基于虚拟筛选和油红O染色联用快速筛选环境致肥化合物的方法

本发明属于化合物筛选，涉及一种基于虚拟筛选和油红o染色联用快速筛选环境致肥化合物的方法。

背景技术：

1、过氧化物酶体增殖物激活受体(ppar)属于一类核受体，由pparα、pparβ/δ和pparγ三个同源异构体组成。其中，pparγ主要在脂肪组织以及肝组织中表达，与脂肪细胞分化、能量平衡和糖脂代谢密切相关，当其功能发生异常时，将导致胰岛素抵抗以及二型糖尿病等多种代谢型疾病的发生。pparγ的活化依赖配体的调节，其配体可分为内源性配体和外源性配体。前期大量研究表明，多元不饱和脂肪酸、某些类前列腺素、类花生酸、氧化低密度脂蛋白、氧化烷基磷脂均可以激活pparγ，并导致pparγ靶基因的表达增加，进一步导致肥胖的发生。

2、近年来，虚拟筛选(virtual screening，vs)已成为加快药物开发的一种方式。这是一种基于分子对接的在体外对化合物进行分析的方法，无需对给定库中的每种化合物进行实验测试，而是通过计算化合物的特性，以预测哪种化合物最有利于与所需的药物靶标结合，可以在几周甚至几天时间内完成上千万种化合物的筛选匹配工作，并根据计算所得亲和力对目标库中化合物进行排序(irwin j j,shoichet b k.docking screens fornovel ligands conferring new biology[j].j med chem,2016,59(9):4103-20.)。autodock vina是使用最广泛的对接程序之一，越来越多地被应用于新药研发等领域，如受体类蛋白的配体筛选、covid-19冠状病毒拮抗剂的筛选等(xue q,liu x,etal.evaluation of the binding performance of flavonoids to estrogen receptoralpha by autodock,autodock vina and surflex-dock[j].ecotoxicol environ saf,2022,233(113323.)。然而，在典型的虚拟筛选中，哪怕是得分最高的化合物也只有大约12％在实际生化分析中显示出活性(adeshina y o,deeds e j,et al.machine learningclassification can reduce false positives in structure-based virtualscreening[j].proc natl acad sci u s a,2020,117(31):18477-88.)。

3、油红o是一种溶血色素、脂溶性染料，可染色中性脂质和胆固醇酯，但不会染色生物膜，其染色颜色为红色，最大光吸收为518nm。染色的原理是油红o在溶剂中的溶解度极低，使用前将油红o用水稀释会进一步降低溶解度。因此，疏水染料将从溶剂中析出，与细胞或者组织切片内的脂质结合，从而可以借助显微镜直观的观察到细胞或组织中生成的脂质。油红o不仅在细胞实验上可以检测脂质的合成，同时也已被证实是在小鼠和人类肝活检中检测和量化肝脂肪变性的最准确的方法之一。虽然油红o成本低廉，染色方法操作简便，但是相对于需要检测的大量的环境化合物来说，则需要消耗巨大的时间成本和人力成本。

技术实现思路

1、针对目前单纯的虚拟筛选技术虽然筛选效率高，但是存在假阳性率过高的问题；而传统的油红o染色技术虽然准确率高，但面对庞大数量的环境化合物，存在筛选效率低下的问题，本发明提供一种基于虚拟筛选和油红o染色联用快速筛选环境致肥化合物的方法。

2、本发明所述的基于虚拟筛选和油红o染色联用快速筛选环境致肥化合物的方法，包括以下步骤：

3、步骤1，虚拟筛选：

4、(1)蛋白准备：首先从pdb数据库中获取pparγ的蛋白结构(pdb id：1fm6)，使用autodocktools对蛋白进行处理；

5、(2)格点文件生成：将pparγ蛋白配体结合域所在区域作为对接口袋，用grid模块制作格点文件，盒子大小为

6、(3)化合物准备：将zinc中获取的化合物的2d格式通过ligand模块进行处理，输出3d结构，并进行结构优化；

7、(4)分子对接：利用autodock vina，受体和配体分子通过几何匹配和能量匹配而互相识别，进行分子对接，分别输出3d对接结果和亲和力值，并按照亲和力由大到小对小分子化合物排序，最后复核靶点与化合物结合力、化合物结构以及细胞毒性，排除结构错误、具有明显细胞毒性以及结合力结果错误的化合物，重新排序，将排序好的化合物作为最终的虚拟筛选结果；

8、步骤2，油红o染色细胞实验：

9、在人正常肝细胞株l02细胞的培养皿中加入虚拟筛选的化合物溶液，同时设置加入dmso的实验为阴性对照组，培养一段时间后，固定细胞，采用油红o染色观察细胞中脂质积聚，并结合图像处理软件统计油红o相对密度，油红o相对密度越高，提示对应的化合物的致肥可能性越高。

10、步骤1(1)中，使用autodocktools对蛋白进行处理采用常规处理方式，例如进行去水、加氢、修补缺失残基、优化结构、能量最小化等处理。

11、步骤1(3)中，结构优化采用常规优化方式，例如去盐、能量优化等结构优化。

12、步骤1(4)中，分子对接方法为：先采用grid模块中生成的格点文件设置对接参数，然后采用shell脚本程序将准备好的小分子化合物进行分子对接，分别输出3d对接结果和亲和力值，并且按照亲和力由大到小对小分子化合物进行排序。

13、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

14、本发明的快速筛选方法，包括虚拟筛选和油红o染色，虚拟筛选部分通过分子对接按与受体亲和力对化合物进行排序，油红o染色部分挑选排序靠前的化合物进行染色验证，两者结合能够快速发现并鉴定环境致肥化合物。本发明方法相较于以往单独使用的虚拟筛选技术或传统的油红o染色筛选，大大提高了筛选结果的准确性和筛选速度。

技术特征：

1.基于虚拟筛选和油红o染色联用快速筛选环境致肥化合物的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1(1)中，使用autodocktools对蛋白进行去水、加氢、修补缺失残基、优化结构、能量最小化处理。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1(3)中，对3d结构进行去盐、能量优化。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1(4)中，分子对接方法为：先采用grid模块中生成的格点文件设置对接参数，然后采用shell脚本程序将准备好的小分子化合物进行分子对接，分别输出3d对接结果和亲和力值，并且按照亲和力由大到小对小分子化合物进行排序。

技术总结
本发明公开了一种基于虚拟筛选和油红O染色联用快速筛选环境致肥化合物的方法。本发明通过计算机水平分子对接快速完成大量环境化合物与PPARγ的亲和力排序，进一步根据亲和力排序结果在细胞水平通过油红O染色验证环境化合物是否会增加细胞中脂质积聚水平。本发明方法相较于以往单独使用的虚拟筛选技术或传统的油红O染色筛选，大大提高了筛选结果的准确性和筛选速度，适用于环境致肥化合物的快速鉴定。

技术研发人员：翁丹,张维高
受保护的技术使用者：南京理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16