用于关节健康的组合物和方法与流程

用于关节健康的组合物和方法
1.本技术为申请号为201911405863.6，申请日为2014年6月16日，发明名称为“用于关节健康的组合物和方法”的中国专利申请的分案申请。申请号为201911405863.6的中国专利申请是申请号为201480044176.5的中国专利申请的分案申请。


背景技术：

2.身体中最丰富的杂多糖是糖胺聚糖(gag)。它们由通过连接体寡糖区域附接至蛋白聚糖的核心蛋白的氨基己糖和己糖醛酸的重复二糖单元构成。大量的gag连接至软骨聚集蛋白聚糖的核心蛋白。gag是高度带负电的分子，具有为溶液提供粘度的延伸构象(extended confor mation)。这些带负电的碳水化合物引起软骨的高肿胀能力。gag主要位于细胞的表面上或细胞外基质(ecm)中。gag是细胞表面蛋白聚糖以及软骨的细胞外基质大和小蛋白聚糖二者的重要分子成分。伴随着高粘度的gag成为低压缩性，其使得这些分子对于关节中的润滑流体是理想的。同时，它们的刚性为细胞提供了结构完整性并且提供细胞之间的通道。
3.糖胺聚糖是关节软骨、关节流体和其他软结缔组织的主要组分。关节软骨的糖胺聚糖(gag)已经被鉴定为软骨素6-硫酸盐、软骨素4-硫酸盐、硫酸皮肤素、肝素、硫酸肝素和角蛋白硫酸盐。在关节的发炎期间，大量的gag从降解的软骨基质中释放。gag的水平或分子性质的改变与一些结缔组织疾病相关。例如，患关节炎和硬皮病的患者在血液和滑液中具有升高浓度的gag，并且关节炎患者中涉及的关节的破坏与滑液中的高gag水平正向相关。来自关节炎关节的软骨的组织化学和生物化学研究已经显示gag含量的显著下降并且该下降大体上与该疾病的严重程度成比例。
4.桑树(morus alba l)(桑科)，桑椹或白浆果植物，原产于中国北部，并且已经在其他地方，从印度到中东到欧洲南部并且最近到北美地区，被栽培和驯化。根皮用于传统的医药，称为桑白皮(sang bai pi)或桑白皮(cortex mori)(中华人民共和国药典，2005(pharmacopoeia of the people’s republic of china,2005))。该药草在韩国也称为pong-na-moo，并且在日本也称为sohakuhi。在当代药理学研究中，桑树根皮已经报道为具有抗菌、抗病毒、抗氧化、降血糖、降血脂、神经保护、抗溃疡、镇痛和抗炎活性。来自桑树根皮的各种生物活性化合物具有体内和体外抗炎活性。
5.金合欢(acacia)是豆科树和灌木的属。金合欢属包括属于豆科和害羞草亚科的大于1000种。金合欢在世界上分布，在中南美的热带和亚热带地区、非洲、部分亚洲，以及澳大利亚，其具有最大数量的地方性品种。金合欢主要出现在干燥和干旱区域，其中树林通常天然为敞开的多刺灌木(open thorny shrubs)。金合欢在经济上是非常重要的，其提供单宁酸、树胶、木材、燃料和草料的来源。主要从树皮分离的单宁酸广泛用于使皮革和皮肤鞣革。一些金合欢树皮也用于调味当地的烈酒。一些本土品种，比如藤金合欢(a.sinuata)也产生皂苷，其用在去污剂、发泡剂和乳化剂中。一些金合欢品种的花是有香味的并且用于制备香水。许多金合欢的心材用于制造农业器具并且也提供木柴的来源。金合欢树胶广泛用于医药和糖果中并且在纺织品工业中作为上胶和整理材料。
6.黑儿茶(茜草科(rubiaceae))是具有圆枝的攀缘灌木，认为当与蒌叶(piper bettle leves)一起咀嚼时，强化牙齿。植物的所有部分具有收敛性质。黑儿茶植物包含游离儿茶精以及聚合儿茶精
–
单宁酸
–
其在嫩叶中相比老叶更丰富。黑儿茶作为天然调味剂列举在eafus的食品添加剂数据库(在美国，添加至食品的所有)、kfda的韩国食品添加剂法典，和mhlw的日本食品添加剂法典中。黑儿茶也列举在韩国药学规范(kp)、日本药学规范(jp)和中国药学规范(cp)中。在韩国，许多非处方(otc)药物包含黑儿茶提取物，尤其用于消化不良、口臭、呕吐和厌食。在日本，黑儿茶用于腹泻、呕吐和胃炎。在美国，黑儿茶用作膳食补充品以支持肝功能和脂肪代谢。
7.常称为姜黄的curcuma longa l是姜科zingiberaceae的多年生植物。姜黄的名字可能来自拉丁语terra merita(merited earth)或turmeryte，其涉及番红花。其起源于南亚热带并且广泛栽培在印度和东南亚。姜黄由粉碎的根茎制备并且在印度使用了数千年。除了其烹调用途，现代研究已经揭示了姜黄具有抗菌、抗氧化、化学保护、化疗、抗增殖、抗寄生虫、抗疟疾、镇痛和抗炎性质。


技术实现要素：

8.简言之，本公开涉及用于关节健康管理的化合物和组合物，包括公开化合物的立体异构体、药学上或营养上可接受的盐、互变异构体、糖苷和前药，并且涉及改善关节健康的相关方法。
9.在某些实施方式中，本公开提供了组合物，其包括桑属提取物(morus extract)和金合欢提取物(acacia extract)的混合物，所述桑属提取物任选地富含一种或多种异戊烯化的类黄酮(flavonoid)(例如，查尔酮和异戊烯基苯基部分的第尔斯-阿尔德加合物)或一种或多种芪或其组合，所述金合欢提取物任选地富含黄烷。在进一步的实施方式中，本公开提供了组合物，其包括桑属提取物和黑儿茶提取物的混合物，所述桑属提取物任选地富含异戊烯化的类黄酮(例如，查尔酮和异戊烯基苯基部分的第尔斯-阿尔德加合物)或一种或多种芪或其组合；所述黑儿茶提取物任选地富含黄烷。在进一步的实施方式中，本公开提供了包括桑属提取物和姜黄属提取物的混合物的组合物，所述桑属提取物富含一种或多种异戊烯化的类黄酮(例如，查尔酮和异戊烯基苯基部分的第尔斯-阿尔德加合物)或一种或多种芪或其组合。在其他实施方式中，本公开提供了包括桑属提取物和薄荷提取物的混合物的组合物，所述桑属提取物富含一种或多种异戊烯化的类黄酮(例如，查尔酮和异戊烯基苯基部分的第尔斯-阿尔德加合物)或一种或多种芪。在其他实施方式中，任何组合物此外任选地包含一种或多种葡糖胺化合物，比如n-乙酰基葡糖胺。
10.例如，姜黄属和桑树根皮提取物1:1比例的混合物相比单独的姜黄属或桑树根皮提取物表现出增强的抗炎和抗疼痛效力的有益协同作用。
11.在另一方面中，本公开提供了管理关节健康的方法。在某些实施方式中，本公开的组合物可用于下述方法：治疗、预防或管理关节软骨、使软骨退变最小化、通过保护软骨完整性促进健康的关节、减少影响关节健康的酶的作用、改善关节移动和/或功能、缓解关节疼痛、缓解关节僵硬、改善关节运动的范围和/或灵活性、促进移动性和/或其任何组合。
12.当参考下述详细说明书时，本发明的这些和其他方面将显而易见。
附图说明
13.图1显示姜黄88个htp馏分对bkb1受体结合的抑制。
14.发明详述
15.在某些方面中，本公开提供了用于改善关节健康、与黄烷或类黄素(curcuminoid)混合的异戊烯化的类黄酮和白藜芦醇化合物。在某些实施方式中，异戊烯化的类黄酮和白藜芦醇化合物提取自桑树，比如提取自桑树根。在仍另一实施方式中，结合黄烷的桑属提取物任选地进一步结合其他关节健康处理剂，比如非甾类抗炎剂/止痛剂、cox/lox抑制试剂比如乙酰氨基酚(acetaminophen)、布洛芬(ibuprofen)、塞来考昔(celecoxib)、乳香属提取物(boswellia extract)、葡糖胺化合物比如葡糖胺硫酸盐、葡糖胺盐酸盐、n-乙酰基葡糖胺、硫酸软骨素和甲基磺酰甲烷、透明质酸、ω-3脂肪酸(比如二十碳五烯酸，epa和二十二碳六烯酸，dha)，水解的胶原蛋白(例如，来自牛i型胶原蛋白、鸡胸骨ii型胶原蛋白)、胶原蛋白衍生的肽或胶原蛋白氨基酸的混合物、叶黄素类胡萝卜素(例如，虾青素，其分布在海洋细菌、藻类、甲壳类、鱼中)、复合维生素和矿物质比如维生素d和果糖硼酸钙、神经性疼痛缓解剂、促进关节健康的草药和/或植物提取物或促进关节健康的膳食补充品。
16.其他实施方式涉及使用本公开的组合物的方法，比如保持关节软骨、使软骨退变最小化、通过保护软骨完整性促进健康的关节、减少影响关节健康的酶的作用、改善关节移动和/或功能、缓解关节疼痛、缓解关节不适、缓解关节疼痛和不适、缓解关节僵硬、改善关节运动的范围和/或灵活性、促进移动性等。
17.在下述说明中，阐释了某些具体细节以便提供本公开的各种实施方式的充分理解。但是，本领域技术人员将理解，本发明可在没有这些细节的情况下实施。
18.在本说明书中，任何浓度范围、百分数范围、比例范围或整数范围理解为包括所叙述范围内的任何整数的值，并且在适当的情况下，包括其分数(比如整数的十分之一和百分之一)，除非另外指出。而且，本文叙述的涉及任何物理性质比如聚合物亚单位、尺寸或厚度的任何数量范围理解为包括所叙述范围内的任何整数，除非另外指出。如本文所使用，术语“约”和“基本上由
……
组成”意思是
±
20％的叙述的范围、值或结构，除非另外指出。应理解，如本文使用的术语“一个(a/an)”和“一种(a/an)”指“一个(种)或多(种)”列举的组分。可选(例如，“或”)的使用应理解为意思是可选的一个、两个或其任何组合。除非上下文以其他方式需要，贯穿本说明书和权利要求，词“包括(comprise)”和其变型，比如，“包括(comprises)”和“包括(comprising)”以及同义词术语，比如“包含(include)和“具有(have)”和其变型解释为开放式包含意思；即，解释为“包括但不限于”。
19.遍及本说明书，提及“一种实施方式”或“实施方式”意思是结合该实施方式描述的具体特征、结构或特点包括在本发明的至少一种实施方式中。因此，在遍及本说明书的各个地方，短语“在一种实施方式中”或“在实施方式中”的出现没必要都指相同的实施方式。此外，具体的特征、结构或特点在一种或多种实施方式中可以任何适当的方式结合。
[0020]“氨基”指-nh2自由基。
[0021]“氰基”指-cn自由基。
[0022]“羟基(hydroxy)”或“羟基(hydroxyl)”指-oh自由基。
[0023]“亚氨基”指＝nh取代基。
[0024]“硝基”指-no2自由基。
[0025]“氧”指＝o取代基。
[0026]“硫代(thioxo)”指＝s取代基。
[0027]“烷基”指仅仅由碳原子和氢原子组成的直链或支链烃链自由基，其是饱和的或不饱和的(即，包含一个或多个双键或三键)，具有一至十二个碳原子(c
1-c
12
烷基)，或一至八个碳原子(c
1-c8烷基)或一至六个碳原子(c
1-c6烷基)，并且其与分子的剩余部分通过单键连接，例如，甲基、乙基、正丙基、1-甲基乙基(异丙基)、正丁基、正戊基、1,1-二甲基乙基(叔丁基)、3-甲基己基、2-甲基己基、乙烯基、丙-1-烯基、丁-1-烯基、戊-1-烯基、戊-1,4-二烯基、乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。除非在本说明书中明确另外指出，烷基基团可以是任选地取代的。
[0028]“亚烷基”或“亚烷基链”指将分子的剩余部分连接至自由基基团的直链或支链二价烃链，其仅仅由碳和氢组成，是饱和的或不饱和(即，包含一个或多个双键或三键)，并且具有一至十二个碳原子，例如，亚甲基、亚乙基、亚丙基、正亚丁基、亚乙烯基、亚丙烯基、正亚丁烯基、亚丙炔基(propynylene)、正亚丁炔基(n-butynylene)等。亚烷基链通过单键或双键连接至分子的剩余部分并且通过单键或双键连接至自由基基团。亚烷基链与分子的剩余部分和自由基基团的连接点可通过链中的一个碳或任何两个碳。除非在本说明书中明确另外指出，亚烷基链可以是任选地取代的。
[0029]“烷氧基”指式-ora的自由基，其中ra是如上定义的包含一至十二个碳原子的烷基自由基。除非在本说明书中明确另外指出，烷氧基基团可以是任选地取代的。
[0030]“烷基氨基”指式-nhra或-nrara的自由基，其中每个ra独立地是如上定义的包含一至十二个碳原子的烷基自由基。除非在本说明书中明确另外指出，烷基氨基基团可以是任选地取代的。
[0031]“硫代烷基”指式-sra的自由基，其中ra是如上定义的包含一至十二个碳原子的烷基自由基。除非在本说明书中明确另外指出，硫代烷基基团可以是任选地取代的。
[0032]“芳基”指包括氢、6至18个碳原子和至少一个芳环的烃环系统自由基。为了本公开的目的，芳基自由基可以是单环、双环、三环或四环环系统，其可包括稠合的或桥连的环系统。芳基自由基包括衍生自下述的芳基自由基：醋蒽烯、苊烯、醋菲烯、蒽、甘菊环烃、苯、荧蒽、芴、不对称引达省、对称引达省、二氢化茚、茚、萘、非那烯(phenalene)、菲、七曜烯(pleiadene)、芘和苯并菲。除非在本说明书中明确另外指出，术语“芳基”或前缀“芳
‑”
(比如“芳烷基”中)意思是包括任选地被取代的芳基自由基。
[0033]“芳烷基”指式-r
b-rc的自由基，其中rb是如上定义的亚烷基链和rc是如上定义的一个或多个芳基自由基，例如，苄基、二苯基甲基等。除非在本说明书中明确另外指出，芳烷基基团可以是任选地取代的。
[0034]“环烷基”或“碳环”指仅仅由碳原子和氢原子组成的稳定的非芳族单环或多环烃自由基，其可包括稠合的或桥连的环系统，具有三至十五个碳原子，或具有三至十个碳原子，和其是饱和的或不饱和的并且通过单键连接至分子的剩余部分。单环自由基包括，例如，环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。多环自由基包括例如，金刚烷基、降冰片基、十氢萘基、7,7-二甲基-二环[2.2.1]庚基等。除非在本说明中明确另外指出，环烷基基团可以是任选地取代的。
[0035]“环烷基烷基”指式-rbrd的自由基，其中rb是如上定义的亚烷基链并且rd是如上定
义的环烷基自由基。除非在本说明书中明确另外指出，环烷基烷基基团可以是任选地取代的。
[0036]“稠合的”指本文所述的稠合至本公开的化合物中存在的环结构的任何环结构。当稠合环是杂环基环或异芳基环时，成为稠合杂环基环或稠合异芳基环的一部分的存在的环结构上的任何碳原子可被氮原子替换。
[0037]“卤基”或“卤素”指溴基、氯基、氟基或碘基。
[0038]“卤代烷基”指被如上定义的一个或多个卤基自由基取代的如上定义的烷基自由基，例如，三氟甲基、二氟甲基、三氯甲基、2,2,2-三氟乙基、1,2-二氟乙基、3-溴-2-氟丙基、1,2-二溴乙基等。除非在本说明书中明确另外指出，卤基烷基基团可以是任选地取代的。
[0039]“杂环基”或“杂环的环”指稳定的3元至18元非芳环自由基，其由两至十二个碳原子和选自氮、氧和硫的一至六个杂原子组成。除非在本说明书中明确另外指出，杂环基自由基可以是单环、双环、三环或四环环系统，其可包括稠合的或桥连的环系统；并且杂环基自由基中的氮、碳或硫原子可以被任选地氧化；氮原子可被任选地季铵化；和杂环基自由基可以是部分或完全饱和的。这样的杂环基自由基的例子包括二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑啉基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧哌嗪基、2-氧哌啶基、2-氧吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基、噻吗啉基、1-氧-硫代吗啉基和1,1-二氧-硫代吗啉基。除非在本说明书中明确另外指出，杂环基基团可以是任选地取代的。
[0040]“n-杂环基”指如上定义的包含至少一个氮和其中杂环基自由基至分子的剩余部分的连接点是通过杂环基自由基中的氮原子的杂环基自由基。除非在本说明书中明确另外指出，n-杂环基基团可以是任选地取代的。
[0041]“杂环基烷基”指式-rbre的自由基，其中rb是如上定义的亚烷基链并且re是如上定义的杂环基自由基，和如果杂环基是含氮的杂环基，杂环基可在氮原子处连接至烷基自由基。除非在本说明书中明确另外指出，杂环基烷基基团可以是任选地取代的。
[0042]“异芳基”指5元至14元环系统自由基，其包括氢原子、一至十三个碳原子、选自氮、氧和硫的一至六个杂原子，和至少一个芳环。为了本公开的目的，异芳基自由基可以是单环、双环、三环或四环环系统，其可包括稠合的或桥连的环系统；并且异芳基自由基中的氮、碳或硫原子可任选地被氧化；氮原子可任选地被季铵化。例子包括氮杂卓、吖啶基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、苯并吲哚基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并呋喃基、苯并噁唑基、苯并噻唑基、苯并噻二唑基、苯并[b][1,4]二氧杂环庚烯基、1,4-苯并二噁烷基、苯并萘并呋喃基、苯并噁唑基、苯并二氧杂环戊烯基、苯并二氧杂环己二烯基、苯并吡喃基、苯并吡喃酮基、苯并呋喃基、苯并呋喃酮基、苯并噻吩基(苯并硫代苯基)、苯并三唑基、苯并[4,6]咪唑并[1,2-a]吡啶基、咔唑基、噌嗪基、二苯并呋喃基、二苯并硫代苯基、呋喃基、呋喃酮基、异噻唑基、咪唑基、吲唑基、吲哚基、吲唑基、异吲哚基、二氢吲哚基、异吲哚啉基、异喹啉基、中氮茚基、异噁唑基、萘啶基、噁二唑基、2-氧氮杂卓、噁唑基、环氧乙烷基、1-环氧吡啶基、1-环氧嘧啶基、1-环氧吡嗪基、1-环氧哒嗪基、1-苯基-1h-吡咯基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡咯基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、喹啉基、奎宁环基、异喹啉基、四氢喹啉基、噻唑基、噻唑基、三唑基、四唑基、三嗪基和硫代
苯基(即噻吩基)。除非在本说明书中明确另外指出，异芳基基团可以是任选地取代的。
[0043]“n-异芳基”指如上定义的包含至少一个氮和其中异芳基自由基与分子的剩余部分的连接点是通过异芳基自由基中的氮原子的异芳基自由基。除非在本说明书中明确另外指出，n-异芳基基团可以是任选地取代的。
[0044]“杂芳基烷基”指式-rbrf的自由基，其中rb是如上定义的亚烷基链并且rf是如上定义的异芳基自由基。除非在本说明书中明确另外指出，异芳基烷基基团可以是任选地取代的。
[0045]
本文使用的术语“取代的”意思是任何上述基团(即，烷基、亚烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、n-杂环基、杂环基烷基、异芳基、n-异芳基或杂芳基烷基)，其中至少一个氢原子被与非氢原子的键替换，比如卤原子比如f、cl、br和i；基团比如羟基基团、烷氧基基团和酯基团中的氧原子；基团比如硫羟基团、硫代烷基基团、砜基团、磺酰基基团和亚砜基团中的硫原子；基团比如胺、酰胺、烷基胺、二烷基胺、芳胺、烷基芳胺、二芳胺、n-氧化物、酰亚胺和烯胺中的氮原子；基团比如三烷基甲硅烷基、二烷基芳基甲硅烷基、烷基二芳基甲硅烷基和三芳基甲硅烷基中的硅原子；和各种其他基团中的其他杂原子。“取代的”也意思是其中一个或多个氢原子被与杂原子，比如氧基、羰基、羧基和酯基团中的氧；和比如亚胺、肟、腙和腈基团中的氮的高阶键(例如，双键或三键)取代的任何上述基团。例如，“取代的”包括其中一个或多个氢原子被下述取代的任何上述基团：-nrgrh、-nrgc(＝o)rh、-nrgc(＝o)nrgrh、-nrgc(＝o)orh、-nrgso2rh、-oc(＝o)nrgrh、-org、-srg、-sorg、-so2rg、-oso2rg、-so2org、＝nso2rg和-so2nrgrh。“取代的”也意思是其中一个或多个氢原子被下述取代的任何上述基团：-c(＝o)rg、-c(＝o)org、-c(＝o)nrgrh、-ch2so2rg、-ch2so2nr
g rh。在前述内容中，rg和rh是相同的或不同的并且独立地是氢、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、n-杂环基、杂环基烷基、异芳基、n-异芳基或杂芳基烷基。“取代的”进一步意思是其中一个或多个氢原子被与下述基团的键取代的任何上述基团：氨基、氰基、羟基、亚氨基、硝基、氧基、硫代、卤基、烷基、烷氧基、烷基氨基、硫代烷基、芳基、芳烷基、环烷基、环烷基烷基、卤代烷基、杂环基、n-杂环基、杂环基烷基、异芳基、n-异芳基或异芳基烷基基团。另外，每个前述取代基也可任选地用一个或多个上述取代基取代。
[0046]“糖苷”指其中糖基团通过其异头碳与另一基团经糖苷键连接的分子。示例性糖包括葡萄糖、鼠李糖、甘露糖(manose)、半乳糖、阿拉伯糖、葡糖苷酸等。糖苷可通过o-(o-糖苷)、n-(糖胺)、s-(硫代糖苷)或c-(c-糖苷)糖苷键连接。本公开的化合物可在任何适当的连接点形成糖苷。
[0047]“异戊烯基(prenyl)基团”是包括下述结构的五碳骨架的部分：在一些实施方式中，异戊烯基基团包括一个或多个碳-碳双键和/或被一个或多个取代基取代。“异戊烯基”指自由基。异戊二烯基(isoprenyl)指自由基(顺式或反式)。异戊烯基基团是取代的或未取代的，比如
[0048]“异戊烯基苯基”指连接至如上定义的异戊烯基部分的苯基部分。异戊烯基苯基包
括取代的苯基比如类黄酮和其他取代的苯基和杂芳基，条件是分子中存在至少一个异戊烯基基团。在取代的苯基和异芳基的情况下，异戊烯基部分不需要直接连接至苯基环，但是可在分子的任何点连接。
[0049]“查尔酮”指包括下述核心结构的化合物：
[0050][0051]
查尔酮可在任何上述碳原子处取代。
[0052]“前药”意思是指示可在生理学条件下或通过溶剂分解转化成本公开的生物活性化合物的化合物。因此，术语“前药”指药学上和营养上可接受的本公开化合物的代谢前体。当施用至需要其的受试者时，前药可以是无活性的，但是在体内转化成本公开的活性化合物。前药通常在体内快速转化，产生本公开的母体化合物，例如，通过在血液或肠道中水解或在肝中代谢。前药化合物通常提供在哺乳动物生物中溶解度、组织相容性或延迟释放的优势(见bundgard，h.，design of prodrugs(1985)，pp.7-9，21-24(elsevier，amsterdam)).前药的讨论提供在higuchi，t.，等人，a.c.s.symposium series，vol.14，以及在drug design中的bioreversible carriers，ed.edward b.roche，american pharmaceutical and nutraceutical association and pergamon press，1987。
[0053]
术语“前药”也意思是包括任何共价键合的载体，其当这样的前药施用至哺乳动物受试者时，在体内释放本公开的活性化合物。本公开的化合物的前药可通过改性本公开的化合物中存在的官能团制备，使得改性在常规操作或体内切割成本公开的母体化合物。前药包括本公开的化合物，其中羟基、氨基或巯基基团结合任何基团，其当本公开的化合物的前药施用至哺乳动物受试者时，分别切割以形成游离羟基、游离氨基或游离巯基基团。前药的例子包括本公开的化合物中胺官能团的醇或酰胺衍生物的乙酸酯、甲酸酯和苯甲酸酯衍生物等。
[0054]
本公开也意思是包括通过具有一个或多个被具有不同的原子量或质量数的原子取代的原子被同位素标记的结构(i)-(vi)中的任何一个的所有药学上或营养上可接受的化合物。可并入本公开化合物的同位素的例子包括氢、碳、氮、氧、磷、氟、氯和碘的同位素，比如分别2h、3h、
11
c、
13
c、
14
c、
13
n、
15
n、
15
o、
17
o、
18
o、
31
p、
32
p、
35
s、
18
f、
36
cl、
123
i和
125
i。这些放射性标记的化合物可用于帮助测定或测量化合物的效力，例如，通过表征作用位点或模式，或对药理学重要的作用位点的结合亲和力。结构(i)-(vi)中的任何一种的某些同位素标记的化合物，例如，并入放射性同位素的那些用于药物或底物组织分布研究。就它们容易并入和容易检测方式而言，放射性同位素氚，即3h，和碳-14，即，
14
c尤其用于该目的。
[0055]
用重质同位素比如氘，即，2h替换可提供源自更大代谢稳定性的某些治疗性优势，例如，增加的体内半衰期或降低的剂量要求，和因此在某些情况下可以是优选的。
[0056]
用正电子发射同位素，比如
11
c、
18
f、
15
o和
13
n替换可用于正电子发射断层扫描术(pet)研究，用于检查底物受体占据。同位素标记的结构(i)-(vi)中任何一种的化合物可大体上通过本领域技术人员已知的常规的技术制备或通过本文阐释的在制备和实施例中使用适当的同位素标记的试剂代替先前采用的非标记的试剂描述的那些类似的方法制备。
[0057]
本公开也意思是包括公开化合物的体内代谢产物。这样的产物可源自例如主要由
于酶过程对施用的化合物氧化、还原、水解、酰胺化、酯化等。因此，本公开包括通过下述过程产生的化合物，包括施用本公开的化合物至哺乳动物足够产生其代谢产物的时间段。这样的产物通常通过下述鉴定：以可检测的剂量施用放射性标记的本公开的化合物至动物，比如大鼠、小鼠、荷兰猪、狗、猫、猪、绵羊、马、猴或人，允许足够发生代谢的时间，并且从尿、血液或其他生物样品分离转化产物。
[0058]“稳定的化合物”和“稳定的结构”意思是指示足够刚健，以经受从反应混合物分离至有用程度的纯度，并且制备成有效治疗剂。
[0059]“哺乳动物”包括人和驯养动物，比如实验室动物或家庭宠物(例如，大鼠、小鼠、荷兰猪、猫、狗、猪、牛、绵羊、山羊、马、兔子、灵长类)，和非驯养动物，比如野生动物等。
[0060]“任选的”或“任选地”意思是随后描述的要素、组分、事件或条件可能发生或不发生，并且包括要素、组分、事件或条件发生的情况和其中它们不发生的情况。例如，“任选地取代的芳基”意思是芳基自由基可能是取代的或非取代的
–
换句话说，描述包括取代的芳基自由基和没有取代的芳基自由基。
[0061]“药学上或营养上可接受的载体、稀释剂或赋形剂”包括已经由美国食品和药品管理局批准为对于用于人或驯养动物可接受的任何佐剂、载体、赋形剂、助滑剂、甜味剂、稀释剂、防腐剂、染料/着色剂、调味剂增强子、表面活性剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂或乳化剂。
[0062]“药学上或营养上可接受的盐”包括酸加成盐和碱加成盐。
[0063]“药学上或营养上可接受的酸加成盐”指保持游离碱的生物效力和性质、不是生物或以其他方式非期望的并且由无机酸和有机酸形成的那些盐，所述无机酸，比如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、磷酸等，所述有机酸比如乙酸、2,2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、抗坏血酸、天冬氨酸、苯磺酸、苯甲酸、4-乙酰氨基苯甲酸、樟脑酸、樟脑-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、碳酸、肉桂酸、柠檬酸、环拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1,2-二磺酸、乙磺酸、2-羟乙基磺酸、甲酸、反式丁烯二酸、粘酸、龙胆酸、葡庚糖酸、葡糖酸、葡糖醛酸、谷氨酸、戊二酸、2-氧-戊二酸、甘油磷酸、乙醇酸、马尿酸、异丁酸、乳酸、乳糖醛酸、月桂酸、马来酸、苹果酸、丙二酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2-磺酸、1-羟基-2-萘甲酸、烟酸、油酸、乳清酸、草酸、棕榈酸、扑酸、丙酸、焦谷氨酸、丙酮酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、癸二酸、硬脂酸、琥珀酸、酒石酸、硫氰酸、对甲苯磺酸、三氟乙酸、十一碳烯酸等。
[0064]“药学上或营养上可接受的碱加成盐”指保持游离酸的生物效力和性质、不是生物或以其他方式非期望的那些盐。这些盐通过将无机碱或有机碱添加至游离酸而制备。源自无机碱的盐包括钠盐、钾盐、锂盐、铵盐、钙盐、镁盐、铁盐、锌盐、铜盐、锰盐、铝盐等。在某些实施方式中，无机盐是铵盐、钠盐、钾盐、钙或镁盐。源自有机碱的盐包括下述的盐：伯胺、仲胺和叔胺、取代的胺包括天然存在的取代胺、环胺和碱性离子交换树脂，比如氨、异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、二乙醇胺、乙醇胺、二甲基乙醇胺、2-二甲基氨基乙醇、2-二乙基氨基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、普鲁卡因、海巴明、胆碱、甜菜碱、苯乙胺、苄星(benzathine)、1,2-乙二胺、葡糖胺、甲基葡糖胺、可可碱、三乙醇胺、氨基丁三醇、嘌呤、哌嗪、哌啶、n-乙基六氢吡啶、聚胺树脂等。尤其有用的有机碱包括异丙胺、二乙胺、乙醇胺、三甲胺、二环己胺、胆碱或咖啡因。
