳定粘附于伤口处，利用本发明止血组织粘合剂，可以迅速封闭伤口并抑制胃部伤口出血。该组织粘合剂制备方法简单、原料便宜易得，可完全降解吸收，在皮肤表面无残留，有明显促进皮肤伤口愈合的功效，为胃部伤口修复组织粘合剂的开发和应用，提供新的解决方案和治疗策略。