MOF纳米酶的用途

mof纳米酶的用途
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及mof纳米酶的应用。


背景技术：

2.糖尿病是一种以高血糖为特征的内分泌疾病，糖尿病足溃疡是糖尿病最严重的并发症之一，患病率可以达到25％，糖尿病足溃疡会显著降低患者的生活质量，甚至截肢。目前糖尿病足溃疡的临床治疗方法主要包括手术清创、感染控制、使用敷料和高压氧疗法，但是这些方法存在治疗过程比较复杂，效果不稳定，成本高，并且常伴随一定的副作用等缺点，而且5年内对于治愈后的患者有高达50％～70％的复发率，这会再次增加治疗费用并延长患者的痛苦。因此，迫切需要找到效果可靠、安全且使用便捷的方法用于糖尿病足溃疡的治疗。
3.伤口愈合是一个复杂但有序的过程，可以分为四个重叠的阶段：止血期、炎症期、增殖期和重塑期。在伤口愈合过程中，任何阶段出现问题都会延缓伤口的愈合。氧化还原信号在伤口愈合过程中充当关键的中间媒介，然而，在糖尿病伤口中，由于高血糖继发的多种病理机制，正常的氧化还原信号传导被破坏，因此糖尿病伤口会存在高水平的ros，特别是
·o2-和h2o2。ros的异常积累会增加氧化应激反应，使糖尿病伤口愈合停滞在炎症期，很难进入增殖期阶段，最终导致慢性伤口的形成。
4.研究表明炎症反应的放大是慢性伤口愈合延迟的主要原因，使用抗氧化剂清除过量的ros是一种治疗各种炎症性疾病常用的策略。然而，目前使用的一些抗氧化剂在病理条件下存在稳定性低、生物利用率低和疗效差等缺点，这些因素限制了它们进一步的临床应用。纳米酶作为一种新型的人工酶，因其在诊断和治疗上具有良好的应用前景近年来备受关注。迄今为止，已经开发出了数十种纳米酶，涵盖数百种纳米材料。其中，由金属离子/簇和有机连接体通过配位形成的多孔晶体材料，金属有机框架(mofs)，具有孔隙可调、比表面积大和催化中心多等多种自身独特的优势。然而，大多数报道的mof纳米酶主要为类oxd和类pod，只有极少数mofs用于模拟抗氧化酶的活性。例如，wei等人通过结合具有类sod活性的pcn222-mn和具有类cat活性的ptnps开发了一种级联纳米酶(pt@pcn222-mn)，制备的这种级联纳米酶可以用于ros清除和炎症性肠病治疗。除了直接利用mofs的类抗氧化酶活性治疗炎症性疾病，和mofs结合还可以赋予抗氧化纳米酶新的物理性能。例如，he等人通过在ceo2nps表面上生长zif-8制备了复合纳米材料ceo2@zif-8nps，并成功用于缺血性脑卒中治疗。zif-8的修饰可以阻止ceo2nps的聚集，延长血液循环时间，提高血脑屏障穿透能力以及提高材料利用率等。尽管mofs具有优异的物理化学性能，在治疗方面显示出良好的前景，但目前还没有mofs自身可以同时模拟sod和cat两种酶的活性，其在糖尿病慢性伤口治疗上的效果仍不清楚。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供mof纳米酶在制备促进伤口愈合的
药物中的应用。
6.本发明提供了mof-818在制备促进伤口愈合的产品中的应用。
7.本发明通过实验证明，mof-818具有促进伤口愈合的能力，并进一步对mof-818在产生这一效果过程中发挥的作用进行了研究。
8.本发明中，所述促进伤口愈合包括如下i)～iv)中至少一项：
9.i)、调解氧化应激微环境；ii)、促进创伤组织修复；iii)、提高抗炎水平；iv)、提高生长因子水平。
10.本发明中，所述调解氧化应激微环境包括清除ros和/或提高氧化应激的细胞内o2含量。
