一种促内源性牙髓再生注剂、制法及BMP7在制备牙髓再生注剂中的应用的制作方法

一种促内源性牙髓再生注剂、制法及bmp7在制备牙髓再生注剂中的应用
技术领域
1.本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种促内源性牙髓再生注剂、制法及bmp7在制备牙髓再生注剂中的应用。


背景技术：

2.牙髓通过根尖开口和根管侧方交通与牙齿周围的组织建立联系，其中含有丰富的细胞、血管和神经，发挥着重要的生理功能。然而，严重的龋病或者牙外伤会导致牙髓组织发生坏死，影响了患者的身心健康。
3.针对这个问题，目前临床上的处理方法主要包括根管治疗、活髓切断和牙髓血运重建。根管治疗术通过器械和药物清理和消毒根管，最终利用牙胶等材料封闭整个根管系统。活髓切断术主要是利用生物材料覆盖根方活髓，使牙根继续发育。牙髓血运重建术主要是使根管腔内充满新鲜血液，诱导机体产生修复反应使牙根继续生长。
4.目前，研究人员希望通过利用组织工程的方法在根管腔内再生出具有生理性牙髓结构和恢复牙髓生理功能，这个过程可以依赖于内源性，或外源性干细胞的再生能力。牙髓组织干细胞(dental pulp stem cells,dpscs)是在牙髓中发现的具有增殖、迁移、多向分化能力的干细胞。在牙髓组织工程中，dpscs作为种子细胞已经得到了广泛研究与应用。
5.然而，然而基于细胞移植的牙髓再生策略需要在体外对干细胞进行扩增、储存、运输、移植等操作程序，这些环节增加了细胞移植的风险，并且，基于细胞移植的牙髓再生策略近年来由于伦理、政策、安全性等问题在临床转化应用上受到一定限制。基于内源性牙髓再生的方法在一定程度上为牙髓坏死的患者提供了一种新的治疗策略，具有巨大的应用前景。
6.迄今为止，临床上尚无可用于内源性牙髓再生的有效治疗策略。


技术实现要素：

7.针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种基于搭载bmp7因子胶原凝胶的干细胞归巢策略，通过胶原凝胶搭载的bmp7细胞因子，诱导体内的静止干细胞向组织缺失部位迁移、增殖、分化，避免了细胞移植所面临的一系列的问题，具有更可靠的安全性和经济性。此外，本发明提供的含bmp7注剂用于促内源性牙髓组织再生，能够有效简化基于细胞移植策略的牙髓再生治疗步骤，减少病患痛苦。
8.具体发明内容如下：
9.第一方面，本发明提供一种促内源性牙髓再生注剂，所述注剂的组成包括bmp7细胞因子和胶原凝胶；所述注剂注射于根管腔内，在体温条件下转化为凝胶态支架结构；
10.所述bmp7细胞因子用于诱导内源性干细胞归巢和牙向分化触发牙髓组织再生；
11.所述胶原凝胶用于支持内源性干细胞的粘附，伸展，自我更新。
12.可选地，所述bmp7细胞因子和所述胶原凝胶的质量体积比为10-250ng：1ml。
13.可选地，所述注剂的保存和注射温度为0-4℃。
14.第二方面，本发明提供一种上述第一方面所述的促内源性牙髓再生注剂的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
15.s1：将胶原凝胶溶液、5 x dmem溶液以及缓冲溶液在0-4℃条件下混合，形成混合溶液ⅰ；
16.s2、将bmp7细胞因子粉末溶解于含4mm hcl和0.1％的牛血清蛋白的无菌纯水中，形成混合溶液ⅱ；
17.s3、将混合溶液ⅰ与混合溶液ⅱ在0-4℃条件下混合，得到所述注剂。
18.可选地，所述缓冲溶液由固体组成部分nahco3、naoh和hepes，以及液体组成部分ddh2o混合得到。
19.可选地，所述nahco3、所述naoh和所述hepes(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)的质量比为2.2：0.2：4.766。
20.可选地，所述固体组成部分与所述液体组成部分的质量体积为7.166g：100ml。
21.可选地，所述胶原凝胶溶液、所述5 x dmem溶液以及缓冲溶液的体积比为7:2:1。
22.可选地，所述注剂中，所述bmp7细胞因子和所述胶原凝胶的质量体积比为10-250ng：1ml。
23.第三方面，本发明提供一种bmp7细胞因子在制备促内源性牙髓再生注剂中的应用。
24.与现有技术相比，本发明具有以下优点：
25.本发明提供的一种促内源性牙髓再生注剂，通过胶原凝胶搭载的bmp7细胞因子，诱导体内的静止干细胞向组织缺失部位迁移、增殖、分化。其中，bmp7通过诱导内源性干细胞归巢和牙向分化触发牙髓组织再生，并且作为促血管生成因子介导再生牙髓组织中的血管形成，而胶原凝胶提供了良好的再生微环境，支持内源性干细胞的粘附，伸展，自我更新。相较于细胞移植，注剂具有更可靠的安全性和经济性。此外，本发明提供的含bmp7注剂用于促内源性牙髓组织再生，能够有效简化基于细胞移植策略的牙髓再生的治疗步骤，减少病患痛苦。
附图说明
26.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
27.图1示出了本发明实施例提供的促内源性牙髓再生注剂用于牙髓组织再生操作过程的示意图；
28.图2示出了本发明实施例提供的促内源性牙髓再生注剂用于牙髓组织再生的作用机制；
29.图3示出了本发明实施例提供的胶原凝胶中dpscs的细胞存活和细胞伸展情况；
30.图4示出了本发明实施例提供的胶原凝胶中dpscs的存活率统计；
31.图5示出了本发明实施例提供的促内源性牙髓再生注剂的制备方法的流程示意
图；
32.图6示出了本发明实施例提供的wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs增殖能力的影响；
33.图7示出了本发明实施例提供的划痕实验结果图；
34.图8示出了本发明实施例提供的痕实验结果的统计图；
35.图9示出了本发明实施例提供的茜素红染色实验评估wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs成骨分化能力的影响结果图；
36.图10示出了本发明实施例提供的茜素红染色实验评估wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs成骨分化能力影响的结果统计图；
37.图11示出了本发明实施例提供的qpcr评估wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs成骨/成牙分化相关标志物表达的影响；
38.图12示出了本发明实施例提供的不同因子作用下对huvecs血管生成能力的影响结果图；
39.图13示出了本发明实施例提供的不同因子作用下对huvecs血管生成能力影响的结果统计图；
