异喹啉类化合物制备抗冠状病毒产品中的用途的制作方法

异喹啉类化合物制备抗冠状病毒产品中的用途
1.本技术是申请号为201910819673.2、申请日为2019年08月31日、发明名称为“异喹啉类化合物制备抗病毒产品的用途”的分案申请。
技术领域
2.本发明属于动物疾病防治领域。特别涉及异喹啉类化合物或其盐在制备抗冠状病毒科病毒产品中的用途。


背景技术：

3.病毒是一种非细胞生命形态，它由一个核酸长链和蛋白质外壳构成，病毒没有自己的代谢机构，没有酶系统。因此病毒离开了宿主细胞，就成了没有任何生命活动、也不能独立自我繁殖的化学物质。一旦进入宿主细胞后，它就可以利用细胞中的物质和能量以及复制、转录和转译的能力，按照它自己的核酸所包含的遗传信息产生和它一样的新一代病毒。病毒的感染主要有注射式侵入、细胞内吞(endocytosis)、膜融合或者其他特殊的侵入方式。内体是细胞内吞作用中运载途径的一个区室，核内体从细胞质膜被传递到溶酶体被其降解，或者再循环回到细胞质膜。溶酶体是分解蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的细胞器，内含许多水解酶，其功能是分解从外界进入到细胞内的物质，也可消化细胞自身的局部细胞质或细胞器。核内体可根据细胞内吞作用的不同时间阶段分为早期内体(early endosome)，晚期内体(late endosome)，以及再循环体(recycling endosome)，并可被如gtp结合蛋白rabs等蛋白标记而区分(早期内体标记物为运铁蛋白rab5，rab4和它的运铁蛋白受体，以及eea1；晚期内体标记物为rab7，rab9，以及m6p受体；再循环体标记物为rab11)，并且此三种内体在形态上也有不同。一旦在内吞作用中的囊泡被释放，它们首先与初级内体融合，之后再成长为次级内体并与溶酶体融合。大多数通过胞吞作用进入细胞的病毒在囊泡到达溶酶体之前就已经释放到胞质中了，还有部分病毒能够到达溶酶体并利用这些蛋白酶和核酸酶来脱去其衣壳。许多使用内体途径或溶酶体途径的病毒需要特定的ph环境，目的是进行构象变化以触发与内体膜融合及细胞入侵。
4.目前，我国动物养殖领域有以下几种由病毒引起的严重危害的动物疾病：
5.猪传染性胃肠炎(tge)是由冠状病科的冠状病毒引起猪的一种高度接触性传染病,以猪的胃肠炎为主要特征。猪传染性胃肠炎被oie列为b类疾病，在中华人民共和国农业部公布的《一、二、三类动物疫病病种名录》中，猪传染性胃肠炎被列为三类动物疫病。本病潜伏期12～24小时，有时长达4天，暴发后迅速传播，经10天左右达到高潮，随后呈零星发病。病猪表现为呕吐、严重腹泻和脱水。不同年龄的猪均可发病，哺乳子猪发病会造成大批死亡，日龄越小，病程越短，死亡率越高。生长育成猪或公母猪发病几乎没有死亡。目前治疗手段有(1)返饲(2)口服或注射抗生素，但效果均不理想。
6.猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)，是由猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)引起的以猪水样腹泻、呕吐、脱水和对哺乳仔猪高致死率为主要特征的一种高度接触性肠道传染病。本病常发生于各种年龄的猪都能感
染发病。病猪是主要传染源，本病具有一定的季节性，多发生于秋、冬季节，夏季也可发生各种年龄的猪都能感染发病。哺乳仔猪、断奶仔猪和育肥猪感染发病率100％，成年母猪为15％～19％，本病对10日龄以内的哺乳仔猪影响尤为严重，死亡率可达80％～100％。目前国内虽有多家商品化猪流行性腹泻疫苗，但由于病毒变异快的等特性，疫苗免疫难以达到理想的效果，经多次免疫保护率也不高。
