一种促修复载药纳米纤维膜的制备方法

1.本发明属于医药领域，涉及落新妇苷纳米纤维膜的制备方法及其用途。


背景技术：

2.皮肤可以通过提供电解质平衡、热量调节、蒸发水分和微生物控制等方法，充当人体的保护屏障。皮肤产生病变会损害皮肤功能的发挥，皮肤一旦受损，就会触发分子和细胞机制来恢复受伤区域。伤口愈合是一种常见的生物学过程，包括伤口出血、炎症反应和组织重塑，其中的炎症反应、血管生成和细胞募集起重要调节作用。
3.自噬是一种机体自我保护的途径，可将细胞内大分子废物输送到溶酶体，在溶酶体中它们被降解为具有生物活性的氨基酸等单体物质，随后被重新利用以维持细胞代谢更新和体内平衡。近年来，自噬对皮肤愈合的影响越来越受到关注。自噬可通过控制皮肤稳态参与内源性防御机制，因此调节自噬可能有助于治疗皮肤屏障功能障碍。落新妇苷(asb)是一种黄酮苷，过去的研究表明，asb具有抑制炎症、调节角质细胞增殖分化、抑制多种细菌和真菌生长以及抗氧化的作用。因此，我们推测asb可能对皮肤伤口愈合有一定的促进作用。在本发明中，我们将asb掺入纳米尺寸的生物相容性载体中对小鼠创伤部位进行治疗，并公开其其纳米纤维膜的制备方法和皮肤修复的作用。


技术实现要素：

4.本发明将落新妇苷与壳聚糖、聚乙烯吡咯烷酮通过静电纺丝的方法，获得负载落新妇苷的纳米纤维膜；通过对落新妇苷纳米纤维膜调控皮肤伤口菌群的研究，确定落新妇苷能够调控皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群丰富度、多样性和均匀度；因此，本发明的第一个目的在于：提供落新妇苷的新用途，具体为：落新妇苷在制备调控皮肤菌群结构的药物和/或化妆品中的应用。
5.作为本发明的优选，落新妇苷的新用途为：所述落新妇苷在制备调控受损皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群丰富度、多样性的药物和/或化妆品中的应用。
6.作为本发明的优选，落新妇苷的新用途为：所述落新妇苷在制备调控受损皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群均匀度的药物和/或化妆品中的应用。
7.作为本发明的优选，落新妇苷用于调控皮肤菌群结构时，落新妇苷是负载在纳米纤维膜内，之后通过贴敷的方式贴在皮肤上。
8.另外，本发明对落新妇苷纳米纤维膜通过诱导自噬途径促进创伤皮肤的修复进程进行研究，确定落新妇苷纳米纤维膜是通过激活mapk介导的自噬途径而促进创伤皮肤修复；因此，本发明的第二个目的在于：提供一种mapk介导的自噬信号通路激活剂，该激活剂包括负载落新妇苷的纳米纤维膜。
9.本发明通过落新妇苷纳米纤维膜对创面组织中vegf、hif-a、pan-keratin及cd31的影响进行研究，确定落新妇苷通过促进受伤组织中血管生成而加速创面修复；因此，本发明的第三个目的在于：提供一种促进受伤组织中血管生成药物，该药物包括负载落新妇苷
的纳米纤维膜。
10.本发明通过落新妇苷纳米纤维膜对小鼠皮肤创面伤口愈合的影响进行研究，确定含有落新妇苷纳米纤维膜的样品有利于创伤修复；另外，通过对小鼠皮肤伤口愈合的组织病理学分析，发现经过落新妇苷纳米纤维膜处理后，少量新生表皮生成，皮下毛囊、皮脂腺饱满，表皮光滑，胶原密度大，排列均匀致密；进一步证实，落新妇苷纳米纤维膜处理可加速伤口创面表皮生成，在皮肤修复过程中表现出良好的促进作用；因此，本发明的第四个目的在于：提供一种促进皮肤伤口修复的方法，该方法为：在皮肤伤口处贴敷含有落新妇苷的纳米纤维膜的药物。
11.本发明第五个目的在于：提供一种负载落新妇苷纳米纤维膜的制备方法，该方法包括以下步骤：(1)称取聚乙烯吡咯烷酮溶于90％的乙酸中均匀搅拌为4wt％的溶液，再加入等量的壳聚糖粉末在磁力搅拌器下均匀混合，随后加入落新妇苷，放入磁力搅拌水浴锅中50℃搅拌24h，使用超声震动脱泡，静置30分钟，配制成为9-12 wt％的溶液；(2)以锡箔纸为基材，将配置好的溶液倾倒入针管内，采用0.6ml/h的注射推进速度，高压电源电压18-22kv之间，接收距离15-21 cm之间，在金属滚筒上收集落新妇苷复合纳米纤维膜，收集完毕后，取下滚筒上的纳米纤维膜，真空烘干器37℃干燥24 h，得到落新妇苷纳米纤维膜。
12.本发明的优点和有益效果：（1）本发明通过实验证实了落新妇苷能够调控受损皮肤菌群结构，提高受损皮肤菌群丰富度、多样性和均匀度，同时还能够促进有益菌的生长，该新用途的发现为皮肤感染性疾病的治疗提供了新的方法和有利依据。
