一种预防治疗流感的雾化液及其制备方法和给药方法与流程

1.本发明涉及中医药技术领域，具体是一种预防治疗流感的雾化液及其制备方法和给药方法。


背景技术：

2.流感主要是病毒从口鼻进入体内引起的机体发病，其传染性明显强于风热感冒，表现为高烧、浑身酸疼、鼻涕口水等病状，该病好发于冬春季节。据who报道每年因流感导致的死亡病例约有25～50万例、严重病例约有300～500万例。流感暴发给人类健康和社会经济造成的损失仍然是一个全球性的公共卫生问题。目前，抗流感病毒的药物主要有：神经氨酸酶抑制剂(nais)、m2离子通道阻滞剂及中药类。其中神经氨酸酶是一种流感病毒表面的糖蛋白，被认为是开发抗病毒药物的重要靶点，因此nais被广泛用于流感治疗。但是nais在抑制流感病毒的同时有恶心、呕吐、腹泻、腹痛等副作用。中药防治流感历史悠久，具有不易耐药、副作用小等特点，因此，以中药材为原料开发预防治疗流感病毒的制剂尤为重要。
3.紫苏入药入膳历史十分悠久，属于药食同源药材。两晋南北朝时的《名医别录》、唐代的《食疗本草》中对紫苏入药的功效都有记载。紫苏辛温，入肺、脾两经，具有解表散寒、行气和胃、止咳平喘和解诸毒之功。紫苏叶富含的迷迭香酸、木犀草素等具有抗病毒、抗炎、抗过敏、抗肿瘤等多种药理作用。在民间紫苏被广泛应用于感冒初期症状的治疗，效果显著。
4.铁皮石斛也是药食同源药材，具有益胃生津、滋阴清热的功效。《时病论》收载的复方石斛汤可治热病伤津、口干烦渴等症。现代药理学揭示石斛多糖可以调节人体巨噬细胞和t细胞的活性，使这些细胞产生更多的免疫因子，从而起到消炎的功效，缓解流行性感冒和高热；石斛碱通过减少细胞表面病毒糖蛋白的表达来抑制流感病毒增殖，具有止痛、解热作用；石斛多酚具有抑制病毒蛋白质和rna合成、抑制病毒的吸附作用。铁皮石斛经益生菌发酵后可以将石斛多糖转变为寡糖，更有利于吸收，同时大大提高黄酮、多酚等的含量。
5.传统中药主要是口服给药方式，其弊端是不注重口感，且倡导“良药苦口”的理念，这导致许多年轻人对中医药有一定的排斥。随着时代变迁，用药更强调“顺应性”。近年发展起来的电子加热烟具和超声雾化器为传统中药剂型的创新提供了硬件支撑。雾化给药一般通过粘膜吸收，具有药物充分分散、吸收面积大、作用迅速、副作用小、疗效佳、无吞咽和扎针的痛苦、并且能够避免肝脏的首过效应等优点。目前，who已将雾化吸入列为治疗上呼吸道疾病如咽炎、扁桃体炎、哮喘等的有效手段之一。


技术实现要素：

6.本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术的不足，提供一种起效快、疗效好、口感好、气味愉悦、便于携带的预防治疗流感的雾化液及其制备方法和给药方法。
7.本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种预防治疗流感的雾化液，该雾化液的重量百分比组成为：紫苏叶提取物3～10％、铁皮石斛提取物0.5～2％、罗汉果提取物0.05～2％、凉味剂0～0.2％、食用香精0.5～20％、山梨酸钾0～0.05％、丙二醇5～
30％、乙醇0～6％、植物甘油0～50％，余量为蒸馏水。
8.中医认为流感属“时行感冒”和“风温”范畴，感冒初起存在着风热时毒侵袭肺卫、肺失宣降、表郁较甚的基本病理变化。流感在中医属温病范畴，符合“寒热并用”的治疗原则。紫苏属辛温中药，铁皮石斛属甘微寒中药，二者配伍形成“寒热”药对，有利于紫苏更好地发挥抗流感病毒作用。同时，二者都含有丰富的生物碱、多酚、有机酸、多糖等成分，有利于二者协同增效。
9.罗汉果提取物具有清肺止咳功效，用于感冒咳嗽、咽喉肿痛，同时具有甜度高、热量低的特点，可改善口感，增加雾化液的甜度。
10.作为优选，所述的紫苏叶提取物中迷迭香酸含量为231.5