7.异喹啉类化合物是一类含氮的有机化合物，自然界中广泛存在的含异喹啉或四氢异喹啉为母核的生物碱，是一类通常具有生物活性的异喹啉类化合物，它们是生物碱的重要组成部分。异喹啉生物碱广泛分布于罂粟科(papaveraceae)、巴比特科(berbidaceae)、毛茛科(ranunculaceae)和防己科(menispermaceae)中。现有研究报道，异喹啉生物碱有包括抗肿瘤、抗菌、镇痛、降血脂、抗心律失常、降压等方面的作用，如小檗碱具有抗心率失常、抗菌、抗原虫、降血脂、降血糖、抗疟、抗脑缺血等活性。目前也有报导异喹啉生物碱具有抗病毒的活性，如cn201510942635.8报导从傣族药用植物豆科翅荚决明(cassia alata l.)树皮分离得到异喹啉生物碱对轮状病毒具有良好的抑制作用；cn201710256643.6报导异喹啉生物碱对乙肝病毒的活性并用于治疗乙肝肝炎；cn201110218079.1报导异喹啉生物碱对人类乳头瘤病毒的活性；cn200910063163.3报导黄连素抗流感病毒的活性，但由于病毒的种类繁多，作用机制复杂，入侵细胞途径不同，异喹啉生物碱数量多且结构复杂多样，研究数量较少，其具体的抗病毒机理尚不明确。目前异喹啉生物碱抗其他病毒的研究还很鲜见，尤其是对于冠状病毒科病毒活性还未见报导。


技术实现要素：

8.本发明研究发现一类异喹啉类化合物或其盐的新用途，其具有良好的抗冠状病毒科病毒活性，即异喹啉类化合物或其盐在制备抗冠状病毒科病毒产品中的用途。
9.本发明上述目的通过以下技术方案实现：
10.本发明目的是提供异喹啉类化合物或其盐的抗冠状病毒科病毒新用途，所述异喹啉类化合物如下式(i)结构所示：
[0011][0012]
式中，w与x之间的虚线表示w与x可以相连或不相连；y与z之间的虚线表示y与z可以通过双键相连或不相连；取代基r1、r2间，r2、r3间及r4、r5间的虚线表示取代基r1、r2、r3、r4、r5可以是独立的取代基或它们也可以相连成环；
[0013]
其中，w与x的取代方案为：当w与x相连时，w选自亚甲基或羟基取代的亚甲基，x选自亚甲基；当w与x不相连时，w选自氢、甲基，x选自甲基；
[0014]
y和z的取代方案为：当y和z相连时，y和z各自独立地选自次甲基；当y和z不相连
时，y和z各自独立地选自氢或甲基；
[0015]
r1的取代方案为：当r1与r2相连时，r1与r2组合成亚甲二氧基；当r1与r2不相连时，r1选自氢、羟基或甲氧基；
[0016]
r2的取代方案为：当r1与r2相连或r2与r3相连时，r1与r2或r2与r3组合成亚甲二氧基；当r2与r1或r3都不相连时，r2选自氢、羟基或甲氧基；
[0017]
r3的取代方案为：当r2与r3相连时，r2与r3组合成亚甲二氧基；当r2与r3不相连时，r3选自氢、羟基或甲氧基；
[0018]
r4、r5的取代方案为：当r4、r5相连时，r4与r5组合成亚甲二氧基；当r4、r5不相连时，r4、r5各自独立地选自氢、羟基或甲氧基。
[0019]
本发明的一个优选方案，所述异喹啉类化合物如下式(ii)结构所示：
[0020][0021]
其中，y和z各自独立地选自氢或甲基；
[0022]
r2、r3的取代方案为：当r2与r3相连时，r2与r3组合成亚甲二氧基；当r2与r3不相连时，r2与r3各自独立地选自羟基或甲氧基；
[0023]
r4、r5的取代方案为：当r4、r5相连时，r4与r5组合成亚甲二氧基；当r4、r5不相连时，r4、r5各自独立地选自羟基或甲氧基；
[0024]
r6选自氢或羟基。
[0025]
本发明的另一个优选方案，所述异喹啉类化合物如下式(iii)结构所示：
[0026][0027]
其中，r1、r2的取代方案为：当r1与r2相连时，r1与r2组合成亚甲二氧基；当r1与r2不相连时，r1、r2各自独立地选自羟基或甲氧基；
[0028]
r4、r5的取代方案为：当r4、r5相连时，r4与r5组合成亚甲二氧基；当r4、r5不相连时，r4、r5各自独立地选自羟基或甲氧基。
[0029]
本发明的最优方案，所述异喹啉类化合物选自以下化合物：
[0030][0031][0032]
更进一步地，研究显示，异喹啉类化合物的不同组合对药效的发挥也有较为明显的影响，黄连素与血根碱的组合以及黄连素与白屈菜红碱的组合显示出了显著的协同增效作用。
[0033]
优选地，所述病毒为冠状病毒属(coronavirus)病毒。