[0065]
通常结晶产生本公开的化合物的溶剂化物。如本文所使用，术语“溶剂化物”指包
括一种或多种具有一种或多种溶剂分子的本公开的化合物的分子的聚集体。溶剂可以是水，在该情况下溶剂化物可以是水合物。可选地，溶剂可以是有机溶剂。因此，本公开的化合物可作为水合物存在，包括一水化物、二水合物、半水合物、倍半水合物、三水合物、四水合物等，以及相应的溶剂化形式。本公开的化合物可以是真溶剂化物，而在其他情况下，本公开的化合物可仅仅保持外来的水或水加一些外来的溶剂的混合物。
[0066]“药学组合物”或“营养组合物”指本公开的化合物和通常在本领域接受用于递送生物活性化合物至哺乳动物，例如，人的媒介的制剂。例如，本公开的药学组合物可配制或用作单独的组合物或作为处方药、非处方(otc)药、植物学药物、草药、顺式疗法试剂或由政府当局检查和批准的任何其他形式的健康护理产品中的组分。本公开的示例性营养组合物可配制或用作单独的组合物或作为食品、新食品、功能食品、饮品、棒、食品调味剂、食品添加剂、医学食品、膳食补充品或草药产品中的营养或生物活性组分。本领域通常可接受的媒介包括所有药学上或营养上可接受的载体、稀释剂或其赋形剂。
[0067]
如本文所使用，“富含”指植物提取物或其他制剂具有一种或多种活性化合物的数量或活性相比于提取或其他制备之前在植物材料或其他来源重量中出现的一种或多种活性化合物的数量或活性增加至少两倍至约1000倍。在某些实施方式中，提取或其他制备之前，植物材料或其他来源的重量可以是干重、湿重或其组合。
[0068]
如本文所使用，“主要活性成分”或“主要活性组分”指植物提取物或其他制剂中出现的，或植物提取物或其他制剂中富含的具有至少一种生物活性的一种或多种活性化合物。在某些实施方式中，富含的提取物的主要活性成分是该提取物中富含的一种或多种活性化合物。一般而言，相比其他提取物组分，一种或多种主要活性组分将直接或间接赋予(即，大于50％)一种或多种可测量的生物活性或作用。在某些实施方式中，主要活性成分可以是按提取物的重量百分数计次要组分(例如，小于提取物中包含的组分的50％、25％、20％、15％、10％、5％或1％)，但是仍提供大部分期望的生物活性。包含主要活性成分的任何本公开的组合物也可包含可对富含组合物的药学或营养活性有贡献或没贡献，但是没达到主要活性组分水平的次要活性成分，并且次要活性组分单独在没有主要活性成分的情况下可能无效。
[0069]“有效量”或“治疗有效量”指本公开的化合物或组合物当施用至哺乳动物，比如人时，足够有效治疗的量，包括下述任何一种或多种的量：(1)治疗或预防哺乳动物中的软骨损失；(2)促进关节健康；(3)抑制哺乳动物中的软骨损失；(4)增加哺乳动物中的关节灵活性；(5)治疗或预防哺乳动物中的关节疼痛；(6)缓和哺乳动物中的关节炎症；和(7)增加关节运动的范围。构成“治疗有效量”的本公开的化合物或组合物的量将取决于化合物、待治疗的病况和其严重程度、施用的方式、治疗持续时间或待治疗受试者的体重和年龄而改变，但是可通过本领域普通技术人员根据其自身知识和本公开来确定。
[0070]
如本文所使用，“补充品”指改善、促进、支持、增加、调节、管理、控制、保持、优化、缓和、减少、抑制或预防与天然状态或生物过程相关的具体条件、结构或功能的产品(即，不用于诊断、治疗、缓解、治愈或预防疾病)。在某些实施方式中，补充品是膳食补充品。例如，就关节健康相关的病况而言，膳食补充品可用于保持关节软骨、使软骨退变最小化、通过保护软骨完整性促进健康的关节、减少影响关节健康的酶的作用、改善关节移动和/或功能、支持关节功能、缓解关节疼痛、缓解关节不适、缓解关节僵硬、改善关节运动的范围、改善关
节灵活性、改善关节运动的范围和灵活性、促进移动性等。在某些实施方式中，膳食补充品是专用膳食、食品或二者的类别，而不是药物。
[0071]“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”或“减轻”指治疗性处理或预防性/预防处理具有或怀疑具有关注的疾病或病况的哺乳动物，比如人中的关注的疾病或病况，并且包括：(i)预防哺乳动物中出现疾病或病况，尤其，当这样的哺乳动物倾向于患有该病况但是还未诊断为患有该病况；(ii)抑制疾病或病况，即，抑制其发展；(iii)缓解疾病或病况，即，使得疾病或病况衰退；或(iv)缓解疾病或病况的症状(例如，缓解疼痛、减轻炎症、减少软骨的损失)，而不解决根本的疾病或病况。如本文所使用，术语“疾病”和“病况”可互换使用或可不同，因为具体的疾病或病况可能没有已知的病因(从而病因学还不清楚)，并且其所以不视为疾病但是仅仅视为非期望的病况或综合症，其中临床医生已经鉴定了或多或少特定症状组。在某些实施方式中，本公开的组合物和方法用于治疗例如骨关节炎、风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)或二者。
[0072]
如本文所使用，“统计显著性”指如使用students t-检验计算的0.050或更小的p值，并且指示不可能偶然出现待测量的具体事件或结果。
[0073]
本文使用的化学命名方案和结构图是i.u.p.a.c.命名系统的改进形式，使用acd/name 9.0版7软件程序或chemdraw ultra 11.0版软件命名程序(cambridgesoft)，其中本公开的化合物在本文命名为中心核心结构，例如，咪唑并吡啶结构的衍生物。对于本文采用的复杂的化学名，取代基基团在其连接的基团之前命名。例如，环丙基乙基包括具有环丙基取代基的乙基骨架。除了如下面描述的，所有键在本文化学结构图中鉴定，除了一些碳原子，其认为键合足够的氢原子以完成化合价。
[0074]
如本文所叙述，在某些实施方式中，本公开提供了包括异戊烯化的类黄酮的组合物。类黄酮包括黄烷、黄酮、黄酮醇、黄烷酮、双氢黄酮醇、异黄酮类化合物、新黄酮类化合物、查尔酮、芳基苯并呋喃等。
[0075]
在某些实施方式中，本公开的类黄酮化合物具有如下结构(iii)：
[0076][0077]
其中r
1-r
12
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代(alkthio)、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基、芳烷基羰基或结构(iii)或(iv)的化合物的键；或r
1-r
12
之一与r
1-r
12
中的另一个彼此连接，以形成环，并且其他r
1-r
12
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基、芳烷基羰基或结构(iii)或(iv)的化合物的键，条件是满足所有的化合价(例如，当任选的双键存在于环c中时，那么没有r
12
和没有r
10
或r
11
中的至少一个)。在某些实施方式中，r
1-r
12
中的至少一个是异戊烯基基
团，比如在进一步的实施方式中，任选的双键存在于环c时，没有r
11
和r
12
，并且r
10
是异戊烯基基团。在仍进一步实施方式中，r
1-r9中的至少一个是异戊烯基基团和r
10-r
12
独立地为h或羟基。在某些具体的实施方式中，异戊烯化的类黄酮包括albanin g、桑酮g(kuwanon g)、桑根素(morusin)或其任何组合。
[0078]
在某些实施方式中，本公开的类黄酮化合物具有如下的结构(iv)：
[0079][0080]
其中r
1-r
12
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基、芳烷基羰基或结构(iii)或(iv)的化合物的键；或r
1-r
12
之一与r
1-r
12
的另一个彼此连接，以形成环，和剩余的r
1-r
12
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基、芳烷基羰基或结构(iii)或(iv)的化合物的键，条件是满足所有的化合价(例如，当任选的双键存在于环c时，那么没有r
12
和没有r
10
或r
11
的至少一个)。在某些实施方式中，r
1-r
12
的至少一个是异戊烯基基团，比如的至少一个是异戊烯基基团，比如在进一步的实施方式中，任选的双键存在于环c时，没有r
11
和r
12
，和r
10
是异戊烯基基团。在仍进一步实施方式中，r
1-r9的至少一个是异戊烯基基团和r
10-r
12
独立地为h或羟基。在某些具体的实施方式中，异戊烯化的类黄酮包括albanin g、桑酮g、桑根素、桑根皮醇(morusinol)、桑根酮(sanggenon)、异黄腐酚(isoxanthoumol)、光甘草定、cathayanon a或其任何组合。
[0081]
在一些实施方式中，本公开的查尔酮化合物具有如下结构(v)：
[0082][0083]
其中r
1-r
10
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基或芳烷基羰基。在某些实施方式中，r
1-r
10
的至少一个是异戊烯基基团，比如在进一步的实施方式中，任选的双键存在于环c时，没有r
11
和r
12
，并且r
10
是异戊烯基基团。在仍进一步实施方式中，r
1-r9的至少一个是异戊烯基基
团和r
10-r
12
独立地为h或羟基。在某些具体的实施方式中，查尔酮化合物包括黄腐酚。
[0084]
在某些实施方式中，本公开的芪化合物是如下式i的(e)-芪(反式异构体)结构或式ii的(z)
–
芪(顺式异构体)结构：
[0085][0086]
其中r
1-r
10
每个独立地是h、羟基、糖苷、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烯基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基或芳烷基羰基。在某些实施方式中，r
1-r
12
的至少一个是异戊烯基基团，比如在进一步的实施方式中，r1、r5、r6和r
10
是h。在仍进一步实施方式中，r2是葡糖苷或r2和r8是糖苷，和r4、r9和r
10
的一个或多个是羟基。在仍进一步实施方式中，r1、r5和r6是h，和r
2-r4和r
7-r
10
的一个或多个独立地为羟基、c
1-3
烷氧基或其任何组合。在某些具体的实施方式中，芪包括氧化白藜芦醇、白藜芦醇、白皮杉醇、银松素、3,4'-二羟基芪、考布他汀a-1、蝶芪、丹叶大黄素，并且芪糖苷包括桑皮苷a、土大黄苷、云杉新苷、白皮杉醇葡萄糖苷葡糖苷(白皮杉醇)或这些芪或芪糖苷的任何组合。
[0087]
应理解，如上面阐释的结构(i)至(vi)的化合物的任何实施方式和本文为结构(i)至(vi)的化合物阐释的任何具体的取代基，可独立地结合结构(i)至(vi)的任何一个化合物的其他实施方式或取代基，以形成上面未明确阐释的本公开的实施方式。另外，在具体实施方式或权利要求中为任何具体的r基团列举取代基的列表的情况下，应理解，每个单个取代基可从具体的实施方式或权利要求删除并且取代基的其他列表视为在本公开的范围内。
[0088]
为了施用的目的，本公开的化合物和组合物可作为粗化学品施用或可配制为药学或营养组合物。在某些实施方式中，本公开的药学或营养组合物包括任何一种或多种具有结构(i)至(vi)的化合物和药学上或营养上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。结构(i)至(vi)的化合物以有效治疗关注的具体疾病或病况的量单独或组合存在于组合物中。用如结构(i)至(vi)任何一个阐释的化合物促进、管理或改善关节健康或治疗疾病可由本领域技术人员决定，例如，如在本文实施例中描述。
[0089]
在某些实施方式中，本公开的化合物和组合物(例如，药学、营养)可以下述量施用：足够促进关节健康；改善关节健康；维持关节健康；治疗或管理关节健康；支持关节健康；支持正常和舒适运动的范围和/或灵活性；改善运动的范围和/或灵活性；降低分解保护性关节组织的有害酶的作用；改变影响关节健康的酶的作用；改善关节移动和/或关节功能；改善物理移动性；管理和/或维持物理移动性；缓解关节疼痛和/或关节僵硬；改善关节物理功能；促进或增强灵活性和舒适移动；促进健康的关节功能和关节舒适；缓解关节不适；缓解由运动、工作、用力过度或其任何组合造成的关节不适；通过保护软骨完整性促进健康的关节；维持关节软骨；支持关节软骨；治疗、预防或管理软骨退变；使软骨退变最小
化；通过保持关节润滑的滑液促进关节健康或舒适；支持关节稳定性和关节灵活性；恢复关节和促进移动性；促进柔性关节和强壮软骨；维持至关节的稳定血流以支持增强的灵活性和/或强度；运动、工作、用力过度或其任何组合之后促进关节舒适和宽范围的动作；或本文所述的任何其他相关的症状，和通常对患者具有可接受的毒性。
[0090]
在某些其他实施方式中，本公开的化合物和组合物(例如，药学、营养)可以下述量施用：足够治疗骨关节炎、风湿性关节炎、幼年风湿性关节炎、斯提耳病、银屑病关节炎、反应性关节炎、化脓性关节炎、莱特尔氏综合征、贝赫切特综合征、费耳蒂氏综合症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、弥漫性特发性骨肥厚(dish)、骶髂关节功能失常、风湿性多肌痛、腕管综合症、痛风、粘液囊炎、肌腱炎、滑膜炎、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥大、骨炎)综合症、髌骨软骨软化、重复性劳损、扭伤、脱臼或任何其他相关的适应症，并且通常对患者具有可接受的毒性。
[0091]
本公开的化合物或它们药学上或营养上可接受的盐以纯化形式或以适当的药学或营养组合物的施用可经用于类似用途的施用试剂的任何可接受的模式进行。本公开的药学或营养组合物可通过将本公开的化合物与适当的药学上或营养上可接受的载体、稀释剂或赋形剂组合而制备，并且可配制成固体、半固体、液体或气态形式的制剂，比如片剂、胶囊、粉末、颗粒剂、药膏、溶液、栓剂、注射液、吸入剂、凝胶、微球和气溶胶。施用这样的药学或营养组合物的典型路径包括口服、局部、经皮的、吸入、肠胃外、舌下、含服、直肠、阴道或鼻内。如本文使用的术语肠胃外，包括皮下注射、静脉内、肌内、胸骨内注射或注入技术。本公开的药学或营养组合物配制为使得其中包含的活性成分当将组合物施用至患者时，是可生物利用的。在某些实施方式中，本公开的组合物以一种或多种剂量单位施用至受试者或患者，其中，例如，片剂可以是单个剂量单位，和本公开的以气溶胶形式的化合物的容器可容纳多个剂量单位。制备这样的药物形式的实际方法对于本领域技术人员是已知的，或显而易见的；例如，见remington:the science and practice of pharmacy，第20版(philadelphia college of pharmacy and science，2000)。无论如何，待施用的组合物包含治疗有效量的本公开的化合物或其药学上或营养上可接受的盐，用于根据本公开的教导治疗关注的疾病或病况。
[0092]
本公开的药学或营养组合物可为固体或液体形式。在一个方面中，载体(一种或多种)是微粒，从而组合物为例如片剂或粉末形式。载体(一种或多种)可以是液体，组合物是例如口服糖浆剂、可注射的液体或气溶胶，其用于例如吸入施用。
[0093]
当意欲口服施用时，药学或营养组合物为固体或液体形式，其中半固体、半液体、悬液和凝胶形式包括在本文视为固体或液体的形式内。
[0094]
作为用于口服施用的固体组合物，药学或营养组合物可配制成粉末、细粒、压缩片剂、药丸、胶囊、口香糖、膜片、棒或类似形式。这样的固体组合物通常包含一种或多种惰性稀释剂或可食用载体。另外，可存在下述的一种或多种：粘合剂比如羧甲基纤维素、乙基纤维素、环糊精、微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂比如淀粉、乳糖或糊精；崩解剂比如藻酸、藻酸钠、primogel、玉米淀粉等；润滑剂比如硬脂酸镁或助滑剂，比如胶体二氧化硅；甜味剂比如蔗糖或糖精；调味剂比如薄荷、甲基水杨酸酯或橙香精；和着色剂。
[0095]
当药学或营养组合物为胶囊形式，例如，白明胶胶囊(gelatin capsule)时，其除了上述类型材料可包含液体载体比如聚乙二醇或油。
[0096]
药学或营养组合物可为液体形式，例如，酏剂、糖浆剂、凝胶、溶液、乳液或悬液。作为两个例子，液体可用于口服施用或用于通过注射递送。当意欲口服施用时，有用的组合物除了本化合物，包含一种或多种甜味剂、防腐剂、染料/着色剂和调味增强剂。在旨在通过注射施用的组合物中，可包括一种或多种表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、悬浮剂、缓冲液、稳定剂和等渗剂。
[0097]
本公开的液体药学或营养组合物，无论它们是否是溶液、悬液或其他类似形式，可包括一种或多种下述佐剂：无菌稀释剂比如注射用水、盐水溶液，比如生理学盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、不挥发油比如合成的单甘油酯或甘油二酯——其可用作溶剂或悬浮媒介、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他溶剂；抗细菌剂比如苯甲醇或羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂比如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂比如乙二胺四乙酸；缓冲液比如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐和用于调整肌肉弹性的试剂，比如氯化钠或右旋糖。肠胃外制剂可封装在由玻璃或塑料制造的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理学盐水是通常使用的佐剂。可注射的药学或营养组合物是无菌的。
[0098]
预期肠胃外或口服施用的本公开的液体药学或营养组合物应包含使得获得适当剂量的本公开的化合物的量。
[0099]
本公开的药学或营养组合物可预期被局部施用，在该情况下载体可适当地包括溶液、乳液、乳霜、洗剂、软膏或凝胶基础部分(base)。基础部分，可包括例如下述的一种或多种：凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、蜂蜡、矿物质油、稀释剂比如水和醇以及乳化剂和稳定剂。增稠剂可存在于用于局部施用的药学或营养组合物中。如果预期经皮施用，组合物可包括经皮的贴片或离子电渗疗法设备。
[0100]
本公开的药学或营养组合物可预期直肠施用，为例如栓剂的形式，其在直肠中融解并且释放药物。用于直肠施用的组合物可包含含油基础部分作为适当的无刺激赋形剂。这样的基础部分包括羊毛脂、可可脂和聚乙二醇。
[0101]
本公开的药学或营养组合物可包括各种材料，其修饰固体或液体剂量单位的物理形式。例如，组合物可包括围绕活性成分形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常是惰性的，并且可选自，例如，糖、紫胶和其他肠溶衣试剂。可选地，活性成分可封装在白明胶胶囊中。
[0102]
本公开的固体或液体形式的药学或营养组合物可包括结合本公开的化合物和从而有助于递送化合物的试剂。可用于该能力的适当的试剂包括单克隆或多克隆抗体、蛋白质或脂质体。
[0103]
本公开的为固体或液体形式的药学或营养组合物可包括降低颗粒的尺寸以例如改善生物利用度。有或没有赋形剂的组合物中的粉末、细粒、颗粒、微球等的尺寸可以是大的(例如，肉眼可见或至少100μm的尺寸)、微小的(例如，尺寸范围可以是约100μm至约100nm)、纳米(例如，尺寸可不大于100nm)，和其之间任何尺寸或其任何组合，以改善尺寸和体密度。
[0104]
本公开的药学或营养组合物可由可作为气溶胶施用的剂量单位组成。术语气溶胶用于表示范围从胶体性质的那些至由气溶胶包装(press urized packages)组成的系统的各种系统。递送可通过液化或压缩气体或通过分散活性成分的适当的泵送系统。本公开的化合物的气溶胶可以在单相、双相或三相系统中递送，以便递送活性成分(一种或多种)。气
溶胶的递送包括必要的容器、活化剂、阀门、子容器等，其一起可形成试剂盒。本领域技术人员，在不需要过度实验的情况下，可确定最适当的气溶胶(一种或多种)。
[0105]
本公开的药学或营养组合物可通过药学或营养领域熟知的方法制备。例如，旨在通过注射施用的药学或营养组合物可通过将本公开的化合物与无菌蒸馏水结合，以便形成溶液来制备。可添加表面活性剂，以利于形成均质溶液或悬液。表面活性剂是与本公开的化合物非共价相互作用以便利于使化合物在水性递送系统中的溶解或均匀悬浮的化合物。
[0106]
本公开的化合物或它们的药学上或营养上可接受的盐，以治疗有效量施用，这将取决于各种因素，包括所采用特定化合物的活性；化合物的代谢稳定性和作用长度；患者的年龄、体重、一般健康、性别和膳食；施用的模式和时间；排泄的速度；药物组合；具体疾病或病况的严重程度；和进行治疗的受试者。
[0107]
本公开的化合物或其药学上或营养上可接受的衍生物，也可在施用一种或多种其他治疗剂的同时、之前或之后施用。这样的组合疗法包括施用单个药学或营养剂量制剂，其包含本公开的化合物和一种或多种另外活性试剂，以及施用本公开的化合物和以其自身分开的药学或营养剂量制剂的每个活性试剂。例如，本公开的化合物和另一活性试剂可以以单个口服剂量组合物，比如片剂或胶囊一起施用至患者，或每个试剂可以以分开的口服剂量制剂施用。在使用分开的剂量制剂时，本公开的化合物和一种或多种另外活性试剂可基本上同时，即，同步，或在单独的错开的时间，即，顺序施用；组合疗法理解为包括所以这些方案。
[0108]
应理解，在本说明书中，描述式的替代或变型的组合是允许的，只要这样的贡献产生稳定的化合物。
[0109]
本领域技术人员也认识到，在本文所述的方法中，可能需要通过适当的保护基团保护中间体化合物的官能团。这样的官能团包括羟基、氨基、巯基和羧酸。羟基的适当的保护基团包括三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲代甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。用于氨基、脒基和胍基的适当的保护基团包括叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等。用于巯基的适当的保护基团包括-c(o)-r"(其中r"是烷基、芳基或芳基烷基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等。用于羧酸的适当的保护基团包括烷基、芳基或芳基烷基酯。可根据标准技术添加或去除保护基团，其是本领域技术人员已知的和如本文所描述的。保护基团的使用详细描述在green，t.w.和p.g.m.wutz，protective groups in organic synthesis(1999)，3
rd ed.，wiley中。如本领域技术人员将认识到，保护基团也可以是聚合物树脂，比如王氏树脂、rink树脂或2-氯三苯甲基-氯化物树脂。
[0110]
本领域技术人员也认识到，尽管这样保护的本公开的化合物的衍生物可能不具有这样的药理学活性，但是可施用至哺乳动物并且其后在身体中代谢，以形成药理学活性的本公开的化合物。所以，这样的衍生物可描述为“前药”。本公开化合物的所有前药包括在本公开的范围内。
[0111]
此外，以游离碱或酸形式存在的本公开的所有化合物可通过用适当的无机或有机碱或酸经本领域技术人员已知的方法转化成它们的药学上或营养上可接受的盐。本公开的化合物的盐可通过标准技术转化成它们的游离碱或酸的形式。
[0112]
在一些实施方式中，本公开的化合物可从植物来源分离，例如，从在本技术的实施
例和其他地方包括的那些植物。用于分离化合物的适当的植物部分包括叶子、树皮、树干、树干皮、茎、茎皮、细枝、块茎、树根、根皮、树皮表面(比如周皮或复周皮，其可包括木栓层、木栓形成层、栓内层或其任何组合)、嫩芽、根茎、种子、果实、雄蕊群、雌蕊群、花萼、花蕊、花瓣、萼片、心皮(雌蕊)、花朵或其任何组合。在一些相关的实施方式中，化合物从植物来源被分离并且被合成修饰以包含任何叙述的取代基。就此而言，从植物分离的化合物的合成修饰可使用本领域已知并且本领域普通技术人员熟知的许多技术实现。
[0113]
如本文所叙述，查尔酮和异戊烯基苯基部分的第尔斯-阿尔德加合物的化合物——异戊烯化的类黄酮、芪或其任何组合可通过化学合成获得或从植物提取物，比如桑属或milicia提取物获得。例如桑属是桑科中开花树属，其包括在许多国家中野生或栽培的大于30个物种(称为桑椹)。示例性桑属物种包括桑树、鸡桑(morus australis poir)、morus celtidifolia kunth、morus insignis、morus mesozygia stapf、morus microphylla、黑桑(morus nigra l.)、红果桑(morus rubra l.)、广东桑(morus atropurpurea)、山桑(morus bombycis)、葫芦桑(morus cat hayana)、morus indica、morus lhou、morus japonica、八丈桑(morus kagayamae)、长果桑(morus laevigata)、偏叶桑(morus latifolia)、荔波桑(morus liboensis)、奶桑(morus macroura)、马尔康桑(morus mongol ica)、鲁桑(morus multicaulis)、川桑(morus notabilis)、morus rotun diloba、morus serrate、morus heterophyllus、毛桑(morus tillaefolia)、裂叶桑(morus trilobata)、滇桑(morus yunnanensis)和长穗桑(morus wi ttiorum)。
[0114]
在某些实施方式中，桑属提取物来自桑树，或桑属提取物是来自一种、两种、三种、四种或五种不同桑属物种提取物的混合物。提取物的混合物可包括来自表a中列举的两种或更多种桑属物种或其他来源的提取物。例如，包括查尔酮和异戊烯基苯基部分的第尔斯-阿尔德加合物——异戊烯化的类黄酮、芪或其任何组合的组合物可由桑属提取物(例如，桑树)和milicia提取物(例如，大绿柄桑木(milicia excelsa))组成。在某些实施方式中，富含异戊烯化的类黄酮和芪的桑属提取物来自桑树(a)根皮、(b)根皮和叶子、(c)根皮和细枝、(d)根皮、叶子和细枝，或(e)根皮、树根木材、细根、茎皮、树枝、树枝皮、树枝木材和细枝。
[0115]
在一些具体的实施方式中，查尔酮和异戊烯基苯基部分的第尔斯-阿尔德加合物化合物可以是表a中提供的化合物的任何一种或多种。
[0116]
表a示例性第尔斯-阿尔德加合物的化合物的列表
[0117]
[0118]
[0119]
[0120]
[0121]
[0122]
[0123]
[0124]
[0125]
[0126]
[0127]
[0128]
[0129]
[0130]
[0131]
[0132]
[0133]
[0134]
[0135]
[0136]
[0137]
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142]
[0143][0144]
