一种穿心莲在制备用于预防神经退行性疾病药物中的用途

1.本发明属于生物医学技术领域，尤其涉及一种穿心莲在制备用于预防神经退行性疾病药物中的用途。


背景技术：

2.目前，随着人口老龄化的加剧，神经退行性疾病的发病率逐年攀升。根据世界卫生组织的预测，神经退行性疾病将在未来20年中成为仅次于心血管疾病的第二大常见死因。阿尔兹海默氏症(alzheimer's disease,ad)是临床最常见的神经退行性疾病，是导致老年痴呆症的主要原因，并正在以极快的速度成为本世纪最昂贵、最致命和最沉重的疾病之一。ad主要表现为认知功能障碍、渐进性记忆障碍、人格改变及语言障碍等神经精神症状。β-淀粉样(aβ)斑块和神经元内高磷酸化tau蛋白聚集物(神经纤维缠结)是ad的典型神经病理学特征。已有研究发现aβ斑块具有突触毒性，能够诱导轴突静脉曲张和神经突触断裂，过度磷酸化的tau蛋白则会导致短棘和丝状伪足的增加及海马锥体神经元总树突长度的减少。
3.帕金森氏病(parkinson's disease，pd)又称为“震颤性麻痹”，发病率仅次于ad。丘脑下核和黑质的致密区域中多巴胺能神经元的大量丢失是pd最突出和统一的形态学特征，因此pd又被认为是与基底神经节中多巴胺消耗有关的神经退行性疾病。pd会引起进行性运动和非运动性残疾，其中非运动性残疾包括情绪、认知、睡眠、自主神经和胃肠道症状。这些疾病不仅对老年人的身体健康和日常生活造成巨大的潜在威胁，也进一步加剧了社会的负担。然而，目前仍没有有效的方法来彻底防治该类疾病。因此，寻找新型的、高效的神经退性病疾病防治药物已成为人们研究的热点。
4.中草药来源丰富且结构复杂，大部分具有多成分、多靶点的作用，特别在应对糖尿病、神经退行性疾病、炎症、癌症等复杂疾病时具有较好疗效。因此利用中草药或从中草药中寻找具有防治神经退行性疾病的活性成分已成为神经退行性疾病药物研发的主要出发点之一。网络药理学是一个新兴领域，它能够结合口服生物利用度预测及多种药物靶标预测和网络分析，获得目标中药的活性化合物和防治靶标，也能够全面分析中药方剂或单味药的复杂网络调控机制。近年来，越来越多的学者运用网络药理学方法研究中草药在防治神经退行性疾病上的潜力，如现有技术1运用网络药理学方法分析了山茱萸－肉苁蓉防治帕金森病的作用机制。现有技术2运用网络药理学方法来确定石菖蒲在ad中的潜在作用机制和分子靶点。
5.穿心莲(andrographis paniculata)，又名春莲秋柳、一见喜、榄核莲、苦胆草等，是爵床科植物穿心莲的全草或叶，现已被广泛用作药用植物。穿心莲性寒、味苦，归心、肺、大肠、膀胱经，不仅具有清热解毒、凉血、消肿的功效，还具有抗癌、抗病毒、抗肿瘤及防治糖尿病等多种功效。
6.通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术尚没有将穿心莲应用于预防神经退行性疾病药物中的方法。本发明借鉴网络药理学方法，确定穿心莲在预防神经退行性疾病中的关键活性成分、作用靶点及信号通路，揭示其可能存在的作用机制，为穿心
莲临床应用提供基础理论依据。同时，通过活性研究获得具有抗神经炎和神经营养作用的先导化合物，为预防神经退行性疾病药物的研究提供药学依据。


技术实现要素：

7.针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种穿心莲在制备用于预防神经退行性疾病药物中的用途。
8.本发明是这样实现的，一种穿心莲，按干燥品计算，含穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的总量不得少于1.5％在制备用于预防神经退行性疾病的药物中的用途。
9.进一步，所述神经退行性疾病的药物包含穿心莲的活性成分。
10.进一步，所述穿心莲的活性成分包括：汉黄岑素、千层纸素a、黄芩黄酮以及苏荠宁黄酮。
11.进一步，所述穿心莲活性成分通过促进ngf诱导的pc12细胞神经轴突生长起作用。
12.进一步，所述穿心莲活性成分通过抑制lps诱导的bv-2细胞中促炎因子的产生起作用。
13.进一步，所述神经退行性疾病包括：阿尔兹海默氏症与帕金森氏病。
14.本发明的另一目的在于提供一种验证所述穿心莲在制备用于预防神经退行性疾病药物中的用途的基于网络药理学的穿心莲活性测定方法，所述基于网络药理学的穿心莲活性测定方法包括：
