重组胆碱酯酶制品及其应用的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种重组胆碱酯酶制品及其应用。


背景技术：

2.胆碱酯酶分为两大类，那些优先水解乙酰胆碱酯类如乙酰胆碱的酶，其酶活性对化学抑制剂bw284c51敏感，被称为乙酰胆碱酯酶(ache)，或乙酰胆碱乙酰水解酶。乙酰胆碱酯酶又称真实型，特异型，纯正型，红细胞型，或i型胆碱酯酶，是一种膜结合糖蛋白，并以不同分子形式存在于红细胞、神经末梢、肺、脾和大脑灰质。乙酰胆碱酯酶在体内主要用于水解乙酰胆碱。那些优先水解其他类酯如丁酰胆碱的酶，其酶活性对化学抑制剂四异丙酯焦磷酰胺 (iso-ompa)敏感，被称为丁酰胆碱酯酶(bche，ec 3.1.1.8)。
3.丁酰胆碱酯酶也被称为假性丁酰胆碱酯酶或非特异丁酰胆碱酯酶。丁酰胆碱酯酶根据其电荷，疏水性，与细胞膜或细胞外结构互动，及亚基组成而进一步分类。该酶又称血浆型，血清型，苯甲酰型，虚假型或ii型胆碱酯酶，有超过11个同工酶变异体。丁酰胆碱酯酶优先使用丁酰胆碱和苯甲酰胆碱作为其体外反应底物。该酶存在于哺乳动物血浆、肝、胰、肠粘膜、中枢神经系统白质、平滑肌和心脏。丁酰胆碱酯酶的具体功能尚不明晰，它没有已知的特定自然底物，虽然它也水解乙酰胆碱。
4.人血浆丁酰胆碱酯酶是一个球状分子四聚体的丝氨酸酯酶，人血半衰期12 天。它能在血液中和降解神经毒剂及其他有机磷毒剂，阻止这些毒剂结合乙酰胆碱脂酶。应用外源丁酰胆碱酯酶，以防止乙酰胆碱酯酶失活，是一个潜在的预防和治疗神经毒剂和有机磷毒剂中毒的战略性考虑。但人血浆中该酶浓度极低(2毫克/升)，直接从人血浆中分离纯化商业价值较低，还有传播传染性病原体包括病毒，如丙型肝炎和艾滋病毒的风险。
5.饥饿激素(ghrelin)是一种内源性脑肠肽激素，主要由人胃底粘膜分泌，是生长激素促泌素受体的内源性配体。具有促进生长激素的释放，增强食欲，调节能量代谢，减少侵略行为等功能。用餐前饥饿激素水平升高，餐后降低，当以较高水平存在时诱导饱食。在一些减肥手术中，患者的胃饥饿激素水平降低，因此在正常用餐之前引起饱腹感。如何使得饥饿激素在人体内的水平降低是肥胖患者减轻体重的途径之一。现有技术中，人体对介导bche基因减肥方法的病毒载体可能产生的过度反应，以及外源性基因体内表达存在准确性、稳定性和长期安全性潜在的风险问题。
6.因此有必要提供一种新型的重组胆碱酯酶制品及其应用，以避免现有技术中存在的上述问题。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于提供一种重组胆碱酯酶制品及其应用，解决了人体对介导bche基因减肥方法的病毒载体可能产生过度反应及外源性基因表达存在准确性、稳定性和长期安全性潜在的风险问题。
8.为实现上述目的，本发明所述重组胆碱酯酶制品，包括重组胆碱脂酶、第一混合
酶、第二混合酶、重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白中的任意一种，其中，所述第一混合酶包括透皮短肽和重组胆碱酯酶，所述第二混合酶包括纳米晶片和重组胆碱酯酶。
9.本发明的所述重组胆碱酯酶制品的有益效果在于：所述重组胆碱酯酶制品包括重组胆碱脂酶、第一混合酶、第二混合酶、重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白中的任意一种，其中，所述第一混合酶包括透皮短肽和重组胆碱酯酶，所述第二混合酶包括纳米晶片和重组胆碱酯酶。所述重组胆碱酯酶制品解决了人体对介导bche基因减肥方法的病毒载体可能产生过度反应及外源性基因表达存在准确性、稳定性和长期安全性潜在的风险问题。
10.优选的，所述重组胆碱酯酶、所述重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、所述重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和所述重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白均来自动物表达系统、植物表达系统、细菌表达系统和酵母表达系统中的任意一种。
11.优选的，所述动物表达系统选自昆虫表达系统和哺乳动物表达系统中的任意一种。
12.优选的，所述哺乳动物表达系统包括来自于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、骆驼、牦牛、水牛和奶牛动物乳腺生物反应器系统(乳汁)中的任意一种或两种以上。
13.优选的，所述重组胆碱酯酶制品还包括口服制剂促进剂和透皮吸收促进剂。其有益效果在于：能够使得重组胆碱酯酶制品更容易进入人体，从而达到更好的减轻体重的效果。
14.优选的，所述口服制剂促进剂包括蛋白酶抑制剂、酸性ph值修饰剂、螯合物、表面活性剂、胆盐、芳香醇、哌嗪衍生物、离子液体、肠毒素肽衍生物、阴离子聚合物、阳离子聚合物、硫化聚合物、聚合物颗粒、无机颗粒、微胶粒、脂质体、药物晶体、纳米纤维和外泌体中的任意一种或两种以上。
15.进一步优选的，所述蛋白酶抑制剂包括n-乙酰半胱氨酸、甲磺酸卡莫司他、大豆胰蛋白酶抑制剂和抑肽酶中的任意一种或两种以上。