表a和实施例3、5、6和68中的化合物可从指示的植物品种或某些植物部分(例如，从树皮、树干、树干皮、茎皮、树根、根皮、树皮表面(比如周皮或复周皮，其可包括木栓层、木栓形成层、栓内层或其任何组合)、叶子、果实、花朵其他植物部分或其任何组合)提取、分离或纯化，或可如在pct专利申请号pct/us2013/43188中更详细描述的合成或半合成制备，该合成方法通过引用并入本文。在某些实施方式中，表a和实施例3、5、6和68中的一种或多种化合物富含在指示植物品种的提取物中或是主要活性成分，其中富含的提取物获得自完整植物或某些植物部分，比如叶子、树皮、树干、树干皮、茎、茎皮、细枝、块茎、树根、根皮、树皮表面(比如周皮或复周皮，其可包括木栓层、木栓形成层、栓内层或其任何组合)、嫩芽、根茎、种子、果实、雄蕊群、雌蕊群、花萼、花蕊、花瓣、萼片、心皮(雌蕊)、花朵或其任何组合。
[0145]
在进一步的实施方式中，桑属提取物的主要活性成分包括异戊烯化的类黄酮和芪(比如表a和实施例3、5、6和68中提供的那些)，其中提取物富含来自根皮、叶子、细枝或其组合的这些活性成分。在某些实施方式中，桑属提取物富含异戊烯化的类黄酮和芪，其中提取物包括约1％至约25％的异戊烯化的类黄酮和约1％至约25％的芪，或其中提取物包括约2％至约6％的异戊烯化的类黄酮和约2％至约6％的芪，或其中提取物包括至少3％的异戊烯化的类黄酮和至少3％的芪(重量比)。
[0146]
在某些实施方式中，本文提供了富含一种或多种异戊烯化的类黄酮或查尔酮和一种或多种芪的桑属提取物，其中一种或多种异戊烯化的类黄酮是具有式(iii)或(iv)结构的化合物：
[0147][0148]
或其药学上或营养上可接受的盐、互变异构体、糖苷、前药或立体异构体，其中r
1-r
12
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基、芳烷基羰基或结构(iii)或(iv)的化合物的键；或r
1-r
12
之一与r
1-r
12
的另一个彼此连接，以形成环，和其他r
1-r
12
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基、芳烷基羰基或结构(iii)或(iv)的化合物的键，条件是满足所有的化合价；
[0149]
查尔酮(chalcanoid)是结构(v)的化合物：
[0150][0151]
或其药学上或营养上可接受的盐、互变异构体、糖苷、前药或立体异构体，其中r
1-r
10
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基或芳烷基羰基，条件是满足所有的化合价；和
[0152]
一种或多种芪是具有式(i)或(ii)结构的化合物：
[0153][0154]
其中r
1-r
10
每个独立地是h、羟基、糖苷、异戊烯基、类黄酮、查尔酮、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烯基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基或芳烷基羰基。
[0155]
在进一步的实施方式中，一种或多种异戊烯基化的类黄酮是具有式(iii)、(iv)或(v)结构的化合物，其中任选的双键存在于环c时，没有r
11
和r
12
，和r
10
是异戊烯基基团。在仍
进一步实施方式中，一种或多种异戊烯基化的类黄酮是具有式(iii)、(iv)或(v)结构的化合物，其中r
1-r9的至少一个是异戊烯基基团和r
10-r
12
独立地为h或羟基。在某些具体的实施方式中，异戊烯化的类黄酮包括albanin g、桑酮g、桑根素、桑根皮醇、桑根酮、异黄腐酚、光甘草定、cathayanon a或其任何组合。在某些实施方式中，一种或多种芪是具有式(i)或(ii)结构的化合物，其中r
1-r
10
每个独立地是h、羟基、糖苷或c
1-4
烷氧基。在进一步的实施方式中，一种或多种芪是具有式(i)或(ii)结构的化合物，其中r1、r5、r6和r
10
是h。在仍进一步实施方式中，一种或多种芪是具有式(i)或(ii)结构的化合物，其中r2是葡糖苷或r2和r8是糖苷，和一个或多个r4、r9和r
10
是羟基。在仍进一步实施方式中，一种或多种芪是具有式(i)或(ii)结构的化合物，其中r1、r5和r6是h，和r
2-r4和r
7-r
10
的一个或多个独立地为羟基、c
1-3
烷氧基或其任何组合。在某些具体的实施方式中，芪化合物包括氧化白藜芦醇、白藜芦醇、白皮杉醇、银松素、3,4'-二羟芪、考布他汀a-1、蝶芪、丹叶大黄素，并且芪糖苷包括桑皮苷a、土大黄苷、云杉新苷、白皮杉醇葡糖苷或这些芪或芪糖苷的任何组合。
[0156]
在一些实施方式中，类黄酮是结构(iii)的化合物，和在其他实施方式中，类黄酮是结构(iv)的化合物。在一些其他实施方式中，r
1-r
12
的至少一个，比如r
10
是异戊烯基。在其他实施方式中，提供了聚类黄酮并且结构(iii)或(iv)的化合物中的r
1-r
12
的至少一个是与(iii)或(iv)结构的化合物的键(即，化合物包括大于一种结构(iii)和/或(iv)的类黄酮)。
[0157]
在结构(iii)或(iv)的化合物的一些其他实施方式中，r
1-r
12
是h、羟基、异戊烯基基团或环烷基。例如，在一些实施方式中，环烷基是取代的和/或包括一个或多个碳-碳双键(即，是不饱和的)。任选的取代基通常选自芳基，比如苯基和芳基羰基。因此，在一些进一步实施方式中，类黄酮具有下述结构(iiia)或(iva)之一：
[0158][0159]
其中r
4a
在每次出现时独立地是h、羟基或异戊烯基基团。
[0160]
在结构(iiia)或(iva)的化合物的某些实施方式中，r
1-r3和r
5-r
12
每个独立地是选自h、羟基和异戊烯基基团。在某些实施方式中，r
1-r3、r
4a
或r
5-r
12
的至少一个是异戊烯基，例如在一些实施方式中，r
10
是异戊烯基。在结构(iiia)或(iva)的化合物的其他实施方式中，r
1-r3、r
4a
或r
5-r
12
的至少两个是羟基。
[0161]
在一些更具体的实施方式中，类黄酮具有下述结构之一：
[0162][0163]
在其他实施方式中，r
1-r
12
之一与r
1-r
12
的另一个连接，以形成环和其他r
1-r
12
是h、羟基或异戊烯基基团。在这些实施方式的某些中，环是杂环的环，例如环醚环。因此，在某些实施方式中，类黄酮具有下述结构(iiib)或(ivb)之一：
[0164][0165]
在结构(iiib)或(ivb)的化合物的某些实施方式中，r1、r2和r
5-r
12
每个独立地是选自h、羟基和异戊烯基基团。在某些实施方式中，r1、r2或r
5-r
12
的至少一个是异戊烯基，例如在一些实施方式中，r
10
是异戊烯基。在结构(iiib)或(ivb)的化合物的其他实施方式中，r1、r2或r
5-r
12
的至少两个是羟基。在某些实施方式中，类黄酮具有下述结构：
[0166][0167]
在各种其他实施方式中，结构(v)的查尔酮(chalcanoid)的r
1-r
10
每个独立地选自h、羟基、异戊烯基基团和c
1-12
烷氧基。
[0168]
本公开的生物活性黄烷可通过合成方法获得或从一种或多种植物提取，比如金合欢、钩藤属(uncaria)或二者。在某些实施方式中，金合欢植物品种选自a.angustifolia、a.ataxacantha、a.berlandieri、a.bonariensis、a.brevispica、a.catechu、a.chundra、a.concinna、a.floribunda、a.greggii、a.interior、a.macilenta、a.mellifera、a.merrallii、a.occidentalis、a.peninsularis、a.pennata、a.pennatula、a.polyacantha、a.polyphylla、a.riparia、a.roemeriana、a.senegal、a.sinuata、a.tamarindifolia、a.tenuifolia、a.victoriae、a.visco，或其任何组合(对于示例性金合欢提取物和黄烷，见美国专利号8,124,134)。在某些实施方式中，钩藤属植物品种选自u.acida、u.africana、u.attenuate、u.bernaysii、u.borneensis、u.callophylla、u.cordata、u.elliptica、uncaria gambir、u.guianensis、u.hirsute、u.homomalla、
u.lanosa、u.longiflora、u.macrophylla、u.orientalis、u.rhynchophylla、u.scandens,u.sessilifructus、u.setiloba,u.sinensis、u.sterrophylla、u.tomentosa,u.wangii，或其任何组合(对于示例性钩藤属提取物和黄烷，见美国专利公开号2007/0264361)。
[0169]
在进一步的实施方式中，本公开的组合物包括富含黄烷的儿茶提取物，所述黄烷包含儿茶素、表儿茶素或其组合。在仍进一步实施方式中，本公开的组合物包括富含黄烷的黑儿茶提取物，所述黄烷包含儿茶素、表儿茶素或其组合。在仍进一步实施方式中，富含黄烷的金合欢提取物来自儿茶，或富含黄烷的金合欢提取物是来自一种、两种、三种、四种、五种或多种不同金合欢品种、钩藤属品种或其他来源的提取物的混合物。在其他实施方式中，富含黄烷的钩藤属提取物来自黑儿茶，或富含黄烷的钩藤属提取物是来自一种、两种、三种、四种、五种或多种不同钩藤属品种、金合欢品种、其他来源(例如，不同植物，比如绿茶、合成的)或其任何组合的提取物的混合物。例如，本公开的组合物包括富含包含儿茶素、表儿茶素或二者的黄烷的儿茶提取物和富含包含儿茶素、表儿茶素或二者的黄烷的黑儿茶提取物的混合物。
[0170]
在某些实施方式中，金合欢的提取物中的主要活性成分包括包含儿茶素、表儿茶素或二者的黄烷，其中提取物富含来自树根、树皮或其组合的这些活性成分。在某些实施方式中，钩藤属的提取物中的主要活性成分包括包含儿茶素、表儿茶素或二者的黄烷，其中提取物富含来自叶子的这些活性成分。
[0171]
在某些实施方式中，本文提供了富含一种或多种包含儿茶素、表儿茶素或二者的黄烷的金合欢或钩藤属提取物，其中黄烷是具有式(vi)的结构的化合物：
[0172][0173]
其中r
21
、r
22
、r
23
、r
24
和r
25
独立地选自h、-oh、-sh、-och3、-sch3、-or、-sr、-nh2、-nrh、-nr2、-nr
3+
x-、取代基团的酯——其独立地选自五倍子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯；单种或多种糖的组合的碳、氧、氮或硫糖苷，所述糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮糖；二聚体、三聚体或其他聚合的黄烷；
[0174]
其中r是c
1-10
烷基基团；和
[0175]
x是羟基、氯根、碘根、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟根或碳酸根的药学上可接受的抗衡阴离子。
[0176]
在某些实施方式中，本文提供了包含类黄素的姜黄属提取物。在进一步的实施方式中，姜黄提取物富含类黄素，比如姜黄素(二阿魏酰基甲烷)、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素、casumunin a、cassu munin b或其任何组合。本公开的生物活性类黄素和其类似物可通过合成方法获得(见anand等，biochem.pharmacol.76:1590，2008)或从一种或多种植物，比如姜黄、姜属(zingiber)植物或二者提取。
[0177]
本公开的姜黄属的示例性品种包括c.aeruginosa、c.albicoma、c.albiflora、
c.alismatifolia、c.amada、c.amarissima、c.americana、c.angustifolia、c.aromatica、c.attenuata、c.aurantiaca、c.australasica、c.bakeriana、c.bicolor、c.bhatii、c.brog、c.burttii、c.caesia、c.candida、c.cannanorensis、c.caulina、c.careyana、c.ceratotheca、c.chuanezhu、c.chuanhuangjiang、c.chuanyujin、c.coccinea、c.cochinchinensis、c.codonantha、c.coerulea、c.colorata、c.comosa、c.cordata、c.cordifolia、c.coriacea、c.decipiens、c.domestica、c.ecalcarata、c.ecomata、c.elata、c.erubescens、c.euchroma、c.exigua、c.ferruginea、c.flaviflora、c.glans、c.glaucophylla、c.gracillima、c.grahamiana、c.grandiflora、c.haritha、c.harmandii、c.heyneana、c.inodora、c.karnatakensis、c.kuchoor、c.kudagensis、c.k
ü
nstleri、c.kurzii、c.kwangsiensis、c.lanceolata、c.larsenii、c.latiflora、c.latifolia、c.leucorhiza、c.leucorrhiza、c.loerzingii、c.longa、c.longiflora、c.longispica、c.lutea、c.malabarica、c.mangga、c.meraukensis、c.montana、c.musacea、c.mutabilis、c.neilgherrensis、c.nilamburensis、c.ochrorhiza、c.officinalis、c.oligantha、c.ornata、c.pallida、c.parviflora、c.parvula、c.peethapushpa、c.petiolata、c.phaeocaulis、c.picta
–
c.pierreana、c.plicata、c.porphyrotaenia、c.prakasha、c.pseudomontana、c.purpurascens、c.purpurea、c.raktakanta、c.ranadei、c.reclinata、c.rhabdota、c.rhomba、c.roscoeana、c.rotunda、c.rubescens、c.rubricaulis、c.rubrobracteata、c.sattayasaii、c.sessilis、c.sichuanensis、c.singularis、c.soloensis、c.sparganiifolia、c.speciosa、c.spicata、c.stenochila、c.strobilifera、c.sulcata、c.sumatrana、c.sylvatica、c.sylvestris、c.thalakaveriensis、c.thorelii、c.trichosantha、c.vamana、c.vellanikkarensis、c.viridiflora、c.vitellina
–
c.wenchowensis、c.wenyujin、c.xanthorrhiza、c.yunnanensis、c.zedoaria、c.zedoaroides、c.zerumbet。
[0178]
在某些实施方式中，富含类黄素的姜黄属提取物来自姜黄，或富含类黄素的姜黄属提取物是来自一种、两种、三种、四种、五种或更多种不同姜黄属品种或来自其他来源的提取物的混合物。例如，包括类黄素的组合物可以是与合成类黄素混合的姜黄属提取物(例如，姜黄)或富含类黄素的姜黄属提取物(例如，姜黄)与富含类黄素的zingiber cassumunar提取物、富含类黄素的curcuma phaeocaulis提取物、富含类黄素的curcuma.xanthorrhiza提取物或其任何组合的混合物。在其他实施方式中，富含一种或多种类黄素(例如，姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素、casumunin a、cassumunin b或其任何组合)的姜黄属提取物可来自树根、根茎或其组合。
[0179]
在某些实施方式中，本公开的组合物包括合金欢提取物——其包含或富含一种或多种如本文或美国专利号8,124,134所描述的黄烷，和桑属提取物——其包含或富含查尔酮和异戊烯基苯基部分的至少一种第尔斯-阿尔德加合物(异戊烯化的类黄酮)、芪或其任何组合。在某些实施方式中，组合物包括金合欢提取物——其包含或富含一种或多种如本文或美国专利号8,124,134中所描述黄烷，和桑属提取物——其包含或富含一种或多种表a和实施例3、5、6和68中列举的化合物。在仍进一步实施方式中，组合物包括金合欢提取物——其包含或富含儿茶素、表儿茶素或二者，和桑属提取物——其包含或富含一种或多种异戊烯化的类黄酮、一种或多种芪，或其任何组合。在其他实施方式中，组合物包括富含
一种或多种异戊烯化的类黄酮和一种或多种芪的桑属提取物，和富含黄烷的金合欢提取物的混合物。
[0180]
在进一步的实施方式中，本公开的组合物包括富含一种或多种异戊烯化的类黄酮和一种或多种芪的桑属提取物，和富含一种或多种黄烷的金合欢提取物的混合物，
[0181]
其中一种或多种异戊烯化的类黄酮是具有式(iii)或(iv)结构的化合物：
[0182][0183]
或其药学上或营养上可接受的盐、互变异构体、糖苷、前药或立体异构体，其中r
1-r
12
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基、芳烷基羰基或结构(iii)或(iv)的化合物的键；或r
1-r
12
之一与r
1-r
12
的另一个连接，以形成环，和其他r
1-r
12
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基、芳烷基羰基或结构(iii)或(iv)的化合物的键，条件是满足所有的化合价；
[0184]
查尔酮(chalcanoid)是结构(v)的化合物：
[0185][0186]
或其药学上或营养上可接受的盐、互变异构体、糖苷、前药或立体异构体，其中r
1-r
10
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基或芳烷基羰基，条件是满足所有的化合价；和
[0187]
一种或多种芪是具有式(i)或(ii)结构的化合物：
[0188]
[0189]
其中r
1-r
10
每个独立地是h、羟基、糖苷、异戊烯基、类黄酮、查尔酮、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烯基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基或芳烷基羰基；和
[0190]
其中黄烷是具有式(vi)的结构的化合物：
[0191][0192]
其中r
21
、r
22
、r
23
、r
24
和r
25
独立地选自h、-oh、-sh、-och3、-sch3、-or、-sr、-nh2、-nrh、-nr2、-nr
3+
x-、取代基团的酯——其独立地选自五倍子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯；单种或多种糖的组合的碳、氧、氮或硫糖苷，糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮糖；二聚体、三聚体或其他聚合的黄烷；
[0193]
其中r是c
1-10
烷基基团；和
[0194]
x是羟基、氯根、碘根、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟根或碳酸根的药学上可接受的抗衡阴离子。
[0195]
在任何上述的组合物中，桑属提取物来自桑树，和金合欢提取物来自儿茶。在这些组合物的进一步实施方式中，桑属提取物中的主要活性成分是albanin g、桑酮g、桑根素、氧化白藜芦醇、桑皮苷a或其任何组合，和金合欢提取物中的主要活性成分是儿茶素、表儿茶素或二者。
[0196]
在进一步的实施方式中，任何上述组合物包括具有式(iii)、(iv)或(v)结构的化合物的一种或多种异戊烯基化的类黄酮，其中任选的双键存在于环c时，没有r
11
和r
12
，并且r
10
是异戊烯基基团。在仍进一步实施方式中，任何上述的组合物包括具有式(iii)、(iv)或(v)结构的化合物的一种或多种异戊烯基化的类黄酮，其中r
1-r9的至少一个是异戊烯基基团和r
10-r
12
独立地为h或羟基。在某些实施方式中，任何上述的组合物包括具有式(i)或(ii)的结构的一种或多种芪，其中r
1-r
10
每个独立地是h、羟基、糖苷或c
1-4
烷氧基。在某些其他实施方式中，任何上述的组合物包括具有式(i)或(ii)结构的化合物的一种或多种芪，其中r
1-r
10
每个独立地是h、羟基、糖苷或c
1-4
烷氧基。在进一步的实施方式中，任何上述的组合物包括具有式(i)或(ii)结构的化合物的一种或多种芪，其中r1、r5、r6和r
10
是h。在仍进一步实施方式中，任何上述的组合物包括具有式(i)或(ii)结构的化合物的一种或多种芪，其中r2是葡糖苷或r2和r8是糖苷，和r4、r9和r
10
的一个或多个是羟基。在仍进一步实施方式中，任何上述的组合物包括具有式(i)或(ii)结构的化合物的一种或多种芪，其中r1、r5和r6是h，并且r
2-r4和r
7-r
10
的一个或多个独立地为羟基、c
1-3
烷氧基或其任何组合。在某些具体的实施方式中，芪化合物包括氧化白藜芦醇、白藜芦醇、白皮杉醇、银松素、3,4'-二羟芪、考布他汀a-1、蝶芪、丹叶大黄素，并且芪糖苷包括桑皮苷a、土大黄苷、云杉新苷、白皮杉醇葡糖苷或这些芪或芪糖苷的任何组合。
[0197]
与金合欢提取物组合物混合的任何上述的桑属提取物用于促进、管理或改善关节
健康或治疗关节不适或疾病(例如，骨关节炎、风湿性关节炎、幼年风湿性关节炎、斯提耳病、银屑病关节炎、反应性关节炎、化脓性关节炎、莱特尔氏综合征、贝赫切特综合征、费耳蒂氏综合症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、弥漫性特发性骨肥厚(dish)、骶髂关节功能失常、风湿性多肌痛、腕管综合症、痛风、粘液囊炎、肌腱炎、滑膜炎、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥大、骨炎)综合症、髌骨软骨软化、重复性劳损、扭伤、脱臼)。
[0198]
在某些方面中，本公开的组合物包括富含一种或多种异戊烯化的类黄酮和一种或多种芪的桑属提取物，和富含黄烷的金合欢提取物的混合物，其中组合物抑制软骨退变。软骨退变测量为在gag释放试验反应结束时释放(例如，从蛋白聚糖释放)至媒介的硫酸化的gag的水平，其反映关节软骨退变的量。当硫酸化的gag释放存在统计学上显著的下降时，如在例如blyscan
tm
试验(accurate chemical and scientific corp.，westbury，new york)和本文实施例27中所述的测量，确定“软骨退变的抑制”。
[0199]
在某些实施方式中，本公开的组合物包括钩藤属提取物——其包含或富含如本文或美国专利号8,034,387中所描述的一种或多种黄烷，和桑属提取物——其包含或富含查尔酮和异戊烯基苯基部分的至少一种第尔斯-阿尔德加合物(异戊烯化的类黄酮)、芪或其任何组合。在某些实施方式中，组合物包括钩藤属提取物——其包含或富含如本文或美国专利号8,034,387中所描述的一种或多种黄烷，和桑属提取物——其包含或富含表a和实施例3、5、6和68中列举的一种或多种化合物。在仍进一步实施方式中，组合物包括金合欢提取物——其包含或富含儿茶素、表儿茶素或二者，和桑属提取物——其包含或富含一种或多种异戊烯化的类黄酮、一种或多种芪，或其任何组合。在其他实施方式中，组合物包括富含异戊烯化的类黄酮的桑属提取物和富含黄烷的钩藤属提取物的混合物。
[0200]
在进一步的实施方式中，本公开的组合物包括富含一种或多种异戊烯化的类黄酮和一种或多种芪的桑属提取物，和富含一种或多种黄烷的钩藤属提取物的混合物，
[0201]
其中一种或多种异戊烯化的类黄酮是具有式(iii)或(iv)结构的化合物：
[0202][0203]
或其药学上或营养上可接受的盐、互变异构体、糖苷、前药或立体异构体，其中r
1-r
12
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基、芳烷基羰基或结构(iii)或(iv)的化合物的键；或r
1-r
12
之一与r
1-r
12
的另一个彼此连接，以形成环，和其他r
1-r
12
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基、芳烷基羰基或结构(iii)或(iv)的化合物的键，条件是满足所有的化合价；
[0204]
查尔酮(chalcanoid)是结构(v)的化合物：
[0205][0206]
或其药学上或营养可接受的盐、互变异构体、糖苷、前药或立体异构体，其中r
1-r
10
每个独立地是h、羟基、异戊烯基基团、类黄酮、查尔酮、糖苷、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、环烷基、杂环基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基或芳烷基羰基，条件是满足所有的化合价；和
[0207]
一种或多种芪是具有式(i)或(ii)结构的化合物：
[0208][0209]
其中r
1-r
10
每个独立地是h、羟基、糖苷、异戊烯基、类黄酮、查尔酮、卤素、硫氢基、氨基、醛、c
1-12
烷基、c
1-12
烯基、c
1-12
烷氧基、c
1-12
烷基硫代、c
1-12
烷氨基、芳基、异芳基、芳烷基、烷基羰基或芳烷基羰基；和
[0210]
其中黄烷是具有式(vi)结构的化合物：
[0211][0212]
其中r
21
、r
22
、r
23
、r
24
和r
25
独立地选自h、-oh、-sh、-och3、-sch3、-or、-sr、-nh2、-nrh、-nr2、-nr
3+
x-、取代基团的酯——其独立地选自五倍子酸酯、乙酸酯、肉桂酰基和羟基-肉桂酰基酯、三羟基苯甲酰基酯和咖啡酰基酯；单种或多种糖的组合的碳、氧、氮或硫糖苷，糖包括戊醛糖、甲基戊醛糖、己醛醣、已酮糖的；二聚体、三聚体或其他聚合的黄烷；
[0213]
其中r是c
1-10
烷基基团；和
[0214]
x是羟基、氯根、碘根、硫酸根、磷酸根、乙酸根、氟根或碳酸根的药学上可接受的抗衡阴离子。
[0215]
在任何上述的组合物中，桑属提取物来自桑树，和钩藤属提取物来自黑儿茶。在进一步的实施方式中，桑属提取物中的主要活性成分是albanin g、桑酮g、桑根素、氧化白藜芦醇、桑皮苷a或其任何组合，和钩藤属提取物中的主要活性成分是儿茶素、表儿茶素或其
组合。
[0216]
在进一步的实施方式中，一种或多种异戊烯基化的类黄酮是具有式(iii)、(iv)或(v)结构的化合物，其中任选的双键存在于环c时，没有r
11
和r
12
，和r
10
是异戊烯基基团。在仍进一步实施方式中，一种或多种异戊烯基化的类黄酮是具有式(iii)、(iv)或(v)结构的化合物，其中r
1-r9的至少一个是异戊烯基基团和r
10-r
12
独立地为h或羟基。在某些具体的实施方式中，异戊烯化的类黄酮包括albanin g、桑酮g、桑根素、桑根皮醇、桑根酮、异黄腐酚、光甘草定、cathayanon a或其任何组合。在某些实施方式中，一种或多种芪是具有式(i)或(ii)结构的化合物，其中r
1-r
10
每个独立地是h、羟基、糖苷或c
1-4
烷氧基。在进一步的实施方式中，一种或多种芪是具有式(i)或(ii)结构的化合物，其中r1、r5、r6和r
10