15.步骤一，利用tcmsp获取、筛选穿心莲的活性成分；并通过sea、swiss、stitch和batman-tcm数据库获取与所述穿心莲的活性成分相关的潜在靶点；
16.步骤二，利用ctd、ttd、genecards、pharmgkb和mas 3.0筛选得到所述潜在靶点中与阿尔兹海默氏症和帕金森氏症相关的靶点；
17.步骤三，通过david对步骤二获取的靶点进行基因本体分析和京都基因与kegg分析；
18.步骤四，采用cytoscape构建穿心莲的活性成分-靶点和靶点-通路网络图；
19.步骤五，对得到的穿心莲的活性成分-靶点和靶点-通路网络图进行分析确定穿心莲活性成分中可用于制备用于预防神经退行性疾病的药物的活性成分。
20.进一步，所述步骤一中，利用tcmsp获取、筛选穿心莲的活性成分包括：利用tcmsp筛选ob值≥30％、dl值≥0.18的穿心莲活性成分并构建穿心莲活性成分数据库。
21.进一步，所述步骤四中，采用cytoscape构建穿心莲的活性成分-靶点和靶点-通路网络图包括：
22.将穿心莲中与阿尔兹海默氏症和帕金森氏症相关的主要活性成分及作用靶点和信号通路导入cytoscape中，进行网络拓扑分析，构建可视化的穿心莲的活性成分-靶点和靶点-通路网络图。
23.进一步，所述基于网络药理学的穿心莲活性测定方法还包括：
24.以神经生长因子(ngf)诱导的pc12细胞和脂多糖(lps)诱导的bv-2细胞为模型，检测穿心莲部分活性成分的神经营养和抗神经炎活性。
25.结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的
技术方案所具备的优点及积极效果为：
26.第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
27.本发明针对筛选得到的29个化合物中部分化合物进行了神经营养和抗神经炎活性测试。结果表明，穿心莲活性成分24能够显著的促进ngf诱导的pc12细胞神经轴突生长，而化合物16则能够显著的抑制lps诱导的bv-2细胞中促炎因子的产生。
28.本发明基于网络药理学方法系统分析了穿心莲防治ad和pd的潜在靶点，及关键信号通路，为穿心莲防治神经退行性疾病提供了理论基础，为后续相关药物的研究提供方法和思路。
29.本发明利用网络药理学方法筛选了穿心莲活性成分，对与神经退行性疾病ad和pd相关的潜在靶点进行了有效分析，共获得与ad相关的靶点116个，与pd相关的靶点90个，发现穿心莲活性成分中汉黄岑素、千层纸素a、黄芩黄酮、苏荠宁黄酮对ad和pd均具有较多靶点，推测这些化合物是穿心莲防治神经退行性疾病发挥药效的重要化合物。同时，可视化构建了“靶点-信号通路”网络，分析均显示穿心莲防治ad和pd的作用途径主要与促进细胞存活、抑制细胞凋亡、参与细胞增殖和细胞周期过程以及影响神经活性配体-受体相互作用等有关。
30.第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
31.本发明通过网络药理学的方法对穿心莲的主要活性成分、作用靶点及信号通路进行分析和总结，并结合相关的活性测定，确定穿心莲对ad和pd的潜在防治作用，能够为神经退行性疾病药物研发提供新的策略和一定的药理学依据。
32.第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
33.(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
34.本发明将药物作用疾病的研究网络化、系统化，使对穿心莲的研究更具有目的性和靶向性，大大节约了药物研究费用和缩短了研究周期。同时，结合具体实验，为获得高活性化合物提供了模板，提高了药物研究的效率。
35.(2)本发明的技术方案解决了人们一直渴望解决、但始终未能获得成功的技术难题：
36.本发明为世纪难题神经退行性疾病药物的研发提供了技术依据，有望通过药食同源食物穿心莲预防神经退行性疾病的发生发展。
附图说明
37.图1是本发明实施例提供的基于网络药理学的穿心莲活性测定方法流程图；
38.图2是本发明实施例提供的穿心莲活性成分对应疾病靶点数图(a和b分别为ad和pd对应靶点数)；
39.图3是本发明实施例提供的“活性成分—靶点—疾病”网络图(a和b分别与ad和pd相关)；
40.图4是本发明实施例提供的go富集分析图(a和b分别为与ad和pd相关)；