13.（2）本发明提供了一种全新的mapk介导的自噬信号通路激活剂，其为mapk介导的自噬信号通路参与的疾病的治疗提供了新的方法。
14.（3）本发明提供的一种落新妇苷纳米纤维膜的制备方法，该方法操作简便、生产成本低、收率高。
附图说明
15.图1电压和距离对纳米纤维膜拉伸强度的响应面和等高线图图2电压和纺丝液浓度对纳米纤维膜拉伸强度的响应面和等高线图图3 距离和纺丝液浓度对纳米纤维膜拉伸强度的响应面和等高线图图4距离和电压对纳米纤维膜断裂伸长率的响应面和等高线图图5纺丝液浓度和电压对纳米纤维膜断裂伸长率的响应面和等高线图图6距离和纺丝液浓度对纳米纤维膜断裂伸长率的响应面和等高线图图7 asb粉末sem形貌，pvp/cs、pvp/cs/asb纳米纤维sem形貌及纤维直径分布图图8聚乙烯吡咯烷酮、壳聚糖、落新妇苷、聚乙烯吡咯烷酮/壳聚糖及聚乙烯吡咯烷酮/壳聚糖/落新妇苷的红外光谱图图9 pvp、cs、pvp/cs纳米纤维膜、pvp/cs/asb纳米纤维膜在空气中的tga曲线图10 pvp、cs、pvp/cs纳米纤维膜、pvp/cs/asb纳米纤维膜的xrd谱图图11 pvp/cs/asb 纳米纤维的接触角图像
图12pvp/cs/asb纳米纤维的抗氧化活性图13asb对小鼠皮肤伤口愈合(a)和伤口愈合面积(b)的影响图14asb对小鼠愈合皮肤组织中h&e，masson染色的影响图15落新妇苷小鼠创面中vegf、cd31、hif-1α和pan-keratin蛋白水平的影响图16落新妇苷对小鼠皮肤组织中炎症因子的影响图17落新妇苷对小鼠皮肤组织中erk，jnk和p38水平表达的影响图18落新妇苷对小鼠皮肤组织中自噬相关蛋白水平表达的影响图19样品的稀疏曲线。a：chao1指数曲线；b：shannon指数曲线；c：simpson指数曲线；d：pielou’sevenness指数图20小鼠皮肤微生物群多样性和组成的影响图21落新妇苷对皮肤菌群alpha多样性的影响图22落新妇苷对皮肤菌群组成影响。a：属水平群落图；b:门水平群落图。
具体实施方式
16.下面结合附图和具体实施例来进一步说明本发明，但本发明的实施方式不限于此。对于未特别注明的工艺参数，可参照常规技术进行。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
17.实施例1落新妇苷纳米纤维膜的制备1材料与方法1.1药品与试剂聚乙烯吡咯烷酮(pvp，mw=630000)购自广州奥化化工科技有限公司。脱乙酰度99%的粉状壳聚糖(mw~400,000)购自国药集团化学丽晶有限公司。落新妇苷(含量≥95.8%)。冰乙酸(ch3cooh)分析纯(乙酸含量≥99.5%，天津市大茂化学试剂厂)。
18.1.2仪器及设备电子天平，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；磁力搅拌水浴锅，金坛良友仪器有限公司；静电纺丝设备，北京永康乐业科技发展有限公司；高压直流电源，天津东文高压电源有限公司；拉力试验机，mxl-100，上海台硕有限公司；1.3实验方法1.3.1纺丝液的配备按设计方案用电子天平称取pvp、cs、asb粉末，用90%乙酸作为溶剂混合，装入密封玻璃瓶中，放入磁力搅拌水浴锅中50℃搅拌24h，制备出混合溶液，充分溶解后，使用超声震动脱泡，静置30分钟。
19.1.3.2pvp/cs/asb纳米纤维膜的制备将配置好的溶液倾倒入针管内，针头与高压电正极相连，金属滚筒与负极连接，电源开启后，采用0.6ml/h的注射推进速度，高压电源电压18-22kv之间，接收距离15-21cm之间，连接好设备后，进行通电，在金属滚筒上收集asb复合纳米纤维膜，每张纳米纤维膜使用10ml纺丝液，当所有纺丝液都被收集器接收后，关闭电源。静置2分钟，等待空气中的溶液挥
发完全，取下滚筒上的pvp/cs/asb纳米纤维膜。真空烘干器37℃干燥24 h，使纳米纤维膜完全干燥。随后，将干燥的pvp/cs/asb纳米纤维膜裁成长方形(30mm
×
4mm)，每张纤维膜裁3份，准备后续检测。
20.将纳米纤维膜制成30mm
×
4mm的条状样品，用mxl-100型拉力试验机(上海台硕) 在室温(23
°
c)下测定和评估纳米纤维样品的机械性能，将样品装入夹具内固定，以10mm/min的应变率进行拉伸，直至断裂。每个样品试验3次，取平均值。
21.1.3.4响应面法实验因素设计根据design expert 8.0.6 trial响应面分析软件及box-behnken的中心组合原理，结合单因素实验结果，选择电压 (a)、纺距 (b)、纺丝液浓度(c)、3个因素为独立变量，以机械强度和断裂伸长率作为响应值，见表1。