是h。在仍进一步实施方式中，一种或多种芪是具有式(i)或(ii)结构的化合物，其中r2是葡糖苷或r2和r8是糖苷，和r4、r9和r
10
的一个或多个是羟基。在仍进一步实施方式中，一种或多种芪是具有式(i)或(ii)结构的化合物，其中r1、r5和r6是h，和r
2-r4和r
7-r
10
的一个或多个独立地为羟基、c
1-3
烷氧基或其任何组合。在某些具体的实施方式中，芪化合物包括氧化白藜芦醇、白藜芦醇、白皮杉醇、银松素、3,4'-二羟芪、考布他汀a-1、蝶芪、丹叶大黄素，并且芪糖苷包括桑皮苷a、土大黄苷、云杉新苷、白皮杉醇葡糖苷或这些芪或芪糖苷的任何组合。
[0217]
在一些实施方式中，类黄酮是结构(iii)的化合物，和在其他实施方式中，类黄酮是结构(iv)的化合物。在一些其他实施方式中，r
1-r
12
的至少一个，比如r
10
是异戊烯基。在其他实施方式中，提供聚类黄酮并且结构(iii)或(iv)的化合物中的r
1-r
12
的至少一个与(iii)或(iv)的结构的化合物的键(即，化合物包括大于一种结构(iii)和/或(iv)的类黄酮)。
[0218]
在结构(iii)或(iv)的化合物的一些其他实施方式中，r
1-r
12
是h、羟基、异戊烯基基团或环烷基。例如，在一些实施方式中，环烷基是取代的和/或包括一个或多个碳-碳双键(即，是不饱和的)。任选的取代基通常选自芳基，比如苯基和芳基羰基。因此，在一些进一步实施方式中，类黄酮具有下述结构(iiia)或(iva)之一：
[0219][0220]
其中r
4a
每次出现独立地是h、羟基或异戊烯基基团。
[0221]
在结构(iiia)或(iva)的化合物的某些实施方式中，r
1-r3和r
5-r
12
每个独立地是选自h、羟基和异戊烯基基团。在某些实施方式中，r
1-r3、r
4a
或r
5-r
12
的至少一个是异戊烯基，例如在一些实施方式中，r
10
是异戊烯基。在结构(iiia)或(iva)的化合物的其他实施方式中，r
1-r3、r
4a
或r
5-r
12
的至少两个是羟基。
[0222]
在一些更具体的实施方式中，类黄酮具有下述一种结构：
[0223][0224]
在其他实施方式中，r
1-r
12
之一与r
1-r
12
的另一个彼此连接，以形成环并且其他r
1-r
12
是h、羟基或异戊烯基基团。在某些这些实施方式中，环是杂环的环，例如环醚环。因此，在某些实施方式中，类黄酮具有下述结构(iiib)或(ivb)之一：
[0225][0226]
在结构(iiib)或(ivb)的化合物的某些实施方式中，r1、r2和r
5-r
12
每个独立地是选自h、羟基和异戊烯基基团。在某些实施方式中，r1、r2或r
5-r
12
的至少一个是异戊烯基，例如在一些实施方式中，r
10
是异戊烯基。在结构(iiib)或(ivb)的化合物的其他实施方式中，r1、r2或r
5-r
12
的至少两个是羟基。在某些实施方式中，类黄酮具有下述结构：
[0227][0228]
在各种其他实施方式中，结构(v)的查尔酮(chalcanoid)的r
1-r
10
每个独立地是选自h、羟基、异戊烯基基团，和c
1-12
烷氧基。
[0229]
与钩藤属提取物组合物混合的任何上述的桑属提取物用于促进、管理或改善关节健康或治疗关节不适或疾病(例如，骨关节炎、风湿性关节炎、幼年风湿性关节炎、斯提耳病、银屑病关节炎、反应性关节炎、化脓性关节炎、莱特尔氏综合征、贝赫切特综合征、费耳蒂氏综合症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、弥漫性特发性骨肥厚(dish)、骶髂关节功能失常、风湿性多肌痛、腕管综合症、痛风、粘液囊炎、肌腱炎、滑膜炎、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥大、骨炎)综合症、髌骨软骨软化、重复性劳损、扭伤、脱臼)。在某些实施方式中，本公开的组合物包括富含一种或多种异戊烯化的类黄酮和一种或多种芪的桑属提取物和富含黄烷的钩藤属提取物的混合物，其中组合物抑制软骨退变。
[0230]
在某些实施方式中，组合物包括富含异戊烯化的类黄酮的桑属提取物、富含黄烷的钩藤属提取物和富含黄烷的金合欢提取物的混合物。在进一步的实施方式中，组合物包
括富含一种或多种异戊烯化的类黄酮和一种或多种芪的桑属提取物、富含包括儿茶素、表儿茶素或二者的黄烷的钩藤属提取物，和富含包括儿茶素、表儿茶素或二者的黄烷的金合欢提取物的混合物。在某些实施方式中，桑属提取物来自桑树，钩藤属提取物来自黑儿茶，和金合欢提取物来自儿茶。在进一步的实施方式中，桑属提取物中的主要活性成分是albanin g、桑酮g、桑根素、氧化白藜芦醇、桑皮苷a或其任何组合，以及钩藤属和金合欢提取物中的主要活性成分是儿茶素、表儿茶素或其组合。任何这些三种提取物组合物(桑属、钩藤属、金合欢)用于促进、管理或改善关节健康或治疗关节不适或疾病(例如，骨关节炎、风湿性关节炎、幼年风湿性关节炎、斯提耳病、银屑病关节炎、反应性关节炎、化脓性关节炎、莱特尔氏综合征、贝赫切特综合征、费耳蒂氏综合症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、弥漫性特发性骨肥厚(dish)、骶髂关节功能失常、风湿性多肌痛、腕管综合症、痛风、粘液囊炎、肌腱炎、滑膜炎、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥大、骨炎)综合症、髌骨软骨软化、重复性劳损、扭伤、脱臼)。
[0231]
在某些实施方式中，本公开的组合物包括包含或富含查尔酮和异戊烯基苯基部分的至少一种第尔斯-阿尔德加合物(异戊烯化的类黄酮)、芪或其任何组合的桑属提取物，和富含类黄素的姜黄属提取物的混合物。在进一步的实施方式中，组合物包括包含或富含表a和实施例3、5、6和68中列举的一种或多种化合物的桑属提取物，和富含一种或多种类黄素的姜黄属提取物的混合物。在仍进一步实施方式中，组合物包括包含或富含一种或多种异戊烯化的类黄酮、一种或多种芪或其任何组合的桑属提取物，和富含一种或多种类黄素的姜黄属提取物。在某些实施方式中，桑属提取物来自桑树，和姜黄属提取物来自姜黄。在任何上述的组合物中，桑属提取物中的主要活性成分是albanin g、桑酮g、桑根素、氧化白藜芦醇、桑皮苷a或其任何组合，和姜黄属提取物中的主要活性成分是姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素或其任何组合。
[0232]
与姜黄属提取物组合物混合的任何上述的桑属提取物用于促进、管理或改善关节健康，或治疗关节不适或疾病(例如，骨关节炎、风湿性关节炎、幼年风湿性关节炎、斯提耳病、银屑病关节炎、反应性关节炎、化脓性关节炎、莱特尔氏综合征、贝赫切特综合征、费耳蒂氏综合症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、弥漫性特发性骨肥厚(dish)、骶髂关节功能失常、风湿性多肌痛、腕管综合症、痛风、粘液囊炎、肌腱炎、滑膜炎、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥大、骨炎)综合症、髌骨软骨软化、重复性劳损、扭伤、脱臼)。在某些实施方式中，本公开的组合物包括富含一种或多种异戊烯化的类黄酮和一种或多种芪的桑属提取物，和富含一种或多种类黄素的姜黄属提取物的混合物，其中组合物抑制软骨退变。
[0233]
在某些实施方式中，组合物包括富含异戊烯化的类黄酮的桑属提取物、富含黄烷的金合欢提取物，和富含类黄素的姜黄属提取物的混合物。在进一步的实施方式中，组合物包括富含一种或多种异戊烯化的类黄酮和一种或多种芪的桑属提取物，富含包括儿茶素、表儿茶素或二者的黄烷的金合欢提取物，和富含一种或多种类黄素的姜黄属提取物的混合物。在某些实施方式中，桑属提取物来自桑树，金合欢提取物来自儿茶，和姜黄属提取物来自姜黄。在进一步的实施方式中，桑属提取物中的主要活性成分是albanin g、桑酮g、桑根素、氧化白藜芦醇、桑皮苷a或其任何组合，和姜黄属提取物中的主要活性成分是姜黄素(二阿魏酰基甲烷)、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素或其任何组合。
[0234]
在某些实施方式中，组合物包括富含异戊烯化的类黄酮的桑属提取物、富含黄烷
的钩藤属提取物和富含类黄素的姜黄属提取物的混合物。在进一步的实施方式中，组合物包括富含一种或多种异戊烯化的类黄酮和一种或多种芪的桑属提取物、富含包括儿茶素、表儿茶素或二者的黄烷的钩藤属提取物，和富含一种或多种类黄素的姜黄属提取物的混合物。在某些实施方式中，桑属提取物来自桑树，钩藤属提取物来自黑儿茶，和姜黄属提取物来自姜黄。
[0235]
任何这些三种提取物组合物(桑属、金合欢、姜黄属或桑属、钩藤属、姜黄属)用于促进、管理或改善关节健康，或治疗关节不适或疾病(例如，骨关节炎、风湿性关节炎、幼年风湿性关节炎、斯提耳病、银屑病关节炎、反应性关节炎、化脓性关节炎、莱特尔氏综合征、贝赫切特综合征、费耳蒂氏综合症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、弥漫性特发性骨肥厚(dish)、骶髂关节功能失常、风湿性多肌痛、腕管综合症、痛风、粘液囊炎、肌腱炎、滑膜炎、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥大、骨炎)综合症、髌骨软骨软化、重复性劳损、扭伤、脱臼)。
[0236]
在任何上述的组合物中，桑属提取物富含异戊烯化的类黄酮，比如albanin g、桑酮g、桑根素或其任何组合。在某些实施方式中，桑属提取物富含芪，比如氧化白藜芦醇、桑皮苷a或其任何组合。在进一步的实施方式中，桑属提取物富含异戊烯化的类黄酮和芪，包括albanin g、桑酮g、桑根素、氧化白藜芦醇、桑皮苷a或其任何组合。在仍进一步实施方式中，桑属提取物富含异戊烯化的类黄酮和芪，其中提取物包括约2％至约25％的异戊烯化的类黄酮和约1％至约8％的芪，或其中提取物包括至少3％的异戊烯化的类黄酮和至少3％的芪(重量比)。在其他实施方式中，异戊烯化的类黄酮、芪或二者从桑属提取物分离或纯化并且用在本公开的组合物中。可从桑属提取物分离或纯化并且用在本公开的组合物中的示例性活性成分包括albanin g、桑酮g、桑根素、氧化白藜芦醇、桑皮苷a或其任何组合。在任何上述的组合物中，桑属提取物来自桑树。
[0237]
在任何上述的实施方式中，包括提取物或化合物的混合物的组合物可按重量计以具体的比例混合。例如，桑属提取物和金合欢提取物可以分别2:1重量比掺混。在某些实施方式中，本公开的两种提取物或化合物的比例(按重量计)的范围为约0.5:5至约5:0.5。当使用大于两种提取物或化合物(例如，三种、四种、五种)时，采用类似的范围。示例性比例包括0.5:1、0.5:2、0.5:3、0.5:4、0.5:5、1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、2:1、2:2、2:3、2:4、2:5、3:1、3:2、3:3、3:4、3:5、4:1、4:2、4:3、4:4、4:5、5:1、5:2、5:3、5:4、5:5、1:0.5、2:0.5、3:0.5、4:0.5或5:0.5。在某些实施方式中，桑属和金合欢提取物分别以下述范围掺混：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、1:2、1:3、1:4或1:5重量比。在进一步的实施方式中，桑属和金合欢提取物分别以1:2至4:1重量比的范围掺混。在某些实施方式中，桑属和钩藤属提取物分别以下述范围掺混：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、1:2、1:3、1:4、或1:5重量比。在进一步的实施方式中，桑属和钩藤属提取物分别以1:4至4:1重量比的范围掺混。在某些实施方式中，桑属和姜黄属提取物分别以1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、1:2、1:3、1:4或1:5重量比掺混。在进一步的实施方式中，桑属和姜黄属提取物分别以1:1至4:1重量比范围掺混。
[0238]
在任何上述的实施方式中，包括提取物或化合物的混合物的组合物可以某些百分数水平或比例存在。在某些实施方式中，包括桑属提取物的组合物可包括0.1％至49.9％或约1％至约10％或约0.5％至约3％的异戊烯化的类黄酮、0.1％至49.9％或约1％至约10％或约0.5％至约3％的芪，或其组合。在某些实施方式中，包括金合欢提取物的组合物可包括
约0.01％至约99.9％的黄烷或包括至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％或80％的黄烷(例如，儿茶素、表儿茶素或二者)
[0239]
在某些实施例中，本公开的组合物可配制为进一步包括药学上或营养上可接受的载体、稀释剂或赋形剂，其中药学或营养制剂包括约0.5重量百分数(wt％)至约90wt％的提取物混合物的活性或主要活性成分。在进一步的实施方式中，药学或营养制剂包括约0.5重量百分数(wt％)至约90wt％、约0.5wt％至约80wt％、约0.5wt％至约75wt％、约0.5wt％至约70wt％、约0.5wt％至约50wt％、约1.0wt％至约40wt％、约1.0wt％至约20wt％、约1.0wt％至约10wt％、约3.0wt％至约9.0wt％、约5.0wt％至约10wt％、约3.0wt％至约6wt％的提取物混合物的主要活性成分等。在任何上述的制剂中，本公开的组合物配制为片剂、硬胶囊、软明胶胶囊、粉末或细粒。
[0240]
在某些实施方式中，包括桑属提取物与药学上或营养上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物包含至少6wt％或至少5wt％或至少3wt％或至少2wt％或至少1wt％的活性桑属成分，比如异戊烯化的类黄酮、芪或其组合。例如，包括桑属提取物的药学或营养组合物将包括至少3wt％的异戊烯化的类黄酮或约至少0.5wt％至约至少2.5wt％或约至少1wt％至约至少2.5wt％或约至少1.5wt％至约至少2.5wt％(例如，albanin g、桑酮g、桑根素或其任何组合)和至少3％的芪(例如，氧化白藜芦醇、桑皮苷a或二者)。在某些实施方式中，包括金合欢或钩藤属提取物与药学上或营养上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物将包含至少20wt％的活性金合欢或钩藤属成分，比如黄烷。例如，包括金合欢或钩藤属提取物的药学或营养组合物将包括至少约3.5wt％至约至少14wt％或至少约6wt％至约至少16.5wt％(例如，儿茶素、表儿茶素或二者)。在某些实施方式中，包括姜黄属提取物与药学上或营养上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的组合物将包含至少25wt％的活性姜黄属成分，比如类黄素(cucuminoids)。例如，包括姜黄属提取物的药学或营养组合物将包括至少约4.5wt％至至少约13wt％的类黄素(例如，姜黄素、脱甲氧基姜黄素、双脱甲氧基姜黄素或其任何组合)。在任何上述的制剂中，本公开的组合物配制为片剂、硬胶囊、软明胶胶囊、粉末或细粒。
[0241]
在某些实施方式中，本公开的组合物包括桑属和金合欢提取物，其中组合物包括约1wt％至约2.5wt％的异戊烯化的类黄酮，包括albanin g、桑酮g和桑根素；约1wt％至约2.5wt％的芪，包括氧化白藜芦醇和桑皮苷a；和约3.5wt％至约14wt％黄烷，包括儿茶素和表儿茶素。在某些其他实施方式中，本公开的组合物包括桑属和钩藤属提取物，其中组合物包括约0.5wt％至约2.5wt％的异戊烯化的类黄酮，包括albanin g、桑酮g和桑根素；约0.5wt％至约2.5wt％的芪，包括氧化白藜芦醇和桑皮苷a；和约6wt％至约16.5wt％的黄烷，包括儿茶素和表儿茶素。在某些进一步实施方式中，本公开的组合物包括桑属和姜黄属提取物，其中组合物包括约1.5wt％至约2.5wt％的异戊烯化的类黄酮，包括albanin g、桑酮g和桑根素；约1.5wt％至约2.5wt％的芪，包括氧化白藜芦醇和桑皮苷a；和约4.5wt％至约13wt％类黄素，包括姜黄素。
[0242]
任何这些组合物可用于促进关节健康；改善关节健康；维持关节健康；治疗或管理关节健康；支持关节健康；支持正常和舒适运动的范围和/或灵活性；改善运动的范围和/或灵活性；降低分解保护性关节组织的有害酶的作用；改变影响关节健康的酶的作用；改善关
节移动和/或关节功能；改善物理移动性；管理和/或维持物理移动性；缓解关节疼痛和/或关节僵硬；改善关节物理功能；促进或增强灵活性和舒适移动；促进健康的关节功能和关节舒适；缓解关节不适；缓解由运动、工作、用力过度或其任何组合造成的关节不适；通过保护软骨完整性促进健康的关节；维持关节软骨；支持关节软骨；治疗、预防或管理软骨退变；使软骨退变最小化；通过保持关节润滑的滑液促进关节健康或舒适；支持关节稳定性和关节灵活性；活化关节和促进移动性；促进柔性关节和强壮软骨；维持至关节的稳定血流以支持增强灵活性和/或强度；运动、工作、用力过度之后促进关节舒适和宽范围的动作，或其任何组合。
[0243]
在其他实施方式中，任何这些组合物可用于治疗骨关节炎、风湿性关节炎、幼年风湿性关节炎、斯提耳病、银屑病关节炎、反应性关节炎、化脓性关节炎、莱特尔氏综合征、贝赫切特综合征、费耳蒂氏综合症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、弥漫性特发性骨肥厚(dish)、骶髂关节功能失常、风湿性多肌痛、腕管综合症、痛风、粘液囊炎、肌腱炎、滑膜炎、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥大、骨炎)综合症、髌骨软骨软化、重复性劳损、扭伤、脱臼或任何其他相关的适应症，并且通常对患者具有可接受的毒性。
[0244]
在本公开的其他实施方式中，组合物可也包括佐剂或载体。佐剂包括通常提高制剂在促进、保持或改善关节健康方面的功能的物质。适当的佐剂包括弗氏佐剂；其他细菌细胞壁组分；基于铝的盐；基于钙的盐；二氧化硅；硼、组氨酸、葡糖胺硫酸盐、硫酸软骨素、葡萄糖酸铜、多核苷酸；维生素d、维生素k、类毒素；鲨鱼和牛软骨；血清蛋白；病毒壳蛋白；其他细菌衍生的制品；γ-干扰素；嵌段共聚物佐剂，比如hunter's titermax佐剂(vaxcel
tm
，inc.norcross，ga.)；ribi佐剂(可获得自ribi immunochem research，inc.，hamilton，mont.)；和皂苷以及它们的衍生物，比如quil a(可获得自superfos biosectora/s，丹麦)。载体包括在治疗的受试者中延长治疗性或营养组合物的半衰期的化合物。适当的载体包括聚合控制释放制剂、生物可降解的植入物、脂质体、细菌、病毒、油、酯或乙二醇。
[0245]
用于本公开的组合物的另外佐剂包括葡糖胺(包括葡糖胺硫酸盐、葡糖胺盐酸盐、n-乙酰葡糖胺)、糖胺聚糖(gag)、透明质酸(ha)、弹性蛋白、胶原蛋白、ii型鸡胶原蛋白、透明质酸和胶原蛋白掺混物、硫酸软骨素、甲基磺酰甲烷(msm)、牛软骨、氨基酸(包括锁链素、异锁链素、l-谷氨酰胺)、乳香(boswellia serrata)提取物、胡椒碱(例如，白胡椒(piper nigrum l)(黑胡椒)提取物或荜茇(piper longum l)(长辣椒)提取物)、菠萝蛋白酶(菠萝提取物)、胰蛋白酶、芸香甙、鸸鹋油、转化生长因子(tgf)-β、类胡萝卜素(比如叶黄素、胡萝卜素、角黄素)；维生素(比如维生素d3)、ω-3脂肪酸(比如二十碳五烯酸，epa；二十二碳六烯酸，dha)、果糖硼酸钙、蛋壳膜、虾青素、黑藻(hydrilla verticillata)提取物(叶和芽)、姜提取物(树根)、葡萄柚提取物(种子)、非甾类抗炎药(nsaids)或其任何组合。
[0246]
示例性nsaids包括水杨酸盐，比如阿司匹林(乙酰水杨酸)、二氟尼柳、双水杨酸酯；丙酸衍生物，比如布洛芬、右旋布洛芬、萘普生、非诺洛芬、酮洛芬、右旋酮洛芬、氟比洛芬、噁丙嗪、洛索洛芬；乙酸衍生物，比如吲哚美辛、托美丁、舒林酸、依托度酸、酮咯酸、双氯芬酸、萘丁美酮；烯醇酸衍生物，比如吡罗昔康、美洛昔康、替诺昔康、哚昔康、氯诺昔康、伊索昔康；灭酸衍生物，比如甲芬那酸、甲氯灭酸、氟芬那酸、托芬那酸；选择性cox-2抑制剂，比如塞来考昔、帕瑞考昔、鲁米考昔、依托考昔、非罗考昔、扑热息痛、哈帕苷；磺酸苯胺，比如尼美舒利；烟酸衍生物，比如赖氨酸氯尼辛；双cox/lx抑制剂，比如利考非隆。相关的药
物，扑热息痛或“乙酰氨基酚”通常认为与nsaids属于相同目录，原因是其用作非麻醉药镇痛药和退烧药，但是不归类为nsaid，因为其仅仅展示弱的抗炎性。
[0247]
在某些实施方式中，本公开的组合物进一步包括可注射的抗凝剂、口服抗凝剂、抗血小板剂、抗心绞痛剂或cox-2选择性抑制剂。示例性可注射的抗凝剂包括肝素、达肝素、依诺肝素和亭扎肝素。口服抗凝剂的例子包括但不限于杀鼠灵、维生素k拮抗物和维生素k还原酶抑制剂。抗血小板剂的例子包括阿司匹林、氯吡格雷和双嘧达莫。示例性抗心绞痛药物包括硝酸盐、β-阻断剂、钙阻断剂、血管紧张肽-转化酶抑制剂和钾通道活化剂。最后，cox-2选择性抑制剂的例子包括罗非考昔、塞来考昔、依托度酸和美洛昔康。
[0248]
在某些实施方式中，组合物包括富含一种或多种异戊烯化的类黄酮和一种或多种芪的桑属提取物、富含黄烷的金合欢提取物和葡糖胺型化合物的混合物。在进一步的实施方式中，桑属提取物是桑树提取物，金合欢提取物是儿茶提取物，和葡糖胺型化合物是葡糖胺硫酸盐、葡糖胺盐酸盐、n-乙酰葡糖胺、硫酸软骨素、甲基磺酰甲烷或透明质酸。在某些实施方式中，桑属提取物、金合欢提取物和nag分别以下述重量比掺混：1:1:1、2:1:1、3:1:1、4:1:1、5:1:1、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:5:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4或1:1:5。在某些实施方式中，桑属提取物、钩藤属提取物和nag分别以下述重量比掺混：1:1:1、2:1:1、3:1:1、4:1:1、5:1:1、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:5:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4或1:1:5。在某些实施方式中，桑属提取物、姜黄属提取物和nag分别以下述重量比掺混：1:1:1、2:1:1、3:1:1、4:1:1、5:1:1、1:2:1、1:3:1、1:4:1、1:5:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4、或1:1:5。在某些实施方式中，组合物包括富含异戊烯化的类黄酮的桑属提取物、富含黄烷的钩藤属提取物和葡糖胺型化合物的混合物。在进一步的实施方式中，桑属提取物是桑树提取物，钩藤属提取物是黑儿茶提取物，和葡糖胺型化合物是葡糖胺硫酸盐、葡糖胺盐酸盐、n-乙酰葡糖胺、硫酸软骨素、甲基磺酰甲烷或透明质酸。
[0249]
在某些实施方式中，组合物包括富含异戊烯化的类黄酮的桑属提取物、富含类黄素的姜黄属提取物和葡糖胺型化合物的混合物。在进一步的实施方式中，桑属提取物是桑树提取物，姜黄属提取物是姜黄提取物，和葡糖胺型化合物是葡糖胺硫酸盐、葡糖胺盐酸盐、n-乙酰葡糖胺、硫酸软骨素、甲基磺酰甲烷或透明质酸。
[0250]
在任何上述的组合物中，组合物可另外包括富含迷迭香酸、圣草次苷(eriocitrin)或二者的薄荷属提取物。迷迭香酸积聚最显著见于唇形科(lamiaceae family)(双子叶植物)的许多植物，尤其荆芥亚科(subfamily nepetoideae)，包括通常用作烹调草药的植物，比如ocimum basilicum(罗勒)、ocimum tenuiflorumcum(圣罗勒)、melissa officinalis(香蜂叶)、rosmarinus officinalis(迷迭香)、origanum majorana(马郁兰)、salvia officinalis(鼠尾草)、thymus vulgaris(百里香)和mentha piperita(薄荷)。迷迭香酸也见于具有医药特性的植物，比如常见的自愈植物(夏枯草(prunella vulgaris))或stachy属中的品种。包含迷迭香酸的其他示例性植物包括heliotropium foertherianum(紫草科中的植物)、maranta属中的品种(maranta leuconeura、maranta depressa，其是marantaceae科中的植物，单子叶植物)、thalia属中的品种(thalia geniculata)和anthoceros agrestis(金鱼藻)。
[0251]
包含迷迭香酸或圣草次苷或二者的示例性薄荷植物包括mentha aquatica(水薄荷或mint薄荷)；mentha arvensis(玉米薄荷、野薄荷、日本薄荷、field mint、pudina、香蕉
薄荷)；洋薄荷(mentha asiatica)(亚洲薄荷)；澳洲薄荷(mentha australis)(澳大利亚薄荷)；加拿大薄荷(mentha canadensis)；哈特普列薄荷(mentha cervina)(hart's pennyroyal)；mentha citrata(柠檬薄荷、香橙薄荷)；mentha crispata(卷曲叶薄荷(wrinkled-leaf mint))；mentha dahurica(dahurian thyme)；mentha diemenica(细长薄荷)；mentha laxiflora(森林薄荷)；mentha longifolia(mentha sylvestris，马薄荷)；mentha piperita(胡椒薄荷)；mentha pulegium(薄荷油l)；mentha requienii(科西嘉薄荷(corsicanmint))；mentha sachalinensis(花园薄荷(garden mint))；mentha satureioides(native pennyroyal)；mentha spicata(m.viridis，syn m.cordifolia spearmint，curly mint)；mentha suaveolens(苹果薄荷、菠萝薄荷(苹果薄荷的杂色培养物))；mentha vagans(灰薄荷(gray mint))。
[0252]
在某些实施方式中，组合物包括富含异戊烯化的类黄酮的桑属提取物、富含黄烷的金合欢提取物，和富含迷迭香酸、圣草次苷或二者的薄荷属提取物的混合物。在进一步的实施方式中，桑属提取物是桑树提取物，金合欢提取物是儿茶提取物，和薄荷属提取物是胡椒薄荷提取物。在某些实施方式中，桑属提取物、金合欢提取物和薄荷属提取物分别以下述重量比掺混：1:1:0.5、2:1:0.5、3:1:0.5、4:1:0.5、5:1:0.5、1:2:0.5、1:3:0.5、1:4:0.5、1:5:0.5、1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4或1:1:5。
[0253]
在某些实施方式中，组合物包括富含异戊烯化的类黄酮的桑属提取物、富含黄烷的钩藤属提取物和富含迷迭香酸、圣草次苷或二者的薄荷属提取物的混合物。在进一步的实施方式中，桑属提取物是桑树提取物，钩藤属提取物是黑儿茶提取物，和薄荷属提取物是胡椒薄荷提取物。在某些实施方式中，桑属提取物、钩藤属提取物和薄荷属提取物分别以下述重量比掺混：1:1:0.5、2:1:0.5、3:1:0.5、4:1:0.5、5:1:0.5、1:2:0.5、1:3:0.5、1:4:0.5、1:5:0.5、1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4或1:1:5。
[0254]