11.本发明中，所述促进创伤组织修复包括促进细胞增殖、促进血管形成、促进胶原蛋白合成和/或促进再上皮化。
12.所述促进细胞增殖为促进伤口处细胞的增殖，包括，角质形成细胞、成纤维细胞和/或内皮细胞。
13.所述促进血管形成包括提高伤口处的血管密度和血管直径。
14.所述促进胶原蛋白合成包括提高胶原蛋白含量，提高胶原蛋白i/iii比率。
15.所述促进再上皮化包括促进复层上皮结构的形成。
16.本发明中，所述提高抗炎水平包括促进巨噬细胞由m1表型向m2表型极化和/或抑制促炎因子水平。本发明中，所述促炎因子包括il-6、tnf-α或il-1β中至少一种。
17.本发明中，所述提高生长因子水平包括提高pdgf、vegf、bfgf和/或tgf-β的水平。
18.本发明中，所述伤口为慢性伤口，进一步的，所述伤口为糖尿病慢性伤口。本发明中，所述促进伤口愈合为促进慢性伤口愈合。更进一步的，所述促进伤口愈合为促进糖尿病慢性伤口的愈合。研究表明，持续和过度活跃的炎症反应是导致糖尿病慢性伤口愈合时间延长的主要原因。mof-818可以通过清除ros、调解氧化应激微环境、促进创伤组织修复、提高抗炎水平和/或提高生长因子水平修复糖尿病慢性伤口。
19.并且，本发明通过将具有类抗氧化酶活性的mof纳米酶与水凝胶结合，提供了一种可以促进糖尿病慢性伤口愈合的抗氧化体系(mof/gel)，其中的有效抗炎成分mof纳米酶至少可以在90天内保持稳定。
20.本发明还提供了一种促进伤口愈合的药物，该药物的剂型为水凝胶。所述药物由plga-peg-plga、mof-818和生理盐水组成。
21.本发明所述的药物中，mof-818的浓度为75μg ml-1
，plga-peg-plga的质量分数为15.0wt％。
22.本发明所述药物的制备方法包括，以生理盐水溶解plga-peg-plga后加入mof-818，经搅拌、保温制得所述药物。保温的条件包括30～40℃保温10～60min。一些实施例中，所述搅拌后37℃保温30min获得含有mof-818的凝胶剂。
23.本发明提供了mof-818在修复伤口中的作用，研究表明，通过清除ros、调解氧化应激微环境、促进创伤组织修复、提高抗炎水平和/或提高生长因子水平，mof-818能够促进伤口的愈合，并且具有良好的安全性。在以mof-818为活性成分的凝胶剂中，mof-818具有良好的稳定性。
附图说明
24.图1中，a为mof-818的tem图，b为mof-818分散在水溶液中的照片，c为mof-818的xrd图，d为mof-818的氮气吸附-脱附等温线，e为mof-818的孔径分布图；
25.图2中，a为mof-818的类sod和类cat活性示意图，b为x/xo/nbt体系中加入不同浓度mof-818对吸收的影响，c为不同浓度mof-818类sod活性比较，d为epr测试mof-818的类sod活性，e为mof-818和报道的sod纳米酶活性比较，f为溶氧仪评估不同浓度mof-818对类cat活性的影响，g为不同浓度mof-818类cat活性比较，h为mof-818和报道的cat纳米酶活性比较，i为mof-818的储存稳定性；
26.图3中，a为mof-818的细胞毒性，b为mof-818的溶血性，c为mof-818缓解h2o2诱导的细胞氧化应激荧光图，d为mof-818缓解h2o2诱导的细胞氧化应激后o2浓度的变化，e为mof-818缓解lps诱导的细胞氧化应激荧光图