40.图14示出了本发明实施例不同浓度bmp7对dpscs增殖能力的影响；
41.图15示出了本发明实施例提供的不同浓度bmp7对dpscs迁移能力的影响结果图；
42.图16示出了本发明实施例提供的不同浓度bmp7对dpscs迁移影响的结果统计图；
43.图17示出了本发明实施例提供的茜素红染色实验评估不同浓度bmp7对dpscs成骨分化能力的影响结果图；
44.图18示出了本发明实施例提供的茜素红染色实验评估不同浓度bmp7对dpscs成骨分化能力影响的结果统计图；
45.图19示出了本发明实施例提供的qpcr评估不同浓度bmp7对dpscs成骨/成牙分化相关标志物表达的影响；
46.图20示出了本发明实施例提供的不同浓度bmp7对huvecs迁移能力的影响结果图；
47.图21示出了本发明实施例提供的不同浓度bmp7作用下huvecs迁移能力影响的结果统计图；
48.图22示出了本发明实施例提供的不同浓度bmp7对huvecs血管形成能力的影响结果图；
49.图23示出了本发明实施例不同浓度bmp7对huvecs血管形成能力影响的结果统计图；
50.图24示出了本发明实施例提供的胶原凝胶中dpscs的存活和伸展情况；
51.图25示出了本发明实施例提供的胶原凝胶中dpscs的存活率统计图；
52.图26示出了本发明实施例中he染色评估根管腔内牙髓样组织长入情况；
53.图27示出了本发明实施例中he染色评估根管腔内牙髓样组织长入情况的结果统计图；
54.图28示出了本发明实施例h&e染色及免疫组化检测牙髓样组织内细胞的成牙分化情况；
55.图29示出了本发明实施例h&e染色及免疫组化检测牙髓样组织内细胞的成牙分化情况的结果统计图；
56.图30示出了本发明实施例中根管腔内血管的生长情况；
57.图31出了本发明实施例中激光多普勒检测根管腔内血液灌注情况；
58.图32示出了本发明实施例中he染色评估再生牙髓样组织内血管形成情况；
59.图33示出了本发明实施例中he染色评估再生牙髓样组织内血管形成情况的结果统计图；
60.图34示出了本发明实施例中免疫荧光检测牙髓样组织中人源性线粒体的表达情况。
具体实施方式
61.提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。
62.实施例中未注明具体实验步骤或者条件，按照本领域内的现有技术所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
63.本发明的发明人研究发现，内源性干细胞的来源、激活再生的信号分子以及血供的建立是目前基于细胞归巢策略的研究需要解决的首要问题。因此，构建一种能有效诱导牙源性干细胞向根管内迁移，并实现牙向分化的高效便捷的策略，对实现牙髓组织再生来说具有重要的临床意义和广阔的应用前景。
64.进一步地，牙发育相关信号分子wnt3a、tgf-β1和bmp7的信号通路在牙齿发育和调控细胞功能方面起着至关重要的作用，但wnt3a、tgf-β1和bmp7信号尚未在基于内源性干细胞的牙髓再生研究中进行探讨应用。因此，发明人通过体外验证wnt3a、tgf-β1和bmp7对dpscs的增殖、迁移、成骨/牙向分化能力的影响，得出，与wnt3a和tgf-β1相比，bmp7在体外具有更强的诱导内源性牙髓再生潜力，能够更好的促进dpscs迁移，诱导dpscs牙向分化，上调dspp和dmp-1表达。
65.为了进一步探究bmp7调控细胞功能是否存在剂量依赖性，发明人选择2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml以及250ng/ml浓度的bmp7对dpscs增殖、迁移、成骨/成牙向分化进一步研究，发现，10ng/ml和50ng/ml的bmp7能够进dpscs的增殖，但促进作用较弱。50ng/ml和250ng/ml的bmp7显著促进了dpscs迁移，dpscs迁移数量随bmp7剂量的增加而有所增加。此外，虽然茜素红染色定量仅在250ng/mlbmp7组升高，但钙化结节的大小和染色深度随着bmp7剂量的增加而增加。dspp基因表达在50ng/ml bmp7上升，而dmp-1基因表达在10、50、250ng/mlbmp7组均上升。因此，发明人推测高剂量的bmp7可能比低剂量的bmp7促进dpsc中产生更多的钙沉积。从上述研究结果中可以推断出bmp7可以作为诱导内源性干细胞归巢触发牙髓再生的潜在信号分子。而bmp7剂量对于诱导再生效果和导致过度钙化值得注意。
66.进一步地，发明人为探究bmp7对huvecs血管生成能力的作用是否存在剂量依赖性，发明人评估了2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml以及250ng/ml浓度的bmp7对huvecs迁移能力和成管能力的影响，发现，50ng/ml和250ng/mlbmp7能够更有效的促进huvec的迁移能力和血管样结构形成。这说明bmp7不仅具有促进dpscs再生能力的作用，同时还可能有助于内源性
牙髓再生的血运重建。
67.发明人基于以上的研究发现，构建了一种在0-4℃条件下保存和使用的注剂，该注剂为含有bmp7细胞因子的胶原凝胶注剂，可用于促内源性牙髓组织再生，能够有效简化治疗牙髓炎、牙周炎等与牙髓病变有关疾病的治疗步骤，减少病患痛苦。
68.具体实施内容如下：
69.第一方面，本发明提供了一种促内源性牙髓再生注剂，注剂的组成包括bmp7细胞因子和胶原凝胶；所述注剂注射于根管腔内，在体温条件下转化为凝胶态支架结构；
70.所述bmp7细胞因子用于诱导内源性干细胞归巢和牙向分化触发牙髓组织再生；
71.所述胶原凝胶用于支持内源性干细胞的粘附，伸展，自我更新。
72.具体实施时，图1示出了本发明实施例提供的促内源性牙髓再生注剂用于牙髓组织再生操作过程的示意图，如图1所示，牙髓部分或全部坏死的患牙需要经过以下几步操作完成牙髓再生注剂的植入。(其中需要使用到目前临床常用的根管治疗器械进行操作)
73.第一步、利用开髓器械建立畅通的开髓孔；
74.第二步、拔髓针摘除所有坏死牙髓组织，清理根管系统；
75.第三步、常规根管消毒药物和冲洗药物处理根管，充分止血；
76.第四步、体外按照所述方法制备注剂，使用1ml注射器将载bmp7细胞因子的胶原凝胶注射到根管中；
77.第五步、待注剂凝胶化后于开髓孔处填充盖髓剂，垫底，充填封闭开髓孔。
78.具体实施时，图2示出了本发明实施例提供的促内源性牙髓再生注剂用于牙髓组织再生的作用机制，如图2所示，所述注剂体系中，bmp7细胞因子作为再生信号触发内源性干细胞的归巢和牙向分化，并作为促血管生成因子诱导内皮细胞形成新生血管。胶原凝胶提供理想的再生微环境，支持细胞的粘附、伸展、自我更新并维持细胞活性。基于搭载bmp7因子胶原凝胶的干细胞归巢策略协同促进了内源性牙髓组织再生。