在某些实施方式中，组合物包括富含异戊烯化的类黄酮的桑属提取物、富含类黄素的姜黄属提取物，和富含迷迭香酸、圣草次或二者的薄荷属提取物的混合物。在进一步的实施方式中，桑属提取物是桑树提取物，姜黄属提取物是姜黄属提取物，和薄荷属提取物是胡椒薄荷提取物。在某些实施方式中，桑属提取物、姜黄属提取物和薄荷属提取物分别以下述重量比掺混：1:1:0.5、2:1:0.5、3:1:0.5、4:1:0.5、5:1:0.5、1:2:0.5、1:3:0.5、1:4:0.5、1:5:0.5、1:1:1、1:1:2、1:1:3、1:1:4或1:1:5。
[0255]
任何上述的组合物用于促进关节健康；改善关节健康；保持关节健康；处理或管理关节健康；支持关节健康；支持正常和舒适运动的范围和/或灵活性；改善运动的范围和/或灵活性；减少分解保护性关节组织的有害酶的作用；改变影响关节健康的酶的作用；改善关节移动和/或关节功能；改善物理移动性；管理和/或保持物理移动性；缓解关节疼痛和/或关节僵硬；改善关节物理功能；促进或增强灵活性和舒适移动；促进健康的关节功能和关节舒适；缓解关节不适；缓解由氧化应激、有害的自由基、衰老、磨损、运动、工作、用力过度或其任何组合造成的关节不适；管理或减少由氧化应激、有害的自由基、衰老、磨损、运动、工作、用力过度或其任何组合造成的关节损伤；通过保护软骨完整性促进健康的关节；保持关节软骨；支持关节软骨；治疗、预防或管理软骨退变；使软骨退变最小化；通过保持关节润滑的滑液促进关节健康或舒适；支持关节稳定性和关节灵活性；恢复关节和促进移动性；促进柔性关节和强壮软骨；保持至关节的稳定血流以支持增强灵活性和/或强度；运动、工作、用
力过度之后促进关节舒适和宽范围的动作或其任何组合；或其任何组合。
[0256]
在进一步的实施方式中，任何上述的组合物用于治疗、预防，或减轻关节不适或疾病，比如骨关节炎、风湿性关节炎、幼年风湿性关节炎、斯提耳病、银屑病关节炎、反应性关节炎、化脓性关节炎、莱特尔氏综合征、贝赫切特综合征、费耳蒂氏综合症、系统性红斑狼疮、强直性脊柱炎、弥漫性特发性骨肥厚(dish)、骶髂关节功能失常、风湿性多肌痛、腕管综合症、痛风、粘液囊炎、肌腱炎、滑膜炎、sapho(滑膜炎、痤疮、脓疱病、骨肥大、骨炎)综合症、髌骨软骨软化、重复性劳损、扭伤、脱臼或其任何组合。
实施例
[0257]
实施例1
[0258]
从桑树制备有机和水性提取物
[0259]
来自桑树根皮的植物材料粉碎成不大于两毫米(mm)的颗粒大小。将干燥粉碎的植物材料(然后将60克(g)转移至erlenmeyer烧瓶并且添加甲醇:二氯甲烷(1:1体积比)(600毫升(ml))。振荡混合物一小时，过滤并且再次用甲醇:二氯甲烷(1:1体积比)(600ml)提取生物质。组合这些有机提取物并且在真空下蒸发，以提供3.55g的有机提取物(oe)。有机提取之后，使生物质风干并且用超纯水(600ml)提取一次。过滤水溶液并且冻干，以提供4.44g的水性提取物(ae)。
[0260]
使用相同的程序或在烧瓶中的回流获得类似的结果，但是用甲醇或乙醇替换有机溶剂，以分别提供甲醇提取物(me)或乙醇提取物(ee)。使用该相同的程序提取其他品种和植物的部分和海洋样品。
[0261]
实施例2
[0262]
高通量纯化(htp)活性植物提取物
[0263]
将从实施例1中获得的桑树根皮提取物的有机提取物材料(400mg)装载至预填料的(2cm id x 8.2cm，10g二氧化硅凝胶)柱上。然后，使用高通量纯化(htp)系统洗脱柱，梯度流动相为(a)50:50体积比的etoac:己烷和(b)甲醇，30分钟内100％a至100％b，流速为5ml/min。使用宽频波长uv检测器监测分离并且使用gilson馏分收集器将馏分以1.9ml/孔收集在96深孔板中。在低真空和离心下使样品板干燥并且然后用每孔1.5ml二甲基亚砜(dmso)溶解样品。取一部分(100μl)并且组合(基于uv跟踪)用于功能试验。保留具有明显生物活性的柱馏分用于进一步测试。
[0264]
实施例3
[0265]
分离、纯化和鉴定来自桑树提取物的异戊烯化的类黄酮
[0266]
将如实施例1中描述的获得的来自桑树根皮的有机提取物(11g)分开并且分别装载在两个预填料的闪蒸柱(120g二氧化硅，颗粒大小32-60μm，4cm x 19cm)，并且然后用己烷、etoac和甲醇(作为流动相)以20ml/分钟的流速洗脱。梯度开始于95％的己烷/etoac，5分钟，然后在25分钟的期间内将etoac从5％增加至100％，并且然后保持在100％etoac另外的五分钟，然后在接下来的15分钟内将meoh从0％增加至50％meoh/etoac，最后将洗脱溶液变成100％meoh，并洗脱柱另外的16分钟。总运行时间是66分钟并且每个柱产生88个馏分。通过二氧化硅凝胶薄层色谱(tlc)分析馏分并且汇集在一些产生八个柱洗脱液池。
[0267]
所得最佳活性池(包含300mg的材料)在制备c18柱(30cm x 250cm)上用水(a)和甲
醇(b)的梯度流动相在60分钟内以20ml/分钟流速分馏，以产生22个馏分池。质谱(ms)分析显示这些合并的材料馏分包含三个相关的化合物，其在下面更详细描述。
[0268]
通过高分辨率电子喷雾电离质谱法(hresims)，化合物1(28.2mg)鉴定为查尔酮和异戊烯基苯基部分的第尔斯-阿尔德加合物，称为桑酮g，也称为桑白皮素b或albanin f，(m/z)[m+h]-＝693.2329；uvλ
max
(meoh):265,320nm；1h nmr(600mhz,dmso-d6,100℃)δppm 1.44(s,3h)1.52(br.s.,3h)1.58(s,3h)1.92(m,2h)3.08(d,3h)3.56(m,2h)4.29(d,j＝10.02hz,1h)4.48(m,1h)5.07(m,1h)5.14(br.s,1h)5.93(s,2h)5.96(dd,j＝8.35,2.23hz,1h)6.02(br s,1h)6.11(d,j＝2.23hz,1h)6.41(dd,j＝8.35,2.23hz,1h)6.51(s,1h)6.60(m,1h)7.13(d,j＝8.35hz,1h)7.28(br s,1h)；
13
c nmr(126mhz,methanol-d4)δppm 16.35(1c)21.78(1c)23.35(1c)24.53(1c)37.72(1c)97.14(1c)101.57(1c)102.22(1c)102.33(1c)104.28(1c)106.55(2c)107.00(1c)107.21(1c)112.37(1c)114.47(1c)120.27(1c)121.62(2c)123.27(1c)131.05(1c)131.35(2c)132.62(1c)132.99(1c)155.16(1c)155.56(1c)156.38(1c)159.66(1c)160.39(2c)161.13(1c)161.88(1c)164.51(1c)164.63(1c)182.46(1c)208.68(1c)。
[0269][0270]
通过hresims，化合物2(10.5mg)鉴定为albanin g，也称为桑酮h或桑白皮素a，查尔酮和异戊烯基苯基部分的另一第尔斯-阿尔德加合物，(m/z)[m-h]-＝759；uvλ
max
(meoh)：265，320nm；
13
c nmr(126mhz，methanol-d4)δppm 16.35(1c)16.47(1c)20.96(1c)21.79(1c)23.32(1c)24.51(1c)24.53(1c)33.74(1c)35.61(1c)36.81(1c)37.77(1c)97.19(1c)102.27(1c)102.33(1c)104.24(1c)106.07(1c)106.53(2c)107.34(1c)112.37(1c)113.94(1c)114.35(1c)120.17(1c)121.60(2c)122.31(2c)123.25(1c)130.21(2c)131.33(2c)132.96(1c)156.37(3c)157.07(1c)159.59(1c)160.37(1c)161.23(1c)161.77(1c)161.96(1c)162.21(1c)182.45(1c)208.82(1c)。
[0271][0272]
通过esims，化合物3(12.9mg)鉴定为桑根皮醇，(m/z)[m-h]-＝437；uvλ
max
(meoh)：269，317nm；1h nmr(500mhz，meth anol-d4)δppm 1.08(s，6h)1.43(s，6h)1.60(m，2h)2.43(m，2h)5.59(d，j＝9.97hz，1h)6.16(s，1h)6.43(m，2h)6.59(d，j＝10.26hz，1h)7.15(d，j＝
9.09hz，1h)；
13
c nmr(126mhz，methanol-d4)δppm 21.52(t，1c)28.54(q，2c)28.88(q，2c)43.19(t,1c)71.56(s，1c)79.28(s，1c)100.28(d，1c)102.35(s，1c)104.06(d，1c)106.05(s，1c)108.26(d，1c)113.14(s，1c)115.89(d，1c)122.99(s，1c)128.36(d，1c)132.37(d，1c)153.97(s，1c)157.96(s，1c)160.62(s，1c)162.13(s，1c)162.88(s，1c)163.63(s，1c)184.09(s，1c)
[0273][0274]
另一最佳活性池(包含538mg的材料)，在制备c18柱(30cm x 250cm)上用水(a)和甲醇(b)的梯度流动相在60分钟内以20ml/分钟的流速分馏，以产生16个馏分池。分离异戊烯基苯基化的化合物4，称为桑根素(80mg)，也称为桑皮烯黄素。结构和光谱学数据如下：esi ms(m/z)[m-h]-419；uvλmax(meoh)：269.4nm；1h nmr(500mhz，methanol-d4)δppm 1.41(m，9h)1.58(s，3h)3.10(d，j＝7.15hz，2h)5.09(m，1h)5.57(d，j＝10.49hz，1h)6.14(s，1h)6.40(m，2h)6.59(d，j＝10.01hz，1h)7.10(d，j＝8.11hz，1h)；13c nmr(126mhz，methanol-d4)δppm 16.25(q，1c)23.48(t，1c)24.42(q，1c)26.99(q，2c)77.70(s，1c)98.69(d，1c)100.79(s，1c)102.43(d，1c)104.51(s，1c)106.63(d，1c)111.67(s，1c)114.35(d，1c)120.63(s，1c)121.30(d，1c)126.73(d，1c)131.02(d，1c)131.42(s，1c)152.36(s，1c)156.51(s，1c)159.04(s，1c)160.61(s，1c)161.27(s，1c)162.14(s，1c)182.44(s，1c)。
[0275][0276]
实施例4
[0277]
由桑树制备有机的70％乙醇提取物
[0278]
切割2kg的干燥桑树根和根皮，碾碎，并且然后用约十倍体积(20l)的水中的70％乙醇溶液(v/v)提取；在80℃下进行提取5小时。过滤乙醇溶液，以获得上清液，其然后用蒸发器在真空下在40℃浓缩。该提取和浓缩程序重复两次。将提取溶液组合在一起并且浓缩直到体积变成初始体积的1/25。通过真空冻干，使浓缩的溶液干燥，以获得283.5g的桑树70％乙醇提取物粉末1-01。提取产率是约14.7％(w/w)。
[0279]
实施例5
[0280]
从桑树乙醇提取物分离桑皮苷a
[0281]
将来自实施例4的20g量的桑树70％乙醇提取物1-01装载在二氧化硅凝胶柱上并且以逐步施加包含线性梯度的己烷:etoac(5:1至1:5)的溶剂混合物洗脱柱，以产生八个子馏分。在八个子馏分中，第8个馏分经历rp-hplc柱(ymc-ods)5μm，c18(250x30mm)，通过注射
至制备型hplc系统(jai，lc-9104，日本)上，以uv波长330nm用水中的15％乙腈在16.2min内洗脱，以产生化合物5(rn367-35-p2，桑皮苷a)(191mg)。
[0282]
化合物5(桑皮苷a，c
26h32o14
)：apci-ms(m/z)[m+h]
+
569.58；uvλ
max
(meoh)：217.9，325.6nm；1h nmr(400mhz，dmso-d6)δppm 6.34(brs，1h)6.52(dd，j＝8.6，2.4hz，1h)6.54(d，j＝2.4hz，1h)6.57(s，1h)6.64(s，1h)6.94(d，j＝16.4hz，1h)7.22(d，j＝16.4hz，1h)7.45(d，j＝8.6hz，1h)；
13
c nmr(125mhz，dmso-d6)δppm 60.58(t，g-6’)60.62(d，g-6)69.56(d，g-4)69.63(d，g-4’73.20(d，g-2’)73.29(d，g-2)76.61(d，g-3’)76.61(d，g-3)77.00(d，g-5’)77.04(d，g-5)100.39(s，g-1’)100.76(s，g-1)102.65(d，c-2’)103.86(d，c-3)105.35(d，c-4’106.52(d，c-5)107.46(d，c-6’)117.86(s，c-1)123.47(d，c-6)126.00(d，a)127.27(d，b)139.77(s，c-1’)155.86(s，c-2)157.96(s，c-4)158.40(s，c-5’)158.92(s，c-3’)
[0283][0284]
桑皮苷a
[0285]
实施例6
[0286]
从大绿柄桑木(非洲柚木)纯化的化合物
[0287]
将使用实施例1中描述的方法获得的来自大绿柄桑木的茎干皮的有机提取物(8g)分开并且分别装载在两个预填料的闪蒸柱(120g二氧化硅，颗粒大小32-60μm，4cm x 19cm)上，然后用如实施例4中描述的梯度洗脱柱。异戊烯化的类黄酮
–
化合物6
–
分离自活性馏分之一并且鉴定为桑根酮c/d/o。
[0288]
化合物6的结构和光谱学数据如下：esims(m/z)[m-2h]-706；uvλ
max
(meoh)：265，320nm；1h nmr(500mhz，methanol-d4)ppm 1.55(s，ch3，3h)1.58(s，ch3，3h)1.82(m，ch3，3h)2.28(dd，j＝18.65，5.09hz，1h)2.39(dd，j＝17.80，5.09hz，1h)2.69(m，1h)2.94(m，1h)3.87(d，j＝6.78hz，ch，1h)4.16(br.s.，ch，1h)4.49(br.s.，ch，1h)5.19(br.s.，1h)5.45(br.s.，1h)5.64(s，1h)6.11(d，j＝2.26hz，1h)6.17(dd，j＝8.48，2.26hz，1h)6.23-6.34(m，3h)6.42(dd，j＝8.20，1.70hz，1h)6.86(d，j＝8.19hz，1h)7.21(d，j＝8.48hz，1h)8.08(d，j＝8.76hz，1h)。
[0289][0290]
实施例7
[0291]
制备各种大绿柄桑木提取物
[0292]
如下产生miliciaetoac提取物馏分7：切割5kg的干燥大绿柄桑木茎干皮，碾碎并且用约4倍体积(20l)的乙醇水溶液(v/v)(食品级，korea ethanol supplies company，korea)提取。在80℃下处理提取溶剂4小时并且过滤所得提取物，以获得用蒸发器在40℃下浓缩的上清液。上述提取程序重复两次。所得提取溶液组合在一起并且浓缩直到体积变成初始体积的1/25。然后，通过真空冻干使浓缩的溶液干燥，以获得200g的粗大绿柄桑木乙醇提取物粉末。
[0293]
在上面程序中制备的196g的粗大绿柄桑木乙醇提取物粉末悬浮在2l的蒸馏水中并且悬液与2l的正己烷强力混合，以获得正己烷可溶性馏分和水溶性馏分。收集正己烷可溶性馏分并且残留的溶液进行第二次正己烷提取。上述程序重复四次并且将所得正己烷可溶性馏分组合以及在真空下蒸发，以获得74.8g的大绿柄桑木茎干树皮的正己烷可溶性提取物7-1。
[0294]
在上面程序中制备的大绿柄桑木茎干树皮的水溶性馏分与等体积的乙酸乙酯强力混合，以获得乙酸乙酯可溶性馏分和水溶性馏分。收集乙酸乙酯可溶性馏分并且残留的溶液再次进行乙酸乙酯提取。该程序重复四次。乙酸乙酯可溶性馏分和水溶性馏分分别在真空下蒸发，以获得大绿柄桑木茎干树皮的63.9g的乙酸乙酯可溶性提取物馏分7和35.34g的水溶性提取物7-2。
[0295]
实施例8
[0296]
来自桑属植物的提取物的制备和hplc定量
[0297]
从在韩国不同地理位置的不同植物部分收集桑属样品。将干燥的植物材料粉碎成粉末。将20克桑属植物粉末与足够的硅藻土混合，以填充100ml提取槽，并且用70％乙醇/水通过使用ase 350提取器提取(提取条件：加热＝5分钟，静置＝5分钟，冲洗＝80体积，清洗＝900秒，循环＝3，压力＝1500psi，温度＝60℃)。提取之后，用蒸发器在50℃下使溶液浓缩，以产生固体提取物。
[0298]
桑属提取物中的靶组分桑皮苷a、氧化白藜芦醇、桑酮g、alban in g和桑根素用hitachi hplc系统中的luna c18反相柱(phenomenex，10μm，250mm x4.6mm)在325nm下量化。用0.1％甲酸水溶液(流动相a)和乙腈(流动相b)的二元梯度以1ml/min流速和30℃柱温度将柱洗脱。
[0299]
表1.hplc分析方法的梯度表
[0300]
时间(min)流动相a流动相b0.090108.0851535.0109035.1010038.0010038.1901045.09010
[0301]
根据实施例4产生的参照标准材料72-1(桑属70％乙醇提取物1-01)用作量化标准。以meoh中约5mg/ml浓度制备所有的提取物样品。在超声处理约15分钟之后，使样品溶液
在烧瓶中冷却至室温并且通过0.45um尼龙注射器过滤器过滤并且将20μl的样品注入柱中。
[0302]
从韩国和中国两个国家的不同地理区域收集桑属植物。在从不同地区和在不同植物年龄收集的不同品种、不同植物部分中的桑皮苷a、氧化白藜芦醇、桑酮g、albanin g和桑根素含量的hplc量化列在表2和3中。已经从桑属根皮、树根木材、细根、茎干树皮、树枝、树枝树皮、树枝木材和细枝量化活性物。在桑属叶子中检测存在少量的芪型化合物，桑皮苷a和氧化白藜芦醇。
[0303]
表2.从韩国收集的桑属中的活性化合物的量化
[0304][0305]
表3.来自中国的桑属收集的活性化合物的量化
[0306][0307][0308]
实施例9
[0309]
来自桑属根皮的提取物的hplc量化
[0310]
桑属根皮的乙醇提取物获得自中国的不同地理区域。用实施例8中描述的hplc方法量化在那些桑属提取物中的四种活性组分——桑皮苷a、桑酮g、albanin g和桑根素——的含量。如表4中显示，两种桑属提取物(me-10和me-12)不包含四种活性化合物。三种桑属提取物(me-6、me-7和me-8)不包含桑皮苷a并且非常少量的异戊烯化的类黄酮(小于存在的3种化合物总量的4％)。四种桑属提取物(me-3、me-4、me-5和me-14)的另一种包含少量的异戊烯化的类黄酮(小于存在的3种化合物总量的2％)和不同量的桑皮苷a。该实施例清晰表明在规则桑属根皮提取物中缺少芪和异戊烯化的类黄酮的富集和标准化。
[0311]
表4.来自中国的桑属提取物中活性化合物的量化
[0312]
[0313][0314]
实施例10
[0315]
制备桑树70％乙醇提取物10
[0316]
切割干燥的桑树根和根皮(93.3kg)、碾碎并且然后用约七倍体积(700l)的70％乙醇水溶液(v/v)提取；提取在100℃下进行4小时。过滤乙醇溶液，以获得上清液，其然后用蒸发器在真空下在40℃浓缩。该提取和浓缩程序重复两次。然后将提取溶液组合在一起并且浓缩直到体积变成初始体积的1/25。通过真空冻干，使浓缩的溶液干燥，以获得18.3kg的桑树70％乙醇提取物粉末10。提取产率是约19.6％(w/w)。主要活性组分含量列在实施例14的表4中。
[0317]
实施例11
[0318]
制备桑树etoac馏分11
[0319]
根据实施例10产生的桑树乙醇提取物用约两倍体积的乙醇(ep级，ducksan chemical，korea)从4kg的干燥桑树根皮提取，产生570g的桑树乙醇提取物粉末。用己烷和水分配乙醇提取物，随后用乙酸乙酯提取。通过用匀化器(ika t25d，德国)使提取溶液在15,000rpm下匀化五分钟进行提取。然后，通过离心机(beckman j-20xp，德国)在3，000rpm下(转子#jla8.1000)使良好匀化的提取溶液分离五分钟。由570g粗桑树乙醇粉末制备相应的正己烷可溶性提取物和水溶性提取物。这使得产生桑树的80.5g正己烷可溶性提取物和156g水溶性提取物。在用etoac的溶剂分配之后，通过滤纸(hyundai micro，no.20，korea)使上层(etoac可溶性层)过滤并且收集etoac溶液。用两倍体积(300l)的乙酸乙酯(ep级，ducksan chemical，korea)再提取从离心收集的残渣(沉淀材料)。在150rpm下搅拌再提取溶液2小时。然后使所得混合物过滤(hyundai micro，no.20，korea)，以获得另外的etoac提取物溶液。上述程序重复两次。使三种所得etoac提取物溶液组合并且通过蒸发器在40℃下浓缩，以获得最终etoac提取物11。从该方法获得的桑树etoac馏分11的最终量是327g。主要活性组分含量提供在表4(实施例14)中。
[0320]
实施例12
[0321]
制备桑树70％乙醇沉淀提取物12
[0322]
如下产生桑树乙醇沉淀提取物12(lot#110910-3)；切割634千克(kg)干燥的桑树根和根皮、碾碎并且用约7倍体积(3600升(l))的70％乙醇水溶液(v/v)提取；提取溶剂在80℃下处理4小时；使残渣过滤，以获得上清液，其然后用蒸发器在40℃下浓缩。上述程序重复三次。然后使提取溶液浓缩直到体积变成初始体积的约1/30。然后，使浓缩的溶液组合，以再次蒸发，以便使浓缩溶液的体积下降直到初始提取溶液的1/90体积。浓缩的溶液在室温下静置24小时(hr)，以使得分离成两层(上清液和沉淀层)。使沉淀物过滤并且通过真空冻干干燥，以获得m.alba 70％乙醇沉淀物粉末。从634kg的初始植物材料获得总共24kg的所得产品。提取产率是约3.79％(w/w)。主要活性组分含量列在表4(实施例14)中。
[0323]
实施例13
[0324]
制备桑树70％乙醇提取物(13-1)、沉淀物(13-2)和上清液(13-3)提取物
[0325]
如下产生桑树乙醇沉淀提取物：切割465kg的干燥桑树根和根皮、碾碎，和用约10倍体积(4500l)的70％乙醇水溶液(v/v)提取；提取溶剂在80℃下处理4小时；使残渣过滤，以获得上清液，其用蒸发器在40℃下浓缩。上述程序重复三次。使提取溶液浓缩直到体积变成初始体积的1/30。然后使浓缩的溶液组合并且再次蒸发，以使浓缩的溶液的体积下降直到实现初始提取溶液的1/90体积。浓缩的溶液在室温下静置24hr，以使得分离成上清液和沉淀层。然后，使沉淀层通过真空干燥，以获得12kg的桑树70％乙醇沉淀粉末13-2。来自桑属根皮的沉淀产率是约2.6％(w/w)。通过真空干燥使上清液层干燥，以获得24kg桑树70％乙醇上清液粉末13-3。上清液13-3的提取产率是约5.2％。
[0326]
通过掺混2kg的沉淀物(13-2)和4kg的上清液(13-3)获得桑树70％乙醇组合提取物(13-1)。两个桑树乙醇提取物13-1、沉淀物13-2和上清液13-3中的主要活性组分含量列在表4(实施例14)中。
[0327]
实施例14
[0328]
不同桑树提取物中活性含量的hplc量化
[0329]
桑皮苷a、氧化白藜芦醇、桑酮g、albanin g和桑根素含量的详细hplc量化方法描述在实施例8中。表4列举了如实施例10、11、12和13中制备的不同桑属根皮提取物中的活性含量。
[0330]
表5.桑属提取物中活性化合物的量化
[0331]
[0332]
实施例15
[0333]
从姜黄制备有机提取物
[0334]
将总共20克的姜黄的干燥根茎粉末装入两个100ml的不锈钢管并且用有机溶剂混合物(比例为1:1的二氯甲烷/甲醇)使用ase 300自动提取器在80℃和1,500psi的压力下提取两次。使提取物溶液过滤、收集，并且用旋转式蒸发器蒸发，以产生粗有机提取物(oe)(6.04g，30.2％产率)。
[0335]
实施例16
[0336]
姜黄有机提取物的高通量纯化(htp)
[0337]
将如实施例15中描述的姜黄有机提取物(oe，400mg)装载至预填料的闪蒸柱(2cm id x 8.2cm，25ml，10g二氧化硅凝胶)，使用具有(a)50:50etoac:己烷和(b)甲醇的独特梯度流动相的hitachi高通量纯化(htp)系统从100％a至100％b在30分钟内以5ml/min的流速洗脱。使用gilson馏分收集器，以1.9ml每孔在96深孔板中收集总共88种馏分。在低真空和离心下使样品板干燥，并且然后将干燥样品再悬浮在每孔1.5ml二甲基亚砜(dmso)中。从每个孔取一部分(100μl)并且组合(基于uv跟踪)，用于bkb1抑制试验。
[0338]
实施例17
[0339]
姜黄属提取物和其馏分的缓激肽b1放射性配体结合试验
[0340]
进行缓激肽b1(bkb1)放射性配体结合试验，以确定姜黄oe和提取物馏分对bkb1结合bkb1受体(bkb1r)的抑制活性。用改良的hepes缓冲液(ph＝7.4)中的il-1β刺激的人imr-90肺成纤维细胞的膜在存在0.9nm[3h](des-arg
10
)-缓激肽的情况下在室温下用测试样品培育60分钟。培育之后，使膜过滤并且用改良的dpbs缓冲液(ph＝7.4)冲洗五次。对样品进行闪烁计数，以确定与包含膜的bkb1受体特异性结合的数量。
[0341]
在166μg/ml的浓度下测试姜黄oe并且使用相同方法以浓度范围从400μg/ml和5ng/ml的连续稀释测定ic
50
值，以获得剂量响应曲线。显示通过姜黄oe提取物抑制bkb1结合bkb1r的数据提供在表6中。
[0342]
表6.通过姜黄oe抑制bkb1受体结合
[0343][0344]
姜黄oe显示强的bkb1结合抑制，ic
50
是约9.6μg/ml。此外，在bkb1结合试验中检测了姜黄oe的htp馏分(见图1)。htp馏分的活性曲线指示馏分11-22、34和38具有最强的bkb1受体结合抑制，平均控制百分数(poc)在10％以下。发现类黄素是与htp馏分11-22的活性相关的主要活性化合物。
[0345]
实施例18
[0346]
姜黄属化合物的bkb1和bkb2r结合活性
[0347]
如实施例17中描述的bkb1结合试验用于测试分离自姜黄提取物的姜黄素化合物(化合物11)，以及商业上购买自sigma-aldrich(c1386)的可得的姜黄素。以范围从200μm至5nm的终浓度测试姜黄素。通过非线性回归拟合(使用graphpad prizm软件)绘制结合曲线。使用cheng-prusoff算法计算ki值。另外，用与实施例17中为bkb1受体描述的那些类似但稍
微修改的方法检查姜黄素对bkb2受体结合活性的抑制。使用标准试验在下列条件下进行缓激肽放射性配体结合试验(bkb2)：
[0348]
1.试验缓冲液的组成：24mm tes，ph 6.8，1mm 1.10-邻菲咯啉，0.3％bsa。
[0349]
2.bkb2r的来源：表达重组人bkb2r的cho-k1细胞
[0350]
3.配体：[3h]-缓激肽：0.2nm。
[0351]
4.培育时间：90min rt。
[0352]
5.读数：topcount。
[0353]
在200μm至5nm范围的浓度下测试商业姜黄素(sigma，c1386)。商业姜黄素的结合曲线不符合竞争性抑制剂的质量作用定律。通过使用cheng-prusoff方程手动计算ki。姜黄素对bkb1和bkb2的抑制活性提供在表7中。
[0354]
表7.姜黄素对bkb1和bkb2的抑制
[0355][0356]