±
3.49mg/g。
11.作为优选，所述的铁皮石斛提取物中石斛多糖含量为207.75
±
5.96mg/g、总黄酮含量为17.44
±
0.76mg/g、总多酚含量为27.37
±
1.19mg/g。
12.作为优选，所述的罗汉果提取物中罗汉果甜苷的含量为800
±
5.00mg/g。
13.作为优选，所述的紫苏叶提取物的制备方法为：以新鲜紫苏叶为原料，用0.3～0.8％nacl溶液清洗后，备用；将新鲜紫苏叶按料液比1:15～30加入煮沸后冷却至60～70℃的蒸馏水中，再置于多功能破壁机内，以10000rpm破碎3min、间歇2min、循环3次后，以4000rpm离心10min，取上清液，减压浓缩至相对密度1.10～1.15时，于-50℃预冻24h后冷冻干燥72h，得到紫苏叶提取物。高效水提破壁冷冻干燥工艺符合且优于中药传统的煎煮汤剂，可有效提取紫苏叶的有效成分。
14.作为优选，所述的铁皮石斛提取物的制备方法为：以新鲜铁皮石斛为原料，用0.3～0.8％nacl溶液清洗后，切成3～5cm长的小段，再将切成小段的铁皮石斛按料液比1:25～35加入沸水中，以10000rpm破碎2min、间歇3min、循环5次后得到破碎液，将破碎液加热煮沸灭菌20min，得到灭菌后的铁皮石斛提取液，冷却备用；称取5g果蔬酵素发酵剂溶于灭菌冷却的250ml的2％蔗糖水中，于37℃活化2h，再按照2％接种量加入到灭菌后的铁皮石斛提取液中，置摇床170r/min、37℃培养4天后，取出，经煮沸灭菌20min后，以4000rpm离心10min，取上清液，减压浓缩至相对密度1.10～1.15时，于-50℃预冻24h后冷冻干燥72h，得到铁皮石斛提取物。高效水提破壁冷冻干燥工艺符合且优于中药传统的煎煮汤剂，可有效提取铁皮石斛的有效成分，铁皮石斛经乳酸菌发酵后，多糖变成寡糖，更易于吸收，且其他活性成分含量有所增加。
15.作为优选，所述的凉味剂为天然薄荷脑、凉味剂ws-23、凉味剂ws-5中的一种或几种。凉味剂的主要作用是提供雾化液在口腔和鼻腔中薄荷样的清凉感觉，掩盖或改善传统中药口服液中味道的缺陷或单一性。
16.作为优选，所述的食用香精为水溶性香精，包括中草药味、水果味等用于掩盖或改善传统中药口服液中味道的缺陷或单一性，赋予雾化液更好的气味。
17.上述预防治疗流感的雾化液的制备方法，包括以下步骤：
18.1)按重量百分比组成称取以下原料：紫苏叶提取物3～10％、铁皮石斛提取物0.5～2％、罗汉果提取物0.05～2％、凉味剂0～0.2％、食用香精0.5～20％、山梨酸钾0～0.05％、丙二醇5～30％、乙醇0～6％、植物甘油0～50％、蒸馏水10～50％；
19.2)将紫苏叶提取物、铁皮石斛提取物、罗汉果提取物、山梨酸钾混合均匀，加入灭菌后的蒸馏水，搅拌至溶解并采用0.45μm滤膜过滤得到溶液a；
20.3)在凉味剂中加入丙二醇、乙醇至完全溶解，再加入食用香精，混匀后得到溶液b；
21.4)将溶液a倒入溶液b中，搅拌均匀，得到透明溶液，加入植物甘油，混合均匀后，于25～35℃搅拌15min，然后置于阴凉室温处贮放3～15天，得到预防治疗流感的雾化液。
22.作为优选，该雾化液的给药方法包括喷雾给药、超声雾化给药和电子加热雾化给药，该雾化液中植物甘油的含量为0～10％时，采用喷雾给药或超声雾化给药方法；该雾化液中植物甘油的含量为33～50％时，采用电子加热雾化给药方法。采用喷雾给药方法时，将植物甘油的含量为0～10％的雾化液倒入到喷雾瓶中，通过直接向口腔中喷洒药液的方式给药，其特点是雾滴粒径相对较大，为10～20μm，每喷约50～100μl，药物分散程度相对较低，其优点是制备成本相对较低。