16.进一步优选的，所述酸性ph值修饰剂包括柠檬酸、富马酸、亚甲基丁二酸和酒石酸中的任意一种或两种以上。
17.进一步优选的，所述螯合物包括乙二胺四乙酸(edta)、二乙基三胺五乙酸(dtpa)和乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)中的任意一种或两种以上。
18.进一步优选的，所述表面活性剂包括十二烷基硫酸钠(sds)、8-(2-羟基苯甲酰胺基)辛酸钠(snac)、丙烷磺酸吡啶嗡盐(pps)和棕榈酰肉碱中的任意一种或两种以上。
19.进一步优选的，所述胆盐包括脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘脱氧胆酸钠和牛磺酰二氢氟化钠中的任意一种或两种以上。
20.进一步优选的，所述芳香醇包括没食子酸丙酯，丁基羟基甲苯和丁基羟基苯甲醚中的任意一种或两种以上。
21.进一步优选的，所述哌嗪衍生物包括1-苯基哌嗪，1-甲基-4-苯基哌嗪和 1-(4-甲基苯基)哌嗪中的任意一种或两种以上。
22.进一步优选的，所述离子液体包括胆碱、葛根酸盐、烟酸和胡卢巴碱中的任意一种或两种以上。
23.进一步优选的，所述肠毒素肽衍生物包括细胞闭锁带毒素和产气荚膜梭菌肠毒素肽中的任意一种或两种。
24.进一步优选的，所述阴离子聚合物包括聚羧乙烯、聚丙烯酸树脂(eudragitl100)和醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯(hpmcas)中的任意一种或两种以上。
25.进一步优选的，所述阳离子聚合物包括渗透素、n-三甲基壳聚糖(tmc)和微晶纤维素(mcc)中的任意一种或两种以上。
26.进一步优选的，所述硫化聚合物包括壳聚糖-巯基乙酸和稳定化巯基化聚合物(paa-cys-2mna)中的任意一种或两种。
27.进一步优选的，所述聚合物颗粒包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)、聚乳酸(pla)、苯基乙胺(pea)和聚己内酯(pcl)中的任意一种或两种以上。
28.进一步优选的，所述无机颗粒包括氧化铝、金和二氧化硅中的任意一种或两种以上。
29.进一步优选的，所述微胶粒包括聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(pluronics)、二缩三丙二醇(tpg)和口服抗凝药(oac)中的任意一种或两种以上。
30.进一步优选的，所述脂质体包括人工合成的脂质纳米颗粒(lnp)、脂质多聚复合物(lpp)和某些天然脂质体包括大豆磷脂、蛋黄磷脂和动物乳汁乳脂球磷脂和sirna脂质纳米粒中的任意一种。
31.进一步优选的，所述药物晶体包括结晶脂肪酶和脂质纳米晶体(lnc)中的任意一种或两种。
32.进一步优选的，所述纳米纤维包括鱼肌浆蛋白纤维和透明质酸纳米纤维中的任意一种或两种。
33.进一步优选的，所述外泌体是指从各种细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，即细胞间沟通的“载体”，负责不同细胞之间物质的转移。
34.优选的，所述透皮吸收促进剂包括表面活性剂、二甲基亚砜衍生物、吡咯酮衍生物、氮酮类化合物、醇类化合物和脂肪类化合物中的任意一种或两种以上。
35.优选的，所述重组胆碱酯酶包括重组乙酰胆碱酯酶、重组丁酰胆碱酯酶、重组胆碱酯酶的同工酶及重组胆碱酯酶的变异体中的任意一种。
36.优选的，所述重组丁酰胆碱酯酶的序列如seq id no.1所示，包括山羊β
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酪蛋白信号肽序列和人体丁酰胆碱酯酶氨基酸序列。
37.进一步优选的，所述山羊β-酪蛋白信号肽序列能促进所述重组丁酰胆碱酯酶分泌至动物乳汁或培养细胞上清液。
38.优选的，所述透皮短肽位于所述重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白的n端或 c端。
39.优选的，所述重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、所述重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和所述重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白还包括柔性连接肽。
40.优选的，所述重组胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白的序列如seq id no.2所示。
41.优选的，所述重组胆碱酯酶-fc融合蛋白的序列如seq id no.3所示。
42.优选的，所述重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白的序列如seq id no.4所示。
43.优选的，所述柔性连接肽的序列如seq id no.5或seq id no.6所示。