41.图5是本发明实施例提供的穿心莲防治ad(a)和pd(b)的“靶点—信号通路”图；
42.图6是本发明实施例提供的穿心莲活性成分对ngf诱导的pc12细胞神经突起生长的影响示意图；
43.图6(a)是本发明实施例提供的化合物1，2，3,4，16和28在10μm时对ngf诱导的pc12细胞分化率的影响示意图；
44.图6(b)是本发明实施例提供的化合物24在不同浓度下对ngf诱导的pc12细胞分化率的影响示意图；
45.图6(c)是本发明实施例提供的1，2，3,4，16和28对pc12细胞形态的影响示意图；
46.图6(d)是本发明实施例提供的24对pc12细胞形态的影响示意图；
47.图7是本发明实施例提供的穿心莲活性成分对lps诱导的bv-2细胞中促炎介质产生的影响示意图；
48.图7(a)是本发明实施例提供的化合物3、4、16和28分别在1和10μm时对lps诱导的bv-2细胞上清中no浓度的影响示意图；
49.图7(b)是本发明实施例提供的化合物16在不同浓度时对lps诱导的bv-2细胞上清中no浓度的影响示意图；
50.图7(c)是本发明实施例提供的16在不同浓度时对lps诱导的bv-2细胞上清中il-6浓度的影响示意图；
51.图7(d)是本发明实施例提供的在不同浓度时对lps诱导的bv-2细胞上清中tnf-α浓度的影响示意图。
具体实施方式
52.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
53.一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
54.如图1所示，本发明实施例提供的基于网络药理学的穿心莲活性测定方法包括：
55.s101，利用tcmsp获取、筛选穿心莲的活性成分；并通过sea、swiss、stitch和batman-tcm数据库获取与所述穿心莲的活性成分相关的潜在靶点；
56.s102，利用ctd、ttd、genecards、pharmgkb和mas 3.0筛选得到所述潜在靶点中与阿尔兹海默氏症和帕金森氏症相关的靶点；
57.s103，通过david对步骤s102获取的靶点进行基因本体分析和京都基因与kegg分析；
58.s104，采用cytoscape构建穿心莲的活性成分-靶点和靶点-通路网络图；
59.s105，对得到的穿心莲的活性成分-靶点和靶点-通路网络图进行分析确定穿心莲活性成分中可用于制备用于预防神经退行性疾病的药物的活性成分。
60.步骤s101中，本发明实施例提供的利用tcmsp获取、筛选穿心莲的活性成分包括：利用tcmsp筛选ob值≥30％、dl值≥0.18的穿心莲活性成分并构建穿心莲活性成分数据库。
61.步骤s104中，本发明实施例提供的采用cytoscape构建穿心莲的活性成分-靶点和
靶点-通路网络图包括：
62.将穿心莲中与阿尔兹海默氏症和帕金森氏症相关的主要活性成分及作用导入cytoscape中，进行网络拓扑分析，构建可视化的穿心莲的活性成分-靶点和靶点-通路网络图。
63.本发明实施例提供的基于网络药理学的穿心莲活性测定方法还包括：
64.以神经生长因子(ngf)诱导的pc12细胞和脂多糖(lps)诱导的bv-2细胞为模型，检测穿心莲部分活性成分的神经营养和抗神经炎活性。
65.穿心莲按干燥品计算，含穿心莲内酯、新穿心莲内酯、14-去氧穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯的总量不得少于1.5％。
66.二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
67.将本发明实施例提供的穿心莲或穿心莲活性成分应用制备用于治疗、缓解、预防神经退行性疾病的药物中。
68.实施例1穿心莲活性成分的收集方法
69.借助中药系统药理学数据库与分析平台(tcmsp)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索“穿心莲”的活性成分，筛选标准为：ob值(oral bioavailability)≥30％和dl值(drug-likeness)≥0.18。筛选后共获得穿心莲活性成分29个，包括汉黄岑素、千层纸素a、苏荠宁黄酮、黄芩黄酮等。
70.实施例2穿心莲与ad和pd相关靶点的收集方法