采用超声雾化给药方法时，将植物甘油的含量为0～10％的雾化液加入到雾化弹中，将雾化弹插入到常温超声波雾化器中，通过抽吸触及超声感应系统使药液雾化，产物的雾滴粒径为0.5～5μm，吸一口约10μl，雾化体积约30～50ml，口含雾滴5～10秒吸收后可以吞服或吐出，药液高度吸收，抽吸的顺应性非常好。采用电子加热雾化给药方法时，将雾化液装入雾化弹中，将雾化弹插入到电子烟具中，通过抽吸触及加热系统，温度达到140～180℃，瞬间加热雾化液产生粒径200～300nm的雾滴，吸一口约10μl，雾化体积约30～50ml，口含雾滴5～10秒吸收后可以吞服或吐出。上述超声雾化给药方法和电子加热雾化给药方法，是对传统中药给药方式的创新，集药效、口感、香气、烟雾集于一体，更好地发展了中医药产品的体验感。
23.与现有技术相比，本发明的优点在于：
24.(1)本发明雾化液对流感预防与初期治疗非常有效且安全可靠，紫苏和铁皮石斛都属于药食同源药材，紫苏属辛温中药，铁皮石斛属甘微寒中药，二者配伍形成“寒热”药对优于单味药材，有利于紫苏更好地发挥抗流感病毒作用，同时，二者都含有丰富的生物碱、多酚、有机酸、多糖等成分，有利于二者协同增效，提高了雾化液协同抗病毒的效果；
25.(2)雾化液经口腔吸入，药物高度分散，通过口腔、上呼吸道粘膜吸收，能够避免肝首过效应，减少剂量、提高疗效；
26.(3)本发明雾化液的给药方法可集药效、口感、香气、烟雾集于一体，提高了用药的顺应性，更好地提升了中医药产品的体验感，利于中医药的普及。
附图说明
27.图1为本发明雾化液的研发流程；
28.图2为紫苏药物靶点与流感相关发病机制靶点的韦恩图；
29.图3为紫苏-有效成分-靶点-流感a网络图；
30.图4为紫苏治疗流感的关键基因的柱状图；
31.图5为紫苏靶向流感的核心网络靶点的go分析得到的生物过程、细胞组分、分子功能3个模块条形图；
32.图6为紫苏靶向流感核心靶点的kegg通路富集气泡图；
33.图7为迷迭香酸与四个核心靶点的对接结果；
34.图8为木犀草素与四个核心靶点的对接结果。
具体实施方式
35.以下结合附图实施案例对本发明作进一步详细描述。
36.借助网络药理学分析紫苏的成分、流感靶点、通路之间的关系，为紫苏抗流感药剂开发提供理论支持，研发流程见图1。得到如下结果：
37.一、本发明雾化液产品研发的理论基础——紫苏对流感病毒的分子机制分析
38.1.紫苏有效成分及靶点筛选
39.经tcmsp平台和文献查阅，以口服利用度(ob)≥30％、类药性(dl)≥0.18收集得到紫苏有效成分19个、对应靶点数103个。紫苏有效成分的基本信息见表1。
40.表1紫苏有效成分的基本信息
[0041][0042]
2.紫苏与流感病毒的交集靶点
[0043]
通过genecards和disgenet数据库收集筛选流感“influenza a”疾病的靶点，利用r软件对紫苏有效成分的活性靶点与流感疾病靶点进行统计，绘制得到交集靶点的韦恩图(如图2)，取药物-疾病交集基因得到48个共有靶点。
[0044]
3.紫苏-有效成分-靶点-疾病网络图
[0045]
使用cytoscape3.7.0软件构建药物-活性成分-靶点-疾病网络，根据拓扑学参数筛选紫苏治疗流感的关键靶点。
[0046]
由图3所示的紫苏-有效成分-靶点-流感a网络图，可以看出木犀草素、迷迭香酸和β-谷甾醇分别对应了27个、19个和11个关键基因，是对应关键基因最多的三个有效成分。从图4可知，vegfa(vascμlar endothelial growth factor a，血管内皮生长因子)、akt1(akt serine/threonine kinase 1，akt丝氨酸/苏氨酸激酶1)、mapk1(mitogen-activated protein kinase 1，丝裂原活化蛋白激酶1)、il6(interleukin 6，白细胞介素6)等，它们是
