绞股蓝总苷颗粒中具有抑制PCSK9作用的皂苷类化合物的应用的制作方法

绞股蓝总苷颗粒中具有抑制pcsk9作用的皂苷类化合物的应用
1.本技术是申请号为2020112777401，申请日为2020年11月16日，发明名称“绞股蓝总苷颗粒中皂苷类化合物制备抑制pcsk9发挥降脂作用的药物中的应用”的分案申请。
技术领域
2.本发明涉及天然药物化学技术领域，具体涉及从湖南产地和广西产地绞股蓝中分离得到的达玛烷型三萜皂苷类化合物及其在制备抑制pcsk9发挥降脂作用的药物中的应用。


背景技术：

3.动脉粥样硬化(as(arteriosclerosis))和心血管疾病(cvd(cardiovascular disease))在全球范围都有极高的发病率和致死率，都是我国死亡的主要病因。高胆固醇血症是动脉粥样硬化和心脏病的主要危险因素，低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)已被确定为是一种独立且最有效的可改变心血管疾病发展的危险因素。
4.在过去20年中，他汀的使用已经成功地降低了心血管事件发生的风险。他汀类药物是一种3-羟基-3-甲基-戊二酰辅酶(hmgcr)(机体内胆固醇合成的限速酶)抑制剂，能够有效降低血液中ldl-c的含量，但他汀类药物仍然存在一些不足的地方，例如部分患者出现横纹肌溶解等不良反应，且大剂量他汀类药物使用时在抑制胆固醇合成的同时，升高了血浆前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9,proprotein convertase subtilisin/kexin type 9)水平，这大大削弱了他汀类药物的降脂活性，这种对pcsk9的增强作用存在剂量依赖关系。
5.pcsk9是前蛋白转化酶家族(pc)蛋白酶k亚家族成员，命名为前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)，主要在人肝脏细胞、小肠、肾等组织中表达。pcsk9是一种脂质代谢调节蛋白，通过结合肝细胞表面的低密度脂蛋白受体(ldl-r)，促进ldl-r的降解，减弱肝细胞对ldl-c的清除能力从而调节肝脏脂质代谢，升高血浆ldl-c水平。pcsk9被发现为除apob、ldl-r外第三个基因突变引起家族性高胆固醇血症的致病基因。目前临床上已经注册上市的针对pcsk9发挥降脂作用的药物只有单克隆抗体，但单克隆抗体具有价格昂贵、患者依从性差等缺点，并且其在三期临床实验中出现不良反应甚至严重不良反应的情况。因此，安全、有效、价格可接受的pcsk9抑制剂成为现阶段降脂治疗研究的热点。
6.绞股蓝[gynostemma pentaphyllum(thunb.)makino]为葫芦科(cucurbitaceae)绞股蓝属(gynostemma)多年生攀援草本植物，主要分布于中国、日本、朝鲜、印度和东南亚地带，在我国主产于陕西南部和长江以南广大地区，是除五加科以外罕见的含有人参皂苷的植物，被誉为“南方人参”。药理学研究表明，绞股蓝能有效地改善糖脂代谢，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、抗疲劳、保肝等广泛的药理作用，可用于糖尿病、肥胖症、血脂异常等多种代谢疾病的预防和治疗。截止目前已从绞股蓝中分离鉴定了大量并具有显著生物活性的化合物，如三萜皂苷、黄酮以及多糖等多种类型化合物。前期研究发现，绞股蓝总皂苷提取物可
通过抑制pcsk9发挥降脂活性(吴柳松,钱民章.绞股蓝总苷对pcsk9基因表达及辛伐他汀降血脂作用的影响,中国病理生理杂志,2017)。然而，不同产地的绞股蓝之间化学成分存在显著差异，且绞股蓝抑制pcsk9的具体活性成分并不明确。我们通过对湖南产地和广西产地绞股蓝化学成分和药理活性进行系统研究，以明确其降低pcsk9的活性物质，进一步发掘其药用价值。


技术实现要素：

[0007]
为了解决治疗高血脂症的一线药物——他汀类药物存在的升高pcsk9导致降脂活性降低问题，本发明提供了一种降低肝细胞分泌pcsk9的天然药物的应用。
[0008]
为了实现上述目的，本发明公开了绞股蓝的新用途，具体为湖南产地和广西产地绞股蓝中单体化合物降低肝细胞分泌pcsk9活性的应用。