71.借助similarity ensemble approach(sea,http://sea.bkslab.org/),swiss target prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/),stitch(http://stitch.embl.de/)和batman-tcm(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)数据库，设定检索物种类别为“homo sapiens”，检索穿心莲主要活性成分靶点信息，合并数据库获得穿心莲作用靶点。将上述获得的靶点导入comparative toxicogenomics database(ctd，http://ctdbase.org/)，therapeutic target database(ttd,http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)，genecards:the human gene database(https://www.genecards.org/),pharmacogenomics knowledgebase(https://www.pharmgkb.org/)和molecule annotation system 3.0(mas 3.0,http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/)进行检索，设定检索物种类别为“homo sapiens”，检索词分别为“alzheimer's disease”和“parkinson's disease”，收集ad和pd相关靶点，利用cytoscape ver.3.7.0(https://cytoscape.org/)并使用merge功能汇总各数据库靶点信息绘制“活性成分—靶点”网络图(active ingredient-target-network)。可得出穿心莲中的汉黄岑素、千层纸素a、黄芩黄酮、咖啡酸、苏荠宁黄酮有可能为与ad相关的主要活性成分，主要针对ptgs2、ptgs1、mapt、cyp1b1、abcb1等基因靶点；千层纸素a、汉黄岑素、黄芩黄酮、苏荠宁黄酮、穿心莲黄酮、甘油单油酸酯有可能为与pd相关的主要活性成分，主要针对prkcd、adora1、mapt、abcb1等基因靶点。
72.实施例3穿心莲与ad和pd相关信号通路的收集方法
73.将筛选出的作用靶点转换为基因名，上传至david数据库，进行kegg信号通路富集分析。ad的kegg通路富集提示31个靶点富集在23条通路上，主要涉及alzheimer’s disease、pi3k-akt signaling pathway、pathways in cancer、toxoplasmosis等信号通
路；pd的kegg通路富集提示27个靶点富集在13条通路上，主要涉及alzheimer’s disease、pathways in cancer、neuroactive ligand-receptor interaction、pi3k-akt signaling pathway等信号通路。
74.实施例4穿心莲部分成分的神经营养活性
75.1.细胞：pc12细胞由中国科学院细胞库提供。
76.2.试剂：胎牛血清由hyclone公司提供，马血清和dmem培养基由gibco公司提供，多聚赖氨酸由sigma公司提供，ngf由武汉海特生物制药股份有限公司提供。
77.3.药物：化合物1，2，3，4，16和28由上海源叶生物科技有限公司提供。
78.4.实验方法：pc12细胞培养于含10％马血清、5％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的dmem培养基中，于37℃、5％co2恒湿培养箱中培养至对数生长期。将pc12细胞以2
×
104个/孔的密度接种于多聚赖氨酸(pll)包被的24孔板中，待贴壁后用不同浓度的待测化合物和20ng/ml ngf共同处理72h。实验中以0.1％dmso为空白对照，20ng/ml ngf为阳性对照。待化合物作用72h，观察pc12细胞形态变化。计数时，将含有一个或多个神经突起，且至少有一个神经突起的长度大于或等于胞体直径的细胞视为阳性细胞。细胞分化率＝阳性细胞数/总细胞数