紫苏治疗流感的关键基因，属于核心靶点。
[0047]
4.go和kegg通路富集分析
[0048]
将交集靶点基因名称输入david数据库(https://david.ncifcrf.gov/)，数据类型选择“official gene symbol”，表格类型选择“gene list”，物种类型选择为“homo sapiens”，背景选择“homo sapiens”，再选择“functional annotation tool”，筛选时限选择p＜0.05、fdr＜0.05，得到go(基因本体)和kegg(京都基因与基因组百科全书)富集分析。go分析得到的生物过程、细胞组分、分子功能3个模块条形图5。在生物学过程中涉及了对细菌来源分子反应、细胞对氧化应激反应、神经炎症反应、t细胞活化等。在细胞组分中包括膜筏、膜微区、内质网内腔、囊泡腔等。在分子功能中涉及了细胞因子受体结合、细胞因子活性、半胱氨酸型内肽酶活性参与细胞凋亡过程、泛素样蛋白连接酶结合、抗氧化活性、g蛋白偶联受体结合、丝氨酸型肽酶活性、半胱氨酸型内肽酶活性等。
[0049]
图6为紫苏靶向流感核心靶点的kegg通路富集气泡图。kegg显著富集的通路有111条(p＜0.05、基因数≥4为度)，图6是部分相关性较高的通路。在111条通路中，核心网络的靶点涉及的与流感疾病显著相关的重要通路有13条，分别为甲型流感通路、乙型肝炎、人类巨细胞病毒感染、丙型肝炎、肺结核、白细胞介素-17(il-17)信号通路、t细胞受体信号通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶b(pi3k-akt)信号通路、酪氨酸激酶-信号转导子和转录激活子(jak-stat)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(mapk)通路、抗病毒反应需要病毒感染激活多种模式识别受体(tlr/rig-i)信号通路、nf-κb信号通路、细胞凋亡通路。
[0050]
5.紫苏抗流感的分子作用机制分析(以甲型流感通路为例)
[0051]
甲型流感通路共富集了17个关键基因，包含blc2、casp9、casp3、casp8、prkca、akt1、prss1、rela、mapk1、il6、nfkbia、icam1、ifng、ikbkb、stat 1、ccl2、ccnd3，在通路中红色框为靶点或靶蛋白所在的位置，每个框可为一个或一类基因，如pkb框为akt1，表明紫苏叶中木犀草素、β-胡萝卜素可对akt1进行调控。又如erk1/2框包含有mapk1基因，紫苏叶中木犀草素、迷迭香酸可对mapk1进行调控。从通路中红色框可以看出紫苏发挥抗流感功能主要通过pi3k-akt信号通路、mapk通路、tlr/rig-i信号通路、nf-κb信号通路等。迷迭香酸和木犀草素都对mapk信号通路有一定的抑制作用，迷迭香酸和木犀草素很有可能通过抑制流感病毒的产生和传播来抵御流感。木犀草素还很有可能通过抑制akt1使得被感染的细胞凋亡，使得病毒的复制和增殖不能进行，从而抵御流感。迷迭香酸和木犀草素也能作用于tlr4/nf-κb信号通路，抑制促炎性细胞因子il-6的分泌，减轻流感引发的高烧和非典型肺炎等症状。
[0052]
6.紫苏核心成分对流感靶点的分子对接
[0053]
木犀草素和迷迭香酸是成分-靶点网络中的关键成分，vegfa、akt1、mapk1、il6是ppi网络中的核心靶点。盲法对接后每对组合产生了6个配体-蛋白结合预测模型，对结合能最低的模型进行可视化分析。紫苏核心成分对流感靶点分子对接的结合能见表2。
[0054]
表2紫苏核心成分对流感靶点分子对接的结合能
[0055]
[0056]