27.图4中，a为mof/gel在4℃环境下的照片，b为mof/gel在37℃环境下的照片，c为mof/gel的sem元素扫描图，d为mof/gel中mof纳米酶的释放行为，e为不同治疗组在不同时间的伤口照片，f为不同治疗组在不同时间的伤口面积柱形图，g为不同治疗组在第12天伤口面积柱形图，h为不同治疗组在第12天伤口皮肤组织ck10和ck14免疫荧光染色照片，i为不同治疗组在第12天伤口皮肤组织h&e染色照片；
28.图5中，a为不同组在第12天伤口皮肤组织ki67免疫荧光染色照片，b为不同组在第12天伤口皮肤组织ki67定量分析柱形图，c为不同组在第12天伤口皮肤组织cd31免疫荧光染色照片，d为不同组在第12天伤口皮肤组织cd31定量分析柱形图，e为不同组在第12天伤口皮肤组织马松染色照片，f为偏振光显微镜分析不同治疗组在第12天伤口皮肤组织胶原纤维i/iii比率，g为不同组在第12天胶原纤维定量分析柱形图，h为不同组在第12天胶原纤维i/iii比率定量分析柱形图，i-l为不同组在第12天伤口皮肤组织不同生长因子定量分析柱形图；
29.图6中，a，f为不同组在第12天伤口皮肤组织ros荧光染色照片及定量分析柱形图，b，g为不同组在第12天伤口皮肤组织cd206/cd86免疫荧光染色照片及定量分析柱形图，c，h为不同组在第12天伤口皮肤组织il-6免疫荧光染色照片及定量分析柱形图，d，i为不同组在第12天伤口皮肤组织tnf-α免疫荧光染色照片及定量分析柱形图，e，j为不同组在第12天伤口皮肤组织il-1β免疫荧光染色照片及定量分析柱形图；
30.图7中，a为不同组大鼠体重变化，b为不同组大鼠尾静脉注射第12天的全血血常规分析，c-h为不同组大鼠尾静脉注射第12天的血清生化分析，i为不同组大鼠尾静脉注射第12天重要组织的h&e图。
具体实施方式
31.本发明提供了mof纳米酶的用途，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
32.为了探究具有类抗氧化酶活性的mof纳米酶在糖尿病慢性伤口治疗中的效果，我
们将具有高活性、高稳定性和良好生物相容性的mof纳米酶负载到可注射和热敏感的水凝胶中形成抗氧化体系(mof/gel)，水凝胶作为载体可以将具有抗氧化活性的mof纳米酶输送到伤口部位。释放的mof纳米酶可以通过清除伤口部位的ros重塑氧化应激微环境，进而促进m1巨噬细胞向m2巨噬细胞转化，最终减轻伤口部位的炎症反应，并进入到下一阶段，即增殖期。结果显示，只需要在伤口模型建立的第一天使用一次，mof/gel的治疗效果可以和每天都要使用的人表皮生长因子凝胶(hegfg)相比。我们的实验结果证明了具有类抗氧化酶活性的mof纳米酶可以与水凝胶结合有效促进糖尿病慢性伤口愈合。这是首次关于利用mof纳米酶作为抗氧化剂治疗糖尿病慢性伤口的报道，其疗效可与商业化的hegfg相媲美，但成本更低，使用更方便。
33.本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。
34.下面结合实施例，进一步阐述本发明：
35.实施例1 mof-818的合成和确认
36.通过简单的一步溶剂热法合成mof-818：在超声的作用下将cu(no3)2·
3h2o(124mg)、zrocl2·
8h2o(42.5mg)、h2pyc(32.5mg)和三氟乙酸(120μl)加到20ml dmf中，完全溶解后将混合溶液转移到50ml的高压反应釜中，然后在100℃下加热8小时，自然冷却至室温后用乙醇和dmf多次洗涤，最后在60℃下干燥10小时获得浅蓝色的mof-818粉末。