44.优选的，所述重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、所述重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和
所述重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白还包括便于蛋白纯化的标签序列，所述标签序列为his、flag、mbp、gst、ha和myc中的任意一种或两种以上。
45.优选的，所述重组胆碱酯酶、所述透皮短肽、所述重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、所述重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和所述重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白的纯度均在90～99％。
46.优选的，所述透皮短肽由人工合成制备得到。
47.优选的，所述重组胆碱酯酶制品的载体为粘结贴片、聚合物支架和水凝胶中的任意一种。
48.本发明的又一目的是为了提供一种重组胆碱酯酶制品的使用方法，将所述重组胆碱酯酶制品通过口服、透皮吸收、皮内注射、皮下注射、淋巴结注射、肌肉注射、腹腔注射和静脉注射中的任意一种方式进入人体。
49.本发明的所述重组胆碱酯酶制品的使用方法的有益效果在于：所述重组胆碱酯酶制品通过口服、透皮吸收、皮内注射、皮下注射、淋巴结注射、肌肉注射、腹腔注射和静脉注射中的任意一种方式进入人体，所述重组胆碱酯酶制品解决了人体对介导bche基因减肥方法的病毒载体可能产生过度反应及外源性基因表达存在准确性、稳定性和长期安全性潜在的风险问题。所述重组胆碱酯酶制品的使用方法解决了botox局部注射引起的副作用及不当注射方法引起的皮肤淤伤问题。
50.优选的，所述透皮吸收包括物理-化学法，所述物理-化学法包括离子导入技术、电转染技术、电致孔技术、超声波导入技术、微针技术、无针技术、化学转染技术中的任意一种或几种。
51.本发明的另一目的在于提供一种重组胆碱酯酶制品的应用，所述重组胆碱酯酶制品在中和降解神经毒剂、中和降解有机磷毒剂、水解饥饿激素和抗皱方面的应用。
52.本发明的所述重组胆碱酯酶制品的应用的有益效果在于：所述重组胆碱酯酶制品在中和降解神经毒剂和中和降解有机磷毒剂中的应用，能减轻或消除神经毒剂和有机磷毒剂的毒害作用。所述重组胆碱酯酶制品在水解饥饿激素中的应用，将所述重组胆碱酯酶制品施用到人体，使得人体内的饥饿激素水平降低，减轻人体体重，减少侵略行为。所述重组胆碱酯酶制品在减轻人体体重、减少侵略行为方面，解决了人体对介导bche基因减肥方法的病毒载体可能产生的过度反应，以及外源性基因体内表达存在准确性、稳定性和长期安全性潜在的风险问题。所述重组胆碱酯酶制品通过透皮吸收或皮内注射，使得人体皮肤光滑及消除细小皱纹。
53.优选的，所述重组胆碱酯酶制品需要重复使用。
54.优选的，所述重复使用的时间包括每天使用、隔天使用或者间隔大约1周至26周使用，以增强其应用效果。
附图说明
55.图1为本发明实施例的重组丁酰胆碱酯酶纯化后通过sds-page电泳和考马斯亮蓝染色法显示的电泳图照片；
56.图2为本发明实施例的重组丁酰胆碱酯酶通过非变性凝胶电泳和活性染色法显示的电泳图照片；
57.图3为本发明实施例的重组丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白和重组丁酰胆碱酯酶-fc融合蛋白通过变性凝胶电泳显示的电泳图照片；
58.图4为现有技术中的人血浆丁酰胆碱酯酶的酶活性模拟动态力学数据曲线图；
59.图5为本发明实施例的重组丁酰胆碱酯酶的酶活性模拟动态力学数据曲线图；
60.图6为本发明实施例的重组丁酰胆碱酯酶制品的稳定性实验的结果示意图；
61.图7为本发明实施例4的大鼠抓力实验的结果示意图。
具体实施方式
62.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”和“包含”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。
63.为大量生产药用重组胆碱酯酶，我们已建立了动物乳腺生物反应器制药平台，产生了数个重组丁酰胆碱酯酶(rbche)阳性兔系，从中筛选了几个兔奶rbche 高表达种系，纯化了一部分蛋白。我们发现所生产rbche的酶动力学参数与人血浆bche相同，神经毒剂抗毒效果相当，尤其是在世界上首次发现该酶对新型毒剂诺维乔克的抗毒效果极佳。rbche也能水解哺乳动物体内分泌的饥饿激素 ghrelin，使哺乳动物减轻体重和减少侵略行为。现有技术中，直接从人血浆中分离纯化bche用于神经毒剂和有机磷毒剂解毒存在商业价值较低的问题。有人利用病毒载体携带bche基因注射到体内的bche基因疗法来水解饥饿激素，但人体对介导bche基因减肥方法的病毒载体可能产生过度反应，外源性基因体内表达准确性、稳定性和长期安全性有潜在风险问题。人血浆丁酰胆碱酯酶还能水解可卡因毒品，但通过cho细胞系统表达生产的重组丁酰胆碱酯酶表达量不高(0.005-0.035克/升)，cmc生产会遭遇技术瓶颈。因此，cho细胞表达生产重组丁酰胆碱酯酶存在水解可卡因毒品效价较低的问题。胆碱酯酶的作用机制与肉毒杆菌毒素类似，它们都能在神经肌肉接头水解乙酰胆碱或使其失活，引起肌肉松弛，我们首次发现所生产的重组胆碱酯酶和其他生物制剂，也能作为化妆品使用。