数据指示姜黄素是选择性bkb1拮抗物，因为其相比bkb2结合显示对bkb1结合活性相当更强的抑制。
[0357]
实施例19
[0358]
制备姜黄乙醇提取物19
[0359]
如下产生姜黄属乙醇提取物：粉碎20kg的干燥姜黄根茎(树根)，并且用约4倍体积(80l)的100％乙醇提取并且将提取溶剂保持在80-85℃30小时。使残渣过滤，以获得上清液，其用蒸发器在85-90℃下浓缩。然后，将提取溶液浓缩，直到体积是初始体积的1/25。通过喷雾干燥法(温度i/p 200℃和o/p 95℃)，使浓缩的溶液干燥，以获得约1kg乙醇提取物粉末19的25％红橙色姜黄属。提取产率是约5％(w/w)。
[0360]
实施例20
[0361]
姜黄属根茎提取物中姜黄素的量化
[0362]
下述分析方法用于确定姜黄根茎提取物中姜黄素的量。与c18反相柱一起使用agilent hplc/pda系统(phenomenex，usa，luna 5um，250mm x 4.6mm)，用于姜黄素和次要组分的检测和定量。纯化水(流动相a)和乙腈(流动相b)梯度中的二元0.1％乙酸用于洗脱姜黄素组分，如表8中描述。流速设置为1ml/min，流过luna c18柱，柱温度为35℃。uv检测器设置为在407nm下读取吸光度。
[0363]
表8姜黄素hplc梯度洗脱方案
[0364]
时间(min)流动相a％流动相b％0554510.0554510.1109025.0109025.1554530.05545
[0365]
量化标准-姜黄素购买自sigma-aldrich co。姜黄素的最高浓度水平是0.05mg/ml并且使用甲醇从l1(0.0031mg/ml)稀释至l5。将姜黄根茎提取物样品的浓度在容量烧瓶中调整至甲醇中的约1mg/ml并且超声处理直到溶解(约20分钟)，然后冷却至室温，充分混合并且通过0.45μm尼龙注射器过滤器过滤。接着，通过hplc量化10μl的样品，对于姜黄根茎提取物的该结果提供在表9中。
[0366]
表9姜黄根茎提取物的hplc量化
[0367]
样品姜黄素％类黄素(总)％110iwtc/6552/001/1016.3430.04210iwtc/6552/002/1014.7127.93310iwtc/6552/003/1013.0826.53
[0368]
实施例21
[0369]
制备gambir(黑儿茶)提取物21
[0370]
如下产生黑儿茶水提取物。切割100kg的黑儿茶的干燥叶子、碾碎并且用15倍体积(1500l)的70％乙醇提取并且在80℃下处理提取溶剂7小时。使所得残渣过滤，以获得上清液。上述程序重复第二次。提取上清液溶液组合在一起并且用蒸发器在46℃在真空条件下浓缩，直到体积变成初始体积的1/30。使浓缩的溶液进一步蒸发，以降低浓缩溶液的体积，直到初始溶液体积的1/90。然后，将所得浓缩的溶液在室温下静置24小时，以使得在浓缩的溶液中形成沉淀物。使沉淀物过滤并且在真空下干燥，以获得作为黑儿茶提取物粉末21的沉淀粉末。来自100kg黑儿茶的干燥叶子的产率是约6kg的提取物粉末，所以提取产率是约6％(w/w)。
[0371]
实施例22
[0372]
黑儿茶提取物的hplc量化
[0373]
下述分析方法用于确定黑儿茶叶子提取物中儿茶素的量。配备c18反相柱的agilent hplc/pda系统(phenomenex，usa，luna 5um，250mm x 4.6mm)用于黑儿茶提取物中儿茶素化合物的检测和定量。二元柱梯度用于从柱子洗脱材料。流动相a：纯化水中0.1％的磷酸，和流动相b：乙腈梯度用于洗脱(表10)。流速设置为1.0ml/min，流过luna c18柱，柱温度为35℃。uv检测器设置为读取275nm下的吸光度。
[0374]
表10 hplc分析方法的梯度表
[0375]
时间(min)流动相a流动相b0.085.015.07.085.015.012.010.090.016.510.090.016.685.015.024.085.015.0
[0376]
纯儿茶素参照样品购买自sigma-aldrich co。将参照样品溶解在meoh:0.1％h3po4(1:1)。儿茶素的最高水平浓度范围是0.5mg/ml并且使用0.1％h3po4中的50％甲醇从l1稀释至l5(0.003mg/ml)。在容量烧瓶中，将黑儿茶提取物样品的浓度调整至0.1％h3po4的50％甲醇中的2mg/ml并且超声处理直到溶解(约10分钟)，并且然后冷却至室温，充分混合并且通
过0.45μm尼龙注射器过滤器过滤。通过将20μl样品注入hplc进行hplc分析。
[0377]
表11黑儿茶提取物的hplc量化
[0378]
样品儿茶素％210zy-2012101520.0212zy-2012122418.5
[0379]
实施例23
[0380]
制备儿茶(acacia catechu)65％儿茶素提取物
[0381]
如下产生儿茶65％儿茶素提取物：将500kg的儿茶(katha)置入750l的50％乙醇中并且在室温下搅拌90min。在将500l的乙酸乙酯置入匀化的katha淤浆之后，平稳搅拌30min。使得淤浆分成两个层1hr。将乙酸乙酯层移入新瓶子，并且用水层重复分配。第1和第2乙酸乙酯层组合并且在60-62℃下浓缩直到tds 30％，并且然后喷雾干燥(温度，i/p 190℃-o/p 90℃)。从500kg的原料获得总共72.5kg儿茶提取物，儿茶素和表儿茶素总含量不小于65％。提取产率是14.5％(w/w)。
[0382]
实施例24
[0383]
来自胡椒薄荷提取物的活性化合物的分馏、纯化和鉴定
[0384]
在己烷(100ml)和水(150ml)之间分配如实施例26中制备的胡椒薄荷甲醇提取物(me)(10.6g)三次。真空干燥组合的己烷溶液，以产生2.19g的己烷提取物(he)。用乙酸乙酯(100ml)提取水性层三次。在真空下干燥组合的乙酸乙酯层，以产生1.26g的乙酸乙酯提取物(ea)。然后，用丁醇(100ml)进一步提取水性层三次，以产生1.91g的丁醇提取物(bu)。冻干剩余的水性层，以产生3.91g的水性提取物(wa)。在小鼠的乙酸诱导的腹部收缩模型中测试对于抗疼痛活性的me、he、ea、bu和wa中的每个。进一步研究分配至ea和bu层的活性化合物。
[0385]
体内活性引导的分离使得发现了三种活性化合物。通过两次注入在hplc系统l6200a上ea馏分(653.5mg)进行rp-hplc柱(phenomex)10μm luna c18(250x30mm)，开始于h2o(a)中40％meoh(b)8min内至60％b，27min内从60％至100％meoh，和最后用100％b冲洗另外15分钟，流速为20ml/min，uv波长230nm，产生化合物1(迷迭香酸)(136.3mg)。
[0386]
化合物7(迷迭香酸)：esims(m/z)[m-h]-359；uvλ
max
(meo h)：284，328.6nm；1h nmr(500mhz，meoh-d4)δppm 3.00(dd，j＝14.31，8.44hz，1h)3.09(dd，j＝14.43，4.16hz，1h)5.18(dd，j＝8.44，4.28hz，1h)6.26(d，j＝15.65hz，1h)6.61(dd，j＝7.95，1.83hz，1h)6.70(d，j＝7.83hz，1h)6.75(d，j＝1.71hz，1h)6.78(d，j＝8.07hz，1h)6.95(dd，j＝8.31，1.96hz，1h)7.04(d，j＝1.96hz，1h)7.55(d，j＝15.90hz，1h)；
13
c nmr(126mhz，meoh-d4)δppm 36.51(t，1c)73.23(d，1c)113.00(d，1c)113.81(d，1c)114.88(d，1c)115.09(d，1c)116.16(d，1c)120.38(d，1c)121.73(d，1c)126.24(s，1c)127.86(s，1c)143.84(s，1c)144.73(s，1c)145.38(s，1c)146.30(d，1c)148.30(s，1c)167.05(s，1c)172.13(s，1c)
[0387][0388]
通过rp-hplc用两次注入在相同柱上进行bu馏分(1.1g)的分离，如上述的，开始于h2o(a)中30％meoh(b)5min，15min内30％b至50％b，20min内50％至100％b，并且用100％b冲洗15分钟，流速为20ml/min，uv波长320nm，以产生化合物2(圣草次苷)(192.0mg)和化合物3(87.4mg)。
[0389]
化合物8(圣草次苷)：esims(m/z)[m-h]-595；uvλmax(meoh)：228.4，289.2，335.5nm；1h nmr(500mhz，meoh-d4)δppm 1.21(m，3h)2.76(d，j＝15.41hz，1h)3.10(m，1h)3.48(m，2h)3.63(m，3h)3.71(m，1h)3.91(m，1h)4.00(d，j＝9.54hz，1h)4.71(br.s.，2h)4.95(d，j＝6.11hz，2h)5.33(m，1h)6.19(d，j＝7.58hz，2h)6.80(br.s.，2h)6.96(m，1h)；
13
c nmr(126mhz，meoh-d4)δppm 16.53(q，1c)42.62(t，1c)66.01(t，1c)68.37(d，1c)69.90(d，1c)70.63(d，1c)70.98(d，1c)72.68(d，1c)73.23(d，1c)75.68(d，1c)76.42(d，1c)79.13(d，1c)95.70(d，1c)96.54(d，1c)99.71(d，1c)100.71(d，1c)103.55(s，1c)113.51(d，1c)114.92(d，1c)117.97(d，1c)130.11(s，1c)145.06(s，1c)145.51(s，1c)162.99(s，1c)163.51(s，1c)165.41(s，1c)197.10(s，1c)
[0390]
在大鼠的角叉菜聚糖诱导的爪水肿和疼痛敏感模型中进一步确认迷迭香酸和圣草次苷的体内活性。迷迭香酸和圣草次苷分别在200mg/kg和100mg/kg水平的剂量显示明显的抗炎性和镇痛活性。
[0391][0392]
化合物9命名为skolimoside：esims(m/z)[m-h]-593；uvλmax(meoh)：228.4，258.1，347.0nm；1h nmr(500mhz，methanol-d4)δppm 1.19(d，j＝6.11hz，3h)3.41(br.s.，1h)3.50(br.s.，2h)3.60-3.71(m，3h)3.74(dd，j＝9.54，3.18hz，1h)3.87-3.96(m，1h)4.06(d，j＝9.78hz，1h)4.72(s，1h)5.04(br.s.，1h)6.52(s，1h)6.60(s，1h)6.75(br.s.，1h)6.93(d，j＝8.07hz，1h)7.41(br.s.，2h)；
13
c nmr(126mhz，metha nol-d4)δppm 16.48(q，1c)66.07(t，1c)68.39(d，1c)69.91(d，1c)70.67(d，1c)71.01(d，1c)72.64(d，1c)73.33(d，1c)75.74(d，1c)76.40(d，1c)94.73(d，1c)99.72(d，1c)100.19(d，1c)100.68(d，1c)102.84(d，1c)105.69(s，1c)112.92(d，1c)115.48(d，1c)119.20(d，1c)122.11(s，1c)145.58(s，1c)149.76(s，1c)157.49(s，1c)161.52(s，1c)163.31(s，1c)165.54(s，1c)182.60(s，1c)
[0393][0394]
实施例25
[0395]
从胡椒薄荷制备乙醇提取物
[0396]
如下产生薄荷(胡椒薄荷)90％乙醇提取物(lot#rm604-13002):切割73.4kg的干燥胡椒薄荷、碾碎，并且用15倍体积(1100l)的90％乙醇(v/v)在85℃提取3hr。使所得残渣过滤，以获得上清液，其用真空蒸发器在40℃浓缩。将所得残渣用13倍体积(950l)的90％乙醇(v/v)在40℃第二次提取1小时并且过滤，以获得第二上清液，其用真空蒸发器在40℃浓缩。所得浓缩的滤饼在真空下干燥，以获得19.3kg的薄荷90％乙醇提取物粉末，命名为提取物25。提取产率是25.3％(w/w)。
[0397]
实施例26
[0398]
从胡椒薄荷制备甲醇和其他有机物提取物
[0399]
将干燥粉碎的薄荷叶粉末(胡椒薄荷)(21.7g)装载至两个100ml不锈钢管中并且用有机溶剂混合物(甲醇)使用ase 300自动提取器在80℃、1,500psi的压力下提取两次。自动过滤提取物溶液、收集，并且用旋转式蒸发器蒸发，以产生粗有机提取物(me 26-1)(4.48g，20.64％产率)。
[0400]
可选地，通过用甲醇提取252.3g胡椒薄荷的干燥粉碎的叶子粉末三次，每次回流一小时。使有机溶液组合并且在真空下蒸发，以提供甲醇提取物(me 26-2)40.88g，产率为16.20％。
[0401]
使用相同的程序获得类似的结果，但是有机溶剂用甲醇或乙醇替换，以分别提供甲醇提取物(me)或乙醇提取物(ee)、乙醇：h2o(7:3)提取物、乙醇：h2o(1:1)提取物、乙醇：h2o(3:7)提取物和水提取物。
[0402]
实施例27
[0403]
离体糖胺聚糖(gag)释放试验
[0404]
在处死每只动物之后立即去除来自兔子(2.5kg体重)跗关节的关节软骨并且通过sandy等(biochem.biophy acta 543:36，1978)描述的下述方法获得关节软骨外植体。简言之，在关节表面在无菌条件下外科手术暴露之后，每个关节解剖约200-220mg关节表面并且浸入完全培养基(dmem，补充有热失活的5％fbs；青霉素100u/ml；链霉素100ug/ml)。然后，用完全培养基冲洗它们数次，并且在37℃下在潮湿的5％co2/95％空气培养箱中培育1至2天，用于稳定。用基础培养基(dmem，补充有热失活的1％fbs、10mm hepes和青霉素100u/ml链霉素100μg/ml)替换完全培养基。约30mg软骨片(2
×3×
0.35mm/片)放入24孔板中并且用给定浓度的测试试剂处理。在预处理1h之后，将5ng/ml的rhil-1α添加至培养基并且在37℃下在潮湿的5％co2/95％空气培养箱中进一步培育。24h之后收集培养基，并且储存在-20℃下直到试验。
[0405]
在反应结束时培养基中硫酸化gag(例如，从蛋白聚糖释放)的量反映了关节软骨退变的量，其使用商业上可得的1，9-二甲基-亚甲基蓝方法根据制造商的说明(blyscan
tm
试验，accurate chemical and scientific corp.，westbury，new york)测定。
[0406]
实施例28
[0407]
来自桑属的纯化化合物对离体gag释放的作用
[0408]
用rhil-1α(5ng/ml)在没有或存在根据实施例3分离的纯化桑属化合物的情况下培养兔子软骨外植体，以检查对蛋白聚糖(pg)降解的保护作用。纯化化合物以浓度依赖性方式抑制rhil-1α-介导的pg降解。尤其，当与双氯芬酸处理的组比较时，桑皮苷a、氧化白藜芦醇和桑根素显示强的抑制作用。
[0409]
表12.桑属化合物对离体gag释放的作用
[0410][0411]
实施例29
[0412]
桑属提取物减少离体gag释放
[0413]
用rhil-1α(5ng/ml)在没有或存在桑属提取物的情况下培养兔子软骨外植体，以检查对pg降解的保护作用。桑属提取物以浓度依赖性方式抑制rhil-1α-介导的pg降解。所有样品与il-1α处理的组相比，显示强的作用。
[0414]
表13.桑属提取物对离体gag释放的作用
[0415][0416]
实施例30
[0417]
姜黄属和钩藤属提取物对离体gag释放的作用
[0418]
用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有来自实施例19的姜黄属提取物或来自实施例21的钩藤属提取物的情况下培养兔子软骨外植体，以检查对pg降解的保护作用。姜黄属提取物19以浓度依赖性方式降低rhil-1α-介导的pg降解，而钩藤属提取物21显示对pg降解的弱保护作用。
[0419]
表14.姜黄属和黑儿茶提取物对离体gag释放的作用
[0420][0421][0422]
实施例31
[0423]
薄荷提取物对离体gag释放的作用
[0424]
用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有来自实施例25和26的薄荷提取物的情况下培养兔子软骨外植体，以检查对pg降解的保护作用。
[0425]
表15.薄荷提取物对离体gag释放的作用
[0426][0427]
薄荷提取物以浓度依赖性方式抑制rhil-1α-介导的pg降解，虽然薄荷提取物对pg降解的作用比双氯芬酸处理的组较弱。
[0428]
实施例32
[0429]
n-乙酰基葡糖胺(nag)对离体gag释放的作用
[0430]
用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有nag的情况下培养兔子软骨外植体，以检查对pg降解的保护作用。nag以浓度依赖性方式降低rhil-1α-介导的pg降解。但是，当与双氯芬酸处理的组相比时，来自nag对pg降解的作用是微小的。
[0431]
表16.n-乙酰基葡糖胺对离体gag释放模型的作用
[0432][0433]
实施例33
[0434]
姜黄(c):桑属(m)组合物对离体gag释放的作用
[0435]
用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有姜黄属和桑属提取物混合物的情况下培养兔子软骨外植体24hr，以检查对pg降解的保护作用。分别根据实施例10和19产生来自桑属和姜黄属的植物提取物。姜黄属和桑属提取物以不同的比例组合，分别包括4:1、2:1、1:1、1:2和1:4。以四个剂量50、100、200和300μg/ml测试组合物。如表17中显示，所有的植物提取物组合物以浓度依赖性方式保护rhil-1α介导的关节软骨的降解。
[0436]
表17.桑属/姜黄属组合物对离体gag释放的作用
[0437][0438]
实施例34
[0439]
评估姜黄属(c):桑属(m)组合物对离体gag释放的协同作用
[0440]
用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有姜黄属提取物、桑属提取物或其混合物组合物的情况下培养兔子软骨外植体24hr，以检查对pg降解的保护作用的存在。分别根据实施例10和19产生来自桑属和姜黄属的植物提取物。姜黄属和桑属提取物以不同的比例组合，包括1:2和1:4。以两个剂量
–
200和300μg/ml，或以一个剂量
–
75μg/ml测试组合物，以检查组合的提取物是否协同或加和运作。以与混合组合物中那些提取物的重量含量成比例的浓度测试单个提取物组合物。
[0441]
表18.c:m组合物对单独c或m的协同作用
[0442][0443]
姜黄属和桑属提取物的组合物以浓度依赖和协同方式干扰rhil-1α-介导的pg降解。尤其，组合物1c:4m(5wt％类黄素、2.4wt％的异戊烯化的类黄酮、2.4wt％的芪)和1c:2m(8.3wt％类黄素、2wt％的异戊烯化的类黄酮、2wt％的芪)以200和300μg/ml显示协同作用。组合物1c:1m(12.5wt％类黄素、1.5wt％的异戊烯化的类黄酮、1.5wt％的芪)以75μg/ml也显示协同作用。通过使用colby公式计算协同作用值(colby，weeds 15:20，1967)。
[0444]
实施例35
[0445]
姜黄属(c):桑属(m):n-乙酰基葡糖胺(nag)组合物对离体gag释放的作用
[0446]
用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有姜黄属和桑属提取物的组合物的情况下培养兔子软骨外植体24hr，以检查对pg降解的保护作用。分别根据实施例10和19从桑属和姜黄属产生植物提取物。姜黄属和桑属提取物以1c:1m:2nag的比例与n-乙酰基葡糖胺(nag)结合。以四种剂量50、100、200和300μg/ml测试组合物。以与组合物中那些提取物的重量含量成比例的浓度测试组合物中的单个提取物。通过使用colby公式计算协同作用值(colby，weeds 15:20，1967)。
[0447]
表19.姜黄属、桑属和nag组合物的作用
[0448][0449]
如表19中所显示，植物提取物的组合物以浓度依赖性方式预防rhil-1α介导的关节软骨的降解。尤其，1c:1m:2nag组合物，与三个单独提取物相比，以300μg/ml显示了出人意料的协同作用(表20)。
[0450]
表20.c:m:nag组合物的协同作用
[0451]
样品剂量％抑制评论1c:1m:2nag300μg/ml89.6理论值1c:1m:2nag300μg/ml90.5实验结果c75μg/ml70.1个体m75μg/ml49.2个体nag150μg/ml31.8个体
[0452]
实施例36
[0453]
姜黄属(c):桑属(m):薄荷(p)组合物对离体gag释放的作用
[0454]
用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有姜黄属和桑属提取物的组合物的情况下培养兔子软骨外植体24hr，以检查对pg降解的保护作用。分别根据实施例10、19和24从桑属、姜黄属和薄荷产生植物提取物。姜黄属、桑属和薄荷提取物以1c:1m:0.5p、1c:1m:1p、1c:1m:1.5p和1c:1m:2p比例组合。以四个剂量
–
50、100、200和300μg/ml测试组合物。
[0455]
表21.c:m:p组合物对离体gag释放的作用
[0456][0457]
如表21中所显示，植物提取物的所有组合物以浓度依赖性方式预防rhil-1α诱导的关节软骨的降解。
[0458]
实施例37
[0459]
动物护理和饲养
[0460]
当动物到来时适应一周，然后随机分配至它们各自的组。cd-1小鼠(5/笼)和路易斯大鼠(3/笼)饲养在聚丙烯笼中并且通过它们尾巴上的数字单个标记。每个笼覆盖金属丝条盖(wire bar lid)和过滤顶(allentown，nj)。用指示项目号、测试品、剂量水平、组和动物数的笼卡片标记每个笼。使用harlan t7087软的玉米芯垫(cob bedding)并且每周至少更换两次。为动物提供淡水和啮齿动物咀嚼膳食#t2018(harlan teklad，370w，kent，wa)自由采食并且饲养在温度控制室(22.2℃)中，以12小时光-黑暗循环。所有的动物实验根据与护理和使用实验室动物的指导一致的协会指南进行。
[0461]
实施例38
[0462]
通过足底注射福尔马林引起的体内疼痛行为模型
[0463]
使小鼠(n＝每组6个)居住在倒置plexiglas观察室中30分钟，以使得它们适应它们的周围环境。用各个处理组口服处理动物30分钟，然后使用hamilton注射器(hamilton company，reno，nevada)足底注射福尔马林(20μl的2.5％溶液)进入受控制的小鼠的右后爪(dubuisson等，pain 4:161，1977)。立即将小鼠转移至它们单独的观察室。在40分钟内以10分钟时间块，监测和记录退缩和/或舔舐发炎的后爪的持续时间。位于室后面的镜子使得当直视不清楚时能够观察右后爪。
[0464]
实施例39
[0465]
内脏疼痛感知模型(writhing测试))
[0466]
小鼠(n＝6个每组)居住在倒置plexiglas观察室中30分钟，以使得它们适应它们周围环境。在使用26规格的针以10ml/kg腹膜内施用新鲜制备的乙酸溶液(0.9％nacl中0.7％)之前的30分钟，使动物口服施用不同剂量的处理制品，100mg/kg的布洛芬或媒介对照(丙二醇)。实验在室温下进行。挑战之后，将每个动物放回其观察室的自己的单独部分，并且在30分钟内累积计数腹部肌肉的收缩以及拉伸数(collier等，br.j.pharmacol.chemother.32:295，1968)。
[0467]
实施例40
[0468]
角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型
[0469]
通过在时间0(t＝0)足底注射角叉菜聚糖λ(sigma，st.louis，mo；生理盐水中100μl的1％[w/v])至镇静大鼠(用2.5％的异氟烷)的右后爪的趾面诱导局部炎症(gamache等，j neurosurg.65:679，1986；guay等，j.biol.chem.279:24866，2004；chou等，anesth.analg.97:1724，2003)。大鼠在程序室中适应20-30分钟，然后进行每个测量。通过测量垂直于右后爪的中心趾面施加的randell-selitto爪压力测试端的反应性评估触摸痛(allodynia)。由电子von frey麻醉度计(2390系列electrovonfrey，iitc，woodland hills，ca)自动记录迅速抽回爪表示的对施加压力的积极反应(vivancos等，braz.j.med.biol.res.37:391，2004)。在角叉菜聚糖接种之前，和其后在1hr、2hr、4hr和6hr评估机械性触摸痛。使用容积测量仪(iitc，woodland hills，ca；模型520)在时间0(角叉菜聚糖之前)，和然后在角叉菜聚糖注射之后的1hr、2hr、4hr和6hr测量爪水肿体积。动物(n＝5个每组)口服强饲阳性对照布洛芬(spectrum chemical mfg，gardena，ca)(100或200mg/kg)；在角叉菜聚糖接种后1小时给予测试品比如：100、200、300至400mg/kg各种剂量的提取物和提取物的组合以及媒介对照(丙二醇)，除非另外指出。
[0470]
实施例41
[0471]
纯化姜黄素在疼痛行为模型中的作用
[0472]
cd-1小鼠中足底注射福尔马林(2.5％)引起双阶段的疼痛响应，包括退缩、抬腿、咬住和舔舐被注射的爪。头五分钟观察到的这些行为反应是由于刺激物对感觉神经末端直接作用，其认为是由于稍后阶段的炎症。在该研究中，对于用单个口服剂量的分离自如实施例16中制备的姜黄有机提取物的姜黄素(化合物11)或炎症阶段布洛芬的动物，观察到大于50％疼痛感知的减少(表22)。在足底福尔马林注射前半小时，用姜黄素(50、100、150或200mg/kg)或布洛芬(200mg/kg)口服处理小鼠。
[0473]
表22通过姜黄素的剂量相关的疼痛敏感抑制
[0474]
[0475]
对于以200mg/kg至100mg/kg的剂量范围的姜黄素处理的小鼠观察到疼痛敏感的剂量相关的抑制。用50mg/kg和100mg/kg的姜黄素处理的动物之间疼痛抑制的水平几乎没有差异。200mg/kg姜黄素或布洛芬的疼痛抑制是统计学上显著的(表22)。此外，在用200mg/kg的姜黄素处理的小鼠中比200mg/kg的布洛芬(63.5％)观察到较大的疼痛抑制(74.6％)。
[0476]
实施例42
[0477]
β-环糊精中配制的姜黄属在疼痛行为模型中的作用
[0478]
为了增加吸收和使效力最大化，如实施例20中描述制备的姜黄属提取物与β-环糊精以各种比例一起配制并且在腹部收缩试验中测试。在腹膜内注射乙酸之前的半小时，cd-1小鼠(n＝6)用50mg/kg或100mg/kg的这些制剂或布洛芬(100mg/kg)处理(强饲)。
[0479]
表23姜黄属组合物对内脏疼痛敏感的作用
[0480][0481]
布洛芬处理的动物显示疼痛敏感56.1％的下降(表23)。除了制剂403-1(其具有最低的姜黄素和总类黄素含量)，所有其他制剂显示统计学上显著的内脏疼痛敏感的抑制(表23)。
[0482]
实施例43
[0483]
胡椒薄荷提取物在疼痛行为模型中的作用
[0484]