×
100％。
79.5.试验结果：化合物1，2，3，4和28具有明显的抑制神经轴突生长的作用。同时，随着浓度的增加，化合物24的促神经轴突生长作用逐步增强。与ngf(细胞分化率为11.49％)相比，24在0.4和0.5μm时的细胞分化率分别可达17.93％和18.71％。
80.实施例5穿心莲部分成分的抗神经炎活性
81.1.细胞：bv-2细胞由中国科学院细胞库提供。
82.2.试剂：胎牛血清由hyclone公司提供，dmem培养基由gibco公司提供，lps由sigma公司提供，no检测试剂盒由碧云天生物试剂有限公司提供，tnf-α和il-6检测试剂盒由博士德生物科技有限公司提供。
83.3.药物：化合物3、4、16和28由上海源叶生物科技有限公司提供。
84.4.实验方法：(1)no浓度测定：bv-2细胞培养于含有10％fbs和1％青霉素/链霉素的dmem培养基中，并置于37℃，5％co2培养箱中培养至对数生长期。将细胞以2
×
104个/孔的密度接种于96孔板中，培养24h以待细胞贴壁。用不同浓度的待测化合物和1μg/ml lps共同处理24h。利用griess试剂检测培养上清中no的浓度。(2)tnf-α和il-6浓度测定：用不同浓度的化合物和1μg/ml lps共同处理细胞6h(tnf-α)或24h(il-6)后，利用试剂盒分别检测化合物对lps诱导的bv-2细胞培养上清中促炎介质肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和白介素-6(il-6)浓度的影响。
85.5.试验结果：化合物3、4、16和28中16能够明显的抑制no的产生。随着浓度的增加，化合物16的no抑制作用明显增强，尤其是在20μm，no的抑制率几乎达100％。另外，随着化合物16浓度的增大，il-6和tnf-α的浓度明显降低。
86.三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
87.下面结合具体实验对本发明的技术效果做进一步说明。
88.1.资料与方法
89.1.1穿心莲活性成分的收集与筛选
90.借助中药系统药理学数据库与分析平台(tcmsp)(http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索“穿心莲”的活性成分，筛选标准为：ob值(oral bioavailability)≥30％和dl值(drug-likeness)≥0.18。
91.1.2收集穿心莲活性成分的作用靶点
92.借助similarity ensemble approach(sea,http://sea.bkslab.org/),swiss target prediction(http://www.swisstargetprediction.ch/),stitch(http://stitch.embl.de/)和batman-tcm(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)1数据库，设定检索物种类别为“homo sapiens”，检索穿心莲主要活性成分靶点信息，合并数据库获得穿心莲作用靶点并进行后续分析。
93.1.3ad和pd疾病靶点的获取
94.将上述获得的靶点导入comparative toxicogenomics database(ctd，http://ctdbase.org/)，therapeutic target database(ttd,http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/)，genecards:the human gene database(https://www.genecards.org/),pharmacogenomics knowledgebase(https://www.pharmgkb.org/)和molecule annotation system 3.0(mas 3.0,http://bioinfo.capitalbio.com/mas3/)进行检索，设定检索物种类别为“homo sapiens”，检索词分别为“alzheimer's disease”和“parkinson's disease”，收集ad和pd相关靶点，汇总各数据库靶点信息绘制“活性成分—靶点”网络图(active ingredient-target-network)，以进行后续分析。