64.针对现有技术存在的问题，本发明的实施例中提供了一种重组胆碱酯酶制品，包括重组胆碱脂酶、第一混合酶、第二混合酶、重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白中的任意一种，其中，所述第一混合酶包括透皮短肽和重组胆碱酯酶，所述第二混合酶包括纳米晶片和重组胆碱酯酶。
65.具体的，所述重组胆碱酯酶制品包括重组胆碱脂酶、第一混合酶、第二混合酶、重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白中的任意一种，其中，所述第一混合酶包括透皮短肽和重组胆碱酯酶，所述第二混合酶包括纳米晶片和重组胆碱酯酶。所述重组胆碱酯酶制品分别解决了人体对介导bche基因减肥方法的病毒载体可能产生过度反应及外源性基因表达存在准确性、稳定性和长期安全性潜在的风险问题。同时所述重组胆碱酯酶制品能够解决直接从人血浆中分离纯化bche商业
价值较低的问题和cho细胞表达生产重组丁酰胆碱酯酶效价较低的问题。
66.本发明一些实施例中，所述重组胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白能够使得所述重组胆碱酯酶制品在人体内的半衰期增加，增强所述重组胆碱酯酶制品的效用。
67.本发明一些实施例中，所述重组胆碱酯酶-fc融合蛋白不仅可发挥所述融合蛋白的生物学活性，还具有一些抗体的性质，如可引起抗体依赖细胞介导的细胞毒作用、补体依赖的细胞毒作用及抗体依赖细胞介导的吞噬作用等。
68.本发明一些具体实施例中，所述透皮短肽为td-1或者其他透皮短肽。
69.本发明一些具体实施例中，所述td-1由11个氨基酸组成，是第一个通过噬菌体展示技术发现的透皮增强肽。
70.本发明一些实施例中，所述重组胆碱酯酶、所述重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、所述重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和所述重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白均来自动物表达系统、植物表达系统、细菌表达系统和酵母表达系统中的任意一种。
71.本发明一些实施例中，所述动物表达系统选自昆虫表达系统和哺乳动物表达系统中的任意一种。
72.本发明一些具体实施例中，所述昆虫表达系统包括昆虫细胞表达系统。
73.本发明又一些具体实施例中，所述哺乳动物表达系统包括哺乳动物细胞表达系统。
74.本发明另一些具体实施例中，所述哺乳动物表达系统包括来自于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、骆驼、牦牛、水牛和奶牛动物乳腺生物反应器系统 (乳汁)中的任意一种或两种以上。
75.具体的，所述动物乳腺生物反应器系统，是指利用乳腺特异表达的乳蛋白基因的调控序列构建表达载体，将所述表达载体导入雌性育龄非人哺乳动物基因中并将重组蛋白定位表达于所述雌性育龄非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管；或将所述表达载体转染至所述雌性育龄非人哺乳动物的乳腺组织或乳腺管；指导特定外源基因在动物乳腺中特异性和高效率地表达，以期从分泌乳汁中获得外源活性蛋白。
76.本发明一些可能实施例中，所述植物表达系统、所述细菌表达系统、所述酵母表达系统、所述昆虫细胞表达系统和所述哺乳动物细胞表达系统是经过基因工程改造得到的。
77.本发明又一些可能实施例中，所述哺乳动物乳腺表达系统和所述植物表达系统是未经过基因工程改造得到的。
78.本发明一些具体实施例中，所述重组胆碱酯酶、所述重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、所述重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和所述重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白来自动物乳汁。
79.本发明一些更具体实施例中，所述动物乳汁包括来自于小鼠、大鼠、兔、山羊、绵羊、猪、骆驼、牦牛、水牛和奶牛乳汁中的任意一种或两种以上。
80.本发明一些更具体实施例中，所述昆虫细胞表达系统为sf9细胞系。
81.本发明一些更具体实施例中，所述哺乳动物细胞表达系统为中国仓鼠卵巢细胞系(cho)，包括但不限于ch0-k1、ch0-dg44以及ch0-s。
82.本发明一些更具体实施例中，所述哺乳动物细胞表达系统为幼仓鼠肾细胞系(bhk)。
83.本发明一些更具体实施例中，所述哺乳动物细胞表达系统为奶牛乳腺上皮细胞mac-t细胞系、奶牛乳腺上皮细胞bme-uv1细胞系和其他奶牛、奶羊及奶兔原代乳腺上皮细胞及乳腺上皮细胞系。