使用writhing动物模型筛选历史上抗炎用途的植物它们的抗疼痛活性。这些提取物中，用单个口服剂量的实施例26中描述的薄荷植物(胡椒薄荷)甲醇提取物me处理的小鼠当以300mg/kg在cd-1小鼠中施用时，显示29.8％的内脏疼痛抑制。乙酸乙酯分馏之后，与甲醇提取物相比，对于以126mg/kg施用的薄荷馏分观察到增强的、统计学上显著的抑制(即，47.2％)(表24)。对于布洛芬处理的动物，也观察到相当的抑制(即，67.6％)。
[0485]
表24.通过薄荷提取物的内脏疼痛敏感的抑制百分数
[0486][0487]
乙酸注射前半小时，cd-1小鼠(n＝6)以布洛芬(100mg/kg)或薄荷(126或300mg/kg)强饲。
[0488]
实施例44
[0489]
薄荷提取物在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中的体内效力
[0490]
角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型用于评估实施例26中描述的薄荷乙醇提取物的不同级别，所述薄荷乙醇提取物在疾病诱导之后一小时以200mg/kg强饲。如表25中可见，提取物的活性随着用于提取的乙醇的百分数下降而按比例下降。当大鼠以200mg/kg剂量被强饲以薄荷的100％乙醇提取物随后90％时，观察到对疼痛和炎症的最大抑制。结果，选择90％乙醇提取物用于随后使用。这些百分数下降在针对媒介对照分析的每个时间点是统计学上显著的。
[0491]
表25.薄荷提取物的抗疼痛和抗炎活性
[0492][0493][0494]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。在角叉菜聚糖接种之后一小时，用布洛芬(200mg/kg)、薄荷(200mg/kg)，或媒介处理路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤0.001。**与媒介相比p≤0.05。
[0495]
实施例45
[0496]
迷迭香酸在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中的效力
[0497]
记录来自腹部收缩试验和角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型的效力，随后进行活性引导的分馏和化合物分离，以确定薄荷提取物中的活性标记物化合物。迷迭香酸(ra)和圣草次苷确认为薄荷的活性标记物并且分别以200mg/kg和100mg/kg剂量在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中测试。如表26中显示，在爪水肿中，分别处理1、3和5小时之后，ra显示29.9％、35.7％和34.6％下降，和圣草次苷显示17.2％、36.0％和30.0％下降。类似地，在疼痛敏感中，分别处理1、3和5小时之后，ra显示38.9％、45.0％和30.6％下降和圣草次苷显示20.4％、36.4％和25.2％下降。分别处理1、3和5小时之后，在爪水肿中，阳性对照布洛芬显示39.5％、50.4％和46.6％下降，和在疼痛敏感中55.1％、701.3％和50.8％的下降(表26)。疼痛和炎症中测量的抑制对于ra和圣草次苷二者在每个检查的时间点是统计学上显著的，除圣草次苷处理后1小时之外。
[0498]
表26.从薄荷meoh提取物纯化的化合物的镇痛和抗炎活性
[0499][0500]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种之后一小时，用布洛芬(200mg/kg)、迷迭香酸(200mg/kg)、圣草次苷100mg/kg或媒介处理路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤0.001。
[0501]
实施例46
[0502]
角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中薄荷提取物的体内剂量响应作用
[0503]
为了确定什么剂量将诱导疼痛和炎症的最大抑制，使用角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型推导剂量响应曲线。大鼠被强饲以如实施例25中描述制备的薄荷的90％乙醇提取物，剂量范围为300mg/kg至50mg/kg。如表27中阐释，当以200mg/kg至50mg/kg的薄荷施予大鼠时，观察到疼痛和炎症下降的相关性。在该具体研究中，用300mg/kg的90％乙醇提取物薄荷处理的大鼠未显示比200mg/kg处理的大鼠更大的抑制，可能由于与更大剂量的溶解度相关的问题。
[0504]
表27.薄荷提取物25的镇痛和抗炎活性
[0505][0506]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种之后一小时，用布洛芬(200mg/kg)和90％乙醇提取物薄荷(300mg/kg，200mg/kg，100mg/kg和50mg/kg)或媒介处理雌性路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤0.001。**与媒介相比p≤0.05。
[0507]
实施例47
[0508]
桑属提取物对疼痛行为模型的作用
[0509]
writhing动物模型用于评估本公开的植物提取物的抗疼痛活性。当cd-1小鼠用25、50或300mg/kg来自实施例11的桑树的乙醇提取物单个口服剂量处理时，与媒介处理的cd-1小鼠相比，分别观察到30.7％、45.3％和48.4％的内脏疼痛抑制(表28)。
[0510]
表28.桑属提取物对内脏疼痛敏感的抑制百分数
[0511][0512]
乙酸注射之前半小时，cd-1小鼠(n＝6)被强饲以媒介(0mg/kg)或桑树(25、50或300mg/kg)。
[0513]
实施例48
[0514]
角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型对桑属提取物的剂量响应
[0515]
也通过使用角叉菜聚糖诱导大鼠爪水肿模型确认桑树的镇痛和抗炎活性。角叉菜聚糖接种之后一小时，路易斯大鼠(n＝5)被口服强饲以100、200或300mg/kg剂量的如实施例13描述的桑属乙醇提取物13-1。桑属的乙醇提取物在低至100mg/kg的两个测量中都有效。如表29中所描绘，当与媒介对照比较时，用300mg/kg处理的大鼠显示最高的疼痛抑制(48.0％
–
31.6％)和炎症抑制(53.1％
–
37.0％)。类似地，对于用200mg/kg剂量的桑属乙醇提取物13-1处理的大鼠，观察到爪水肿45.8％
–
24.6％范围的下降和34.7％
–
22.1％的疼痛下降。这些下降在每个检查的时间点是统计学上显著的。
[0516]
表29.桑属乙醇提取物13-1的镇痛和抗炎活性
[0517][0518]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种之后一小时，用布洛芬(200mg/kg)和桑树乙醇提取物13-1(300mg/kg、200mg/kg和100mg/kg)，或单独媒介处理雌性路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤0.001。**与媒介相比p≤0.05。
[0519]
实施例49
[0520]
桑属的纯的化合物和提取物在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中的效力
[0521]
基于活性引导的分馏和化合物分离；在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中评估如实施例3和5中描述的分离自桑属根皮的四种主要活性物——氧化白藜芦醇、桑皮苷a、桑酮g和桑根素它们的体内活性。角叉菜聚糖接种之后一小时，动物被口服施用以100mg/kg剂量的纯化的桑属化合物。在该研究中，包括200mg/kg剂量的桑属的etoac馏分和乙醇提取物11、13-1和13-3。如表30中可见，所有的标记物化合物当与媒介对照相比时，显示疼痛和炎症的统计学上显著的抑制。但是，当具有高活性含量提取物13-1的提取物与标记物化合物中低活性含量提取物13-3比较时，观察到百分数抑制的显著下降。结果，这些数据指示具有高含量的芪和异戊烯化的类黄酮的根皮桑属提取物可能产生最大的疼痛和炎症抑制。
[0522]
表30.桑属提取物和化合物的镇痛和抗炎活性
[0523][0524]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种之后一小时，用布洛芬(200mg/kg)、标记物化合物(100mg/kg)、13-1(剂量为200mg/kg的桑树的乙醇提取物)、13-3(剂量为200mg/kg的桑树上清液)、11(剂量为200mg/kg的桑树的etoac馏分)或媒介处理雌性路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤0.001。
[0525]
实施例50
[0526]
桑属:姜黄属组合物对角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型的效力
[0527]
当在多个动物模型中确认了姜黄属和桑属提取物的镇痛和抗炎活性，研究被设计
为评估包括这些两种提取物的混合物的组合物的活性。分别根据实施例10和19产生桑属和姜黄属的植物提取物。姜黄属和桑属提取物以不同的比例组合，包括4:1、2:1、1:1、1:2和1:4。以300mg/kg的剂量口服施用组合物1c:1m、1c:2m、2c:1m、1c:4m和4c:1m。如表31中可见，所有的组合物在所有检查的时间点显示疼痛和炎症统计学上显著的抑制。它们中，以1:1比例组合姜黄属和桑属提取物的组合物强饲的大鼠显示疼痛和炎症二者的最大抑制，其是被选择用于随后测试的组合物。
[0528]
表31.c:m组合物的镇痛和抗炎活性
[0529][0530]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种之后一小时，用布洛芬(200mg/kg)和组合物c:m(300mg/kg)或媒介处理雌性路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤0.001。**与媒介相比p≤0.05。
[0531]
实施例51
[0532]
角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中姜黄属：桑属组合物的剂量响应
[0533]
掺混比例为1c:1m的姜黄属：桑属：组合物进一步进行剂量响应研究，以确定产生最显著的疼痛和炎症抑制的剂量。为了该目的，足底角叉菜聚糖注射之后一小时，雌性路易斯大鼠(n＝5)被口服强饲剂量为100、200、300或400mg/kg的实施例50中描述的1c:1m组合物。对于所有施用的剂量，观察到疼痛和炎症的统计上显著的剂量相关的抑制，对于400mg/kg剂量观察到最高的抑制和对于100mg/kg剂量的1c:1m组合物观察到最低抑制。
[0534]
表32. 1c:1m组合物的镇痛和抗炎活性
[0535][0536][0537]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种之后一小时，用布洛
芬(200mg/kg)、组合物1c:1m(400mg/kg、300mg/kg、200mg/kg或100mg/kg)或媒介处理雌性路易斯大鼠(n＝5)。与媒介相比，*p≤0.001。
[0538]
实施例52
[0539]
评估桑属：姜黄属组合物在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中的协同作用
[0540]
使用colby的方法(colby，1967)，角叉菜聚糖诱导的爪水肿模型用于评估来自姜黄属和桑属的提取物当如实施例50中描述以1c:1m的特定比例配制在一起时可能的协同作用或出人意料的作用。用剂量为300mg/kg的1c:1m(12.5wt％类黄素、1.5wt％的异戊烯化的类黄酮、1.5wt％的芪)组合物处理的大鼠在每个分析时间点(处理后的1、3或5小时)对于炎症和疼痛敏感二者都显示比理论上计算(加和作用)更大的(协同)活性。类似地，组合物也显示比300mg/kg的相同剂量的单独施用的姜黄属或桑属提取物更大的疼痛敏感和炎症的抑制(见表33和34)。
[0541]
表33. 1c:1m混合物的镇痛和抗炎活性
[0542][0543]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种之后一小时，用布洛芬(200mg/kg)、组合物1c:1m(300mg/kg)、桑树提取物(150mg/kg或300mg/kg)、姜黄提取物(150mg/kg或300mg/kg)或媒介处理雌性路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤4 0.001。
[0544]
表34. 1c:1m混合物的镇痛和抗炎活性
[0545][0546]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖诱导爪水肿症状后1小时，大鼠(n＝5)被强饲以组合物1c:1m(300mg/kg)、姜黄属和桑属提取物(150mg/kg)和单独媒介。*c
–
姜黄属；m-桑属。
[0547]
**预期的
–
根据colby的方法计算的值＝a-b，即a＝(c+m)，b＝(cm)/100。
[0548]
￥观察的
–
当以300mg/kg口服施用组合物时观察的数据。
[0549]
实施例53
[0550]
桑属:姜黄属:薄荷组合物在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中的效力
[0551]
为增加的效力，检查具有添加的薄荷提取物的组合物1c:1m的效力。有效剂量的1c1m设置为200mg/kg并且以50、100、150或200mg/kg剂量添加薄荷提取物24，以分别产生1c:1m:0.5p、1c:1m:1p、1c:1m:1.5p和1c:1m:2p的比例。当添加的薄荷提取物24的比例从50mg/kg增加至200mg/kg时，对于组合物的镇痛和抗炎活性观察到响应的直接相关性。对于1c:1m:2p，观察到最高抑制，而对于1c:1m:0.5p记录了最低抑制。然而，所有组合物1c:1m:0.5p、1c:1m:1p、1c:1m:1.5p和1c:1m:2p显示比1c:1m更高的效力(表35)。
[0552]
表35.c:m:p和c:m组合物的镇痛和抗炎活性
[0553][0554][0555]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种一小时之后，用布洛芬(200mg/kg)、组合物1c1m0.5p(250mg/kg)、1c1m1p(300mg/kg)、1c1m1.5p(350mg/kg)、1c:1m:2p(400mg/kg)、1c:1m(200mg/kg)或媒介处理雌性路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤0.001
[0556]
实施例54
[0557]
桑属：姜黄属：n-乙酰葡糖胺(nag)组合物在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中的效力
[0558]
n-乙酰葡糖胺(nag)是关节中胶原蛋白的基础部分。通过将nag添加至桑属和姜黄属组合物1c:1m，可能提高关节护理优势，而不改变c:m组合物的抗炎和抗疼痛活性。为了检验该假设，使用角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿作为疾病模型进行研究。在该研究中，疾病诱导后一小时，用200mg/kg剂量的1c:1m或剂量为366mg/kg的相同剂量的3c:3m:5nag口服处理大鼠。166mg/kg的单独nag包括在该研究中。如表36中显示，在该模型中，nag既不增强也不抑制cm组合物的镇痛和抗炎活性。至少在该动物模型中，可得出结论，166mg/kg剂量的nag对于抑制疼痛或炎症具有很小活性至没有活性。
[0559]
表36.c:m:nag组合物的镇痛和抗炎活性
[0560][0561]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种之后一小时，用布洛芬(200mg/kg)、组合物1c1m(200mg/kg)、3c:3m:5nag(366mg/kg)、nag(166mg/kg)或单独媒介处理雌性路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤0.001
[0562]
实施例55
[0563]
桑属：姜黄属：nag组合物在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中的剂量响应
[0564]
为了进一步检查n-乙酰葡糖胺(nag)是否对于组合物cm效力具有中性作用，在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中，为600、500、400和300mg/kg的口服剂量的1c:1m:2nag设计剂量响应研究。足底角叉菜聚糖接种之后一小时，大鼠被强饲该组合物。这些剂量分别与300、250、200和150mg/kg的1c1m剂量相关。如表37中可见，所有组合物显示疼痛和炎症的统计学上显著的抑制，最高的是在600mg/kg和最低的是在300mg/kg。这些数据再次显示nag既不增强也不抑制混合姜黄属：桑属组合物的镇痛和抗炎活性。
[0565]
表37. 1c:1m:2nag组合物的镇痛和抗炎效力
[0566][0567]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种之后一小时，用布洛芬(200mg/kg)、组合物1c:1m:2nag(600、500、400或300mg/kg)或媒介处理雌性路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤0.001
[0568]
实施例56
[0569]
桑属：姜黄属：nag组合物在writhing测试中的效力
[0570]
进一步测试剂量为600mg/kg、500mg/kg和400mg/kg的组合物1c:1m:2nag缓解cd-1小鼠中通过腹膜内施用乙酸造成的内脏疼痛的能力。在该研究中，剂量为300mg/kg的1c:1m
(没有nag)和单独nag(n-乙酰葡糖胺)用作对照。在注射刺激物之后，动物立刻显示由腹部肌肉收缩构成的腹部收缩，其随后进展，并且终止于后肢与背部弓状结构二者的同时屈肌伸展。
[0571]
表38. 1c:1m:2nag组合物对内脏疼痛敏感的作用
[0572][0573]
乙酸注射之前半小时，cd-1小鼠(n＝6)被强饲以布洛芬(200mg/kg)、1c:1m:2nag(600、500或400mg/kg)、1c:1m(300mg/kg)、n-乙酰葡糖胺(nag，300mg/kg)或单独媒介。
[0574]
与媒介对照，即，96.2
±
16.3相比，对于1c:1m:2nag，在以600、500和400mg/kg的剂量口服施用之后，30分钟内观察的行为响应数分别下降至50.8
±
7.9、64.5
±
7.8和76.8
±
12.4(表53)。对于用300mg/kg的1c:1m处理的小鼠，观察到51.5
±
7.9的类似响应(表53)。但是，接收单独nag的小鼠显示91.0+18.7的行为反应。该发现指示1c:1m:2nag提供了以剂量依赖性方式的镇痛作用，并且1c:1m是c:m:nag组合物中的活性组分，而nag对于1c:1m在该模型中的镇痛活性具有最小至中性作用。
[0575]
实施例57
[0576]
桑属：钩藤属组合物在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中的效力
[0577]
如实施例10中描述的桑树乙醇提取物10(m)与实施例21中描述的黑儿茶提取物21(g)以1g:1m、1g:2m、1g:4m、2g:1m(13.3wt％黄烷、1wt％的异戊烯化的类黄酮、1wt％的芪)和4g:1m(16wt％黄烷、0.6wt％的异戊烯化的类黄酮、0.6wt％的芪)一起配制并且在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中以300mg/kg的剂量测试。为了比较，每个成分提取物，钩藤属和桑属，每个以300mg/kg的剂量口服施用。如表39中可见，当与媒介对照相比时，所有处理组(比例和单个组分)显示统计学上显著的疼痛和炎症的抑制。但是，与单独给予300mg/kg的相同剂量的钩藤属或桑属相比，对于1g:1m(10wt％黄烷、1.5wt％的异戊烯化的类黄酮、1.5wt％的芪)、1g:2m(约6.7wt％黄烷、2wt％的异戊烯化的类黄酮、2wt％的芪)和1g:4m(4wt％黄烷、2.4wt％的异戊烯化的类黄酮、2.4wt％的芪)的比例，观察到出人意料的增强(协同)活性。
[0578]
表39.gm组合物与“g”提取物21和“m”提取物10相比的镇痛和抗炎活性
[0579][0580]
数据表示为与媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种之后一小时，用布洛芬(200mg/kg)、组合物g:m(300mg/kg)、桑树(300mg/kg)、黑儿茶(300mg/kg)或媒介处理雌性路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤0.001
[0581]
实施例58
[0582]
桑属：金合欢组合物在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中的效力
[0583]
以300mg/kg的剂量在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中以1a:1m、1a:2m、1a:4m(4wt％黄烷、2.4wt％的异戊烯化的类黄酮、2.4wt％的芪)、2a:1m(13.3wt％黄烷、1wt％的异戊烯化的类黄酮、1wt％的芪)和4a:1m(16wt％黄烷、0.5wt％的异戊烯化的类黄酮、0.5wt％的芪)的比例测试包括如实施例22中描述的来自儿茶的提取物22和如实施例10中描述的桑树乙醇提取物10的组合物。为了比较，来自每个成分的提取物，a.catechu提取物22和桑树提取物10每个以300mg/kg的剂量单独口服施用。如表40中可见，当与媒介对照相比时，所有处理组(比例和单个组分)显示统计学上显著的疼痛和炎症抑制。但是，与以300mg/kg的相同剂量给予的a.catechu提取物22或桑树提取物10相比，对于比例1a:1m(10wt％黄烷、1.5wt％的异戊烯化的类黄酮、1.5wt％的芪)和1a:2m(6.7wt％黄烷、2wt％的异戊烯化的类黄酮、2wt％的芪)观察到出人意料的增强活性。
[0584]
表40.与“a”提取物22和“m”提取物10相比，a:m组合物的镇痛和抗炎活性
[0585][0586]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种之后一小时，用布洛芬(200mg/kg)、组合物a:m(300mg/kg)、桑树(300mg/kg)、儿茶(300mg/kg)或媒介处理雌性路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤0.001。
[0587]
实施例59
[0588]
基于桑属的组合物剂量相关的镇痛和抗炎活性
[0589]
如实施例57和58中描述，1g:1m、1a:2m和1a:1m混合的组合物在300mg/kg的剂量下相对于单独组分g、a或m显示更好的抗炎和镇痛活性。为了确定产生最显著疼痛和炎症抑制的组合物的剂量，以300、200和100mg/kg的剂量在模型诱导后一小时口服施用的角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中测试每个组合物。如表41中可见，对于所有测试的组合物对于超敏反应和炎症观察到明显的剂量相关的、统计上显著的抑制。
[0590]
表41. 1g:1m、1a:2m和1a:1m组合物剂量相关的镇痛和抗炎活性
[0591][0592]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖接种一小时之后，用布洛芬(200mg/kg)、组合物1g1m、1a2m或1a1m(300mg/kg，200mg/kg或100mg/kg)，或单独媒介处理雌性路易斯大鼠(n＝5)。*与媒介相比p≤0.001。
[0593]
实施例60
[0594]
在角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型中评估具体的桑属：金合欢组合物
[0595]
尽管与单个组分g、a或m相比，实施例57和58的组合物1g:1m和1a:2m在作为镇痛药和抗炎剂的效力方面更优的事实，但是使用colby的方法(colby，1967)进行使用角叉菜聚糖诱导的大鼠爪水肿模型的研究，以评估当以1g:1m和1a:2m的比例一起配制时组分可能的协同活性。当大鼠给予剂量为300mg/kg的1g:1m(10wt％黄烷、1.5wt％的异戊烯化的类黄酮、1.5wt％的芪)或1a:2m(6.7wt％黄烷、2wt％的异戊烯化的类黄酮、2wt％的芪)组合物时，观察结果在每个分析的时间点(处理后1、3或5小时)炎症和疼痛敏感都大于理论上计算值(表42)。
[0596]
表42. 1g:1m和1a:2m组合物的镇痛和抗炎活性
[0597][0598][0599]
数据表示为与单独媒介相比的百分数改变。角叉菜聚糖诱导爪水肿之后1小时，大鼠(n＝5)被强饲以组合物1g:1m或1a:2m(300mg/kg)、g(150mg/kg)、a(100和150mg/kg)、m提取物(150和200mg/kg)或单独媒介。*g-黑儿茶，m-桑树，a-儿茶。
[0600]
**期望的：根据colby的方法计算的值＝a-b，即，a＝(c+m)，b＝(cm)/100。
[0601]
￥观察的：当以300mg/kg口服施用组合物时观察到的数据。
[0602]
明显地，桑属乙醇提取物与金合欢或黑儿茶提取物的组合产生了具有出人意料的协同作用和卓越镇痛和抗炎效力的组合物。
[0603]
实施例61
[0604]
金合欢提取物对离体gag释放的作用
[0605]
用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有如实施例23制备的金合欢提取物23的情况下培养兔子软骨外植体，以检查对蛋白聚糖(pg)降解的保护作用。以四个剂量
–
25、50、100和200μg/ml测试金合欢提取物。金合欢提取物以剂量依赖性方式干扰rhil-1α-介导的pg降解。
[0606]
表43.金合欢提取物对离体gag释放的作用
[0607][0608]
实施例62
[0609]
黑儿茶(g)：桑属(m)组合物对离体gag释放的作用
[0610]
用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有黑儿茶和桑属提取物的组合物的情况下培养兔子软骨外植体24hr，以检查对pg降解的保护作用。以两个剂量-100和200μg/ml测试组合物。如表44中显示，植物提取物的所有组合物以浓度依赖性方式防止rhil-1α介导的关节软骨的降解。观察的效力的顺序是1g:2m》1g:1m》1g:4m》2g:1m》4g:1m。
[0611]
表44.g:m组合物对离体gag释放的作用
[0612][0613]
实施例63
[0614]
评估黑儿茶(g):桑属(m)组合物对离体gag释放的协同作用
[0615]