8个对接模型的结合能均小于-5kj/mol，显示对接的结果都很好，且与常见的抗流感病毒药奥司他韦相比较，其结合能更稳定。
[0057]
图7为迷迭香酸与四个核心靶点的对接结果。由图7可知，迷迭香酸可以被vegfa、akt1、mapk1、il6四个核心靶点的活性口袋所包裹，结合模式以氢键作用为主，疏水作用则进一步稳定了化合物-蛋白结构。
[0058]
图8为木犀草素与四个核心靶点的对接结果。由图8可知，木犀草素可以被vegfa、akt1、mapk1、il6四个核心靶点的活性口袋包裹，二者结合模式以氢键、π-π键为主，化合物-蛋白的疏水作用为辅。以木犀草素与il6的对接结果为例，木犀草素与glu135和ser93形成了两条氢键，与phe132和ile142形成π键。
[0059]
7.结论
[0060]
(1)迷迭香酸和木犀草素作用于tlr4/nf-κb信号通路，抑制促炎性细胞因子il-6的分泌，减轻了流感引发的高烧和非典型肺炎等症状。同时由于该途径的激活，引发了宿主的免疫应答，激发了以对抗流感病毒的非结构蛋白ns1作为宿主ifn应答的拮抗剂，发挥抗炎效应。
[0061]
(2)迷迭香酸能抑制il-1β诱导的jnk和p38磷酸化，这些酶没能参与细胞凋亡和细胞因子的表达，所以不能激活raf，erk 1/2也受到了抑制，病毒蛋白的表达和rnps的释放都受到影响。
[0062]
(3)木犀草素抑制akt1的表达，影响其调节的许多下游信号通路发挥作用，如促凋亡因子磷酸化的抑制，正常发挥了使感染细胞死亡的作用，阻止了病毒的进一步传播。
[0063]
二、紫苏叶提取物和铁皮石斛提取物的制备
[0064]
紫苏叶提取物的制备方法为：以新鲜紫苏叶为原料，用0.3～0.8％nacl溶液清洗后，备用；将新鲜紫苏叶按料液比1:15～30加入煮沸后冷却至60～70℃的蒸馏水中，再置于多功能破壁机内，以10000rpm破碎3min、间歇2min、循环3次后，以4000rpm离心10min，取上清液，减压浓缩至相对密度1.10～1.15时，于-50℃预冻24h后冷冻干燥72h，得到紫苏叶提取物。经检测，该紫苏叶提取物中迷迭香酸含量为231.5
±
3.49mg/g。
[0065]
铁皮石斛提取物的制备方法为：以新鲜铁皮石斛为原料，用0.3～0.8％nacl溶液清洗后，切成3～5cm长的小段，再将切成小段的铁皮石斛按料液比1:25～35加入沸水中，以10000rpm破碎2min、间歇3min、循环5次后得到破碎液，将破碎液加热煮沸灭菌20min，得到灭菌后的铁皮石斛提取液，冷却备用；称取5g市售果蔬酵素发酵剂溶于灭菌冷却的250ml的2％蔗糖水中，于37℃活化2h，再按照2％接种量加入到灭菌后的铁皮石斛提取液中，置摇床170r/min、37℃培养4天后，取出，经煮沸灭菌20min后，以4000rpm离心10min，取上清液，减压浓缩至相对密度1.10～1.15时，于-50℃预冻24h后冷冻干燥72h，得到铁皮石斛提取物。经检测，该铁皮石斛提取物中石斛多糖含量为207.75
±
5.96mg/g、总黄酮含量为17.44
±
0.76mg/g、总多酚含量为27.37
±
1.19mg/g。
[0066]
三、紫苏与铁皮石斛复配的依据——体外抗流感病毒实验
[0067]
1.流感病毒a与mdck细胞
[0068]
甲型流感病毒a/pr/8/34鼠适应株h1n1，用9～11日龄鸡胚传代后，经测定血凝效价为1:1024。mdck细胞株，疾控中心购买，于-80℃超低温保存。
[0069]
2.药液配制与实验分组
[0070]
称取两种提取物共100mg，蒸馏水溶解定容至10ml，热压灭菌15min，备用。用细胞维持培养基倍比稀释至所需浓度。
[0071]
紫苏叶提取物浓度(μg/ml)：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63。