79.具体实施时，对于牙髓再生来说，维持干细胞的存活和支持干细胞的粘附同样重要。胶原凝胶是一种天然的细胞外基质，它保留了丰富的细胞粘附位点，介导细胞和基质之间的粘附，能够在维持细胞粘附伸展和细胞存活方面发挥更好的性能。
80.发明人将dpscs均匀混合在胶原凝胶的内部，固化后进行三维培养。分别在第1、3、6天进行活/死细胞染色以评估dpscs在凝胶内部培养时的存活和细胞伸展情况。图3示出了本发明实施例提供的胶原凝胶中dpscs的细胞存活和细胞伸展情况，图4示出了本发明实施例提供的胶原凝胶中dpscs的存活率统计，其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，结果发现，dpscs在胶原凝胶中从第1天到第6天都呈现良好的的纺锤状伸展形态和90％以上的存活率。
81.在一些实施方式中，bmp7细胞因子和胶原凝胶的质量体积比为10-250ng：1ml。
82.发明人选用胶原凝胶作为制备注剂中搭载bmp7细胞因子的载体成分，通过控制bmp7细胞因子和胶原凝胶的质量体积比为10-250ng：1ml，保证bmp7的给药浓度在10ng/ml-250ng/ml，以使bmp7在促进dpsc再生中出现的钙化情况控制在合理的范围。
83.具体实施时，bmp7细胞因子和胶原凝胶组成的注剂需要在0-4℃条件下保存的使用，使用时保持注剂在液体状态，进行根管内注射，随后注剂在体温的作用下凝胶化，凝胶化的胶原凝胶能够维持bmp7细胞因子在凝胶中的缓慢释放，维持牙髓干细胞的存活状态，
并支持牙髓干细胞的粘附，防止牙髓干细胞聚集为团状而影响再生效果。
84.第二方面，本发明提供一种上述第一方面所述的促内源性牙髓再生注剂的制备方法，图5示出了本发明实施例提供的促内源性牙髓再生注剂的制备方法的流程示意图，如图5所示，该制备方法包括如下步骤：
85.s1：将胶原凝胶溶液、5 x dmem溶液以及缓冲溶液在0-4℃条件下混合，形成混合溶液ⅰ；
86.s2、将bmp7细胞因子粉末溶解于含4mm hcl和0.1％的牛血清蛋白的无菌纯水中，形成混合溶液ⅱ；
87.s3、将混合溶液ⅰ与混合溶液ⅱ在0-4℃条件下混合，得到所述注剂。
88.具体实施时，为保证制备得到的注剂在注射前保持溶液状态，制备过程中，需要保证混合溶液ⅰ以及混合溶液ⅱ的温度在0-4℃之间。
89.在一些实施方式中，缓冲溶液由固体组成部分nahco3、naoh和hepes，以及液体组成部分ddh2o混合得到，其中，nahco3、naoh和hepes的质量比为2.2：0.2：4.766，固体组成部分与液体组成部分的质量体积为7.166g：100ml。
90.在一些实施方式中，胶原凝胶溶液、5 x dmem溶液以及缓冲溶液的体积比为7:2:1。
91.在一些实施方式中，注剂中的bmp7细胞因子和胶原凝胶的质量体积比为10-250ng：1ml。
92.第三方面，本发明提供了上述第一方面所述的bmp7细胞因子在制备促内源性牙髓再生注剂中的应用。
93.为使本领域技术人员更加清楚地理解本技术，现通过以下实施例对本技术所述的含bmp7注剂、制备方法及bmp7在制备牙髓再生注剂中的应用进行详细说明。
94.以下实施例所用到的dpscs，是经四川大学华西口腔医院的伦理委员会批准，得到患者同意后，招募华西口腔医院颌面外科门诊患者(16-20岁)，获取因治疗需拔除的第三健康磨牙，经dpscs的提取和培养得到的3-5代dpscs细胞。
95.实施例1：三种不同细胞因子对dpscs再生能力的影响
96.1、wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs增殖能力的影响
97.(1)实验分组：
98.对照组：5％fbs/α-mem；
99.实验组：5％fbs/α-mem+wnt3a(50ng/ml)；
100.5％fbs/α-mem+tgf-β1(10ng/ml)；
101.5％fbs/α-mem+bmp7(50ng/ml)；
102.(2)在96孔板中以1000/孔的密度接种dpscs，每孔加入100μl 5％fbs/α-mem，于37℃，5％co2条件下培养；
103.(3)分别在第0、1、3、5、7天检测细胞增殖情况，去除原培养基，每孔加入含10μl cck 8检测液的α-mem 110μl，37℃孵育1小时；
104.(4)转移孵育后的培养基于新的96孔板，上分光光度计，于450nm下检测吸光度值，graphpad prism 8分析数据。
105.图6示出了本发明实施例提供的wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs增殖能力的影响。如
图6所示，增殖实验表明，与对照组相比，50ng/ml bmp7和50ng/ml wnt3a处理的dpscs在第7天表现出更高的增殖能力，而10ng/ml tgf-β1组从第3天到第7天均表现为抑制dpscs的增殖，可见，bmp7和wnt3a促进dpscs增殖，tgf-β1抑制dpscs增殖。
106.2、wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs迁移能力的影响
107.(1)实验分组：
108.对照组：1％fbs/α-mem；
109.实验组：1％fbs/α-mem+wnt3a(50ng/ml)；
110.1％fbs/α-mem+tgf-β1(10ng/ml)；
111.1％fbs/α-mem+bmp7(50ng/ml)；
112.(2)划痕实验：
113.①
在六孔板中培养dpscs至100％融合，更换无血清培养基饥饿6小时；
114.②
用1000μl枪头在皿底均匀划开一条无细胞区域，pbs清洗；
115.③
更换诱导液继续培养24小时；
116.④
固定：4％多聚甲醛浸泡30分钟；
117.⑤
染色：pbs洗3遍，结晶紫浸泡细胞10分钟；
118.⑥
镜下观察细胞迁移情况，光镜下拍照，image j分析数据。
119.图7示出了本发明实施例提供的划痕实验结果图，如图7所示，划痕实验表明50ng/ml bmp7诱导了更多的dpscs向划痕区域迁移。
120.图8示出了本发明实施例提供的痕实验结果的统计图，其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，如图8所示，50ng/ml wnt3a和10ng/ml tgf-β1组的细胞迁移数量与对照组相比无明显差异。而50ng/ml bmp7较对照组显著促进dpscs迁移。