84.本发明另一些更具体实施例中，所述人体细胞表达系统为hek293细胞系。
85.本发明一些实施例中，所述重组胆碱酯酶包括重组乙酰胆碱酯酶、重组丁酰胆碱酯酶、重组胆碱酯酶的同工酶及重组胆碱酯酶的变异体中的任意一种。
86.本发明一些实施例中，所述重组胆碱酯酶包括全长的重组乙酰胆碱酯酶、全长的重组丁酰胆碱酯酶和全长的重组胆碱酯酶的同工酶或者全长的重组胆碱酯酶的变异体。
87.本发明又一些实施例中，所述重组胆碱酯酶包括片段化的重组乙酰胆碱酯酶、片段化的重组丁酰胆碱酯酶和片段化的的重组胆碱酯酶的同工酶或者片段化的重组胆碱酯酶的变异体。
88.本发明一些实施例中，所述重组胆碱酯酶制品还包括药学上可接受的赋形剂。
89.本发明一些实施例中，所述重组胆碱酯酶制品还包括口服制剂促进剂和透皮吸收促进剂。能够使得重组胆碱酯酶制品更容易进入人体，从而达到更好的减轻体重的效果。
90.本发明一些实施例中，所述口服制剂促进剂包括蛋白酶抑制剂、酸性ph值修饰剂、螯合物、表面活性剂、胆盐、芳香醇、哌嗪衍生物、离子液体、肠毒素肽衍生物、阴离子聚合物、阳离子聚合物、硫化聚合物、聚合物颗粒、无机颗粒、微胶粒、脂质体、药物晶体、纳米纤维和外泌体中的任意一种或两种以上。
91.本发明又一些实施例中，所述蛋白酶抑制剂包括n-乙酰半胱氨酸、甲磺酸卡莫司他、大豆胰蛋白酶抑制剂和抑肽酶中的任意一种或两种以上。
92.本发明又一些实施例中，所述酸性ph值修饰剂包括柠檬酸、富马酸、亚甲基丁二酸和酒石酸中的任意一种或两种以上。
93.本发明又一些实施例中，所述螯合物包括乙二胺四乙酸(edta)、二乙基三胺五乙酸(dtpa)和乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸(egta)中的任意一种或两种以上。
94.本发明又一些实施例中，所述表面活性剂包括十二烷基硫酸钠(sds)、8-(2
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羟基苯甲酰胺基)辛酸钠(snac)、丙烷磺酸吡啶嗡盐(pps)和棕榈酰肉碱中的任意一种或两种以上。
95.本发明又一些实施例中，所述胆盐包括脱氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘脱氧胆酸钠和牛磺酰二氢氟化钠中的任意一种或两种以上。
96.本发明又一些实施例中，所述芳香醇包括没食子酸丙酯、丁基羟基甲苯和丁基羟基苯甲醚中的任意一种或两种以上。
97.本发明又一些实施例中，所述哌嗪衍生物包括1-苯基哌嗪、1-甲基-4-苯基哌嗪和1-(4-甲基苯基)哌嗪中的任意一种或两种以上。
98.本发明又一些实施例中，所述离子液体包括胆碱、葛根酸盐、烟酸和胡卢巴碱中的任意一种或两种以上。
99.本发明又一些实施例中，所述肠毒素肽衍生物包括细胞闭锁带毒素和产气荚膜梭菌肠毒素肽中的任意一种或两种。
100.本发明又一些实施例中，所述阴离子聚合物包括聚羧乙烯、聚丙烯酸树脂 (eudragit l100)和醋酸羟丙甲纤维素琥珀酸酯(hpmcas)中的任意一种或两种以上。
101.本发明又一些实施例中，所述阳离子聚合物包括渗透素、n-三甲基壳聚糖(tmc)和微晶纤维素(mcc)中的任意一种或两种以上。
102.本发明又一些实施例中，所述硫化聚合物包括壳聚糖-巯基乙酸和稳定化巯基化聚合物(paa-cys-2mna)中的任意一种或两种。
103.本发明又一些实施例中，所述聚合物颗粒包括聚乳酸-羟基乙酸共聚物 (plga)、聚乳酸(pla)、苯基乙胺(pea)和聚己内酯(pcl)中的任意一种或两种以上。
104.本发明又一些实施例中，所述无机颗粒包括氧化铝、金和二氧化硅中的任意一种或两种以上。
105.本发明又一些实施例中，所述微胶粒包括聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段共聚物(pluronics)、二缩三丙二醇(tpg)和口服抗凝药(oac)中的任意一种或两种以上。
106.本发明又一些实施例中，所述脂质体包括人工合成的脂质纳米颗粒(lnp)、脂质多聚复合物(lpp)和某些天然脂质体包括大豆磷脂、蛋黄磷脂和动物乳汁乳脂球磷脂和sirna脂质纳米粒中的任意一种。
107.本发明又一些实施例中，所述药物晶体包括结晶脂肪酶和脂质纳米晶体 (lnc)中的任意一种。
108.本发明又一些实施例中，所述纳米纤维包括鱼肌浆蛋白纤维和透明质酸纳米纤维中的任意一种或两种。
109.本发明又一些实施例中，所述外泌体是指从各种细胞膜上脱落或者由细胞分泌的双层膜结构的囊泡状小体，即细胞间沟通的“载体”，负责不同细胞之间物质的转移。
110.本发明一些实施例中，所述透皮吸收促进剂包括表面活性剂、二甲基亚砜衍生物、吡咯酮衍生物、氮酮类化合物、醇类化合物和脂肪类化合物中的任意一种或两种以上。
111.本发明一些实施例中，所述透皮吸收促进剂还可以选自二甲基亚砜和吡咯酮中的任意一种或两种。
112.本发明一些实施例中，所述重组丁酰胆碱酯酶的序列如seq id no.1所示，包括山羊β-酪蛋白信号肽序列和人体丁酰胆碱酯酶氨基酸序列。