[0072]
铁皮石斛提取物浓度(μg/ml)：1000、500、250、125、62.5、31.25、15.63。
[0073]
紫苏-石斛(3:1)：取紫苏叶提取物3/4与铁皮石斛提取物1/4混合均匀后倍比稀释至1000、500、250、125、62.5、31.25μg/ml。
[0074]
紫苏-石斛(1:1)：取紫苏叶提取物1/2与铁皮石斛提取物1/2混合均匀后倍比稀释至1000、500、250、125、62.5、31.25μg/ml。
[0075]
另备正常细胞对照组。
[0076]
3.药液对mdck细胞存活率实验
[0077]
取对数生长期mdck细胞悬液按1
×
104个/孔接种于96孔培养板中，置于37℃、5％co2培养箱中培养24h至细胞贴壁，弃去旧培养液，用pbs轻洗2-3遍细胞。每孔加入100μl倍比梯度稀释的药液，细胞对照组加等体积细胞维持液，每组5个复孔，置于培养箱中培养1h后，每孔补加100μl含10％胎牛血清的dmem培养液继续培养48h，弃上清液，加入100μl mtt(500μg/ml)孵育4h，弃上层液体，加入150μl dmso，振荡培养10min，酶标仪测od
570nm
值。按下式计算细胞存活率。一般认为细胞存活率＞90％对应的药物浓度为无毒浓度。
[0078][0079]
紫苏叶提取物、铁皮石斛提取物及其复配对mdck细胞活性的影响见表3。
[0080]
表3紫苏叶提取物、铁皮石斛提取物及其复配对mdck细胞活性的影响(％，n＝5)
[0081][0082]
由表3可知，紫苏叶提取物与铁皮石斛提取物对mdck细胞在所实验浓度范围内都是安全的，相比来说，铁皮石斛提取物对mdck细胞的安全性优于紫苏叶提取物。紫苏-铁皮石斛组(3:1，1:1)与紫苏叶提取物组比较对细胞的存活率，最大无毒浓度从500μg/ml提高到了1000μg/ml，可见二者配伍有助于提高紫苏的用药安全性，从细胞层次可评价二者配伍是安全的。
[0083]
4.提取物抗流感病毒的有效率测定
[0084]
病毒对mdck细胞的半数细胞感染量(tc id
50
)测定：用pbs轻洗2～3次96孔板中贴壁生长的mdck单层细胞，流感病毒原液(a/pr/8/34鼠适应株h1n1)用细胞维持液按10倍比稀释至浓度为10-1
～10-8
，按100μl/孔接种于细胞孔中(平行5个复孔)，正常对照组中只加细胞维持液。置于37℃、5％co2培养箱中吸附细胞1h后，弃病毒液，用pbs轻洗2～3次，加入100μl细胞维持液，常规培养72h，每天观察细胞病变效应，记录细胞病变状况及孔数。采用reed-muench法计算得到tcid
50
为10-4.6
/100μl。
[0085]
以2
×
104个/孔接种mdck细胞于96孔板，37℃、5％co2培养箱中培养24h，待细胞生长至单层，弃培养液，用pbs洗2次。设计3种不同加药方式观察药物的抗病毒效果：
[0086]
1)药物预防组：先加入100μl不同浓度的药液，作用24h后弃去孔中药液，再加入100μl tcid
50
的病毒稀释液吸附1h后，再加入100μl细胞维持液，置37℃、5％co2培养箱中继续培养24h，弃上清液，每孔加100μl mtt培养4h后，弃上清液，每孔加入150μl dmso，振荡10min，酶标仪测定各孔的od
570nm
，计算药物抗病毒有效率(％)。
[0087]
2)抗病毒吸附组：每孔加入200μl混合液(病毒与不同浓度药液各100μl)于单层的mdck细胞中，置37℃、5％co2培养箱中培养48h，弃上清液。每孔加100μl mtt培养4h后，弃上清液，每孔加入150μl dmso，振荡10min，酶标仪测定各孔的od
570nm
，计算药物抗病毒有效率(％)。