121.3、wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs成骨/成牙分化能力的影响
122.(1)茜素红染色：
123.①
配制成骨诱导液(om)：含有5％fbs、10-8
m地塞米松、50μg/ml维生素c、0.01μm维生素d3、10mmβ-磷酸甘油钠的α-mem，0.22μm滤器过滤除菌；
124.②
实验分组：
125.对照组：om；
126.实验组：om+wnt3a(50ng/ml)；
127.om+tgf-β1(10ng/ml)；
128.om+bmp7(50ng/ml)；
129.③
在24孔板中接种dpscs，2x104/孔，融合率达到70％后，更换诱导液，每3天换液；
130.④
固定：培养三周后，4％多聚甲醛固定30分钟；
131.⑤
染色：0.1％茜素红处理5分钟；pbs清洗3遍；
132.⑥
镜下查看各组矿化结节的形成，拍照记录。
133.⑦
去除上清，每孔加入10％氯化十二烷基吡啶500μl，37℃恒温摇床孵育15分钟萃取染色；
134.⑧
分光光度计于562nm下检测各组吸光度值，graphpad prism 8分析数据。
135.(2)qpcr检测成骨/成牙相关基因表达：
136.①
实验分组：
137.对照组：10％fbs/α-mem；
138.实验组：10％fbs/α-mem+wnt3a(50ng/ml)；
139.10％fbs/α-mem+tgf-β1(10ng/ml)；
140.10％fbs/α-mem+bmp7(50ng/ml)；
141.②
在6孔板中以1x105/孔的密度接种dpscs，融合率达到80％时更换为诱导液，培养3天后根据说明书使用rnf提取试剂盒(诺唯赞)提取各组rnf；
142.③
去除培养基，pbs洗3次，每孔加入500μl buffer rl，冰上反复吹打充分裂解细胞；
143.④
将裂解后样本转移至fastpure gdnf-filter cflumnsⅲ中，12000rpm离心30秒，收集滤液；
144.⑤
添加1/2滤液体积的无水乙醇；使用fastpure rnf cflumnsⅲ以12000rpm离心30秒；
145.⑥
向fastpure rnf cflumnsⅲ中加入700μl buffer rw1，12000rpm离心30秒，弃滤液；
146.向fastpure rnf cflumnsⅲ中加入700μl buffer rw2，12000rpm离心30秒，弃滤液；
147.向fastpure rnf cflumnsⅲ中加入500μl buffer rw2，12000rpm离心2分钟；
148.⑦
将吸附柱转移到1.5ml无酶的收集管中，滴加50μl无酶水，室温静置1分钟；12000rpm离心1分钟；获得rnf；
149.⑧
gdnf去除：在无酶离心管中配制反应体系：
150.无酶水
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
tf 16μl
[0151]4×
gdnf wiper mix
ꢀꢀꢀꢀꢀ
4μl
[0152]
模板rnf
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
500ng
[0153]
混匀后使用逆转录仪于42℃反应2分钟；
[0154]
⑨
逆转录：在第
⑧
步离心管中加入5
×
hiscript iii qrt supermix 4μl；使用要求的反应程序进行cdnf的逆转录；
[0155]
⑩
qpcr反应：
[0156]
a.按以下比例配制96孔板qpcr反应体系(20μl)：
[0157][0158][0159]
b.向pcr 96孔板中加样，贴膜，震荡，离心2000rpm 3分钟；
[0160]
c.上pcr反应仪扩增，扩增程序如下：
[0161]
第一步：95℃，30s；
[0162]
95℃，15s；
[0163]
(1个循环)
[0164]
第二步：60℃，30s；
[0165]
72℃，30s；
[0166]
95℃，15s；
[0167]
(40个循环)
[0168]
第三步：60℃；60s；
[0169]
95℃；15s；
[0170]
(1个循环)
[0171]
d.计算结果，公式如下：
[0172]
以gfpdh为内参，
[0173]
1，δct(实验组)＝ct(实验组目的基因)
–
ct(实验组内参基因)
[0174]
δct(对照组)＝ct(对照组目的基因)
–
ct(对照组内参基因)
[0175]
2，δδct＝δct(实验组)
–
δct(对照组)
[0176]
3，2
–
δδct
＝基因相对表达量
[0177]
e.数据分析，结果导入graphpad prism 8，多组样本间比较使用方差分析，p＜0.05认为有统计学差异。
[0178]
图9示出了本发明实施例提供的茜素红染色实验评估wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs成骨分化能力的影响结果图，图10示出了本发明实施例提供的茜素红染色实验评估wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs成骨分化能力影响的结果统计图，其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，如图9、图10所示，通过分析茜素红染色，结果表明50ng/mlwnt3a和50ng/ml bmp7组的茜素红染色深度与对照组无明显差异，但镜下可以观察到wnt3a和bmp7组产生了更多数量且染色更深的矿化结节(白色箭头所示)；相反，tgf-β1组则完全抑制了矿化结节的形成和茜素红染色。
[0179]
发明人还检测了wnt3a、tgf-β1、bmp7诱导dpscs 3天后runx2和flp以及dspp和dmp-1表达情况。图11示出了本发明实施例提供的qpcr评估wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs成骨/成牙分化相关标志物表达的影响；其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，从qpcr的结果分析，与对照组相比，wnt3a组的runx2基因表达上调，bmp7组的flp基因表达上调，而tgf-β1组的runx2和flp基因表达均降低。此外，与对照组相比，dspp和dmp-1基因表达在所有处理组中均上调。
[0180]