[0034]
更优选地，所述病毒为传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus)或猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus)。
[0035]
本发明研究结果表明，异喹啉类化合物或其盐对多种病毒具有良好的抗冠状病毒科病毒作用，表明该药物可以作为临床上潜在的抗病毒产品进一步开发。
[0036]
另外，异喹啉类化合物的功能性衍生物、代谢物均以与异喹啉类化合物或其盐相同的方式发挥功能，它们对于病毒感染应有类似的预防和/或治疗作用。
[0037]
所述异喹啉类化合物可以来源自植物、植物提取物或化学合成。
[0038]
本发明通过动物实验和体外实验研究发现，异喹啉类化合物可以预防和/或治疗冠状病毒科病毒引起的疾病，同时抗病毒和抗细菌、同时抗病毒和抗炎、同时抗病毒和抗血小板凝聚、同时抗病毒和促生长方面，具有很好的效果。所述异喹啉类化合物指上述式(i)
spp)、李斯特菌属种(listeria spp)、红斑丹毒丝菌(erysipelothrixrhusiopathiae)、幽门螺杆菌(helicobacter pylori)。
[0049]
最后，基于上述用途，本发明还提供一种能够治疗和/或预防病毒感染引起的疾病的组合物，其以上文所述异喹啉类化合物或其盐的一种或一种以上为功能成分。优选还可以加入药学上可接受的载体、佐剂或赋形剂制成各种药物产品。该组合物可以用于预防和/或治疗上文所述病毒引发的疾病。
[0050]
所述药物组合物中的可药用载体、佐剂和运载体包括但不限于：离子交换剂、铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白例如人血清白蛋白、缓冲物质例如磷酸盐、甘油、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质例如鱼精蛋白硫酸盐、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅溶胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、基于纤维素的物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙烯-聚氧丙烯嵌段共聚物、聚乙二醇以及羊毛脂。
[0051]
本发明具有以下有益效果：
[0052]
本发明公开了异喹啉类化合物或其盐的一种的医药用途，通过实验证明异喹啉类化合物或其盐可以预防和/或治疗冠状病毒科病毒引起的疾病，同时具有抗血小板凝聚、促生长、抗炎等作用。异喹啉类化合物可大量从天然植物中提取，如黄连、黄柏、三颗针、白屈菜、南天竹、防己、小檗等，是一类安全性较好的天然产物，毒副作用小，提取分离纯化手段成熟，也可通过合成手段获得，既有治疗效果也有预防作用，可以混饲或混饮给药，也可以通过非肠道方式给药。本发明为冠状病毒科病毒感染引起的疾病的预防和/或治疗提供了新的有效途径，是一种高效安全的防治手段，有极好的临床应用前景。
具体实施方式
[0053]
以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
[0054]
实施例1格兰地新对已感染非洲猪瘟病毒的猪的作用
[0055]
1、实验用猪：位于河南省某发生非洲猪瘟疫情的养殖场，挑选暂无临床症状且经唾液采样pcr确诊非洲猪瘟病毒阳性保育猪。已有临床症状的猪全部扑杀并无害化处理。全过程做好生物安全措施。
[0056]
2、分组：将实验用猪随机分为如下2组，每组20头：
[0057]
(1)实验组：常规饲养+格兰地新；
[0058]
(2)空白对照组：常规饲养。
[0059]
3、处理：通过给实验猪口服格兰地新，给药方式：混饮，剂量：5mg/kg b.w.，连用30天。每天记录死亡情况，统计30天后各组的死亡率。
[0060]
4、结果如表1示，格兰地新可以降低非洲猪瘟病毒阳性猪的死亡率。