37.tem图表明制备的mof-818为八面体结构，平均粒径为112nm(图1中a)。不需要进行任何进一步的化学修饰，mof-818在水溶液中具有良好的分散性，颜色为浅蓝色(图1中b)。icp-oes测试结果表明mof-818中cu和zr元素的质量占比分别为14.09％和18.71％。xrd结果(图1中c)表明制备的mof-818的所有衍射峰都与模拟的标准峰匹配。mof-818的氮气吸附-脱附等温线(图1中d)为iv型，是介孔材料的典型特征，与其孔大小2.18nm相吻合(图1中e)，计算出的mof-818的比表面积为1314m2/g。这些表征结果证明我们成功合成了mof-818。
38.实施例2 mof纳米酶体外模拟sod和cat活性
39.在确定材料成功制备后，我们评估了mof-818清除ros的能力(图2中a)。
·o2-可以把nbt还原为在560nm处有强烈吸收的甲臜，因此我们以nbt作为
·o2-显色剂测试mof-818的类sod活性，其中
·o2-通过x/xo反应体系产生。如图2中b所示，x/xo/nbt反应体系在560nm处的信号强度会随着时间持续升高，表明生成了
·o2-。在上述反应体系中加入mof-818后，560nm处信号强度增加的速度会明显降低，而且降低的程度和mof-818的浓度成正比，证明了mof-818具有类sod活性(图2中b和c)。此外，epr也用于评估mof-818清除
·o2-的能力，很明显，加入mof-818后，
·o2-和dmpo结合后的信号强度显著降低，再次验证了mof-818内在的类sod活性(图2中d)。
40.随后，我们将mof-818加入到含有h2o2的缓冲溶液中，然后使用溶氧仪监测缓冲溶液中o2含量的变化评估mof-818的类cat活性。如图2中f和g所示，加入mof-818后，缓冲溶液中o2的含量会持续增加，而且催化活性随着浓度的增加而增加，表明mof-818具有类cat活性。然后我们对比了mof-818与其他一些抗氧化纳米酶这两种类酶活性的强弱，由图2中e和h可以看出，与cuo，co3o4，ceo2，pb，mno2和v2o5相比，mof-818表现出更高的类sod和类cat活性。稳定性是纳米酶和天然酶相比最主要的优势之一，如图2中i所示，至少在90天内分散在生理盐水中的mof-818可以稳定存在，这有利于其在实际中的应用。
41.综上，实验表明，mof纳米酶可以同时模拟sod和cat活性，表现出高活性和高稳定
性。
42.实施例3 mof-818的细胞毒性及体外抗氧化性能
43.在评估mof-818在细胞内的抗氧化能力之前，使用cck8法测试了mof-818的细胞毒性。细胞毒性测试结果显示和100μg/ml的mof-818共孵育24小时没有对huvec显示出明显的毒性(图3中的a)。此外，通过溶血试验进一步确定mof-818的安全性，由图3中的b可以看出mof-818在100μg/ml的浓度下对sd大鼠新鲜血液表现出低的溶血率(2.5％)，表明其具有良好的血液相容性。
44.在确定mof-818具有低的细胞毒性后，测试了mof-818缓解h2o2诱导的细胞氧化应激的能力。如图3中的c所示，和空白组相比，加入100μm的h2o2后细胞内绿色的荧光强度明显增加，而和mof-818共孵育的细胞的荧光强度和空白组接近，表明mof-818可以有效催化细胞内h2o2的分解从而缓解其诱导的氧化应激。[ru(dpp)3]cl2可以被o2猝灭，所以我们使用[ru(dpp)3]cl2作为o2荧光指示剂测试mof-818在缓解h2o2诱导的细胞氧化应激时细胞内o2含量的变化。由图3中的d中可以看出，mof-818处理过的huvec的荧光强度要比h2o2组中的荧光强度要弱，表明细胞中生成了o2。除了h2o2，mof-818还可以缓解lps诱导的氧化应激(图3中的e)。总之，细胞实验结果表明mof-818不仅具有良好的生物相容性，而且在细胞内具有出色的抗氧化能力。