[0009]
结构式1-13任一所述化合物在制备降低肝细胞分泌pcsk9药物中的应用
[0010]
[0011][0012]
优选为用药浓度为10um。
[0013]
优选结构式4、5、12-13的化合物。
[0014]
所述化合物为从湖南产地绞股蓝和广西产地绞股蓝中分离得到。
[0015]
结构式1-13任一所述化合物在制备降低肝细胞分泌pcsk9降脂药物中的应用。
[0016]
结构式1-13任一所述化合物与他汀类药物在制备降低肝细胞分泌pcsk9的药物中的应用。
[0017]
结构式1-13任一所述化合物与他汀类药物在制备降低肝细胞分泌pcsk9的降脂药物中的应用。
[0018]
所述他汀类药物为辛伐他汀。
[0019]
另外本发明还提供了新的达玛烷型三萜皂苷类化合物，结构式如式1-6所示的任意一种：
[0020][0021]
所述的达玛烷型三萜皂苷类化合物为从湖南产地绞股蓝和广西产地绞股蓝中分离得到。
[0022]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
[0023]
1.本发明的新的达玛烷型皂苷类化合物自湖南产地和广西产地绞股蓝全草中提取、分离、纯化得到。
[0024]
2.本发明的湖南产地和广西产地绞股蓝中部分单体化合物对肝细胞分泌pcsk9具有不同程度的抑制活性，从而达到单独降脂或协同他汀类药物增强其降脂效果的目的。
[0025]
3.本发明公开了湖南产地和广西产地绞股蓝中部分单体可用于协同他汀类药物用于高脂血症治疗的应用。
[0026]
4.绞股蓝在中医药治疗体系以及现代中成药临床应用中具有悠长的使用历史，其降血脂的活性以及药物安全性有临床保障。
附图说明
[0027]
图1：实施例2中湖南产地和广西产地绞股蓝中部分单体在20μm浓度用药的条件下对肝细胞分泌pcsk9具有降低活性。
[0028]
图2：实施例3中湖南产地和广西产地绞股蓝中部分单体在10μm浓度用药的条件下对肝细胞分泌pcsk9具有降低活性。
[0029]
图3：实施例3中绞股蓝总苷在50μg/ml浓度的条件下hepg2细胞分泌pcsk9水平的活性。
具体实施方式
[0030]
下面结合附图和实施例具体介绍本发明实质性内容。但本发明并不限于以下实施方式。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从公开商业途径获得。
[0031]
湖南产地和广西产地绞股蓝中部分单体化合物能够在hepg2水平上降低乏脂蛋白血清与辛伐他汀联合诱导的高pcsk9表达的活性，达到更好的降脂作用。
[0032]
为探索湖南产地和广西产地绞股蓝中单体化合物对高表达pcsk9细胞模型的活性，开展体外细胞实验，检测pcsk9蛋白的表达，采用elisa试剂盒实验验证湖南产地和广西产地绞股蓝中单体化合物对pcsk9高表达模型的作用。
[0033]
在本发明的一个优选实施方式中，所述病理特点为pcsk9的高表达，所述的细胞为人肝癌细胞hepg2。具体实施方式的实验结果表明，在细胞水平上，湖南产地和广西产地绞股蓝中的部分单体对pcsk9具有显著降低活性，这表明湖南产地和广西产地绞股蓝中的成分具有较好的协同他汀类药物降脂的活性。
[0034]
实施例1湖南产地和广西产地绞股蓝中单体化合物的制备方法
[0035]
分别取两产地绞股蓝药材，煎煮法提取两次，每次采用8倍量水提取2h，合并提取液，过滤，浓缩，即得绞股蓝总皂苷提取物。取绞股蓝总皂苷提取物，用8倍量甲醇超声提取5次，每次20min，合并滤液，减压浓缩，得甲醇可溶部分。将甲醇可溶部分浸膏适量，经减活硅胶柱色谱，以三氯甲烷-甲醇-水(100:0:0
→
0:100:0)梯度洗脱，tlc检视，合并得5个流分(fr.a～fr.i)。再分别进行反复硅胶、ods、sephadex lh-20柱层析、flash快速制备和半制备高效液相得化合物1～24，化合物结构式如下所示：
[0036]
[0037][0038]
新化合物1-6(结构式1-6)的理化性质和光谱数据如下：
[0039]
化合物1：白色无定型粉末，ir(kbr)cm-1
:3370,2915,1594,1077，uvλ