[0061]
表1
[0062] 起始数目(头)死亡率(％)实验组2075空白对照组20100
[0063]
实施例2黄连素对感染非洲猪瘟病毒的猪的作用
[0064]
1、实验用猪：位于江苏省某发生非洲猪瘟疫情的养殖场，挑选暂无临床症状且经唾液采样pcr确诊非洲猪瘟病毒感染阳性的怀孕母猪。已有临床症状的猪全部扑杀并无害化处理。全过程做好生物安全措施。
[0065]
2、分组：将实验用猪随机分为3组，分别为实验组、(10％恩诺沙星可溶性粉)对照组和空白对照组，每组50头：
[0066]
(1)实验组：常规饲养+黄连素；
[0067]
(2)对照组：常规饲养+(10％恩诺沙星可溶性粉)；
[0068]
(3)空白对照组：常规饲养。
[0069]
3、处理：实验组给予黄连素，给药方式：混饲，剂量：20mg/kg b.w.，连用30天。对照组：与实验组的不同之处在于使用的药物为(10％恩诺沙星可溶性粉)，剂量：2kg/吨饲料，其余条件相同。每天记录死亡情况，统计30天后各组的死亡率。
[0070]
4、结果如表2示，可以降低非洲猪瘟病毒阳性猪的死亡率，黄连素可以显著降低非洲猪瘟病毒阳性猪的死亡率。空白对照组在实验的第16天时全部死亡。
[0071]
表2
[0072][0073]
实施例3黄连素对感染非洲猪瘟病毒的猪的作用
[0074]
1、实验用猪：位于江苏省某发生非洲猪瘟疫情的养殖场，挑选暂无临床症状且经唾液采样pcr确诊非洲猪瘟病毒阳性哺乳母猪。已有临床症状的猪全部扑杀并无害化处理。全过程做好生物安全措施。
[0075]
2、分组：将实验用猪随机分为实验组和空白对照组2组，每组30头：
[0076]
(1)实验组：常规饲养+黄连素；
[0077]
(2)空白对照组：常规饲养。
[0078]
3、处理：实验组给予黄连素，给药方式：混饮，剂量：1kg/吨饮水，自由饮用，连续使用。每天记录死亡情况，统计30天后各组的死亡率。
[0079]
4、结果如表3示，黄连素可以极显著降低非洲猪瘟病毒阳性猪的死亡率。空白对照组在实验的第14天时全部死亡。
[0080]
表3
[0081] 起始数目(头)死亡率(％)实验组3040空白对照组30100
[0082]
实施例4黄连碱对感染非洲猪瘟病毒的猪的作用
[0083]
1、实验用猪：位于河南某发生非洲猪瘟疫情的养殖场，挑选暂无临床症状且经唾液采样pcr确诊非洲猪瘟病毒阳性50kg～70kg肉猪。已有临床症状的猪扑杀并全部经无害
化处理。全过程做好生物安全措施。
[0084]
2、分组：将实验用猪随机分为如下2组，每组40头：
[0085]
(1)实验组：常规饲养+黄连碱；
[0086]
(2)空白对照组：常规饲养。
[0087]
3、处理：实验组给予黄连碱，给药方式：混饲，剂量：1kg/吨饲料，连续使用。每天记录死亡情况，统计30天后各组的死亡率。
[0088]
4、结果如表4示，黄连碱可以降低非洲猪瘟病毒阳性猪的死亡率。
[0089]
表4
[0090] 起始数目(头)死亡率(％)实验组4052.5空白对照组4095
[0091]
实施例5黄连素在抗病毒和抗细菌感染上的作用
[0092]
在实施例3中实验组与空白对照组在断奶时各有304头和283头仔猪，统计断奶时仔猪黄白痢(大肠杆菌感染)的发生率发现，实验组仔猪断奶时发生黄白痢的比例极显著低于空白对照组的仔猪，并且实验组发病仔猪经黄连素治疗(给药方式、剂量与实施例3同)，死亡率为0，对照组发病仔猪给予口服补液盐(ors)，结果如表5示：
[0093]
表5
[0094] 起始数目(头)黄白痢发生率(％)仔猪死亡率(％)实验组3041.640空白对照组2839.185.3
[0095]
实施例6巴马汀对非洲猪瘟病毒的作用
[0096]
1、实验用猪：位于江西省某发生非洲猪瘟疫情的养殖场，挑选暂无临床症状且经唾液采样pcr确诊非洲猪瘟病毒感染阳性的怀孕母猪。已有临床症状的猪全部扑杀并无害化处理。全过程做好生物安全措施。
[0097]
2、分组：将实验用猪随机分为实验组和空白对照组，共2组，每组25头：
