一种模拟脊髓的水凝胶制备方法及其应用

1.本发明涉及一种模拟天然脊髓组织的水凝胶材料的制备方法及其在脊髓损伤修复方面的应用。


背景技术：

2.脊髓损伤的修复在世界范围内一直是研究重点，且长期没有取得突破性的进展。在损伤部位引入神经干细胞作为现阶段公认脊髓修复方法。神经干细胞其能分化为神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞可以在多个层面参与损伤的修复。但脊髓内部抑制性微环境会不利于移植的神经干细胞的增值分化并且分化方向得不合理调控，会导致的过多向不利于损伤修复的星型胶质细胞分化影响脊髓损伤的修复。
3.近些年，水凝胶由于多功能性及出色的生物相容性在生物材料领域受到人们广泛关注。利用水凝胶可调节性、可负载细胞的特点，模拟脊髓组织的生物物理特性为神经干细胞提供更好增殖分化的微环境。但是神经干细胞在过软还是过硬的微环境中都不利于其分化；在软硬合适的环境(0.1～1kpa)中更利于向神经元分化，并且天然的脊髓组织模量为0.1～3kpa。此外脊髓组织内部的生物电信号能够促进内源与外源细胞的增殖分化，水凝胶能够模仿天然脊髓的高导电性将对组织修复非常有利。因此我们有必要设计一种模拟脊髓模量和电导的可注射导电水凝胶促进神经干细胞向神经元定向分化。
4.该导电水凝胶结合电刺激是一种很有前途的治疗方式，可用于促进神经干细胞向神经元定向分化和促进轴突生长。解决以往神经干细胞分化不可控，过多的向星形胶质细胞分化的问题。因此，这种模拟脊髓组织模量与电导率的可注射导电水凝胶负载神经干细胞结合电刺激治疗方法在脊髓损伤修复上将具有极大的潜能。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种模拟天然脊髓组织的水凝胶材料的制备方法及其在脊髓损伤修复方面的应用。
6.该方法首先制备经过修饰的壳聚糖chic，然后制备ha-ald，再通过刻蚀的方法制备mxene纳米片。将mxene纳米片混入ha-ald溶液中与掺有一定量adh的chic溶液按一定比例反应，可得到模拟脊髓组织结构、模量与电导率的可注射导电水凝胶。
7.1)首先制备邻苯二酚基团修饰的壳聚糖(chic)。0.5～0.8g壳聚糖溶解于去离子水中,通过hcl调节ph至5.0～6.0，然后使用超声波震荡分散20～30min，最终形成1.0％wt的壳聚糖溶液。然后将255～455mg的二氢咖啡酸hca溶解于5.0～8.0ml去离子水中，充分搅拌溶解后加入壳聚糖液中。将240～300mg1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺edc和150～200mgn-羟基硫代琥珀酰亚胺nhs溶解于50.0ml乙醇和去离子水1:1～1:2的混合溶液中保持ph在6～7区间。随后将壳聚糖/hca混合溶液缓慢滴加入其中，反应在20～25℃的环境中密封剧烈搅拌10～12h，保持ph为5.0～6.0，然后放在振荡器快速震荡反应10～15min。溶液在酸化去离子水中透析2～3天，然后放在去离子水中再渗析半天，最后放入冻干机中
冷冻干燥得到黄色固体，即制备得到邻苯二酚基团修饰的壳聚糖chic。
8.2)制备醛基化透明质酸ha-ald。把2.0～3.0g透明质酸ha溶解于200～300ml的去离子水中，在20～25℃的环境中密封快速搅拌24～28h至完全溶解。1.0～1.5g naio4加入ha溶液中避光搅拌4～7h，加入1.5～2.3ml乙二醇搅拌1～2h后，使用超声波震荡反应10～20min。溶液放入渗析袋中用去离子水渗析3～4天，保持溶液ph在7～8区间。反应物放入冻干机中冷燥，最终获得白色固体为醛基化透明质酸ha-ald。
9.3)制备mxene纳米片。取1～4g的lif添加到20～80ml盐酸中,搅拌5～10min。然后将1～4g ti3alc2慢慢添加上述溶液并在35～40℃搅拌24～26h。用去离子水洗涤酸性悬浊液,在3500～4500转离心5～8min直到上层清液的ph值达到6～7。然后收集沉积物，在沉积物中加入去离子水将ar通入分散液中10～20min，使用超声波振荡分散1～1.5h并保证温度在30℃以内。最后，以4500～5000转速离心10～15分钟，于-50～-30℃冷冻干燥2～3天，得到黑色固体粉末为mxene纳米片。
10.4)将chic固体用去离子水配成配成4～6％wt溶液，加入1.0～2.0％wt的己二酸二酰肼adh配成淡黄色溶液a。然后将ha-ald加入去离子水配成4～6％wt溶液，再加入0.1～0.15％wtmxene纳米片粉末经过10～15min超声波震荡，得到黑色溶液b。将上述溶液a、溶液b按体积比1:2～3:1混合，通过振荡器快速混合反应10～60秒。即可得到模拟脊髓组织结构、模量与电导率的可注射导电水凝胶。