22.其中-1代表低水平，0代表中水平，1代表高水平。根据单因素实验获得的结果，选取的变量范围如下：纺丝液浓度为9-12%，纺丝距离为15-21cm，纺丝电压为18-22kv。在三因素二水平基础上对纤维进行优化，以此建立模型。
23.表1 响应面设计方案的因素和水平编码2结果2.1单因素实验2.1.1纳米纤维纺丝液配比对纤维的影响。
24.pvp/cs/asb纺丝液的质量分数为9%、10%、11%、12%，其他工艺条件保持统一，并对不同浓度的纺丝液进行静电纺丝，测得纤维膜的变化见表2。
25.表2 不同溶液浓度对纳米纤维的影响表2给出了不同浓度下pvp/cs/asb复合纳米纤维膜的拉伸强度和拉伸断裂率的变化。结果表明，拉伸强度和断裂伸长率在纺丝溶液浓度为11%时最大。我们推测，开始溶液浓度升高、黏度增加，纳米纤维的结构相对致密，孔隙较少。分子间作用力大，拉伸所用的力大。当浓度持续升高，纤维因浓度升高而变粗，纳米纤维膜的致密度有所降低，测出的拉伸强度和断裂伸长率也有所减少。通过结果我们推测，在10%的浓度下，纳米纤维的机械强度较好。
26.2.1.2纳米纤维纺丝距离对纤维的影响装有纺丝液的针管放置在与接收滚筒不同的距离, 即纺距为9cm、12cm、15cm和18cm，其他工艺条件保持统一，进行静电纺丝，测得纤维膜的变化见表3。
27.表3 不同纺距对纳米纤维的影响从表3可以看出，纺丝距离对纳米膜的平均直径、拉伸强度、拉伸断裂率有明显的影响。纺丝距离增加，纤维的拉伸强度和断裂伸长率在纺距为18cm时最高。起初，距离增加导致溶液喷射后在电场中移动的路程增加，电场力充分拉伸了纤维。由于拉伸时间长，纤维大分子排列整齐，因此拉断纤维需要的力增大。随着距离的逐渐增加，电场强度有所减弱，大分子内部排列无序，纤维方向受电场力的影响小，强度下降。当纺丝距离为18cm时，抗拉强度和拉伸断裂率最高。
28.2.1.3纳米纤维纺丝电压对纤维的影响在不同的电压下进行纳米纤维的制备，其中电压条件的选取为14、16、18和20kv，其他的工艺条件恒定，在此条件下进行静电纺丝，测得纤维膜两水平的变化见表4。
29.表4 不同电压对纳米纤维的影响结果显示，电压增加，纳米纤维的结晶度增加，拉伸强度增加，纤维受到电场力的拉伸而变细，纤维更加致密，因此拉伸强度和断裂伸长率增加。但电压持续增大时，纤维产生不均匀的串珠，可纺性变差，纤维杂乱无序，拉伸强度和断裂伸长率均有所降低。在纺丝电压在20kv时，拉伸强度和拉伸断裂率最高。
30.2.2 box-behnken试验设计及结果采用design expert中的box-behnken空间边缘中心点组合设计，pvp/cs/asb 纳米纤维膜的强度与纺丝液浓度、纺丝电压和接收距离的拟合回归方程如下：r
1 =24.71-1.91a-0.86b+0.079c-1.28ab-0.45ac-0.43bc-6.56a
2-2.25b
2-2.25c2r
2 =23.74-1.70a-0.87b+0.87c-0.42ab-2.26ac+1.81bc-4.08a2-3.77b2-4.41c2表5 响应面box-behnken实验设计及结果
2.2.1方差分析对静电纺丝制备的纳米纤维膜的抗拉强度和伸长率数值进行多元回归方差分析，见表6、表7。其中*p＜0.05为显著，**p＜0.01为极显著。
31.表6 抗拉强度回归模型方差分析表7断裂伸长率回归模型方差分析
由表6可知，方差来源a、ab、a2、b2、c2对于抗拉强度来说影响极显著(p＜0. 001)，b对抗拉强度的影响显著(p＜0. 05)，其余因素对抗拉强度的影响不显著。比较均方值可知，a对抗拉强度的参数影响最大，其次是b，c最小，交互作用通过响应曲面的陡峭程度也有所展现，ab的曲面最陡峭，ac，bc次之，即ab＞ac＞bc。由表7可知，a2、b2、c2对伸长率的影响极显著(p＜0. 01)，a和ac两个因素对伸长率的影响较显著(p＜0. 05)，比较均方值大小可知，影响断裂伸长率程度的工艺参数排序为a＞c＞b，交互作用影响程度由高到低的排序为ac＞bc＞ab。
32.2.2.2响应曲面分析根据上述响应面回归模型作各因素的交互作用的响应曲面和等高线图，表明交互作用对拉伸强度和断裂伸长率的影响较为显著，见图1-6，通过以上响应面试验对三个因素进行工艺优化，条件为电压19.8kv、纺丝距离为17.91cm、纺丝液浓度为10.2%。在此条件下得到纳米纤维膜的拉伸强度和断裂伸长率为24.2307mpa和23.9042%。