[0098]
(1)实验组：常规饲养+巴马汀；
[0099]
(2)空白对照组：常规饲养。
[0100]
3、处理：实验组给予巴马汀，给药方式：混饲，剂量：20mg/kg b.w.，连续使用。每天记录死亡情况，统计30天后各组的死亡率。
[0101]
4、结果如表6示，巴马汀可以降低非洲猪瘟病毒阳性猪的死亡率。
[0102]
表6
[0103] 起始数目(头)死亡率(％)实验组2572空白对照组25100
[0104]
实施例7甲基黄连碱对非洲猪瘟病毒的作用
[0105]
1、实验用猪：位于广东省某发生非洲猪瘟疫情的养殖场，挑选暂无临床症状且经唾液采样pcr确诊非洲猪瘟病毒阳性的保育猪。已有临床症状的猪全部扑杀并无害化处理。全过程做好生物安全措施。
[0106]
2、分组：将实验用猪随机分为如下2组，每组30头：
[0107]
(1)实验组：常规饲养+甲基黄连碱；
[0108]
(2)空白对照组：常规饲养。
[0109]
3、处理：实验组给予甲基黄连碱，给药方式：混饮，剂量：0.5kg/吨饮水，自由饮用，连续使用。每天记录死亡情况，统计30天后各组的死亡率。
[0110]
4、结果如表7示，甲基黄连碱可以降低非洲猪瘟病毒阳性保育猪的死亡率。
[0111]
表7
[0112] 起始数目(头)死亡率(％)实验组3053.3空白对照组3093.3
[0113]
实施例8药根碱、血根碱、白屈菜红碱对非洲猪瘟病毒的作用
[0114]
1、实验用猪：位于河南省某发生非洲猪瘟疫情的养殖场，挑选暂无临床症状且经唾液采样pcr确诊非洲猪瘟病毒阳性的70kg～90kg肉猪。已有临床症状的猪全部扑杀并无害化处理。全过程做好生物安全措施。
[0115]
2、分组：将实验用猪随机分为如下2组，每组40头：
[0116]
(1)实验i组：常规饲养+药根碱；
[0117]
(2)实验ii组：常规饲养+血根碱；
[0118]
(3)实验iii组：常规饲养+白屈菜红碱；
[0119]
(4)空白对照组：常规饲养。
[0120]
3、处理：3个实验组分别给予药根碱、血根碱、白屈菜红碱，给药方式：混饲，剂量：0.05kg/吨饲料(以有效成分计)，连续使用。每天记录死亡情况，统计30天后各组的死亡率。
[0121]
4、结果如表8示，药根碱、血根碱及白屈菜红碱均可不同程度降低非洲猪瘟病毒阳性猪的死亡率。
[0122]
表8
[0123] 起始数目(头)死亡率(％)实验i组4060实验ii组4075实验iii组4067.5空白对照组4095
[0124]
实施例9小檗红碱、5-羟基小檗碱、非洲防己碱对非洲猪瘟病毒的作用
[0125]
1、实验用猪：位于广东省某发生非洲猪瘟疫情的养殖场，挑选暂无临床症状且经唾液采样pcr确诊非洲猪瘟病毒阳性的怀孕母猪。已有临床症状的猪全部扑杀并无害化处理。全过程做好生物安全措施。
[0126]
2、分组：将实验用猪随机分为如下4组，每组30头：
[0127]
(1)实验i组：常规饲养+小檗红碱；
[0128]
(2)实验ii组：常规饲养+5-羟基小檗碱；
[0129]
(3)实验iii组：常规饲养+非洲防己碱；
[0130]
(4)空白对照组：常规饲养。
[0131]
3、处理：3个实验组分别给予小檗红碱、5-羟基小檗碱、非洲防己碱，给药方式：混
饲，剂量：0.1kg/吨饲料，连续使用。每天记录死亡情况，统计30天后各组的死亡率。
[0132]
4、结果如表9示，小檗红碱、5-羟基小檗碱、非洲防己碱均可不同程度降低非洲猪瘟病毒阳性猪的死亡率。
[0133]
表9
[0134] 起始数目(头)死亡率(％)实验i组3056.6实验ii组3063.3实验iii组3070空白对照组30100
[0135]
实施例10异喹啉生物碱组合物对非洲猪瘟病毒的作用
[0136]
1、实验用猪：位于福建某发生非洲猪瘟疫情的养殖场，挑选暂无临床症状且经唾液采样pcr确诊非洲猪瘟病毒阳性50kg～70kg肉猪。已有临床症状的猪扑杀并全部经无害化处理。全过程做好生物安全措施。
[0137]
2、分组：将实验用猪随机分为如下6组，每组20头：