[0088]
3)药物治疗组：加入100μl tcid
50
的病毒稀释液，置37℃、5％co2培养箱中吸附1h后，弃病毒液，再加入100μl不同浓度的药液，置37℃、5％co2培养箱中继续培养48h，弃药液，每孔加100μl mtt培养4h后，弃上清液，每孔加入150μl dmso，振荡10min，酶标仪测定各孔的od
570nm
，计算药物抗病毒有效率(％)。
[0089]
设正常细胞对照组(只加细胞维持液)和病毒对照组(每孔加100μl的tcid
50
病毒生长液)，每个浓度设5个复孔。
[0090][0091]
紫苏、铁皮石斛提取物及其复配抗h1n1流感病毒感染的有效率见表4。
[0092]
表4紫苏、铁皮石斛提取物及其复配抗h1n1流感病毒感染的有效率(％，n＝5)
[0093][0094]
细胞被流感病毒感染后，在细胞内大量繁殖，引起细胞代谢的变化，导致细胞发生病变，如细胞肿胀变圆、细胞间隙增大、细胞核固缩或破裂等，严重时细胞会发生部分或全部脱落。
[0095]
由表4可知，紫苏、铁皮石斛提取物及其药对抗h1n1流感病毒的有效率呈现如下规律：
①
三种给药方式是，治疗组＞吸附组＞预防组。
②
不同药物组是，紫苏-铁皮石斛组＞紫苏组、铁皮石斛组，紫苏与铁皮石斛复配明显优于单方组。
③
总体呈现浓度依赖性，在31.25～500μg/ml浓度范围内，随浓度增大抗病毒效果增强。可见，紫苏-铁皮石斛复配对病毒感染的mdck细胞的抑制率提高，优于紫苏和铁皮石斛单方，显示二者具有协同增效作用。
[0096]
中医认为流感属“时行感冒”和“风温”范畴，多系气候反常、感受邪病、疫疠而发病。感冒初期存在着风热时毒侵袭肺卫、肺失宣降、表郁较甚的基本病理变化。紫苏辛温，入肺、脾两经，具有解表散寒、行气和胃、止咳平喘和解诸毒之功；铁皮石斛具有益胃生津、滋阴清热的功效，可治热病伤津、温热有汗、风热化火等。现代药理学揭示紫苏主要有效成分迷迭香酸、木犀草素等具有抗病毒、抗炎、抗过敏、抗肿瘤等多种作用；铁皮石斛含有石斛多糖、生物碱等活性成分，具有增强人体免疫力，消炎止痛等作用。从中医药配伍角度二者属于“寒热对”，从有效成分角度二者复配能增效。
[0097]
四、实施案例一：预防治疗流感的雾化液的制备及喷雾给药应用
[0098]
一种预防治疗流感的雾化液，其重量百分比组成为：紫苏叶提取物5％、铁皮石斛提取物1％、市售罗汉果提取物0.05％、凉味剂(ws-23)0.025％、山楂味食用香精0.5％、山梨酸钾0.05％、丙二醇8％、乙醇5％、植物甘油5％，余量为蒸馏水。
[0099]
将紫苏叶提取物、铁皮石斛提取物、罗汉果提取物、山梨酸钾混合均匀，加入灭菌后的蒸馏水，搅拌至溶解并采用0.45μm滤膜过滤得到溶液a；在凉味剂中加入丙二醇、乙醇至完全溶解，再加入食用香精，混匀后得到溶液b；将溶液a倒入溶液b中，搅拌均匀，得到透
明溶液，加入植物甘油，混合均匀后，于25～35℃搅拌15min，然后置于阴凉室温处贮放3～15天，得到预防治疗流感的雾化液。将该雾化液倒入到喷雾瓶中，每喷约50～100μl，雾滴粒径为10～20μm。
[0100]
五、实施案例二：预防治疗流感的雾化液的制备及超声雾化给药应用
[0101]
一种预防治疗流感的雾化液，其重量百分比组成为：紫苏叶提取物5％、铁皮石斛提取物1％、市售罗汉果提取物0.1％、凉味剂(ws-23:ws-5为2:1)0.05％、柠檬味食用香精2％、山梨酸钾0.05％、丙二醇10％，余量为蒸馏水。
[0102]