113.本发明另一些更具体实施例中，所述山羊β-酪蛋白信号肽序列能促进所述重组丁酰胆碱酯酶分泌至动物乳汁或培养细胞上清液。
114.本发明一些实施例中，所述透皮短肽位于所述重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白的n端或c端。
115.本发明一些实施例中，所述重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、所述重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和所述重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白还包括柔性连接肽。
116.本发明一些实施例中，所述重组胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白的序列如seq idno.2所示。
117.本发明一些实施例中，所述重组胆碱酯酶-fc融合蛋白的序列如seq id no.3 所示。
118.本发明一些实施例中，所述重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白的序列如seqid no.4所示。
119.本发明一些实施例中，所述柔性连接肽的序列如seq id no.5或seq id no.6 所示。
120.本发明一些实施例中，所述重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、所述重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和所述重组透皮短肽-胆碱酯酶融合蛋白还包括便于蛋白纯化的标签序列，所述标签序列为his、flag、mbp、gst、ha和myc中的任意一种或两种以上。
121.本发明一些实施例中，所述重组胆碱酯酶、所述透皮短肽、所述重组胆碱脂酶-白蛋白融合蛋白、所述重组胆碱脂酶-fc融合蛋白和所述重组透皮短肽
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胆碱酯酶融合蛋白的纯度均在90～99％。
122.本发明一些实施例中，所述透皮短肽由人工合成制备得到。
123.本发明一些实施例中，所述重组胆碱酯酶制品的载体为粘结贴片、聚合物支架和水凝胶中的任意一种。
124.本发明的实施例中，提供了一种重组胆碱酯酶制品的使用方法，将所述重组胆碱酯酶制品通过口服、透皮吸收、皮内注射、皮下注射、淋巴结注射、肌肉注射、腹腔注射和静脉注射中的任意一种方式进入人体。
125.具体的，所述重组胆碱酯酶制品通过口服、透皮吸收、皮内注射、皮下注射、淋巴结注射、肌肉注射、腹腔注射和静脉注射中的任意一种方式进入人体，所述重组胆碱酯酶制品分别解决了人体对介导bche基因减肥方法的病毒载体可能产生过度反应及外源性基因表达存在准确性、稳定性和长期安全性潜在的风险问题。同时所述重组胆碱酯酶制品解决了直接从人血浆中分离纯化bche商业价值较低的问题、cho细胞表达生产重组丁酰胆碱酯酶效价较低的问题。所述重组胆碱酯酶制品的使用方法解决了botox局部注射引起的副作用及不当注射方法引起的皮肤淤伤问题。
126.更具体的，所述皮下注射包括在人体皮肤的多个位点注射，间距约0.5-10 厘米，重组胆碱酯酶制品注射量为0.1-1000单位，以使人体皮肤光滑及消除细小皱纹。
127.本发明一些实施例中，所述透皮吸收包括物理-化学法，所述物理-化学法包括离子导入技术、电转染技术、电致孔技术、超声波导入技术、微针技术、无针技术、化学转染技术中的任意一种或几种。
128.本发明一些具体实施例中，所述微针技术包括纳晶纳米晶片微针技术。
129.本发明的一些实施例中，提供了一种重组胆碱酯酶制品的应用，所述重组胆碱酯酶制品在中和降解神经毒剂、中和降解有机磷毒剂、水解饥饿激素、水解可卡因物质和制备抗皱药物方面的应用。
130.本发明的一些具体实施例中，所述抗皱作用为减少人体皮肤上的皱纹或者消除人体皮肤上的皱纹。
131.具体的，所述重组胆碱酯酶制品在中和降解神经毒剂和中和降解有机磷毒剂中的应用，能减轻或消除神经毒剂和有机磷毒剂的毒害作用。所述重组胆碱酯酶制品在水解饥饿激素中的应用，将所述重组胆碱酯酶制品施用到人体，使得人体内的饥饿激素水平降低，减轻人体体重，减少侵略行为。为了减轻甚至消除botox局部注射引起的副作用和不当注射方法引起的皮肤淤伤，所述重组胆碱酯酶制品通过透皮吸收或皮内注射，使得人体皮肤光滑及消除细小皱纹。所述重组胆碱酯酶制品分别解决了人体对介导bche基因减肥方法的病毒载体可能产生过度反应及外源性基因表达存在准确性、稳定性和长期安全性潜在的风险问题。同时所述重组胆碱酯酶制品解决了直接从人血浆中分离纯化bche商业价值较低的问题、cho细胞表达生产重组丁酰胆碱酯酶效价较低的问题。所述重组胆碱酯酶制品的使用方
法解决了botox局部注射引起的副作用及不当注射方法引起的皮肤淤伤问题。
132.本发明的一些实施例中，所述重组胆碱酯酶制品需要重复使用。