11.本发明具有如下优点：1.所合成的水凝胶的主要原料、生物相容性好、有利于产品商业化；2.水凝胶成胶过程容易，成胶速度快3.该导电水凝胶模拟天然脊髓组织的结构和生物物理特性，具有与脊髓组织相似的孔隙结构、模量和电导率等特点，有助于促进神经干细胞的定向分化；4水凝胶具有可注射性、粘附性、导电性、力学强度等特点，能够弥合脊髓损伤后的不规则缺损.；5.水凝胶具有止血功能，可有效避免由于脊髓损伤处出血导致的炎症反应；6.该导电水凝胶负载神经干细胞后结合电刺激可有效促进神经干细胞向神经元分化和轴突生长；7.当负载神经干细胞的可注射导电水凝胶注入脊髓损伤处并结合电刺激辅助，可以有效促进脊髓损伤修复和运动功能恢复。
附图说明
12.图1：为实施例1所制备的水凝胶相态变化图。通过试剂瓶倾斜实验可以看出，将溶液a与b混合后为黑色溶液十秒后形成可注射导电水凝胶。
13.图2：为实施例1所制备水凝胶的电镜照片。由图可知，该导电水凝胶具有类似脊髓的三维网络孔隙结构。
14.图3：为实施例1所制备水凝胶的流变数据图。由图可知，该水凝胶的模量约为950kpa，与天然脊髓组织模量相接近，有利于神经干细胞的向神经元的分化。
15.图4：为实施例1所制备的水凝胶负载神经干细胞后，结合电刺激可有效促进神经干细胞向神经元分化。
16.图5：为实施例1所制备的水凝胶负载神经干细胞的可注射导电水凝胶注入大鼠脊髓全切模型后结合电刺激治疗，大鼠步态状况。由图可知结合电刺激后通过步态观察到，该组大鼠的运动功能明显恢复。
具体实施方式
17.实施例1
18.(1)0.5g壳聚糖溶解于去离子水中,通过hcl调节ph至5.5，然后使用超声波震荡分散20min形成1.0％wt的壳聚糖溶液。然后将300mg的hca溶解于5.0ml去离子水中，充分搅拌溶解后加入壳聚糖液中。将240mg edc和150mg nhs溶解于50.0ml乙醇和去离子水1:1的混合溶液中保持ph在6～7区间。随后将壳聚糖/hca混合溶液缓慢滴加入其中，反应在20℃的环境中密封剧烈搅拌10h，保持ph为5.5，然后放在振荡器快速震荡10min。溶液在酸化去离子水中透析2天，然后放在去离子水中再渗析半天最后放入冻干机中冷冻干燥得到黄色固体。
19.(2)把2.0g ha溶解于200ml的去离子水中，在20℃的环境中密封快速搅拌24h至完全溶解。1.0g naio4加入ha溶液中避光搅拌5h，加入1.5ml乙二醇搅拌1.5h，使用超声波震荡反应15min。溶液放入渗析袋中用去离子水渗析3天保持溶液ph在7～8区间。反应物放入冻干机中冷冻干燥最终获得白色固体。
20.(3)取1g的lif添加到20ml盐酸中，搅拌5min。将1g ti3alc2慢慢添加上述溶液并在35℃搅拌26h，得到黑色悬浊液。然后用去离子水洗涤酸性悬浊液，在4500转离心5min直到上层清液的ph值达到6.0。然后收集沉积物，在沉积物中加入去离子水将ar通入分散液中10min使用超声波振荡分散1h，加入并保证温度在30℃以内。最后，以5000转速离心10min，于-50℃冷冻干燥3天，得到mxene纳米片蓬松的黑色粉末a。
21.(4)将chic固体用去离子水配成5％wt溶液，加入1.0％wt的adh配成淡黄色溶液a；然后将ha-ald固体加入去离子水配成5％wt溶液后加入0.1％wtmxene纳米片粉末经过10min超声波震荡配成得到黑色溶液b。将上述溶液a和溶液b按体积比1：1混合，通过振荡器快速混合反应10秒，最终得到模拟脊髓组织的可注射导电水凝胶。
22.实施例2
23.(1)0.8g壳聚糖溶解于去离子水中,通过hcl调节ph至5，然后使用超声波震荡分散25min形成1.0％wt的壳聚糖溶液。然后将420mg的hca溶解于6.0ml去离子水中，充分搅拌溶解后加入壳聚糖液中。将280mg edc和190mg nhs溶解于50.0ml乙醇和去离子水1:2的混合溶液中保持ph在6～7区间。随后将壳聚糖/hca混合溶液缓慢滴加入其中，反应在25℃的环境中密封剧烈搅拌12h，保持ph为5，然后放在振荡器快速震荡15min。溶液在酸化去离子水中透析3天，然后放在去离子水中再渗析半天最后放入冻干机中冷冻干燥得到黄色固体。
24.(2)把3.0g ha溶解于300ml的去离子水中，在25℃的环境中密封快速搅拌搅拌24h至完全溶解。1.2g naio4加入ha溶液中避光搅拌4h，加入2ml乙二醇搅拌2h，使用超声波震荡反应20min。溶液放入渗析袋中用去离子水渗析3天保持溶液ph在7～8区间。反应物放入冻干机中冷冻干燥最终获得白色固体。
25.(3)取1g的lif添加到20ml盐酸中，搅拌5min。将1g ti3alc2慢慢添加上述溶液并在40℃搅拌24h，得到黑色悬浊液。然后用去离子水洗涤酸性悬浊液，在3500转离心8min直到上层清液的ph值达到6.0。然后收集沉积物，在沉积物中加入去离子水将ar通入分散液中20min使用超声波振荡分散1.5h并保证温度在30℃以内。最后，以4500转速离心10min，于-50℃冷冻干燥3天，得到mxene纳米片蓬松的黑色粉末a。
26.(4)将chic固体用去离子水配成6％wt溶液后，加入1.5％wt的己二酸二酰肼adh配
成淡黄色溶液a。然后将ha-ald固体加入适量去离子水配成6％wt溶液后加入0.12％wtmxene纳米片粉末经过15min超声波震荡配成得到黑色溶液b。将溶液a和溶液b按体积比2：3混合，通过振荡器快速混合反应60秒，最终得到模拟脊髓组织的可注射导电水凝胶。