33.为确定回归模型建立结果与实际值是否相符，在此条件下对模型进行验证，三次平行实验后得到的拉伸强度和断裂伸长率为23.9562mpa和24.0325%。说明实验值和预测值相对误差为0.2781 mpa和0.1283%，误差相对较小，说明该二次方程预测效果较好。
34.3小结得出结果为电压19.8kv、距纺丝离为17.91cm、纺丝液浓度为10.2%最佳条件。在最优条件下进行静电纺丝，得到载药纤维拉伸强度和断裂伸长率为24.2307mpa和23.9042%。
35.实施例2落新妇苷纳米纤维膜的表征及抗氧化性能1材料与方法1.1实验试剂dpph、abts试剂，福州飞净生物科技有限公司c7h6o3，c2h5oh，feso4，h2o2，c6h6o3 ，hcl等试剂，北京试剂厂1.2实验仪器发射扫描电子显微镜，su8010，日本日立公司傅里叶变换-红外辐射光谱仪，nexus870，美国尼高力仪器公司热重测试分析仪，hcr-2，中国北京恒久仪器x射线衍射仪，ssx-550，日本岛津公司光学接触角测量仪，sl200ks，美国科诺工业有限公司
1.3纳米纤维的表征1.3.1扫描电镜测试将制备好的样品真空烘干，用导电胶把样品粘在样品台，随后用真空镀膜仪喷金。喷金后的样品放入测试仪拍摄，拍摄后的纳米纤维用image-j软件测定纤维直径，观察样品的微观表面形貌，其中纳米纤维样品每个纤维样品随机取100个不同部位进行平均直径的计算。
36.1.3.2结构变化傅里叶红外光谱(ftir)用于识别样品中存在的官能团的振动。样品与溴化钾烘干24h后，将其放入研钵中研磨均匀，进行压片。随后将压片进行测试，扫描范围为400-4000cm-1，用于获得pvp、cs、asb粉末和pvp/cs、pvp/cs/asb纳米纤维的光谱。
37.1.3.3热性能测试样品真空干燥后，利用热重分析仪测试纳米纤维的热稳定性以及纳米纤维可能分解和结晶的温度。加热速率为10
°
c/min，环境温度从室温加热到600
°
c进行测量。所有运行均在氮气气氛下进行，以防止任何热氧化反应。
38.1.3.4 x射线衍射测试样品真空干燥后，制备成直径为2.5cm的圆形，随后用x射线衍射仪分析样品。所述衍射仪的条件为电压40kv，电流40ma，扫描角度10
°‑
80
°
，扫描时长2小时，扫描区域内用cukα辐射来记录xrd图案。
39.1.3.5水接触角测试水接触角测试用于评价载药纳米纤维膜的亲水性。使用光学接触角测量仪在室温下测量水接触角及膜的湿润性，滴加适量生理盐水到平整的纳米纤维膜表面。从水滴滴落开始记录，直到水接触角不再发生明显变化，停止记录。
40.1.3.6载药纳米纤维膜的水蒸气透过率测试测量pvp/cs/asb纳米纤维膜的水蒸气透过率。向瓶中加入去离子水，然后将样品覆盖在瓶口(直径:1.3厘米)。干燥的样品远离水，用封口膜密封瓶口周围的样品边缘。该装置被放置在保持在30℃，相对湿度35%。测量装置随时间(w)的重量损失(水损失)，并通过以下等式计算膜的水蒸气透过率(wvtr)。
41.其中w为重量损失(g)；s为瓶口面积(m2)，t为时间间隔(天)。
42.1.4纳米纤维膜的抗氧化活性自由基是体内无处不在的生物代谢产物，抑制自由基失衡十分重要。本章将落新妇苷纳米纤维膜的dpph、abts+、羟基自由基、超氧阴离子及fe3+总还原力等几方面测定了落新妇苷纳米纤维膜的抗氧化活性。
43.1.4.1 dpph 自由基清除率的测定方法称取dpph粉末，用无水乙醇溶解并定容，避光保存。纳米纤维膜用无水乙醇溶解作为样品液。取dpph溶液2ml，加无水乙醇1ml，测得的值为a0(a0在0.8-1.0之间)。取dpph溶液2ml，加相应有机溶剂后，再加入样品液，有机溶剂和样品总体积为1ml，混合测得的值为a值 (所有实验均在预试后进行)。计算公式如下：
1.4.2 abts自由基清除测定方法将abts二铵盐储备液和k2s2o8储备液混合，避光放置12小时，此溶液作为abts工作液。abts工作液0.8ml与无水乙醇0.2ml稀释混合为空白对照组，检测的吸光度值为a0(a0宜在0.70
±