95.1.4构建“活性成分—靶点—疾病”网络
96.将穿心莲的主要活性成分、ad和pd的靶点信息导入cytoscape ver.3.7.0(https://cytoscape.org/)，使用merge功能分别筛选出穿心莲主要活性成分中对ad和pd的作用靶点，绘制“活性成分—靶点—疾病”网络图(active ingredient-target-disease-network)，对调控网络图进一步分析得出穿心莲防治ad和pd的主要活性成分。
97.1.5kegg通路与go功能富集分析
98.将筛选出的作用靶点转换为基因名，上传至david数据库，进行kegg信号通路富集分析与go功能富集分析，考察ad和pd相关作用靶点的功能分布及可能涉及到的信号调控通路。
99.1.6促ngf诱导的pc12细胞神经突起生长活性评价
100.pc12细胞培养于含10％马血清(horse serum，hs)、5％胎牛血清(fetal bovine serum，fbs)和1％青霉素/链霉素的dmem培养基中，于37℃、5％co2恒湿培养箱中培养至对数生长期。
101.将pc12细胞以2
×
104个/孔的密度接种于多聚赖氨酸(pll)包被的24孔板中，待贴壁后用不同浓度的待测化合物和20ng/ml ngf共同处理72h。实验中以0.1％dmso为空白对照，20ng/ml ngf为阳性对照。待化合物作用72h，观察pc12细胞形态变化。计数时，将含有一个或多个神经突起，且至少有一个神经突起的长度大于或等于胞体直径的细胞视为阳性细胞。细胞分化率＝阳性细胞数/总细胞数
×
100％。
102.1.7抗神经炎症活性
103.bv-2细胞培养于含有10％fbs和1％青霉素/链霉素的dmem培养基中，并置于37℃，
5％co2培养箱中培养至对数生长期。
104.1.7.1lps诱导的bv-2细胞中no含量测定
105.将细胞以2
×
104个/孔的密度接种于96孔板中，培养24h以待细胞贴壁。用不同浓度的待测化合物和1μg/ml lps共同处理24h。利用griess试剂检测培养上清中no的浓度。
106.1.7.2lps诱导的bv-2细胞中tnf-α和il-6的浓度测定
107.用不同浓度的化合物16和1μg/ml lps共同处理细胞6h(tnf-α)或24h(il-6)后，利用试剂盒分别检测16对lps诱导的bv-2细胞培养上清中促炎介质肿瘤坏死因子-α(tnf-α)和白介素-6(il-6)浓度的影响。
108.2.结果
109.2.1穿心莲活性成分筛选结果
110.筛选后共获得穿心莲活性成分29个，用于构建穿心莲活性成分数据库，包括汉黄岑素、千层纸素a、苏荠宁黄酮、黄芩黄酮等，具体活性成分见表1。
111.表1穿心莲活性成分
112.113.114.[0115][0116]
2.2穿心莲活性成分作用靶点的获取结果
[0117]
根据设定的检索策略，检索sea,swiss target prediction,stitch及batman-tcm数据库，导出所有检索到的穿心莲活性成分作用靶点信息，剔除重复数据后，共获得553个作用靶点。
[0118]
2.3ad、pd靶点的获取结果
[0119]
分别以“alzheimer's disease”和“parkinson's disease”为疾病关键词，根据设定的检索策略，检索ctd，ttd,genecards,pharmgkb及mas 3.0数据库，导出所有检索到的穿心莲活性成分作用靶点信息，剔除重复数据后，共获得116个ad靶点(图2中a)和90个pd靶点(图2中b)。
[0120]
2.4活性成分与靶点的网络构建与分析
[0121]
将穿心莲与ad和pd相关的主要活性成分及作用靶点导入cytoscape ver.3.7.0软件，进行网络拓扑分析，构建可视化分析网络图。网络中的度(degree)指与该节点相关联边的条数，度值的大小与该成分在疾病中发挥作用的大小相关，值越大表明该成分防治疾病的可能性越大。“活性成分-靶点-ad”网络图中平均度值4.83，“活性成分-靶点-pd”网络图中平均度值3.75。结果可得出穿心莲中的汉黄岑素(度值＝19)、千层纸素a(度值＝14)、黄芩黄酮(度值＝9)、咖啡酸(度值＝8)、苏荠宁黄酮(度值＝8)有可能为与ad相关的主要活性成分(图3中a)，主要针对ptgs2、ptgs1、mapt、cyp1b1、abcb1等基因靶点；千层纸素a(度值＝13)、汉黄岑素(度值＝11)、黄芩黄酮(度值＝7)、苏荠宁黄酮(度值＝6)、穿心莲黄酮(度值＝6)、甘油单油酸酯(度值＝6)有可能为与pd相关的主要活性成分(图3中b)，主要针对prkcd、adora1、mapt、abcb1等基因靶点。汉黄岑素、千层纸素a、黄芩黄酮、苏荠宁黄酮为ad和pd共同相关的主要活性成分。