结论：通过以上实验，发明人发现tgf-β1处理dpscs后显著抑制钙化结节形成，而上调了dspp和dmp-1基因表达。众所周知，tgf-β1在成牙本质细胞中表达并促进成牙本质母细胞分化和牙本质形成。然而，tgf-β1对成骨分化的影响是有争议的，促进作用和抑制作用在以往研究中都有报道。一项研究报告称0.5-1ng/ml tgf-β1促进shed的flp表达，而5-10ng/ml tgf-β1通过flk5/smad2/3、tfk1、p38和mek/erk的不同调节抑制了flp表达。同样，另一项研究还发现，5-10ng/ml tgf-β1通过flk5/smad2/3信号传导下调牙髓细胞中的runx2和flp表达。这些结果与发明人观察到的现象一致。
[0181]
此外，研究结果还发现，bmp7促进了dpscs的迁移和成牙分化能力，上调了dspp和dmp-1的表达，而runx2基因表达的上调不明显。根据之前的研究，发明人发现，不同的bmps可能通过调控wnt、nftch、pi3k/fkt/mtor等通路介导不同的信号传导，从而对成骨分化产生不同的影响。bmp7没有显著诱导runx2的表达，也没有增加矿物质的积累。这与发明人的结果一致。此外，发明人发现bmp7有效地增强了迁移能力，并略微影响了dpsc的增殖。这些
结果仍然与以前的研究密切相关，牙髓细胞中过表达bmp7促进了成牙本质细胞分化，但增殖能力与对照组无明显差异。
[0182]
发明人选择wnt3a、tgf-β1、bmp7作为促进内源性牙髓再生的候选分子。通过体外探究wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs增殖、迁移、分化能力的影响。发现与wnt3a和tgf-β1相比，bmp7在体外促进dpscs迁移，诱导dpscs牙向分化，表达dspp和dmp-1方面更具优势。
[0183]
实施例2：三种不同细胞因子对huvecs血管生成能力的影响
[0184]
1、成管实验(huvecs购自ftcc公司，用于本实验)
[0185]
(1)实验分组如下：
[0186]
对照组：10％hfrse serum/f12；
[0187]
实验组：10％hfrse serum/f12+wnt3a(50ng/ml)；
[0188]
10％hfrse serum/f12+tgf-β1(10ng/ml)；
[0189]
10％hfrse serum/f12+bmp7(50ng/ml)；
[0190]
(2)实验前一天，4℃预冷ibidiμ-slide 15well孔板和枪头，溶解基质胶；
[0191]
(3)使用预冷的枪头吸取10μl基质胶均匀平铺在孔板底部(冰上进行)，防止气泡产生；
[0192]
(4)转移孔板至37℃孵箱，孵育30分钟；同时准备huvecs悬液；
[0193]
(5)在孔板中以10000/孔的密度接种huvecs(包含50μl诱导液)；
[0194]
(6)诱导4小时后，观察dpscs形成的血管样结构，镜下拍照；
[0195]
(7)将结果导入image j计算总分支长度和连接点数量，数据导入graphpad prism 8进行统计分析。
[0196]
图12示出了本发明实施例提供的不同因子作用下huvecs血管生成能力影响的结果图，如图12所示，成管实验表明，在诱导4小时后，与对照组和50ng/ml wnt3a组相比，10ng/ml tgf-β1和50ng/ml bmp7组可以观察到更多血管状结构形成。
[0197]
图13示出了本发明实施例提供的不同因子作用下huvecs血管生成能力影响的结果统计图；其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，图13的定量分析结果表明，10ng/ml tgf-β1和50ng/ml bmp7组的总血管分支长度和连接点数量明显高于50ng/ml wnt3a组和对照组，提示10ng/ml tgf-β1和50ng/ml bmp7在体外有效增强了huvecs的血管形成能力。
[0198]
结论：无论是组织修复还是再生都要求早期建立血供为组织提供营养和氧气，转运代谢废物，维持细胞更新和组织生长。这对于牙髓再生来说更为重要，因为牙髓组织仅依靠狭窄的根尖孔和侧枝根管等通道与牙周组织相交通，建立血运循环的难度更大。即便是在根管中移植血管内皮细胞，不能早期和宿主血管整合，同样会导致位于冠方的细胞因缺氧而死亡。因此，通过信号分子触发根尖处内皮细胞向根管内迁移逐渐形成血管系统的同时，诱导根尖周的内源性干细胞向根管内迁移，发明人认为是更符合在牙齿这一特殊解剖结构中实现牙髓组织再生的策略。本发明实验结果发现10ng/ml tgf-β1和50ng/ml bmp7在体外均有效促进了huvecs血管形成的能力。这意味着tgf-β1和bmp7可能有助于在内源性牙髓组织再生过程中诱导内皮细胞向根管内迁移形成血管网络。
[0199]
而与wnt3a组和对照组相比，tgf-β1和bmp7在体外显著促进huvecs的血管形成能力，有望用于内源性牙髓组织再生中诱导血管再生。
[0200]
在实施例1、实施例2的研究基础上，发明人得出bmp7在促进dpscs增殖、迁移、成牙
分化、血管生成等方面较wnt3a和tgf-β1表现出更全面的优势。因此，发明人选用bmp7进行后续进一步研究。
[0201]
实施例3：体外探究bmp7对内源性牙髓再生和血管生成的剂量影响
[0202]
1、bmp7对dpscs再生能力的剂量影响
[0203]
(1)实验分组：
[0204]
对照组
[0205]
实验组：bmp7(2ng/ml)；
[0206]
bmp7(10ng/ml)；
[0207]
bmp7(50ng/ml)；
[0208]
bmp7(250ng/ml)；
[0209]
(2)不同浓度bmp7对dpscs增殖能力的作用
[0210]
具体实验操作过程与实施例1验证wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs增殖能力的影响的步骤相同，此处不重复给出。
[0211]
图14示出了本发明实施例不同浓度bmp7对dpscs增殖能力的影响，如图14所示，cck 8结果表明，dpscs在不同浓度bmp7培养第7天后，10ng/ml和50ng/ml bmp7组的dpscs增殖能力较对照组轻度增加。
[0212]
(3)不同浓度bmp7对dpscs迁移能力的作用
[0213]
具体实验操作过程与实施例1验证wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs迁移能力的影响的步骤相同，此处不重复给出。
[0214]