133.本发明的一些实施例中，所述重复使用的时间包括每天使用、隔天使用或者间隔大约1周至26周使用，以增强其应用效果。
134.实施例1
135.将所述重组丁酰胆碱酯酶(rbche，如seq id no.1所示)蛋白编码核酸质粒导入雌性育龄兔基因中并将rbche定位表达于所述雌性育龄兔的乳腺组织，收集兔奶。利用ellman assay检测方法检测兔奶rbche表达浓度，在几个阳性兔系中，已实现兔奶rbche的高效表达(0.24-12克/升，详见表1)，比人血浆bche血清浓度高6000倍以上，创造了世界纪录(表2)，量产的技术瓶颈已突破，取得了意想不到的最佳技术效果。含rbche的兔奶初纯品经亲和层析和离子交换层析进行纯化。将洗涤过的兔奶初纯品加载到普鲁卡因酰胺亲和层析柱上，该亲和层析柱预先用10mm磷酸盐缓冲液(ph 7.2)，1mm edta和 140mm nacl平衡过。用10床体积的相同平衡缓冲液清洗柱子，并用10mm磷酸盐缓冲液(ph 7.2)，1mm edta和500mm nacl洗脱蛋白质。该洗脱液加载到hq50离子交换层析柱，该柱用相同的缓冲液平衡过。收集洗脱液(含有rbche)，随后用10mm磷酸盐缓冲液(ph 7.2)，1mm edta和1m nacl清洗柱子，以去除任何捕获的杂质。将纯化的rbche无菌过滤，并在-20℃储存。测试纯化蛋白的bche活性，并测定总蛋白浓度。
136.表1.不同兔系兔奶rbche的表达浓度
137.兔系兔奶rbche表达浓度d15212.01g/ld1610.63g/ld1730.24g/ld1854.11g/l
138.表2.rbche在不同系统的表达生产
[0139][0140]
同时，将所述重组丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白(如seq id no.2所示) 蛋白编码核酸质粒和所述重组丁酰胆碱酯酶-fc融合蛋白(如seq id no.3所示)蛋白编码核酸质粒分别导入雌性育龄小鼠基因中并分别将重组丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白和重组丁酰胆碱酯酶-fc融合蛋白定位表达于所述雌性育龄小鼠的乳腺组织，收集鼠奶。以在兔奶表达的重组丁酰胆碱酯酶作为对照，利用ellman assay检测方法检测鼠奶重组丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白和重组丁酰胆碱酯酶-fc融合蛋白的表达，分别发现其鼠奶表达浓度与兔奶重组丁酰胆碱酯酶的表达浓度大致相当(详见图3)。
[0141]
图1为本发明实施例的重组丁酰胆碱酯酶纯化后通过sds-page电泳和考马斯亮蓝染色法显示的电泳图照片；图2为本发明实施例的重组丁酰胆碱酯酶通过非变性凝胶电泳和活性染色法显示的电泳图照片；图3为本发明实施例的重组丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白和重组丁酰胆碱酯酶-fc融合蛋白通过变性凝胶电泳显示的电泳图照片；图4为现有技术中的人血浆丁酰胆碱酯酶的酶活性模拟动态力学数据曲线图；图5为本发明实施例的重组丁酰胆碱酯酶的酶活性模拟动态力学数据曲线图。
[0142]
重组丁酰胆碱酯酶纯化后通过变性sds-page电泳和考马斯亮蓝染色后，显示单体重组丁酰胆碱酯酶的分子量约为90kd，纯度大于95％，活性大于700u/ 毫升，参照图1。
[0143]
重组丁酰胆碱酯酶通过非变性凝胶电泳和活性染色法，显示含不同浓度的重组丁酰胆碱酯酶的兔奶样本与0.1mm 50-mer脯氨酸(polyproline)混合， 37℃过夜处理后组装成四聚体。样品1为人血浆丁酰胆碱酯酶(200mu,未经处理)；样品2为阳性兔奶样本(重组丁酰胆碱酯酶1000u/ml)；样品3为阳性兔奶样本(重组丁酰胆碱酯酶300u/ml)；样品4为阳性兔奶样本(重组丁酰胆碱酯酶18u/ml)；样品5为阳性兔奶样本(重组丁酰胆碱酯酶1000u/ml,未经脯氨酸处理)；样品6为初纯兔奶的重组丁酰胆碱酯酶样本(1000u/ml,未经脯氨酸处理)，参照图2。
[0144]
参照图3，为本发明实施例的重组丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白和重组丁酰胆碱酯酶-fc融合蛋白通过变性凝胶电泳显示的电泳图照片。样品1为蛋白大小标准；样品2-4均为阳性兔奶稀释样本含重组丁酰胆碱酯酶蛋白(白色箭头)；样品5为鼠奶稀释样本含重组丁酰胆碱酯酶-fc融合蛋白(灰色箭头)；样品6为鼠奶稀释样本含重组丁酰胆碱酯酶-白蛋白融合蛋白(黑色箭头)；样品7-8均为阴性鼠奶稀释样本对照。
[0145]
参照图4和图5，检测了人血浆丁酰胆碱酯酶和重组丁酰胆碱酯酶的米氏常数，前者km值为120μm/l，后者km值为121μm/l，说明人血浆丁酰胆碱酯酶与重组丁酰胆碱酯酶的酶动力学特征相同。
[0146]
实施例2
[0147]
1.兔奶rbche小鼠针对神经毒剂梭曼的抗毒实验
[0148]
对小鼠进行分组，分别注射2.5mg/ml，5mg/ml，10mg/ml rbche溶液，半小时后分别攻毒1倍和2倍梭曼致死剂量。结果分析：5mg/ml rbche可抗1倍梭曼致死剂量。