[0045]
实施例4 mof/gel的制备
[0046]
以peg作为引发剂，辛酸亚锡作为催化剂，通过d,l-丙交酯和乙交酯开环聚合伸展获得plga-peg-plga，冷冻干燥后放置在-20℃冰箱中保存。称量一定量干燥好的plga-peg-plga放在玻璃瓶里，再加入计算好质量的生理盐水，然后不断搅拌配置15.0wt％的plga-peg-plga溶液。plga-peg-plga完全溶于生理盐水后加入一定量的mof-818再搅拌2小时，mof-818的终浓度为75μg ml-1
，最后将混合物放在37℃的恒温箱中30分钟形成mof/gel。
[0047]
由图4中的a和b可以看出，mof/gel在4℃下可以自由流动，但在37℃时会凝胶化，这种温度敏感的水凝胶适合在伤口治疗中使用。sem元素扫描结果显示在mof/gel中有cu元素的分布(图4中的c)，表明mof纳米酶被成功负载到了水凝胶中。接着我们通过icp-oes研究了mof/gel中mof纳米酶的释放行为，由图4中的d可以看出，在前五天大约有70％的mof纳米酶会从水凝胶中释放出来，在接下来的几天里，mof纳米酶的释放速度会变得缓慢。
[0048]
实施例5 mof-818促进糖尿病慢性伤口的愈合
[0049]
1、糖尿病慢性伤口模型的建立和治疗
[0050]
雄性sd大鼠(170-210g)购买于北京威通立华实验动物科技有限公司(合格号：scxk 2021-0011，北京，中国)，动物研究经中国科学院长春应用化学研究所伦理委员会批准。建立1型糖尿病sd大鼠模型具体方法如下，先将sd大鼠静养一星期，禁食12小时后给大鼠腹腔注射stz(溶解在ph4.5的无菌柠檬酸盐缓冲液中)，注射的剂量为70mg/kg。使用血糖仪(sinocare，长沙)测量空腹时大鼠的血糖浓度，如果血糖浓度持续高于16.7mm三周，则认为1型糖尿病模型构建成功。在麻醉和去除毛发后，在大鼠背部建立直径为15mm的全层皮肤去除伤口，然后将这些大鼠随机分为三组(每组6只)：分别为gel组：每天给予150μl gel；mof/gel组，每天给予150μl mof/gel；hegfg组，每天给予150μl hegfg。给药后每天给伤口拍照，并用imagej软件测量伤口大小。需要指出的是mof/gel只需要在伤口建立第一天涂抹一次，hegfg按照说明书每天涂抹一次。
[0051]
伤口治疗12天后，将大鼠麻醉并收集伤口皮肤组织，其中一部分伤口皮肤组织用4％多聚甲醛固定用于组织学和免疫荧光分析。另一部分储存在-80℃冰箱中用于elisa和ros测试。为保证治疗效果的可靠性，动物实验独立重复进行两次。
[0052]
2、mof/gel用于慢性伤口治疗
[0053]
研究表明，持续和过度活跃的炎症反应是导致糖尿病慢性伤口愈合时间延长的主要原因，因此，我们评估了具有类抗氧化酶活性的mof-818促进慢性伤口愈合的效果。
[0054]
由伤口照片和伤口面积定量分析结果可以看出，mof/gel对慢性伤口的治疗效果可以和hegfg相比，并且这两组的治疗效果都明显好于对照组(图4中的e-g)，但mof/gel只需要使用一次，而hegfg需要每天使用，显示出了纳米酶在治疗应用上的优越性。为了确保实验结果的可靠性，我们进行了独立的重复性实验，结果和上述一致。再上皮化在伤口愈合中至关重要，常作为评判伤口愈合程度的一个具有说服力的指标。细胞角蛋白10(ck10)和细胞角蛋白14(ck14)分别为棘状角化细胞和基底角化细胞的标志物，我们使用这两种角化细胞标志物对伤口皮肤组织切片进行染色来研究不同治疗组再上皮化程度。