[0138]
(1)实验i组：常规饲养+给药(黄连素)；
[0139]
(2)实验ii组：常规饲养+给药(血根碱)；
[0140]
(3)实验iii组：常规饲养+给药(白屈菜红碱)；
[0141]
(4)实验iv组：常规饲养+给药(黄连素+血根碱)
[0142]
(5)实验v组：常规饲养+给药(黄连素+白屈菜红碱)
[0143]
(6)空白对照组：常规饲养。
[0144]
3、给药方式：混饲，剂量：如表10示，连续使用。每天记录死亡情况，统计30天后各组的死亡率。
[0145]
4、结果显示，与空白对照组相比，实验i-v组均能降低非洲猪瘟病毒阳性猪的死亡率。同时结果还显示，与实验i、ii、iii组相比，黄连素和血根碱联用的实验iv组或黄连素和白屈菜红碱联用的实验v组对非洲猪瘟病毒阳性猪死亡率的降低作用得到了更加显著的降低，表明黄连素和血根碱或白屈菜红碱联用有明显的协同增效作用。
[0146]
表10
[0147][0148][0149]
实施例11药根碱、血根碱、白屈菜红碱、黄连素对pedv的作用
[0150]
1、实验用猪：位于江西某的养殖场发生流行性腹泻(ped)，挑选已有临床症状的3-5日龄哺乳仔猪，采集粪便经pcr确诊为ped，及其哺乳母猪。
[0151]
2、分组：将实验用猪随机分为5组，每组哺乳母猪5头：
[0152]
(1)实验i组：母猪，常规饲养+药根碱；仔猪，灌服药根碱；
[0153]
(2)实验ii组：母猪，常规饲养+血根碱；仔猪，灌服血根碱；
[0154]
(3)实验iii组：母猪，常规饲养+白屈菜红碱；仔猪，灌服白屈菜红碱；
[0155]
(4)实验iv组：母猪，常规饲养+黄连素；仔猪，灌服黄连素；
[0156]
(5)空白对照组：母猪，常规饲养；仔猪，灌服口服补液盐溶液。
[0157]
3、处理：实验组：哺乳母猪，给药方式：混饲，剂量：3g/头/天(以有效成分计)；哺乳仔猪，给药方式：配制成10％水溶液(混悬液)灌服，剂量：10mg/kg b.w.(以有效成分计)，连用10天。每天记录仔猪死亡情况，统计各组的第10日龄存活率和第21日龄存活率。
[0158]
4、结果如表11示，黄连素可显著提高感染pedv仔猪的存活率，药根碱、血根碱及白屈菜红碱可极显著提高仔猪的存活率。
[0159]
表11
[0160][0161]
实施例12黄连素、血根碱在抗病毒和促生长的用途
[0162]
1、实验用猪：位于广东某发生传染性胃肠炎(tge)疫情的养殖场，挑选已有临床症状的且经pcr确诊传染性胃肠炎病毒阳性的25日龄断奶仔猪75头和传染性胃肠炎病毒阴性的25日龄健康断奶仔猪25头
[0163]
2、分组：将病猪随机分为三组，每组25头，健康猪设为健康对照组。
[0164]
(1)实验i组：常规饲养+黄连素；
[0165]
(2)实验ii组：常规饲养+血根碱；
[0166]
(3)阳性对照组：常规饲养；
[0167]
(4)健康对照组：常规饲养。
[0168]
3、处理：两个实验组分别给与黄连素、血根碱，给药方式：混饮，剂量：0.1kg/吨饮水(以有效成分计)，自由饮用，连续使用。每天记录死亡情况，统计15天后各组的死亡率及比较其料肉比和日增重
[0169]
4、结果如表12示，黄连素、血根碱均可显著提高病猪的存活率，与健康对照组相比料肉比更低、日增重更高。
[0170]
表12
[0171] 起始猪数(头)存活率(％)料肉比平均日增重(kg)实验i组25881.31
±
0.150.35
±
0.02实验ii组25921.21
±
0.110.40
±
0.02阳性对照组25241.92
±
0.090.19
±
0.01健康对照组25961.5
±
0.090.29
±
0.01
[0172]
实施例13黄连素、药根碱对prrs的作用
[0173]
1、实验用猪：位于河南省的某发生prrs疫情的养殖场，经实验室pcr确诊为prrsv感染，毒株为nadc30株。挑选确诊prrsv阳性的25-35日龄保育猪为实验用猪。
[0174]
2、分组：将实验用猪随机分为2组，每组30头：