max
(ch3oh):201nm，hr-esi-ms m/z 1117.5756[m+na]
+
(c
53h90
nao
23
,calcd.1117.5771)，1h nmr(c5d5n,500mhz)和
13
c nmr(c5d5n,125mhz)见表1和表2，未见文献报道，为新化合物；
[0040]
化合物2：白色无定型粉末，ir(kbr)cm-1
:3395,2918,1599,1077，uvλ
max
(ch3oh):202nm，hr-esi-ms m/z 1085.5858[m+na]
+
(c
53h90
nao
21
,calcd.1085.5872)，1h nmr(c5d5n,500mhz)和
13
c nmr(c5d5n,125mhz)见表1和表2，未见文献报道，为新化合物；
[0041]
化合物3：白色无定型粉末，ir(kbr)cm-1
:3363,2937,1597,1041，uvλ
max
(ch3oh):202nm，hr-esi-ms m/z 1231.6431[m+na]
+
(c
59h100
nao
25
,calcd.1231.6451)，1h nmr(c5d5n,500mhz)和
13
c nmr(c5d5n,125mhz)见表1和表2，未见文献报道，为新化合物；
[0042]
化合物4：白色无定型粉末，ir(kbr)cm-1
:3397,2920,1659,1079，uvλ
max
(ch3oh):200nm，hr-esi-ms m/z 1221.6276[m-h]-(c
59h97o26
,calcd.1221.6268)，1h nmr(c5d5n,500mhz)和
13
c nmr(c5d5n,125mhz)见表1和表2，未见文献报道，为新化合物；
[0043]
化合物5：白色无定型粉末，ir(kbr)cm-1
:3397,2921,1659,1078，uvλ
max
(ch3oh):201nm，hr-esi-ms m/z 1239.6373[m-h]-(c
59h99o27
,calcd.1239.6374)，1h nmr(c5d5n,500mhz)和
13
c nmr(c5d5n,125mhz)见表3和表4，未见文献报道，为新化合物；
[0044]
化合物6：白色无定型粉末，ir(kbr)cm-1
:3397,2920,1659,1078，uvλ
max
(ch3oh):200nm，hr-esi-ms m/z 915.5326[m-h]-(c
47h79o17
,calcd.915.5317)，1h nmr(c5d5n,500mhz)和
13
c nmr(c5d5n,125mhz)见表3和表4，未见文献报道，为新化合物；
[0045]
表1化合物1～4苷元的nmr数据(c5d5n,j in hz)
[0046][0047][0048]
a)
measured at 500mhz；
b)
measured at 125mhz；
c)
overlapped signals.
[0049]
表2化合物1～4糖基的nmr数据(c5d5n,j in hz)
[0050][0051][0052]
a)
measured at 500mhz；
b)
measured at 125mhz；
c)
overlapped signals；glc:glucopyranosyl；ara:arabinopyranosyl；
[0053]
rha:rhamnopyranosyl；xyl:xylopyranosyl.
[0054]
表3化合物5和6苷元的nmr数据(c5d5n,j in hz)
[0055][0056]
a)
measured at 500mhz；
b)
measured at 125mhz；
c)
overlapped signals.
[0057]
表4化合物5和6糖基的nmr数据(c5d5n,j in hz)
[0058][0059][0060]
a)
measured at 500mhz；
b)
measured at 125mhz；
c)
overlapped signals；glc:glucopyranosyl；rha:rhamnopyranosyl；xyl:xylopyranosyl.