0.02)。无水乙醇和pvp/cs和pvp/cs/asb样品液混合后，加入abts工作液0.8ml，反应液总体积为1 ml，测得的吸光度值为a (所有实验均在预试后进行)。计算公式如下：1.4.3羟基自由基清除测定方法取不同浓度pvp/cs和pvp/cs/asb纳米纤维膜乙醇溶液于试管中，依次加入6 mmol/l水杨酸-乙醇溶液，2 mmol/l feso4溶液和1mmol/l h2o2溶液。混匀后37℃水浴30min，在510nm处检测有特殊吸收的2,3-二羟基苯甲酸，测得样品吸光度值为ai，以无水乙醇代显色剂测吸光度测定吸光度a值为a0，以蒸馏水代替样品溶液作为空白组，测定吸光度a值为aj。计算公式如下：1.4.4超氧阴离子及fe3+清除测定方法取60μl的tris-hcl(50 mmol/l)溶液、与30μl的不同浓度样品液和15μl的邻苯三酚-hcl(3 mmol/l)溶液混匀， 25
°
c条件下水浴5 min，加入10μl的hcl10 mol/l)，反应结束后，在420 nm下检测样品的吸光度值。测试样品为pvp/cs和pvp/cs/asb纳米纤维膜溶液。蒸馏水为空白对照组测得的吸光为a0，待测管吸光度为a1，用等量蒸馏水代替邻苯三酚-hcl溶液的吸光度为a2。计算公式如下：2实验结果2.1纳米纤维膜表征结果2.1.1pvp/cs/asb纳米纤维膜的微观形貌由图7扫描电镜图可以观察到asb粉末、pvp/cs纳米纤维和pvp/cs/asb纳米纤维的微观形貌。通过扫描电子显微镜可以观察到静电纺丝将asb粉末载入到了纳米级的纤维中。其中pvp/cs/asb纳米纤维具有更好的纤维微观结构，合成的pvp/cs纳米纤维的平均直径为302.96
ꢀ±
66.45nm，所得载药纤维平均直径为350.01
±
78.47nm。都属于纳米级的纤维，这种细密的结构可以模拟细胞外基质的某些结构特征，能够为细胞粘附、增殖、分化和改善伤口部位的皮肤组织再生提供更好的环境。
44.2.1.2红外光谱(ftir)pvp、cs、asb样品粉末和pvp/cs、pvp/cs/asb纳米纤维的ftir光谱如图8所示。ftir光谱被认为是分析固相结构的有效工具，因为 ftir光谱可以提供纳米纤维中pvp、cs和asb之间相互作用关系的信息。asb的红外谱图结果观察到，在1641cm-1处的强吸收峰为c=o伸
缩振动。此外，在800~1500cm-1处发现了许多特征峰，这是芳香族化合物的弯曲和拉伸以及-oh酚性弯曲的结果。在3443 cm-1附近的宽而强的谱带归因于壳聚糖中-nh和-oh的伸缩振动峰。在1665、1440、1370 和 1290 cm-1处观察到pvp的ftir特征吸收峰，这归因于-c=o的振动、-oh弯曲、内酯结构和-cn-的分别拉伸。观察到共混纳米纤维具有cs、pvp和 asb的红外特征，通过没有新的峰出现可知在cs分子中3400cm-1和3328cm-1处为o-h和n-h键的伸缩振动的多重吸收峰，1644cm-1处为乙酰基的吸收振动峰，这是由于壳聚糖未完全脱去乙酰基团，1022cm-1处为c-o伸缩振动。混体系中,各自组分没有明显改变。pvp/cs/asb纳米纤维中加入asb后，由于特征波段叠加，asb“指纹”区域原有的复杂特征峰被遮盖。总体来说，由ftir结果分析可知,在落新妇苷、壳聚糖和聚乙烯吡咯烷酮共混体系中,各自组分没有明显改变。pvp/cs/asb纳米纤维中加入asb后，由于特征波段叠加，asb“指纹”区域原有的复杂特征峰被遮盖。
45.2.1.3热性能分析图9是pvp、cs、asb样品粉末和pvp/cs、pvp/cs/asb纳米纤维的热稳定性曲线。pvp和cs在没有氧气的热解过程中，仅表现出一个质量损失。pvp与cs混合后，pvp/cs复合纳米纤维的开始分解温度升高, 这可能是因为pvp的加入影响了壳聚糖的结晶结构,导致了热稳定性的增加。pvp/cs/asb的热分解行为也表现为失重分解过程，在100-200℃附近时的初始重量损失，主要归因于水分蒸发和各种溶剂的挥发。与pvp/cs纳米纤维相比，pvp/cs/asb的热分解较平缓，失重温度也有所增加，说明添加asb可以增强pvp/cs/asb混合纳米纤维的热稳定性。
46.2.1.4 x射线衍射分析图10为原材料和纳米纤维样品的x射线衍射图谱。该图谱能够研究晶体结构的变化，落新妇苷在5-45
°
有明显的晶体衍射峰，具有晶体结构特征。而在pvp/cs、pvp/cs/asb复合纳米纤维中晶体衍射峰消失，可能是由于纳米纤维体系中各组分相互作用强，在静电纺丝过程后结晶状态发生变化，特征峰消失，纳米纤维样品观察到宽峰。
47.2.1.5水接触角分析从图11可以明显看出，液滴在2.2秒内迅速进入pvp/cs/asb样品，接触角由103.727
±
2.0
°
降低到9.961
±
2.7
°
。由于 pvp/cs/asb 的孔隙率高、吸收能力强，液滴立即被吸收。上述结果表明，负载asb的纳米复合纤维具有亲水性，利于组织吸收。