[0175]
(1)实验i组：常规饲养+黄连素；
[0176]
(2)实验ii组：常规饲养+药根碱；
[0177]
(3)空白对照组：常规饲养。
[0178]
3、处理：实验组分别给予黄连素、药根碱，给药方式：混饲，剂量分别为：0.5kg/吨饲料、0.1kg/吨饲料(以有效成分计)，连用14天。每天记录死亡情况，统计30天后各组的死亡率。
[0179]
4、结果如表13示，黄连素、药根碱可以降低感染prrsv保育猪的死亡率。
[0180]
表13
[0181] 起始数目(头)死亡率(％)实验i组306.7实验ii组3010空白对照组3026.7
[0182]
实施例14血根碱对猪环状病毒2型的作用
[0183]
1、实验用猪：位于广东省某发生猪环状病毒2型(pcv-2)疫情的养殖场，挑选已经pcr确诊猪环状病毒2型阳性的5-6周龄的断奶仔猪。
[0184]
2、分组：将实验用猪随机分为2组，每组30头：
[0185]
(1)实验组：常规饲养+血根碱；
[0186]
(2)空白对照组：常规饲养。
[0187]
3、处理：实验组给予血根碱，给药方式：混饮，剂量：0.05kg/吨饮水(以有效成分计)，连用7天。每天记录死亡情况，统计30天后各组的死亡率。
[0188]
4、结果如表14示，血根碱可以显著降低猪环状病毒2型阳性的断奶仔猪的死亡率。
[0189]
表14
[0190] 起始数目(头)死亡率(％)实验组303.3空白对照组3020
[0191]
实施例15黄连素对非洲猪瘟病毒的作用
[0192]
1、实验用猪：位于福建省某发生非洲猪瘟疫情的养殖场，挑选暂无临床症状且经唾液采样pcr确诊非洲猪瘟病毒阳性保育猪。已有临床症状的猪全部扑杀并无害化处理。全过程做好生物安全措施。
[0193]
2、分组：将实验用猪随机分为如下2组，每组20头：
[0194]
(1)实验组：常规饲养+黄连素注射液(0.5％)；
[0195]
(2)空白对照组：常规饲养+生理盐水。
[0196]
3、处理：通过给实验猪肌肉注射黄连素注射液(黄连素硫酸氢盐、羟丙基-β-环糊精、增溶剂、ph调节剂、注射用水等，常法制成注射液)，给药方式：肌肉注射，剂量：5mg/kg b.w.(以黄连素计)，每天一次，连用15天。每天记录死亡情况，统计30天后各组的死亡率。
[0197]
4、结果如表15示，黄连素注射液可以降低非洲猪瘟病毒阳性猪的死亡率。
[0198]
表15
[0199] 起始数目(头)死亡率(％)实验组2045空白对照组20100
[0200]
实施例16体外抗病毒活性研究评价异喹啉类化合物对非洲猪瘟病毒感染的抑制作用
[0201]
1、检测方法(t/cvma 5-2018，非洲猪瘟病毒实时荧光pcr检测方法)：采用针对非洲猪瘟病毒vp72基因的引物及探针通过实时荧光pcr检测病毒dna。
[0202]
引物及探针序列：
[0203]
上游引物asf-cadc-rpcrf：
[0204]5’‑
1528
‑‑
atagagatacagctcttccag-1548-3'
[0205]
下游引物asf-cadc-rpcrr：
[0206]5’‑
1660-gtatgtaagagctgcagaac-1679-3'
[0207]
荧光探针asf-cadc-probe：
[0208]5’‑
1638-fam-tatcgataagattgat-mgb-1653-3'
[0209]
2、操作方法：
[0210]
将感染非洲猪瘟病毒的猪原代肺泡巨噬细胞暴露于浓度分别为500、400、300、200、100、75、50、25、10、5和1ug/ml的黄连素、黄连碱、药根碱、血根碱等异喹啉生物碱溶液中，培养7天，每24小时更换培养基。7天后将病毒dna从感染的猪原代肺泡巨噬细胞中提取出来的，采用pcr与实时荧光定量pcr方法对病毒dna进行检测。
[0211]
3、rt-pcr判断标准：参照t/cvma5-2018
[0212]