[0061]
实施例2湖南产地和广西产地绞股蓝中部分单体化合物在20μm用药浓度的条件下对hepg2细胞具有显著的pcsk9降低活性
[0062]
将人肝癌细胞(hepg2)分为若干组，每组有三个平行孔，按每孔接种1*105个细胞接入12孔板，用含有10％胎牛血清的dmem低糖培养基培养，在5％co2的37℃培养箱中实施；
接种细胞后对这若干组细胞分别按照如下方法处理：第1组为空白组，用含有5％胎牛血清(fbs)的dmem低糖培养基培养，第2组为模型组，用含有5％乏脂蛋白血清(lpds)的dmem低糖培养基培养，其后的若干组分别为不同单体化合物的给药组(20μm)，用含有5％lpds的dmem低糖培养基培养，空白组处理48h，模型组和给药组用含有5％lpds的dmem低糖培养基培养23h后加入辛伐他汀(1μm)，模型组继续培养25h，给药组在辛伐他汀作用1h后加入不同单体化合物(20μm)作用24h。以上若干组细胞按上述方法处理后，收集培养基，按照elisa试剂盒说明进行处理测定。结果如图1所示。
[0063]
图1表示湖南产地和广西产地绞股蓝中部分单体化合物在20μm给药浓度的条件下具有降低乏lpds与辛伐他汀(1μm)联合诱导hepg2细胞分泌pcsk9水平的活性。
[0064]
实施例3湖南产地和广西产地绞股蓝中部分单体化合物在10μm用药浓度条件下以及绞股蓝总苷对hepg2细胞具有显著的pcsk9降低活性
[0065]
将人肝癌细胞(hepg2)分为若干组，每组有三个平行孔，按每孔接种1*105个细胞接入12孔板，用含有10％胎牛血清的dmem低糖培养基培养，在5％co2的37℃培养箱中实施；接种细胞后对这若干组细胞分别按照如下方法处理：第1组为空白组，用含有5％fbs的dmem低糖培养基培养，第2组为模型组，用含有5％lpds的dmem低糖培养基培养，其后的若干组分别为不同单体化合物的给药组(10μm)或总苷(50μg/ml)用含有5％lpds的dmem低糖培养基培养，空白组处理48h，模型组和给药组用含有5％lpds的dmem低糖培养基培养23h后加入辛伐他汀(1μm)，模型组继续培养25h，给药组在辛伐他汀作用1h后加入不同单体化合物(10μm)作用24h。以上若干组细胞按上述方法处理后，收集培养基，按照elisa试剂盒说明进行处理测定。结果如图2和图3所示。
[0066]
图2表示湖南产地和广西产地绞股蓝中部分单体化合物在10μm给药浓度的条件下具有降低lpds与辛伐他汀(1μm)联合诱导hepg2细胞分泌pcsk9水平的活性。
[0067]
图3表明绞股蓝总苷在50μg/ml浓度的条件下具有降低lpds与辛伐他汀(1μm)联合诱导hepg2细胞分泌pcsk9水平的活性。有研究表明，在动物水平上他汀在降脂的同时能够升高pcsk9蛋白和mrna的表达，而应用绞股蓝总苷可显著降低pcsk9的蛋白表达。但是因为绞股蓝药材产地较多、基源混乱，不能确证不同来源的绞股蓝总苷提取物均具有该效果。本专利说明了，本实验所用绞股蓝总苷在细胞实验中可以降低他汀导致的pcsk9水平升高，与前期动物实验结果报道一致。本专利基于系统性研究分析，首次发现了细胞水平显著降低pcsk9水平的活性单体化合物，尤其是低浓度(10μm)即显示优良活性的单体化合物。这个结果提示，本专利中描述的活性单体化合物是绞股蓝抑制pcsk9表达的活性物质，且活性优于总苷。
[0068]
显然，上述实施例的作用在于清楚具体地说明本发明的内容，并非对实施方式的限定。对于本发明所属领域的技术人员来说，在本发明所述内容的基础上还可以进行其它不同形式的变动。本发明无需也无法对所有的实施方式予以穷举。故由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。