将紫苏叶提取物、铁皮石斛提取物、罗汉果提取物、山梨酸钾混合均匀，加入灭菌后的蒸馏水，搅拌至溶解并采用0.45μm滤膜过滤得到溶液a；在凉味剂中加入丙二醇至完全溶解，再加入食用香精，混匀后得到溶液b；将溶液a倒入溶液b中，搅拌均匀，得到透明溶液，混合均匀后，于25～35℃搅拌15min，然后置于阴凉室温处贮放3～15天，得到预防治疗流感的雾化液。将该雾化液加入到雾化弹中，每弹1.5ml，将雾化弹插入到常温超声波雾化器中，口吸雾化弹嘴即产生雾化液，雾滴粒径为0.5～5μm，吸一口约10μl，雾化体积约30～50ml，口含雾滴5～10秒吸收后可以吞服或吐出雾气后用鼻腔吸。特点是：常温雾化，药液高度分散，吸收好；口感甜香，颠覆中药口服液的传统味道，用药顺应性好；既可用于流感预防治疗，又可作为抽烟的替代品。
[0103]
六、实施案例三：预防治疗流感的雾化液的制备及电子加热雾化给药应用
[0104]
一种预防治疗流感的雾化液，其重量百分比组成为：紫苏叶提取物5％、铁皮石斛提取物1％、市售罗汉果提取物0.5％、凉味剂(ws-23:ws-5:天然薄荷脑＝1:1:0.5)0.15％、话梅味食用香精15％、丙二醇22％、植物甘油41.35％，余量为蒸馏水。
[0105]
将紫苏叶提取物、铁皮石斛提取物、罗汉果提取物混合均匀，加入灭菌后的蒸馏水，搅拌至溶解并采用0.45μm滤膜过滤得到溶液a；在凉味剂ws-23、ws-5、薄荷脑中加入丙二醇至完全溶解，再加入食用香精，混匀后得到溶液b；将溶液a倒入溶液b中，搅拌均匀，得到透明溶液，加入植物甘油，混合均匀后，于25～35℃搅拌15min，然后置于阴凉室温处贮放3～15天，得到预防治疗流感的雾化液。将该雾化液装入雾化弹中，每弹1.5ml，将雾化弹插入到电子烟具中，打开开关，口吸雾化弹嘴时即产生雾化液，雾滴粒径为200～500nm，吸一口约10μl，雾化体积约50ml，口含雾滴5～10秒吸收后可以吞服或吐出。特点是：药液雾化，烟雾大，药液高度分散吸收；口感甜香、烟雾缭绕，整个吸抽过程完全克服了传统中药气味特殊、苦涩口感，颠覆中药的传统服药方式，提高了用药的顺应性；既可用于流感预防治疗，又可作为抽烟的替代品。
[0106]
七、实施案例一～实施案例三中雾化液的体外抗流感病毒有效性实验
[0107]
1.药液配制
[0108]
分别称取三种实施案例中的雾化液1000mg，分别用蒸馏水溶解定容至10ml，0.22μm微孔滤膜过滤，备用。用时用细胞维持培养基倍比稀释至所需浓度：20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml和1.25mg/ml。
[0109]
另备正常细胞对照组。
[0110]
2.雾化液对mdck细胞存活率实验
[0111]
细胞毒性试验结果见表5，结果显示，实施案例一～实施案例三中雾化液的实验浓度是安全的。
[0112]
表5实施案例一～实施案例三中雾化液对mdck细胞存活率的影响(％，n＝5)
[0113]
浓度/mg/ml案例一案例二案例三2093.30
±
3.1694.22
±
3.1496.10
±
5.061096.52
±
2.1094.93
±
3.2194.97
±
4.48599.45
±
3.5497.65
±
3.8295.46
±
2.632.598.64
±
4.19100.12
±
5.2594.58
±
3.121.25100.69
±
5.0899.38
±
5.54100.41
±
6.07
[0114]
3.雾化液抗流感病毒的有效率测定
[0115]
采用细胞先被流感病毒感染再给予药液的给药方式，检测不同雾化液的抗h1n1流感病毒的有效率，结果见表6。实施案例一～实施案例三中雾化液的主药用量一致，相关辅料用量有差异。从抗流感病毒的实验数据比较结果可知，三种雾化液均呈现剂量依赖性，当浓度为20mg/ml时，抗h1n1流感病毒的有效率达到90％以上。
[0116]
表6实施案例一～实施案例三中雾化液的抗h1n1流感病毒的有效率(％，n＝5)
[0117]