图15示出了本发明实施例提供的不同浓度bmp7对dpscs迁移能力的影响结果图，图16示出了本发明实施例提供的不同浓度bmp7对dpscs迁移影响的结果统计图，其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，如图15、图16所示，50ng/ml bmp7组比其他组促进了更多的dpscs向伤口区域爬行，而2、10、250ng/ml bmp7组之间无统计学差异。
[0215]
(4)不同浓度bmp7对dpscs分化能力的作用
[0216]
具体实验操作过程与实施例1验证wnt3a、tgf-β1、bmp7对dpscs成骨/成牙分化能力的影响的步骤相同，此处不重复给出。
[0217]
图17示出了本发明实施例提供的茜素红染色实验评估不同浓度bmp7对dpscs成骨分化能力的影响结果图，图18示出了本发明实施例提供的茜素红染色实验评估不同浓度bmp7对dpscs成骨分化能力的影响的结果的统计图，其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，如图17、图18所示，茜素红染色实验表明，钙化结节形成的数量和大小随着bmp7剂量的增加而增加。并且，染色密度的定量表明250ng/ml bmp7组显著高于其他组，其余各组间无统计学差异。
[0218]
图19示出了本发明实施例提供的qpcr评估不同浓度bmp7对dpscs成骨/成牙分化相关标志物表达的影响，其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，从qpcr的结果分析，与对照组相比较，runx2和flp基因随着bmp7剂量增加而表达上调，10ng/ml bmp7处理组的runx2和50ng/ml bmp7组flp的表达分别高于他组。dspp基因表达在50ng/ml bmp7组增加，而dmp-1基因表达在10、50、250ng/ml bmp7组均上调。
[0219]
结论：发明人测试了2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml bmp7对dpscs的作用后发现，10ng/ml和50ng/ml bmp7促进dpscs的增殖，但促进作用较弱。此外，50ng/ml和250ng/
ml bmp7显著促进了dpscs迁移，dpscs迁移数量随bmp7剂量的增加而有所增加。
[0220]
此外，虽然茜素红染色定量仅在250ng/mlbmp7组升高，但钙化结节的大小和染色深度随着bmp7剂量的增加而增加。dspp基因表达在50ng/ml bmp7上升，而dmp-1基因表达在10、50、250ng/ml bmp7组均上升。因此，发明人推测高剂量的bmp7可能比低剂量的bmp7促进dpsc中产生更多的钙沉积。从上述研究结果中可以推断出bmp7可以作为诱导内源性干细胞归巢触发牙髓再生的潜在信号分子。
[0221]
因此，发明人得出，不同浓度bmp7对dpscs的增殖，迁移，分化能力具有一定的剂量依赖性，其中50ng/ml和250ng/ml bmp7对于诱导内源性干细胞归巢再生牙髓组织可能发挥更好的作用。
[0222]
2、bmp7对huvecs血管生成能力的剂量影响
[0223]
(1)实验分组：
[0224]
对照组：cfntrfl；
[0225]
实验组：bmp7(2ng/ml)；
[0226]
bmp7(10ng/ml)；
[0227]
bmp7(50ng/ml)；
[0228]
bmp7(250ng/ml)；
[0229]
2、不同浓度bmp7对huvecs迁移能力的影响
[0230]
(1)6孔板中培养huvecs至100％融合，换无血清培养基饥饿6小时；
[0231]
(2)用1000μl枪头在皿底划一条无细胞区，pbs清洗；
[0232]
(3)更换诱导液培养24小时；于0,12,24小时镜下拍照记录；
[0233]
(4)image j分析计算伤口愈合率，graphpad prism 8统计分析。
[0234]
伤口愈合率＝(伤口面积-剩余伤口面积)/伤口面积(％)；
[0235]
图20示出了本发明实施例提供的不同浓度bmp7对huvecs迁移能力的影响结果图，如图20所示，根据划痕实验结果所示，在培养12小时后，huvecs开始向伤口区域迁移，此时各组间无统计学差异；在培养24小时后，发明人观察到50ng/ml和250ng/ml bmp7组向伤口区域迁移的huvecs数量比其余各组显著增多。
[0236]
图21示出了本发明实施例不同浓度bmp7作用下huvecs迁移能力影响的结果统计图，其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，如图21所示，定量分析还表明，24小时后，50ng/ml和250ng/ml bmp7组伤口愈合率达到75％以上。
[0237]
3、不同浓度bmp7对huvecs血管生成能力的影响
[0238]
具体实验操作过程与实施例2验证三种不同细胞因子对huvecs血管生成能力的影响的步骤相同，此处不重复给出。
[0239]
图22示出了本发明实施例不同浓度bmp7对huvecs血管形成能力的影响结果图，如图22所示，成管实验结果表明，10、50、250ng/ml bmp7组较对照组诱导了更多血管样结构的形成。
[0240]
图23示出了本发明实施例不同浓度bmp7对huvecs血管形成能力影响的结果统计图，其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，如图23所示，定量分析表明，与对照组和2ng/ml bmp7组相比，10、50、250ng/ml bmp7组诱导产生的血管样结构具有更长的血管分支和数量更多的连接点。
[0241]
结论：本实施例中，发明人利用2ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、250ng/ml bmp7对huvecs的作用后发现，50ng/ml和250ng/ml bmp7有效促进huvec的迁移能力和血管样结构形成，这说明bmp7不仅具有促进dpscs再生能力的作用，同时还可能有助于内源性牙髓再生的血运重建。
[0242]
而且，不同浓度bmp7对huvecs的迁移，血管形成能力的作用具有一定的剂量依赖性，其中50ng/ml和250ng/ml bmp7对于诱导内源性牙髓再生中血运重建可能发挥更好的作用。
[0243]
实施例4：体外构建内源性牙髓再生的注剂
[0244]
生物支架是细胞定植，细胞存活和药物递送的载体。对于牙髓组织再生来说，牙齿的独特结构要求应用于牙髓再生的支架不仅仅要满足可注射性和生物可降解性等基本性能之外，还需要在体内移植后支持内源性干细胞的粘附伸展及细胞存活。水凝胶作为一种理想的生物相容性材料，具有良好的物理和化学性能。本实施例选用胶原凝胶，在三维培养条件下，检测了不同培养时间点凝胶内部dpscs的粘附伸展和细胞存活情况，旨在明确胶原凝胶能否为内源性牙髓再生提供理想的再生微环境。