48.2.1.6水蒸气透过率分析水蒸气透过率好的伤口敷料有利于伤口愈合。在模拟体表环境条件下测量了未覆盖纳米纤维膜的对照组和覆盖了纳米纤维膜的样品组的水蒸气透过率。对照组、pvp/cs组、pvp/cs/asb组的水蒸气透过率分别为8120g/m2/d、6025 g/m2/d 、6329g/m2/d。结果表明pvp/cs和pvp/cs/asb纳米纤维膜都能够保持湿润的环境和适当的气体交换，从而对伤口愈合有利。水蒸气透过率的相比于对照组的降低可能归因于纤维膜有一定的厚度，小分子在通过纳米纤维膜时的阻力大，导致透湿透气性有所降低。但是总体来说，静电纺丝制备的 pvp/cs/asb纳米纤维膜具有良好的透气性，有成为优质的伤口敷料的潜力。
49.2.2纳米纤维膜抗氧化活性使用抗氧化分析法研究了纳米纤维在负载asb前后的抗氧化活性，如图12所示。pvp/cs/asb 纳米纤维清除的dpph、abts、羟基自由基和超氧阴离子活性分别为 87.98%、
93.36%、99.48% 和92.10%。结果表明，静电纺丝负载asb能够显著提升pvp/cs纳米纤维的抗氧化活性，并表现出较好的抗氧化能力。并且说明asb在纤维生产过程中经受高电位后抗氧化能力没有受到影响。
50.3小结 (1)扫描电镜观测到的pvp/cs/asb纳米纤维显示出均匀且无珠的纳米结构，疏松多孔的纳米结构有利于皮肤组织表面气体交换。红外光谱表明纳米纤维中成功负载了落新妇苷，高压电纺丝后整个体系相对稳定。xrd显示出纤维在高压电作用下改变了原本的晶型，样品出现了宽峰。
51.(2)由于加入热稳定性良好的材料pvp，pvp/cs/asb纳米纤维热稳定性增强。水接触角测试体现了纤维良好的亲水性，水蒸气透过率显示出纳米纤维膜能够保持湿润的环境和适当的气体交换，从而利于伤口愈合。
52.(3)抗氧化试验表明，pvp/cs/asb纳米纤维具有出色的抗氧化能力。这表明我们开发的药物纤维在药物输送方面具有巨大潜力，能够作为伤口愈合以及治疗皮肤问题方面的候选材料。
53.实施例3落新妇苷纳米纤维膜对伤口愈合的促进作用 1材料和方法1.1实验药品与试剂落新妇苷 实验室自制纯度大于95%；粉状壳聚糖(mw~400,000) 购自中国国药集团化学丽晶有限公司。肿瘤坏死因子-α(tnf-α)、白介素-1β(il-β)、白介素6(il-6)购自上海帛龙生物科技有限公司。苏木精-伊红(h&e)试剂盒、免疫荧光染色试剂盒购自于南京建城生物工程研究所。
54.一抗包含jnk、lc3、erk 1/2、beclin
‑ꢀ
1、p38、ikk-α、nf-κb、p-erk 1/2、p-jnk、 p-p38、β-actin和 gapdh，购自购自beyotime biotechnology(中国武汉)，二抗均购自美国abcam公司。其它试剂均购自北京化工厂。
55.1.2实验仪器移液枪(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；酶标仪(海美谷分子仪器有限公司)；恒温水浴锅(郑州耀德实业有限公司)；组织匀浆机(上海净信实业有限公司)；高速离心机(美国sigma)；石蜡包埋机(湖北锦源医疗科技有限公司)；凝胶成像分析系统(北京君意有限公司)；光学显微镜 (labomed lx400)。
56.1.3动物实验30只雄性icr小鼠品系(8周龄，体重24-28g)购自亿斯实验动物有限公司(质量证书编号：scxk(吉)2020-0002；中国长春)。动物最初被关在温度为20
ꢀ‑
25℃、光照条件为12小时明暗循环的集体笼中，并接受标准的固体饮食和自由饮水。
57.1.3.1皮肤损伤实验设计将小鼠适应性饲养7天后，随机分为3组(10只/组)，分别为对照组(control)、空白纳米纤维膜组(pvp/cs)和落新妇苷纳米纤维膜组(pvp/cs/asb)。7天后，将水合氯醛(5% w/
v)以0.1ml/10g的剂量注入小鼠腹腔进行麻醉。麻醉后，迅速将小鼠背侧的毛发剃掉，并用脱毛膏对残留毛发进行彻底清理，清理时使用无纺布轻轻擦拭。待小鼠背部光滑后，用铅笔标记小鼠背侧的两个位置，剪成1cm2的圆形，以划定伤口边缘。然后，用75%乙醇溶液对手术器械进行消毒，消毒过的手术剪刀剪掉标记的皮肤区域，形成两个全层皮肤切口，深入真皮层，不损坏皮下血管。将纳米纤维膜样品轻贴在皮肤伤口处，并每天固定时间换药。每隔三天用数码相机对伤口情况进行拍照记录。在小鼠伤口愈合后(16天后)，采用无菌棉签在小鼠伤口愈合处擦拭1-2min，将棉花部分取下放入ep管，干冰上储存，用于后续组织微生物提取。随后，用于剪下造模时相同位置和尺寸的皮肤愈合组织，一部分用4%多聚甲醛固定，用于包埋，进行病理切片。小鼠脱颈处死后，另一部分皮肤储存在-80℃，用于后续的生化分析。