[0122]
2.5go功能富集分析和kegg通路富集分析
[0123]
go功能富集分析得出在穿心莲防治ad时以生物过程为主，主要与内源性药物反应、脂多糖反应、腺苷酸环化酶抑制g蛋白、磷脂酶c激活g蛋白等有关。细胞过程主要与轴突末端、神经树突有关，分子功能通过影响g蛋白偶联乙酰胆碱、药物绑定发挥作用(图4中a)。穿心莲防治pd时同样以生物过程为主，主要与内源性药物反应、脂多糖反应、凋亡过程的负调控、突触传递、胆碱激导性等有关。细胞过程主要与不对称突触、突触传递有关，分子功能通过影响相同蛋白结合、酶结合发挥作用(图4中b)。
[0124]
ad的kegg通路富集提示31个靶点富集在23条通路上，主要涉及alzheimer’s disease、pi3k-akt signaling pathway、pathways in cancer、toxoplasmosis等信号通路(图5中a)；pd的kegg通路富集提示27个靶点富集在13条通路上，主要涉及alzheimer’s disease、pathways in cancer、neuroactive ligand-receptor interaction、pi3k-akt signaling pathway等信号通路(图5中b)。图形的大小与度(degree)呈正相关，度值的大小与该通路在疾病中发挥作用的大小相关，值越大表明通过该靶点防治疾病的可能性越大,如ad和pd共同涉及alzheimer’s disease、pathways in cancer、pi3k-akt signaling pathway等信号通路。
[0125]
2.6穿心莲活性成分对ngf诱导的pc12细胞轴突生长的影响以ngf诱导的pc-12细胞为模型，测试了化合物1，2，3,4，16和28在10μm时对ngf诱导的pc12细胞轴突生长的影响(图6中a)。结果表明，化合物1，2，3，4和28具有明显的抑制神经轴突生长的作用。同时，测试结果表明，随着浓度的增加，化合物24的促神经轴突生长作用逐步增强。与ngf(细胞分化率为11.49％)相比，24在0.4和0.5μm时的细胞分化率分别可达17.93％和18.71％(图6中b)。
[0126]
实验组设有三个独立重复，数据表示为平均值
±
标准差，与对照相比，*p《0.05，**p《0.01和&&p《0.001表示具有显著性差异(单因素方差分析anova，dunnett检验)。
[0127]
2.7穿心莲活性成分对lps诱导的bv-2细胞中促炎因子浓度的影响
[0128]
分别测试了活性化合物3、4、16和28在1μm和10μm时对lps诱导的bv-2细胞上清中no浓度的影响(图7中a)。结果表明化合物16能够明显的抑制no的产生。进一步的研究结果表明，随着浓度的增加，化合物16的no抑制作用明显增强，尤其是在20μm，no的抑制率几乎达100％(图7中b)。
[0129]
另外，利用试剂盒检测了穿心莲活性化合物16对lps诱导的bv-2细胞培养上清中促炎因子il-6和tnf-α含量的影响(图7中c和图7中d)。结果表明，随着化合物16浓度的增大，il-6和tnf-α的浓度明显降低。
[0130]
实验组设有五个独立重复，数据表示为平均值
±
标准差，与对照相比，*p《0.05，**p《0.01和&&p《0.001表示具有显著性差异(单因素方差分析anova，dunnett检验)。
[0131]
3、结论
[0132]
在正常生理状态下，小胶质细胞处于静息状态。在病理条件下，小胶质细胞被持续的过度激活，进而促进促炎因子如no、tnf-α、il-6和ros等的释放，从而损害健康的神经元，导致突触功能障碍、突触丧失甚至神经元死亡。aβ的大量聚集在ad患者脑内普遍存在，产生的斑块可进一步诱导小胶质细胞的激活，最终对神经元造成损伤。另有研究表明，aβ沉积物可与膜受体发生结合，进一步导致神经元突触功能障碍及神经元凋亡。同时，aβ寡聚体会在特定的病理部位诱导tau磷酸化，进而损害海马突触的可塑性，出现记忆力降低的现象。大量研究也已证实，神经元因其自身的特征极易受到氧化应激的攻击，而最终造成神经元内