[0245]
1、胶原凝胶的制备
[0246]
胶原凝胶购自日本新田明胶公司。根据说明书按如下程序进行凝胶制备：
[0247]
f.提前准备如下溶液：
[0248]
溶液a:胶原凝胶
[0249]
溶液b:5 x dmem
[0250]
溶液c:2.2g nahco3+0.2g naoh+4.766g hepes tf 100ml ddh2o
[0251]
b.将上述溶液置于冰上预冷，随后按照溶液a：b：c＝7：2：1的比例依次轻柔
[0252]
混合，勿引入气泡；
[0253]
c.将溶液态胶原凝胶置于冰上待用。
[0254]
2、胶原凝胶在三维条件下对dpscs伸展形态及存活的影响
[0255]
(1)在胶原凝胶从溶胶转换为凝胶过程中，以1
×
106/ml dpscs重悬到胶原凝胶中；
[0256]
(2)使用100μl移液器转移上述悬液至六孔板中，待凝胶固化后每孔加入2ml培养液，37℃孵箱中培养；
[0257]
(3)于第1、3、6天使用活/死染色试剂盒(凯基，中国)染色；
[0258]
(4)使用共聚焦随机选择5个区域采集图像，并通过image j定量分析：
[0259]
a.计算细胞伸展程度＝细胞短径/细胞长径；
[0260]
b.计算细胞存活率(％)＝活细胞数量/(活细胞数量+死细胞数量)x100％
[0261]
(5)以上数据通过graphpad prism 8统计分析。
[0262]
图24示出了本发明实施例提供的胶原凝胶中dpscs的存活和伸展情况；图24示出了本发明实施例提供的胶原凝胶中dpscs的存活率统计；发明人可以明显观察到dpscs在胶原凝胶中从第1天到第6天都呈现良好的的伸展形态和存活率，也没有发现dpscs聚集为团状。
[0263]
结论：胶原凝胶支持dpscs的粘附和伸展，还能维持理想的细胞存活率。发明人认为胶原凝胶通过支持细胞粘附，细胞伸展和维持细胞存活，可用于内源性牙髓组织再生。
[0264]
实施例5：体内验证(裸鼠模型)基于搭载bmp7因子胶原凝胶的干细胞归巢策略在牙髓再生中的作用
[0265]
体外研究已经初步表明bmp7在促进dpscs增殖、迁移、分化潜力以及诱导huvecs的血管再生能力方面具有重要的作用。胶原凝胶能够有效支持dpscs的粘附和伸展，维持细胞存活，可以为内源性牙髓再生提供一个良好的再生微环境。基于体外研究结果，发明人构建了基于搭载bmp7因子胶原凝胶的干细胞归巢策略以用于诱导牙髓组织再生，发明人在6周龄雌性balb/c裸鼠背部皮下移植6周后收样，脱矿后进行组织学分析
[0266]
1、构建半原位牙髓再生的裸鼠模型
[0267]
(1)牙本质套管制备
[0268]
a.本研究在华西口腔医院颌面外科获得由于正畸治疗而拔除的前磨牙(n＝40)：要求牙齿健康完整；
[0269]
b.收获的牙齿用1％青霉素/链霉素溶液浸泡5min，随后使用灭菌涡轮机去除冠部釉质，根部牙骨质，随后将剩余牙本质制备为8-10mm长的牙本质套管；
[0270]
c.套管用无菌pbs超声清洗10min，重复3次，随后依次用17％，10％，5％edtf分别处理10分钟，最后无菌pbs超声清洗10min，重复3次；
[0271]
d.使用1％青霉素/链霉素溶液在4℃下浸泡牙本质套管3天以上备用。
[0272]
(2)体内植入物的构建
[0273]
a.在体内植入的前一天，使用牙胶密封的牙本质套管的一端，同时保持另一端开放，以模拟临床情况；
[0274]
b.使用无菌生理盐水注入牙本质套管检查以确认无液体渗漏；
[0275]
c.分组：
[0276]
(i)胶原凝胶组(阴性对照)
[0277]
(ii)胶原凝胶+dpscs(阳性对照)
[0278]
(iii)胶原凝胶+bmp7(10ng/ml)
[0279]
(iv)胶原凝胶+bmp7(50ng/ml)
[0280]
(v)胶原凝胶+bmp7(250ng/ml)
[0281]
d.植入前，将胶原凝胶植入阴性对照组，将搭载bmp7因子的胶原凝胶溶液注入处理组，将混有1.0
×
106/ml dpscs的胶原凝胶植入阳性对照组。置于37℃孵箱中，待其凝固30min；其中，搭载bmp7因子的胶原凝胶的制备包括：将体积比为7:2:1的胶原凝胶溶液、5 x dmem溶液以及缓冲溶液在0-4℃条件下混合，形成混合溶液ⅰ，bmp7细胞因子粉末溶解于含4mm hcl和0.1％的牛血清蛋白的无菌纯水中，形成混合溶液ⅱ，将混合溶液ⅰ与混合溶液ⅱ在0-4℃条件下混合，得到搭载bmp7因子的胶原凝胶溶液。
[0282]
e.将5.0
×
105dpscs混合在10μl胶原凝胶溶液中，植入阴性对照组以及bmp7处理组的根尖处，以模拟根尖处的内源性干细胞。置于37℃孵箱中，待其凝固30min。
[0283]
f.随后将套管底朝上放置于24孔板，4℃冰盒保存等待植入；
[0284]
(3)裸鼠体内植入
[0285]
a.6周龄的雌性balb/c裸鼠购自江苏集萃药康公司；
[0286]
b.将构建好的牙本质套管随机植入裸鼠双侧背部皮下间隙内；
[0287]
c.饲养6周后进行结果分析。
[0288]
2、激光多普勒检测血液灌注情况
[0289]
(1)裸鼠体内移植6周后，使用0.3％戊巴比妥麻醉裸鼠；
[0290]
(2)按照制造商的说明使用激光多普勒测量各组样本的血流灌注量；
[0291]
(3)收集整理数据，导入graphpad prism 8进行统计分析。
[0292]
3、样本石蜡切片制备
[0293]
(1)脱钙：所有样本体内植入6周后收样，4％多聚甲醛固定过夜，随后用17％edtf对样本脱钙约8周时间，每天更换一次脱钙液；
[0294]
(2)脱水透明：样本在流水下浸泡8小时；酒精脱水，二甲苯透明；
[0295][0296]
(3)包埋：样本浸入热蜡(约64℃)中过夜；随后在石蜡包埋机上包埋；
[0297]
(4)切片：石蜡切片，厚度5μm；
[0298]
(5)烤片：将切片放置于摊片机烘烤2个小时，随后转移至64℃烘箱过夜；
[0299]
4、he染色
[0300]
(1)脱蜡：热片浸入二甲苯10min，重复两次；
[0301]
(2)复水：依次浸入100％，95％，95％，85％，75％酒精，ddh2o各5分钟；
[0302]
(3)染色：苏木精染色2min，pbs反蓝；伊红染色3min；
[0303]
(4)脱水：浸入75％，85％，95％，95％，100％，100％酒精各1分钟；
[0304]
(5)透明：浸入二甲苯5min，重复两次；
[0305]
(6)封片：晾干后中性树胶封片，镜下拍照。
[0306]
5、免疫荧光
[0307]