58.1.3.2皮肤组织愈合情况造模后，拍照记录0、4、8.、12、16天伤口愈合情况，随后用image j软件对伤口大小进行测量，每组随机测量三个样本并取平均值。
59.1.3.3炎症因子测定将皮肤组织和冰生理盐水匀浆处理(1:9)，3500r/min离心，取上清液，按照ellsa说明书评估tnf-α、il-β、il-6在皮肤组织中的表达量。
60.1.3.4组织形态分析对于组织学研究，将实验结束后切除的皮肤组织置于10%福尔马林中进行固定。然后将样品分别用h&e和masson染色，并在光学显微镜下观察皮肤组织细胞病理变化。
61.1.3.5皮肤免疫荧光染色对皮肤组织切片(5-6
ꢀµ
m)进行脱蜡和脱水，再使用柠檬酸盐缓冲液(10 mm；ph 6.0)进行抗原修复，显色后拍照。利用各组的皮肤组织切片来评估伤口愈合相关抗原的存在，检测的指标包含血小板-内皮细胞粘附分子(cd31)、表皮生长因子(vegf)、泛角蛋白(pan-keratin)和缺氧诱导因子(hif-1α)。
62.1.3.6蛋白免疫印迹分析首先将皮肤组织用裂解液进行裂解，得到的皮肤匀浆高速离心后，收集上清液。首先，用bca试剂盒确定皮蛋白质浓度。将样品加入到10%或12%电泳凝胶上，通电跑电泳。再次通过电泳将凝胶上的样品蛋白转移到适当大小的聚偏二氟乙烯 (pvdf) 膜上，然后将含有蛋白的pvdf膜与含5%奶粉的tbst缓冲液共同孵育。一抗在4℃冰箱内孵育12h，一抗包括jnk、p-jnk、erk、p-erk、p38、p-p38、mtor、p-mtor、beclin-1、atg5和atg7。与一抗孵育后，每张 pvdf 膜在室温下洗涤4次，每次5分钟，然后与二抗孵育。
63.1.3.7皮肤菌群测定高保真聚合酶链式反应 (pcr) 通过引物扩增细菌16s rdna的v4-v5区域。引物序列如下：正向引物338f(5'-gtgccagcmgccgcggtaa-3')，反向引物806r(5'-ccgtcaattcctttgagttt-3')。
64.1.3.8统计分析使用spss 24.0进行统计分析。测量结果表示为平均值
±
标准差(mean
±
sd)。数据通过单向方差分析(anova)进行检验，差异值在p＜0.05或p＜0.01具有统计学意义。
65.2结果
2.1落新妇苷促进皮肤伤口愈合通过小鼠背部皮肤创伤模型的宏观照片来评估皮肤创面的愈合情况，分别在诱导创面后的第0，4，8，12，16天对各组小鼠的创面部位进行拍照。造模开始时，所有组小鼠背部伤口都会分泌炎症和渗出液。与模型对照组相比，pvp/cs组和pvp/cs/asb组抑制炎症反应并减少水肿和渗出液分泌。在造模后的第8天，pvp/cs组伤口面积减小，pvp/cs/asb组愈合速度最快，创面修复效果最好。第16天，伤口无渗出液分泌，伤口随着创面减小而恢复，pvp/cs/asb组伤口几乎完全愈合，与其他组相比，效果最为明显。control的未愈合面积最大，愈合效果最差，见图13。伤口闭合尺寸的变化显示为不同愈合时间伤口面积的百分比。结果表明，含有落新妇苷的纳米纤维膜对皮肤创伤修复有利。
66.2.2 落新妇苷对愈合伤口处皮肤组织形态学变化为评估落新妇苷对伤口组织的修复作用，采用h＆e和mssson染色进行观察(图14)。结果显示，pvp/cs/asb组小鼠皮肤见少量新生表皮生成，皮下毛囊、皮脂腺饱满，表皮光滑，胶原密度大，排列均匀致密；模型对照组小鼠毛囊等结构稀疏，表皮与真皮分界线不明显，真皮层染色不均。pvp/cs组和模型对照组都能观察到炎性细胞浸润。结果表明，落新妇苷纳米纤维可能为促进细胞粘附、迁移和生长提供良好的平台，从而促进胶原沉积和血管生成，加速伤口修复，对皮肤伤口组织损伤具有一定的保护作用。
67.2.3落新妇苷促进血管生成、表皮再生的标志物为了进一步确定asb对急性皮肤损伤愈合的潜在影响，我们通过免疫组化法研究了皮肤愈合中血管内皮生长因子(vegf)，血小板-内皮细胞粘附分子(cd31)，缺氧诱导因子-1α(hif-α)和角蛋白(pan-keratin)的表达水平。在第16天，模型对照组中vegf 、cd31、hif-α和pan-keratin表达水平显著降低(图15)。pvp/cs/asb组皮肤的免疫染色切片中显示cd31和vegf显著的阳性表达。与pvp/cs/asb组相比，pvp/cs组中观察到中度的cd31和vegf阳性表达。在 pvp/cs/asb处理的真皮层中观察到hif-α和pan-keratin因子的的强阳性染色。对照组和pvp/cs组没有表现出明显的hif-α和pan-keratin表达。结果证实了经过asb纳米纤维处理的皮肤可以促进vegf、cd31、hif-α和pan-keratin的表达进而改善皮肤组织损伤。