蛋白质等大分子生理功能的损伤。总之，神经退行性疾病的发生发展与神经炎症、aβ聚集和氧化应激等密切相关。经文献调研发现，汉黄岑素具有抑制与淀粉样前体蛋白(app)处理相关的β分泌酶途径、tau蛋白的磷酸化以及aβ在人类神经母细胞瘤细胞聚集的能力。千层纸素a能够通过激活抵抗氧化应激的nrf2-are信号通路及抑制诱导型一氧化氮合酶(inos)和cox-2表达的上调来抑制lps刺激的炎症反应。同时，体外实验表明千层纸素a可通过抑制il-6/stat3途径进而抑制促炎因子(如il-6和il-1β)的促生存和促生长作用。咖啡酸不仅可以显著缓解ad模型的学习障碍、增强其认知功能，同时可抑制氧化应激、炎症、核因子κb-p65蛋白表达及caspase-3活性，并能够调节p53和磷酸化p38 mapk蛋白的表达。穿心莲内酯不仅能够通过保护线粒体或抑制产生ros的酶来防止自由基的形成，还能通过激活nrf2信号通路来促进酶促或非酶促抗氧化剂的表达。另外，本发明人的前期研究工作也表明穿心莲的主要成分穿心莲内酯能够减少小胶质细胞介导的神经元炎症损伤和氧化应激诱导的神经元氧化损伤，并且穿心莲中的14-脱氧-11,12-二去氢穿心莲内酯和新穿心莲内酯具有一定的神经营养活性。
[0133]
综上分析，中药穿心莲在神经退行性疾病的防治上有非常大的潜力。因此，本发明利用网络药理学方法筛选了穿心莲活性成分，对与神经退行性疾病ad和pd相关的潜在靶点进行了有效分析，共获得与ad相关的靶点116个，与pd相关的靶点90个，发现穿心莲活性成分中汉黄岑素、千层纸素a、黄芩黄酮、苏荠宁黄酮对ad和pd均具有较多靶点，推测这些化合物是穿心莲防治神经退行性疾病发挥药效的重要化合物。同时，可视化构建了“靶点-信号通路”网络，分析均显示穿心莲防治ad和pd的作用途径主要与促进细胞存活、抑制细胞凋亡、参与细胞增殖和细胞周期过程以及影响神经活性配体-受体相互作用等有关。本发明针对筛选得到的29个化合物中部分化合物进行了神经营养和抗神经炎活性测试。结果表明，穿心莲活性成分24能够显著的促进ngf诱导的pc12细胞神经轴突生长，而化合物16则能够显著的抑制lps诱导的bv-2细胞中促炎因子的产生。
[0134]
本发明基于网络药理学方法系统分析了穿心莲防治ad和pd的潜在靶点，及关键信号通路，为穿心莲防治神经退行性疾病提供了理论基础，为后续相关药物的研究提供方法和思路。
[0135]
本发明分析得到穿心莲主要活性成分29个，穿心莲活性成分作用靶点553个，与ad相关的靶点116个，与pd相关的靶点90个。go和kegg分析显示，穿心莲主要通过汉黄岑素、千层纸素a、黄芩黄酮、苏荠宁黄酮、咖啡酸等化学成分，针对ptgs2、ptgs1、mapt、cyp1b1、abcb1等靶点，涉及alzheimer’s disease、pi3k-akt signaling pathway、pathways in cancer、toxoplasmosis等信号通路对ad具有潜在的防治作用；主要通过汉黄岑素、千层纸素a、黄芩黄酮、苏荠宁黄酮、穿心莲黄酮、甘油单油酸酯等化学成分，针对prkcd、adora1、mapt、abcb1等靶点，涉及alzheimer’s disease、pathways in cancer、neuroactive ligand-receptor interaction、pi3k-akt signaling pathway等信号通路对pd具有潜在的防治作用。神经营养活性结果显示，化合物1、2、3、4和28在10μm时能够抑制神经轴突的生长；化合物24具有显著的促神经轴突生长活性，在0.5μm时，细胞分化率达18.71％(ngf的细胞分化率为10.34％)。抗神经炎活性结果显示化合物16能够显著的抑制lps诱导的bv-2细胞中炎症因子no、tnf-α和il-6的产生。结论：通过网络药理学初步预测了穿心莲在防治神经退行性疾病上潜在的主要活性成分、靶点及信号通路，以期为神经退行性疾病药物研发
提供新的思路。
[0136]
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。