(1)切片脱蜡复水后，使用组化笔圈出组织区域；
[0308]
(2)打孔：0.5％tritfn x 100浸泡切片15分钟，洗3次；
[0309]
(3)封闭：1％bsf室温下封闭切片30分钟；
[0310]
(4)孵育一抗：弃封闭液，换为一抗溶液(red flufrescence-labeled cd31或mitfchfndria)，37℃下孵育60分钟，pbs清洗3次，每次5分钟；
[0311]
(5)孵育二抗：更换二抗溶液(flexa flufr 555gfat anti-mfuse),室温孵育30分钟，洗3次；(此步骤用于检测mitfchfndria)
[0312]
(6)封片：加入抗荧光猝灭剂，封片；
[0313]
(7)激光共聚焦观察，拍照；
[0314]
(8)image j分析结果。
[0315]
6、免疫组化
[0316]
(1)切片脱蜡复水后，使用组化笔圈出组织区域；
[0317]
(2)打孔：0.5％tritfn x 100浸泡切片15分钟，洗3次；
[0318]
(3)去除过氧化物酶：加入3％h2o2，室温下处理切片15分钟，洗3次；
[0319]
(4)封闭：1％bsf室温下处理切片30分钟；
[0320]
(5)孵育一抗：弃封闭液，换为一抗溶液(dspp和dmp-1)，37℃下孵育60分钟，洗3次；
[0321]
(6)孵育二抗：加入hrp偶联二抗，室温孵育30分钟，洗3次；
[0322]
(7)显色：切片置于光镜下，使用dfb试剂盒显色；
[0323]
(8)显色完全后，pbs清洗3次，每次5分钟；
[0324]
(9)苏木素核染1分钟；
[0325]
(10)封片：脱水后，中性树胶封片；
[0326]
(11)光镜下拍照，image j分析结果。
[0327]
本实施例步骤通过对样本石蜡切片进行h&e染色，发现牙髓样组织成功长入根管腔内。图26示出了本发明实施例中he染色检测牙髓样组织向根管内长入情况，图27示出了本发明实施例中he染色检测牙髓样组织向根管内长入情况的结果统计图，其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，结果发现，胶原凝胶组牙髓样组织长入的平均长度小于3mm，10ng/ml bmp7组约为4mm，在胶原凝胶+50ng/ml和胶原凝胶+250ng/ml bmp7组中接近6mm，这与阳性对照组观察到的结果相当。
[0328]
进一步地，图28示出了本发明实施例h&e染色及免疫组化检测牙髓样组织内细胞的成牙分化情况，从h&e染色结果来看，除了胶原凝胶组和胶原凝胶+10ng/ml bmp7组外，均可以观察到极化的成牙本质样细胞层(黑色箭头)位于牙本质和新生牙髓样组织之间，这与胶原凝胶+dpscs组观察到的现象相似。免疫组化分析显示部分细胞阳性表达了成牙本质细胞标志物dspp和dmp-1(白色箭头)，表明迁移的dpscs向成牙本质细胞系分化。
[0329]
图29示出了本发明实施例h&e染色及免疫组化检测牙髓样组织内细胞的成牙分化情况的结果统计图，其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，统计结果进一步表明，与胶原凝胶组相比，bmp7处理组显著促进了dpscs迁移并向dmp-1阳性和dspp阳性细胞分化。这说明bmp7诱导迁移的细胞成功向牙源性分化。
[0330]
进一步地，图30示出了本发明实施例中根管腔内血管的生长情况，如图30所示，能观察到各组血管从根尖孔向根管内生长。
[0331]
图31示出了本发明实施例中激光多普勒检测根管腔内血液灌注情况，其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，结果显示，胶原凝胶+50ng/ml和胶原凝胶+250ng/ml bmp7组具有更高的血液灌注量。
[0332]
进一步地，图32示出了本发明实施例中he染色评估再生牙髓样组织内血管形成情况，图33示出了本发明实施例中he染色评估再生牙髓样组织内血管形成情况的结果统计图，其中，ns p》0.05；*p《0.05；#p《0.01，如图32、33所示，胶原凝胶+50ng/ml和胶原凝胶+250ng/ml bmp7组以及胶原凝胶+dpscs组的牙髓样组织中观察到具有更高的血管密度和血管管腔直径(黑色箭头)。相反，在胶原凝胶组和胶原凝胶+10ng/ml bmp7组中未观察到明显的血管结构。
[0333]
进一步地，图34示出了本发明实施例免疫荧光检测牙髓样组织中人源性线粒体的表达情况，如图34所示，为了确定再生的牙髓样组织是宿主来源的还是供体来源的，进一步通过免疫荧光检测了牙髓样组织中人源性线粒体的表达情况。结果显示部分迁移的细胞阳性表达人源性线粒体。随着bmp7剂量的增加，阳性细胞的比例升高。
[0334]
结论：本实施例部分，发明人在体外实验中发现了bmp7作为再生信号分子以及胶原凝胶作为生物支架在细胞归巢策略的牙髓再生中可能发挥更好的作用。因此，发明人在裸鼠模型中移植了载bmp7的胶原凝胶以探索通过细胞归巢策略诱导牙髓再生的效果。为了
更好在小动物体内模拟临床情况，发明人设计了异位牙髓再生的裸鼠模型。结果发现50ng/ml和250ng/ml bmp7诱导了更多的牙髓样组织向根管内生长，并且可以观察到部分迁移的细胞分化为dmp-1和dspp阳性的成牙本质样细胞。此外，发明人观察到根管内不同位置细胞密度存在较大差异，远离根方细胞密度越少。发明人推测这可能是由于距离根尖处越远诱导细胞和组织往上生长的难度越大，一方面可能是由于缺乏营养和氧气，另一方面可能由于位于冠方的bmp7因子由于长时间植入可能部分失效。胶原凝胶+50ng/ml和胶原凝胶+250ng/ml bmp7组中形成了丰富的血管，说明bmp7因子成功在体内介导了再生牙髓样组织的血管化。此外，发明人还观察到再生的牙髓样组织中不同细胞的形态。为了弄清楚这些细胞是宿主来源的还是供体来源，发明人使用免疫荧光检测发现部分迁移的细胞表达人源性线粒体，并且随着bmp7剂量的增加，阳性细胞的比例增加。因此，发明人推测再生的牙髓样组织部分来自宿主，部分来自供体。
[0335]
基于以上的研究得出，异位牙髓再生模型为内源性牙髓再生提供了新的视角，即基于搭载bmp7因子胶原凝胶的干细胞归巢策略在诱导干细胞归巢的同时诱导了血管形成协同促进了内源性牙髓组织的再生。
[0336]
根尖周的细胞向根管内迁移并形成新生组织，这在一定程度上对内源性牙髓再生的研究具有重大的意义。
[0337]
以上对本发明所提供的一种促内源性牙髓再生注剂、制法及bmp7在制备牙髓再生注剂中的应用进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。