68.2.4 asb抑制小鼠体内炎症因子表达为了探究皮肤伤口炎症因子表达，我们利用ellsa试剂盒检测了皮肤组织中炎症因子水平(图16)，并且通过蛋白质印迹分析确定了ikb-α和nf-κb的表达水平。结果显示，pvp/cs/asb组中il-6、il-1β和tnf-α因子显著降低，效果明显优于pvp/cs组和模型对照组。模型对照组中的小鼠的nf-κb和ikk-α表达水平最强，而在pvp/cs/asb组表达水平明显被抑制。表明asb通过降低nf-κb和ikk-α的水平来显著减轻炎症带来的异常。总之，从这些结果可以看出asb能够调节皮肤损伤小鼠炎症相关蛋白表达，并通过减轻炎症反应来促进创面愈合。
69.2.5 asb促进小鼠体内自噬因子表达为了进一步阐明自噬是否对小鼠的皮肤损伤产生影响，我们分析了本实验中与自噬相关的生化标志物。我们通过蛋白质印迹分析检测到 lc3i和 lc3ii在皮肤损伤治疗小鼠中的积累(图17)。给药落新妇苷后后比值显著增加(p 《 0.01)。与上述的结果一致的是，asb处理可以显著增加皮肤损伤处理小鼠中关键靶蛋白的蛋白质表达水平，包括atg5、atg7
和beclin-1(p 《 0.01)(图17)。为了进一步确定自噬在创面愈合皮肤中的关键作用，我们通过蛋白质印迹分析评估了p-erk1/2、erk1/2、p-jnk、jnk、p-p38和p38的蛋白质表达水平(图18)。模型组的皮肤样品中，p-erk1/2、p-jnk、p-p38蛋白水平受到抑制(p 《 0.01)，asb处理可促进这些蛋白的活化(p 《 0.01)。这些结果证实了asb正向调控了小鼠体内自噬。
70.2.6 asb对皮肤菌群微生物的调节2.6.1稀疏曲线样品的chao1指数、simpson指数、shannon指数和pielou’s evenness指数增加，增加到一定程度后逐渐平缓。说明小鼠皮肤微生物测序数据量充足，能够覆盖大多数物种，可以进行后续的分析，见图19。
71.2.6.2veen图分析veen图可以直观地显示独有和共有的otu数量，如图20所示，control组、pvp/cs组和pvp/cs/asb组out数目分别为1620、2742和3478个，pvp/cs/asb组的out数目最高，表明落新妇苷给药后能提高皮肤菌群的多样性。三组共有的out数目为1116个，control组与pvp/cs组间共有otu为222个，pvp/cs/asb组与pvp/cs组间共有otu为505个，表明pvp/cs/asb组与pvp/cs组识别度高。
72.2.6.3小鼠皮肤微生物alpha多样性分析分析结果观察到的物种的肠道微生物群的alpha多样性如图21所示，chao1指数和shannon指数显示，pvp/cs/asb组显著高于control组和pvp/cs组，说明给药组能增加皮肤菌群的丰富度。并且，simpson指数也显示出pvp/cs组和pvp/cs/asb组的显著差异。pielou’s指数反映群落分布的均匀度，本研究中，pvp/cs/asb组显著高于control组和pvp/cs组(p＜0.05)，说明pvp/cs/asb组菌群均匀度好。
73.2.6.4 落新妇苷对皮肤菌群组成的影响在属水平上，三组优势菌群为乳杆菌属(lactobacillus)和嗜盐单胞菌属(halomonas)。control组中占比分别为68.32%和21.41%，pvp/cs组中占比分别为72.66%和11.89%，pvp/cs/asb组中占比分别为84.92%和5.03%。
74.在门水平上，三组中水平最高的菌群为厚壁菌门(firmicutes)和变形菌门(proteobacteria)，control组中占比分别为79.57%和19.87%，pvp/cs组中占比分别为82.91%和14.28%，pvp/cs/asb组中占比分别为93.82%和7.89%。皮肤菌群的变化可能影响皮肤免疫稳态，对伤口愈合产生影响。
75.结果表明，asb能有效提升皮肤表面益生菌水平，降低有害菌水平，对皮肤菌群起正向调节作用。
76.3小结asb可能通过抑制nf-κb信号通路介导的炎症，降低炎症因子水平，同时通过调节自噬来促进小鼠皮肤创面愈合。asb也能通过调节创面菌群的方式对促进小鼠伤口修复起作用。