由图4中的h可以看出，在第12天，在mof/gel和hegfg治疗组中可以看到清晰的复层上皮结构，表明在这两组中再上皮化已经基本完成，而在水凝胶对照组中没有完整的角质形成细胞层。此外，在h&e染色中也观察到了类似的结果，在治疗第12天，对照组的伤口部位仍存在大面积结痂，而mof/gel和hegfg组中具有几乎完好无损的表皮层(图4中的i)。从整体上可以看出mof/gel对慢性伤口具有可以和hegfg相比的效果。
[0055]
接着我们进行了更全面的分析评估不同治疗对糖尿病慢性伤口愈合的影响。首先，我们使用细胞增殖标志物ki67检测伤口处细胞的增殖率，如图5中a和b所示，mof/gel组伤口部位表现出最高的ki67阳性细胞率。血管可以输送o2和营养物质，有利于促进伤口愈合。在第12天，通过cd31免疫荧光染色照片可以看出mof/gel和hegfg组伤口处具有更高的血管密度(图5中的c和d)。然后我们进行了马松染色观察胶原纤维的沉积情况，如图5中的e和g所示，与对照组相比，mof/gel和hegfg组中出现了更多的胶原纤维。此外，通过偏振光显微镜可以看出两个治疗组的胶原纤维i/iii比率更高(图5中f和h)。我们还测试了伤口部位四种重要生长因子的表达情况，包括大鼠血小板衍生生长因子(pdgf)、大鼠血管内皮生长因子(vegf)、大鼠碱性成纤维生长因子(bfgf)和大鼠转化生长因子β(tgf-β)，这些生长因子在伤口愈合过程中具有多种生物学作用，如细胞增殖、血管生成、胶原合成、组织修复和再上皮化，结果表明mof/gel和hegfg组具有更高的生长因子表达(图5中i-l)。
[0056]
我们利用mof/gel治疗慢性伤口的出发点是基于mof-818的类抗氧化酶活性，所以我们系统研究了不同治疗后伤口部位的炎症情况。我们首先通过二氢乙锭(dhe)对糖尿病伤口部位的ros进行荧光染色，如预期的那样，mof/gel治疗组ros阳性细胞密度低于其他组(图6中a和f)，表明在糖尿病伤口愈合中mof/gel可以有效清除ros。为了了解ros清除对慢性伤口愈合过程中炎症反应的影响，我们通过cd86染色评估m1巨噬细胞密度，同时通过cd206染色评估m2巨噬细胞密度，由图6中b和g可知，mof/gel组具有更高的m2/m1比值，表明具有ros清除性能的mof/gel可以促进巨噬细胞由m1表型向m2表型极化。为了进一步揭示不同治疗组的炎症反应，我们进行了炎症因子免疫荧光分析，结果显示，治疗组尤其是mof/gel组中几种促炎因子(il-6、tnf-α和il-1β)的表达都有明显降低(图6中c-e和h-j)，与ros和炎症细胞染色结果一致。
[0057]
3.mof-818的体内生物相容性
[0058]
为了确保我们提出的mof纳米酶在潜在临床应用中的安全性，我们将mof纳米酶(75μg/ml，150μl)通过尾静脉注射到健康sd大鼠体内以进一步评估其体内生物相容性。如图7中的a可知，材料注射组大鼠的体重增长情况与对照组(注射等体积的生理盐水)没有差异。此外，12天后，材料注射组和对照组大鼠的全血血常规分析以及血清生化分析结果无明显差异(图7中的b-h)。病理分析表明mof纳米酶对大鼠的主要器官(心、肝、脾、肺和肾)没有病理作用(图7中的i)。体内安全性评估结果表明mof纳米酶作为抗炎剂具有可靠的生物安全性，由于治疗慢性伤口时是把材料涂抹在皮肤上，因此具有更高的安全性。
[0059]
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。