当阳性对照ct值≤28.0且出现典型扩增曲线，阴性对照无ct值无扩增曲线时，实验成立。当被检样品出现典型的扩增曲线且ct值≤38.0时，判为非洲猪瘟病毒核酸阳性；被检样品无ct值，判为非洲猪瘟病毒核酸阴性；对于ct值》38.0的样品且出现典型的扩增曲线，应重检，重检仍出现上述结果的判为阳性，否则判为阴性。
[0213]
4、实验结果表明，黄连素、黄连碱、药根碱、血根碱等异喹啉生物碱对非洲猪瘟病毒有较优的抑制作用。
[0214]
实施例17体外抗病毒活性研究评价异喹啉类化合物对猪繁殖和呼吸障碍综合症病毒(prrsv)感染的作用
[0215]
ma104细胞经黄连素、黄连碱、药根碱、小檗红碱等异喹啉生物碱预处理24小时。然后在存在异喹啉生物碱的情况下将细胞暴露于prrsv。然后所述细胞经pbs冲洗3次以除去未结合的病毒，并加入异喹啉生物碱的新鲜培养基。将所述细胞继续孵育24小时，随后用
4％甲醛进行固定。使用猪多克隆抗prrsv一抗以及fitc-标记的抗猪二抗，通过间接免疫荧光检测病毒感染。使用共聚焦显微镜检测免疫荧光。通过dapi染色的细胞核，将显示(由fitc染色产生的)绿色荧光的细胞记作阳性。
[0216]
实验结果表明黄连素、黄连碱、药根碱、小檗红碱等异喹啉生物碱能够提高细胞对病毒感染的预防作用。
[0217]
实施例18体外抗病毒活性研究评价黄连素对多种病毒感染的作用
[0218]
培养细胞经黄连素预处理24小时。然后在存在黄连素的情况下将细胞暴露于多种病毒。然后所述细胞经pbs冲洗3次以除去未结合的病毒，并加入异喹啉生物碱的新鲜培养基。将所述细胞继续孵育24小时，随后用4％甲醛进行固定，或根据特定的一抗或样品用有效成分为乙醇、甲醇或其它类型的固定液。根据不同的病毒和细胞选择合适的一抗和二抗，通过间接免疫荧光检测病毒感染。使用共聚焦显微镜检测免疫荧光。
[0219]
实验结果表明，黄连素能提高细胞对多种病毒感染的预防作用。
[0220]
实施例19黄连素对prrsv感染所引起的炎症反应的影响作用
[0221]
采用pge2检测试剂盒，分别在24、48h时收集病毒感染后的ma104细胞上清液，按照试剂盒测定方法测定细胞上清中的pge2含量。
[0222]
实验结果表明黄连素能够降低病毒感染过程中引起的一些炎症因子的分泌，降低病毒感染过程中所导致的炎症反应，起到保护机体的功能。
[0223]
实施例20药根碱对猪血小板凝聚的抑制作用
[0224]
1、血标本的采集：血液样本取自pedv阳性猪，静脉取血30ml，按照1∶9的比例加入抗凝剂3.28％柠檬酸钠。
[0225]
2、血浆制备：富血小板血浆(prp)的制备：在25℃-32℃温度下离心，转速为500-800转/分，时间原则上控制在10分钟，待离心机自然停止后取出(如出现溶血现象应重新采血)，用移液器将离心出的prp吸到另一试管中，尽量将prp全部吸出。贫血小板血浆(ppp)的制备：将已吸取过prp的血再离心，转速是2000-2500转/分，时间控制在10分钟左右，取出上清即为ppp。用ppp调整prp中血小板计数为250
×
109个/l。制取prp后30min后开始血小板凝聚测定，整个测活过程在3小时内完成。
[0226]
3、实验过程：按照bom比浊法进行血小板凝聚试验：在空白管中加入350μlppp，37℃保温并设定透光率为100％。测定管中加入300μl prp，分别加入各代测样品30μl，计算相应样品终浓度，设定透光率为0％。样品37℃保温3分钟，加入20μl血小板凝聚诱导剂adp(终浓度10μmol/l)和胶原(终浓度3μg/ml)，开始检测，一共检测5分钟，记录5分钟内血小板的最大聚集率(maximum aggregation rate mar)。用生理盐水(ns)作对照。计算血小板凝聚抑制率(aggregation inhibition rate，air)，计算最大抑制率和半抑制浓度(ic50)。
[0227]
4、实验结果表明药根碱在发挥抗病毒的作用的同时还有抗血小板凝聚活性，具有开发为新的抗病毒和抗血小板凝聚产品的前景。
[0228]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。