[0149]
对6只小鼠先腹腔注射1倍梭曼致死剂量，随后立即静脉注射10mg/ml rbche 溶液,观察急救效果。6只小鼠存活3只。说明急救有效。给完1倍梭曼致死剂量后，需在一分钟内注射进rbche溶液，不同小鼠因为个体差异，需要的注射时间可能不同。
[0150]
2.兔奶rbche和人血浆bche小鼠针对神经毒剂诺维乔克的抗毒实验
[0151]
诺维乔克是苏联研制的一种二元有机磷系列的神经毒剂，有无法探测、无法防护、使用者安全、不在化武条约之内等四大特点。平时伪装成农药分开储存，用前混合，成为高效神经毒剂，毒性比沙林、vx、梭曼等高出5-8倍。小鼠皮下注射诺维乔克毒剂，静脉注射兔奶rbche和人血浆bche，观察动物的行为学变化和中毒症状，及救治效果。
[0152]
实验结果确定兔奶hubche的抗毒效价：100mg/kg的兔奶hubche静脉注射后，可以救治10倍致死剂量的诺维乔克中毒(表3)。20mg/kg的人血清hubche 静脉注射后，可以救治10倍致死剂量的诺维乔克中毒(表4)。
[0153]
表3.兔奶rbche的抗毒效价
[0154]
诺维乔克兔奶rbche小鼠存活存活率10ld100mg/kg44100％
[0155]
表4.人血浆bche的抗毒效价
[0156]
诺维乔克人血浆bche小鼠存活存活率2ld20mg/kg88100％
[0157]
从表3和表4中可知：(1)兔奶rbche和人血浆bche均可以高效救治诺维乔克中毒小鼠。(2)兔奶rbche和人血浆bche抗毒效价非常高。(3)兔奶 rbche和人血浆bche的抗毒效价基本相当。
[0158]
实施例3
[0159]
将纯化的兔奶rbche样品分别与聚乙二醇产品mpeg-ple50(p50)和 mpeg113-ple100(p100)混合，4℃搅拌30分钟。将原始纯化rbche样品和上述混合物样品，分装250ul，密封放置于37℃温箱，分别于第1天、第4天、第 8天、第39天、第89天和第179天取出部分样品，用ellman assay检测bche 活性。
[0160]
图6为本发明实施例的重组丁酰胆碱酯酶制品的稳定性实验的结果示意图。
[0161]
结果分析：原始纯化rbche样品在37℃温箱，经过半年时间，其酶活性稳定性良好，参照图6。
[0162]
实施例4
[0163]
图7为本发明实施例4的大鼠抓力实验的结果示意图。
[0164]
胆碱酯酶的作用机制理论上与肉毒杆菌毒素(botox)类似，它们都能在神经肌肉接头水解乙酰胆碱或使其失活，引起肌肉松弛。大鼠体内抓力试验主要用于比较botox和重组胆碱脂酶制品对肌肉松弛的麻痹作用。将生理盐水或供试品(rbche，rache，botox)肌肉注射进入sd大鼠的两个前肢肌肉处(100ul/ 次)，注射后0、8、24、48、72小时，使用数字抓力仪测量抓力。大鼠前肢抓力是通过托住颈背和尾巴进行测量，将前肢放在张力杆上，轻轻将大鼠向后拉，直到释放张力杆。每只大鼠连续测试5次。五次试验的平均值记录为大鼠的抓力。通过分析软件对数据进行总结和分析，参照图7。
[0165]
从图7可以看出，不同剂量的rbche在大鼠注射8小时后，大鼠抓力相对减退，24小时后基本恢复正常。而botox注射48小时后显示大鼠抓力相对减退， 72小时后基本恢复正常。实验结果显示，rbche注射所起到的肌肉松弛作用比 botox注射更为早期，而抓力恢复时间基本相同。
[0166]
实施例5
[0167]
从集萃药康采购24只基于高脂饮食喂养构建的10-12周龄的肥胖公鼠模型 (品系背景：c57bl/6j小鼠)，小鼠抵达后，约需2-4天时间休整恢复。肥胖公鼠分为以下3组，每组8只，腹腔注射期间保持高脂饮食(每100g普通饲料中添加20g猪油，20g奶粉，1个鸡蛋，10滴鱼肝油，250g黄豆芽，饲料在配制后进行烘烤熟制)。
[0168]
(1)生理盐水腹腔注射：隔天上午给餐前半小时注射100ul生理盐水x15 次；
[0169]
(2)高剂量rbche(2.5mg/ml)腹腔注射：隔天上午给餐前半小时餐前注射100ul rbche x 15次；
[0170]
(3)低剂量rbche(0.6mg/ml)腹腔注射：隔天上午给餐前半小时注射100ul rbche x 15次。
[0171]
测定指标：实验期间，每周末取尾血测定血浆bche浓度，acylghrelin和 desacyl-ghrelin浓度，及desacyl/acyl ghrelin比例。
[0172]
其他指标：根据小鼠体重、身长，计算lee’s指数：
[0173][0174]
以及脂肪指数(％)：体脂肪重(克)/体重(克)x100。
[0175]
统计学处理：采用spss统计软件进行处理。各组小鼠所有参数采用：均数
±
标准差(x
±
sd)表示，组间差异采用方差分析，显著t检验。
[0176]
实验结果表明，相比注射生理盐水的肥胖小鼠，同期腹腔注射重组丁酰胆碱酯酶制品的肥胖小鼠食欲下降，体重减轻，侵略行为减少。
[0177]
虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。