用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有黑儿茶提取物：桑属提取物混合组合物的情况下培养兔子软骨外植体24hr，以检查对pg降解可能的保护作用。根据根据上面的实施例从黑儿茶和桑属产生植物提取物。以两个剂量
–
100和200μg/ml测试组合物，以检查该组合是否显示协同作用。黑儿茶和桑属提取物的组合物以浓度依赖性方式干扰rhil-1α-介导的pg降解。通过使用colby公式(colby，1967)计算是否存在协同作用。所有五个gm组合1g:1m(10wt％黄烷、1.5wt％的异戊烯化的类黄酮、1.5wt％的芪)、1g:2m(6.7wt％黄烷、2wt％的异戊烯化的类黄酮、2wt％的芪)、1g:4m(4wt％黄烷、2.4wt％的异戊烯化的类黄酮、2.4wt％的芪)、2g:1m(13.3wt％黄烷、1wt％的异戊烯化的类黄酮、1wt％的芪)和4g:1m(16wt％黄
烷、0.6wt％的异戊烯化的类黄酮、0.6wt％的芪)在两个剂量下显示了出人意料的协同作用。
[0616]
表45.g:m组合物对离体gag释放的协同作用
[0617]
[0618][0619]
进行50、100和200μg/ml的1g:1m和1g:2m的证实研究，以验证组合的两个单个提取物的出人意料的协同作用。以与混合组合物中的那些提取物的重量含量成比例的浓度测试在混合的组合物中使用的单个提取物。黑儿茶和桑属提取物以浓度依赖性方式干扰rhil-1α-介导的pg降解。通过使用colby公式(colby，1967)计算协同作用。1g:1m和1g:2m组合物以所有三个剂量都展示了出人意料的协同作用。
[0620]
表46.g:m组合对离体gag释放的协同作用
[0621][0622]
实施例64
[0623]
姜黄属(c):黑儿茶(g):桑属(m)组合物对离体gag释放的作用
[0624]
在存在或没有姜黄属、钩藤属和桑属提取物的组合物的情况下用rhil-1α(5ng/
ml)培养兔子软骨外植体24hr，以检查对pg降解的保护作用。以两个剂量-50和100μg/ml测试组合物。以与组合物中那些提取物的重量含量成比例的浓度测试组合物中的单个提取物。如表47中显示，植物提取物的组合物以浓度依赖性方式防止rhil-1α介导的关节软骨的降解。
[0625]
表47.c:g:m组合物对离体gag释放的作用
[0626][0627]
实施例65
[0628]
金合欢(a):桑属(m)组合物对离体gag释放的作用
[0629]
用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有金合欢和桑属提取物的组合物的情况下培养兔子软骨外植体，以检查对pg降解的保护作用。以两个剂量-100和200ug/ml测试组合物。如在表48中显示，植物提取物的所有组合物防止rhil-1α介导的关节软骨的降解。
[0630]
表48.a:m组合物对离体gag释放的作用
[0631][0632]
实施例66
[0633]
评估金合欢(a):桑属(m)组合物对离体gag释放的协同作用
[0634]
用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有金合欢和桑属提取物的组合物的情况下培养兔子软骨外植体24hr，以检查对pg降解的保护作用。根据上面实施例从金合欢和桑属产生植物提取物。以两个剂量
–
50和100μg/ml测试组合物，以检查组合的提取物是否一起对软骨保护产生出人意料的协同作用。以与混合组合物中那些提取物的重量含量成比例的浓度测试组合物中单个提取物。金合欢和桑属提取物以浓度依赖性方式干扰rhil-1α-介导的pg降解。通过使用colby公式(colby，1967)计算协同作用。1a:1m(10wt％黄烷、1.5wt％的异戊烯
化的类黄酮、1.5wt％的芪)和1a:2m(6.7wt％黄烷、2wt％的异戊烯化的类黄酮、2wt％的芪)以两个剂量都表现了出人意料的协同作用。
[0635]
表49.a:m组合物对离体gag释放的协同作用
[0636][0637]
实施例67
[0638]
组合物对体内mia(碘乙酸钠)诱导的骨关节炎(oa)大鼠模型的关节保护功能
[0639]
将动物随机化并且分配至处理组，然后开始研究。在用异氟烷麻醉之后，使用26规格的针插入髌韧带进入右膝盖的关节内空间，以50μl包含1mg碘乙酸钠(sigma，st.louis，mo；lot#slbb6147v)注射大鼠。正常大鼠被注射等体积的生理盐水代替mia。用塞来考昔100mg/kg、双氯芬酸5mg/kg、(黄芩属(scutellaria)：金合欢提取物混合物)400mg/kg、1c:1m 600mg/kg和1c:1m:2nag 600mg/kg口服处理动物，一天一次，持续4周。在mia注射之前1hr施用第一样品处理。正常和对照大鼠口服给予等体积的媒介(生理盐水中的0.5％cmc)。测量体重和触摸痛，一周一次，持续4周。通过测量对垂直于右后爪的中心趾面施加的randall-selitto测试(2390系列，iitc，woodland hills，ca)尖端的反应性评估触摸痛。通过micro ct扫描(skyscan1173，belgium)，评估每个组中的三只动物的关节软骨表面和软骨下骨构造的结构改变。评估组织学改变，以确认对oa大鼠的膝关节的软骨退变的保护作用。脱钙之后，用苏木精和伊红(he)和番红精o-固绿使关节组织染色，以能够评估蛋白聚糖含量。
[0640]
实施例68
[0641]
异戊烯化的类黄酮的有机提取物
[0642]
异戊烯基查尔酮、异戊烯基黄酮、异戊烯基黄酮醇和异戊烯基黄烷酮都属于异戊烯基类黄酮。异戊烯化的类黄酮有限地分布在植物界。许多异戊烯化的类黄酮已经见于桑
科，但是它们也散布在其他科中，比如大麻科(canabaceae)、豆科(fabaceae)、楝科(meliaceae)、芸香科(rutaceae)、悬铃木科(platanaceae)、号角树科(cecropiaceae)、含羞草科(mimosaceae)、萝藦科(asclepiadaceae)、玄参科(scrophulariaceae)、苦苣苔科(gesneriaceae)、菊科(asteraceae)和姜科(zingiberaceae)。异戊烯基异黄酮更局限于豆科的亚科。
[0643]
选择报道了包含异戊烯化的类黄酮的五种不同的植物属用于提取，如表50中显示。将总共20克粉碎的每个植物的粉末装载至100ml的不锈钢管中并且用有机溶剂混合物(1:1比例的二氯甲烷/甲醇)使用ase 350自动提取器在80℃和1,500psi的压力下提取两次。自动过滤和收集提取物溶液。用旋转式蒸发器使组合的有机提取物溶液蒸发，以产生粗有机提取物(oe)。在本文所述的gag释放试验中测试八个植物的有机提取物。
[0644]
表50.来自选择植物的异戊烯化的类黄酮产率
[0645][0646]
是来自酒花(啤酒花的球果)的异戊烯化的查尔酮和黄烷酮的黄腐酚和异黄腐酚报道为该植物的主要和活性化合物。光甘草定是专门从glycyrrhiza glabra报道的主要的异戊烯化的类黄酮之一。cathayanon a是分离自大绿柄桑木的第尔斯-阿尔德加合物。这些四种异戊烯化的类黄酮获得自商业来源并且在gag释放试验中测试。
[0647]
[0648]
实施例69
[0649]
各种有机提取物对离体gag释放的作用
[0650]
以三个剂量
–
50μg/ml、100μg/ml和200μg/ml
–
在如实施例27中描述的gag释放模型中测试如之前的实施例68描述的从五个不同植物属产生的有机提取物。如表51中显示，测试的每个提取物抑制离体gag释放。尤其，来自槐属、补骨脂属、甘草属和葎草属的有机提取物显示强的软骨保护作用，如通过gag释放的减少所反映，而崖豆藤属提取物，尽管抑制gag释放，但是通过比较显示较弱的效力。
[0651]
表51.各种有机提取物对离体gag释放的作用
[0652][0653]
实施例70
[0654]
纯化的异戊烯化的类黄酮对离体gag释放的作用
[0655]
如在实施例27中描述的离体gag释放模型中，测试如实施例68中描述的纯化的四
种不同的异戊烯化的类黄酮(光甘草定，化合物14；黄腐酚，化合物13；异黄腐酚，化合物14；和cathayanon a，化合物15)。用rhil-1α(5ng/ml)在存在或没有每种纯化的异戊烯基化的类黄酮化合物的情况下培养兔子软骨外植体，以检查对软骨退变的保护作用。以四个浓度
–
6.25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml和50μg/ml测试每种纯化的异戊烯化的类黄酮。
[0656]
表52.异戊烯化的类黄酮对离体gag释放的作用
[0657][0658]
如表52中显示，所有四种异戊烯化的类黄酮以剂量依赖性方式抑制rhil-1α-介导的软骨降解。
[0659]
实施例71
[0660]
黑儿茶:桑属组合物在小鼠writhing模型中的体内抗疼痛效力
[0661]
以400mg/kg、300mg/kg和200mg/kg剂量测试以按重量计1：1比例包含黑儿茶:桑属(1g:1m)的提取物的组合物缓解在cd-1小鼠中由腹膜内施用0.7％新鲜制备的乙酸引起的内脏疼痛。腹膜内施用10ml/kg新鲜制备的乙酸溶液(0.9％nacl中0.7％)之前30分钟，cd-1小鼠(n＝6)口服强饲以布洛芬(200mg/kg)、1g:1m(400、300或200mg/kg)或媒介。在注射刺激物之后，动物立即显示由腹部肌肉的收缩组成的腹部收缩，其随后进展，并且终止于后肢与背部弓状结构二者的同时屈肌伸展。持续观察这些行为响应30分钟。
[0662]
表53. 1g:1m组合物对内脏疼痛敏感的作用
[0663][0664]
与媒介对照，即，77.4
±
18.7相比，发现通过口服施用剂量为400、300和200mg/kg的1g:1m，行为响应分别下降至42.2
±
24.0、50.5
±
17.6和65.7
±
17.2(表54)。阳性对照布洛芬显示疼痛行为25.3
±
14.3或67.4％的下降。当与媒介对照相比时，对于布洛芬和1g:1m(剂量为400mg/kg和300mg/kg)，疼痛敏感的下降都是统计学上显著的。
[0665]
实施例72
[0666]
金合欢:桑属组合物在小鼠writhing模型中的体内抗疼痛效力
[0667]
以300mg/kg、200mg/kg和100mg/kg的剂量测试包含以按重量计1:2比例掺混的金合欢:桑属的提取物的组合物(1a:2m)缓解通过腹膜内施用乙酸引起的内脏疼痛的能力。在以10ml/kg腹膜内施用新鲜制备的乙酸溶液(0.9％nacl中的0.7％)之前30分钟，cd-1小鼠(n＝6)被口服强饲以布洛芬(200mg/kg)、1a:2m(300、200或100mg/kg)或单独媒介。在注射刺激物之后，动物立刻示由腹部肌肉的收缩组成的腹部收缩，其随后进展并且终止于后肢与背部弓状结构二者的同时屈肌伸展。持续观察这些行为响应30分钟。
[0668]
表54. 1a:2m组合物对内脏疼痛敏感的作用
[0669][0670][0671]
与媒介对照，即，77.5
±
16.1相比，发现在以300、200和100mg/kg的剂量口服施用
1a:2m之后，行为响应分别下降至50.8
±
17.2、54.3
±
15.5和64.0
±
11.5(表54)。阳性对照布洛芬显示疼痛行为下降41.8
±
12.6或46.0％。当与单独媒介相比，对于布洛芬和1a:2m(以300mg/kg和200mg/kg的剂量)疼痛敏感的下降都是统计学上显著的。
[0672]
实施例73
[0673]
姜黄属：桑属组合物在佐剂诱导的关节炎(aia)大鼠模型中对疼痛和炎症的作用
[0674]
大鼠中佐剂诱导的关节炎(aia)是炎症关节病况最广泛使用的实验动物模型之一，其临床和病理学特征与许多高等动物共有的风湿性关节炎类似。其特征在于与随后关节骨和软骨的进行性、腐蚀破坏相关的多关节的慢性炎症、单核细胞浸润、关节翳形成和功能损伤(wool ey，curr.rheumatol.rev.4:277，2008；bolon等，j.biomed.biotech nol.2011:569068，2011)。
[0675]
发现大鼠中使用完全佐剂作为抗原诱导关节炎的疾病模型引起导致炎症的两个缠结阶段(intertwined phase)的免疫应答。主要反应是在接种位点部分通过cox/lox途径介导的急性炎症(在第0天至第8天)，其随后是由于针对触发与tnf-α、il1-β和nf-κb相关的细胞和体液响应的抗原的广义免疫爆发更延迟和复杂的第二系统性反应(在第9至14天)(newbould，br.j.pharmacol.chemother.21:127，1963)。所以，抑制免疫应答或促炎症途径的抗炎剂显示在该aia模型中的通过水肿或踝关节直径和疼痛敏感测量的效力。
[0676]
该佐剂诱导的大鼠关节炎模型用于评估姜黄属:桑属(c:m)组合物的抗疼痛和抗炎活性。使重150-175g的有意饲养的雌性wistar大鼠(charles river laboratories，inc.，wilmington，ma)在到来后适应一周，然后随机分配至它们各自的组。为大鼠提供淡水和啮齿动物咀嚼膳食，自由采食，同时饲养在温度控制室(22.2℃)中，以12小时光-黑暗循环。在抗原接种前一天开始处理，其中动物(n＝9)被口服强饲阳性对照布洛芬、1c:1m测试品或仅仅媒介对照(丙二醇)。在第二天，在第二处理剂量之后一小时，通过将包含液体石蜡中的5mg/ml(w/v)热杀死分支杆菌结核悬液的弗氏完全佐剂注射至镇静大鼠的右后爪的足底区域使大鼠敏化来诱导关节炎(currey，ann.rheum.dis.29:314，1970；white house等，may.med.assoc.j.129:249，1983)。
[0677]
抗炎活性
–
爪水肿测量
[0678]
在足底注射完全佐剂至右后爪之前的一天用对照或测试品开始处理。c:m组合物的抗炎作用反映在测量的爪水肿改变。用1c:1m组合物(200mg/kg、100mg/kg或50mg/kg)、布洛芬(100mg/kg)或媒介口服处理大鼠(n＝9)14天。数据表达为平均数
±
sd并且针对媒介计算p-值。使用容积测量仪(iitc，woodland hills，ca；520型)在第1天(抗原之前)，抗原注射后第3、5、7、9和13天测量爪水肿。
[0679]
用抗原刺激之后24小时，显示深红色炎症症状(包括痛敏、肿胀和充血)的aia模型在所有动物中是明显的。与媒介对照相比，用阳性对照(布洛芬)处理的大鼠显示爪水肿统计学上显著的下降，在第3、5、7、9和13天分别是28.8％、21.1％、19.4％、24.3％和32.7％。与媒介对照动物相比，用口服剂量的c:m组合物处理的动物显示爪水肿的下降在第3、5、7、9和13天分别(a)200mg/kg的剂量是24.0％、32.1％、30.6％、38.5％和48.4％，(b)100mg/kg的剂量是21.8％、29.3％、25.0％、33.7％和38.8％，和(c)50mg/kg的剂量是15.6％、17.1％、18.8％、27.1％和38.2％(表55)。这些百分数下降在每个分析的时间点是统计学上显著的。
[0680]
表55.c:m组合物对aia模型中爪水肿的作用
[0681][0682]
与任何测试组合物相比，在3天每日口服处理之后，阳性对照显示更大炎症抑制，但是对于测试组合物观察到的抑制程度随着处理天数延长至第13天增加超过阳性对照。这些结果指示c:m组合物化合物在该处理方案中可持续，其意思是较低剂量的c:m组合物可用于慢性炎症控制和处理。
[0683]
抗疼痛活性
–
触摸痛测量
[0684]
在足底注射完全佐剂至右后爪前一天，开始用对照或测试品处理。c:m组合物的抗疼痛作用由触摸痛(诱导疼痛)反映。用1c:1m组合物(200mg/kg、100mg/kg或50mg/kg)、布洛芬(100mg/kg)或媒介口服处理大鼠(n＝9)14天。数据表达为平均数
±
sd并且针对媒介计算p-值。使用randall
–
selitto测试，通过对垂直于右后爪的中心趾面施加的压力的反应性评估触摸痛(randall和selitto，arch)int'l pharmacodyn therap.133:233，1957)。由电子von frey麻醉度计(2390系列electrovonfrey，iitc，woodland hills，ca)自动记录迅速抽回爪表示的对施加的机械压力的积极反应(vivancos等，2004)。在抗原处理之前，并且然后在抗原注射之后的第3、5、7、9和13天评估机械诱导的触摸痛。
[0685]
口服施用c:m组合物和布洛芬显示疼痛敏感的明显下降。如表56中显示，当大鼠用100mg/kg的布洛芬处理时，观察到疼痛敏感的统计学上显著的下降(在第3、5、7、9和13天分别下降31.3％、39.5％、48.8％、52.5％和52.5％)。以200mg/kg的剂量口服强饲c:m组合物的疼痛敏感抑制是27.1％、38.2％、51.6％、52.8％和54.2％，100mg/kg的剂量是25.6％、34.9％、39.0％、47.6％和46.2％，和50mg/kg的剂量是21.8％、24.3％、29.0％、37.6％和40.8％(表56)。
[0686]
表56.c:m组合物对aia模型中的触摸痛的作用
[0687][0688]
这些数据显示布洛芬(阳性对照)到第3天显示最强的镇痛活性，但是100mg/kg或50mg/kg的c:m组合物其后更强。然而，与爪水肿数据一致，随着处理天数延长至第13天，以任何施用剂量的组合物的活性增加。
[0689]
抗炎活性
–
踝关节宽度测量
[0690]
在足底注射完全佐剂至右后爪的前一天开始用对照或测试品处理。c:m组合物的抗炎作用反映在测量的踝关节直径的改变。用1c:1m组合物(200mg/kg、100mg/kg或50mg/kg)、布洛芬(100mg/kg)或媒介口服处理大鼠(n＝9)14天。数据表达为平均数
±
sd并且针对媒介计算p-值。使用口袋厚度计(pocket thickness gage)(7309，mitutoyo corp.日本)在第1天(抗原之前)、抗原注射之后的第3、5、7、9和13天测量踝关节直径。
[0691]
如表57中所显示，踝关节直径的更大减小支持了c:m组合物在减轻关节中炎症的协调作用。与媒介对照处理的动物相比，踝关节直径在第3、5、7、9和13天，分别地，对于用口服剂量的200mg/kg c:m处理的动物显示43.1％、47.3％、45.5％、52.4和60.9％减小，用100mg/kg的口服剂量处理的动物显示35.9％、39.0％、39.2％、42.0％和51.9％的减小，和用50mg/kg的口服剂量处理的动物显示30.9％、32.2％、34.1％、36.5％和48.7％的减小。这些百分数减小在每个分析的时间点是统计学上显著的。与媒介对照相比，阳性对照布洛芬在第3、5、7、9和13天分别显示统计学上显著的踝关节直径37.2％、34.8％、36.8％、33.5％和44.2％的减小(表57)。
[0692]
表57.c:m组合物对aia模型中的踝关节宽度的作用
[0693][0694]
在该具体的情况下，与任何其他处理组相比，包括阳性对照布洛芬，和在所有监测的时间点，c:m组合物(200mg/kg)显示踝关节肿胀的最大抑制。事实上，用100mg/kg口服剂量的布洛芬处理的大鼠与用50mg/kg的c:m组合物处理的大鼠的抗炎作用相当。
[0695]
实施例74
[0696]
姜黄属:桑属、金合欢:桑属和黑儿茶:桑属组合物抑制cox-1和cox-2酶活性
[0697]
使用比色cox(绵羊)抑制试验试剂盒(cayman chem.，co.)测试cox抑制。简言之，将150μl的试验缓冲液、10μl的血红素、10μl的cox-1或cox-2酶和20μl的测试材料添加至96孔板。小心振荡板数秒，在25℃下培育5分钟，并且然后添加20μl比色底物溶液和花生四烯酸，以启动反应。振荡后，使反应在25℃下进行10分钟并且然后使用孔板读数器在590nm下测量每个孔的吸光度。
[0698]
表58.c:m、g:m和a:m组合物对cox-1/cox-2活性的作用
[0699][0700]
如表58中显示，c:m、g:m和a:m组合物的ic
50
值在cox-1酶活性试验中分别是40.5、12.4和20.9μg/ml，和在cox-2酶活性试验中分别是74.1、39.8和49.2μg/ml。所有样品在cox-1酶的抑制比cox-2酶的抑制显示更有力的作用，每个为剂量依赖方式。
[0701]
实施例75
[0702]
姜黄属:桑属、金合欢:桑属和黑儿茶:桑属组合物抑制5-脂氧合酶活性
[0703]
使用脂氧合酶抑制剂筛选试验试剂盒(5-loxs：potato；cayman chem.,co.)测试对5-脂氧合酶(5-lox)的作用。简言之，将90μl的5-lox酶和10μl的测试材料添加至96孔板，
小心振荡数秒，并且然后添加10μl的亚麻油酸，以启动反应。将板放置在摇床上5分钟，并且然后将100μl色原添加至每个孔，以使酶反应停止。为了使反应显色，将板放置在摇床上5分钟并且然后在490nm下使用孔板读数器测量每个孔的吸光度。
[0704]
表59.c:m、g:m和a:m组合物对5-lox活性的作用
[0705][0706]
如表59中显示，所有的样品显示比5-loxin更有力的作用，并且所有三种组合物显示剂量依赖性作用。在该5-lox酶活性试验中，c:m、g:m和a:m的ic
50
值分别是26.3、13.6和11.1μg/ml。
[0707]
实施例76
[0708]
黑儿茶:桑属组合物在单碘乙酸盐(mia)诱导的骨关节炎大鼠模型中的抗疼痛作用
[0709]
骨关节炎(oa)是退行性关节疾病，其特征在于关节疼痛和关节软骨的进行性损失，并且迄今为止，不能治愈。随着疾病发展，关节软骨中发生的生物化学改变导致合成代谢过程和分解代谢过程之间的失衡，其最终改变了总体关节结构和功能，并且导致慢性疼痛。已经开发了多个动物模型并且用于研究oa的发病机理和评估新治疗剂的效力，只是有限成功的。期望具有关节病理学强健的诱导和再现性，以及与疾病相关疼痛的动物模型，从而采用最小侵略性单碘乙酸盐(mia)诱导的oa模型。单碘乙酸盐(mia)是甘油醛-3-磷酸脱氢酶活性的抑制剂，其显示诱导软骨细胞死亡并且因此使软骨损害重现，损失了与人oa类似的蛋白聚糖基质和功能关节损伤(marker and pomonis,methods mol.biol.851:239,2012)。
[0710]
购买重约170至约230g的雄性sprague
–
dawley(sd)大鼠(6周龄)并且适应一周。疾病诱导前一天，将动物如下随机分成四组：g1(正常)、g2(媒介)、g3(双氯芬酸；10mg/kg)和g4(g:m；500mg/kg)。每组被口服强饲以它们各自的处理。在第二剂量处理之后的一小时，麻醉的大鼠被注射50μl生理盐水溶液中0.8mg的mia进入关节内袋。使用randall-salitto计一周测量疼痛敏感一次并且处理持续6周。一周测量体重一次，以计算每组各自每周的剂量。一旦体内研究结束，以改良的mankin评分体系通过使用组织病理学评估由于疾病进展和/或处理效力的关节组织的结构和细胞改变。
[0711]
表60.oa模型中g:m组合物对疼痛敏感的抑制
[0712][0713]
模型诱导后一周出现oa的基本症状之一(即，疼痛)。如表60中显示，关节内注射mia的大鼠显示不断增加疼痛敏感，如由用mia未处理的媒介对照的平均疼痛敏感值所展示的。相反，用500mg/kg剂量的g:m每天口服处理6周的大鼠在口服处理4周之后，显示疼痛敏感统计学上显著的下降。对于用1g:1m(500mg/kg)处理的大鼠分别在第4周、5周和6周观察到疼痛敏感的16.6％、40.5％和22.0％下降。双氯芬酸(阳性对照)在第5周开始显示疼痛敏感的显著下降并且在第5周和第6周，分别观察到20.8％和18.2％的百分数下降。
[0714]
实施例77
[0715]
通过黑儿茶:桑属组合物保护关节软骨
[0716]
在实施例76的大鼠模型中，也测量了关节软骨基质的完整性。与实施例76中疼痛敏感下降数据一致，出现了关节软骨基质完整性的统计学上显著的改善，如通过用剂量为500mg/kg的g:m处理的动物总的mankin评分所反映的(表61)。相反，阳性对照，双氯芬酸，尽管显示积极趋势，但是与媒介对照相比，显示结构、细胞异常和基质完整性的统计学上不显著的改变(表61)。
[0717]
表61.g:m组合物对oa模型中组织病理学评分的作用
[0718][0719]
*结构评分(0-6)：0＝正常；1＝不规则表面，包括裂开至径向层；2＝关节翳；3＝缺少表面软骨层；4＝轻微组织破坏(缺少细胞行和一些小的表面簇)；5＝裂开至钙化软骨层；6＝组织破坏(混乱的结构、簇和破骨细胞活性)
[0720]
细胞异常评分(0-3)：0＝正常；1＝细胞过多，包括小的表面簇；2＝簇，3＝细胞较少
[0721]
基质(番红精-o)染色评分(0-4)：0＝正常/稍微减小的染色；1＝径向层中染色减少；2＝区间基质中染色减少；3＝外周细胞基质中染色减少；4＝没有染色。
[0722]
实施例78
[0723]
来自姜黄属、钩藤属、金合欢和桑属的组合提取物对支持关节功能的人临床研究
[0724]
在人临床试验中，进行双盲随机安慰剂和阳性比较对照试验，以检查c-姜黄属、g-黑儿茶或a
–
金合欢和m-桑属的混合物在骨关节炎(oa)患者中的效力和安全性。研究将评估在0-10数量评分表(视觉类似物表，vas)的疼痛严重程度的改变，疼痛严重程度在womac级别的改变，和物理功能的改变和如通过womac表测量的刚性的改变。将在开始和研究结束时评估改善的客观测量，也包括通过biodex的运动的范围和六分钟内步行的距离加安全性评估。
[0725]
筛选之前，受试者必须阅读和签署irb批准的知情同意表格。研究群体将由大于18岁并且小于75岁以及医学历史确定的大体上良好健康的男性和女性受试者组成。具有怀孕可能的女性受试者在开始必须具有阴性尿妊娠检验。研究的目标是招募足够的受试者，以每个研究目的(study arm)治疗40个受试者。
[0726]
oa的明确定义，如在纳入标准中列举：男性/女性健康成年，18至75岁，包括，符合疼痛纳入标准，膝关节疼痛历史大于6月，中间或横向胫骨关节线柔软，单侧的膝疼痛在视觉类似表(vas)中平均6/10或更大，其每周很多天干扰功能，以及骨关节炎的kellgren ii级或iii级放射学改变。自愿中断使用所有的镇痛药物治疗(包括非处方[otc]止痛剂)，专门为了研究目的为研究治疗和缓解药物提供的那些除外。
[0727]
主要目的
[0728]
·
在0-10数字等级量表上疼痛严重程度的改变，在0-10cm vas上疼痛严重程度的改变
[0729]
·
在womac疼痛子表(0-100)上疼痛严重程度的改变，所有子表womac总分的改变。
[0730]
第二目标安全性评估
[0731]
·
患者对治疗应答的总体评估、医生对womac和womac的物理功能和刚性子表的治疗改善的应答的总体评估
[0732]
·
如通过活性和被动运动范围、6分钟步行测试内步行距离测量的关节功能的改变。qol：一般健康状态测量，sf-36和具体健康状态测量，womac
[0733]
安全性评估：
[0734]
·
进行完全的血液计数、肝功能测试的化学项目、pt/inr、hcg和ae评估。
[0735]
数据分析
[0736]
在该研究中，120名受试者随机均等接收产物1、产物2或安慰剂(每个40名受试者)。如果12-周研究期间内来自方案前群体的退出率是30％，每组应有约21名可分析的受试者。进行幂分析，以确定有效尺寸(产物之间效力端点的平均12-周改变的差异)，其用每组21名可分析受试者将提供80％获得p≤0.05显著结果的几率。
[0737]
用于该研究的统计设计参数是：
[0738]
·
α水平：0.05(p≤0.05认为统计上显著的)；
[0739]
·
幂：0.8(获得显著p值的80％几率)；
[0740]
·
主要虚假设：对于任何补充物的平均12-周改变将等于对于安慰剂的12-周改变
[0741]
·
备选假设：改变在产物之间不同。
[0742]
·
统计检验：分析协方差(基于非配对student t检验的幂计算)；
[0743]
·
样品大小：120名招募的受试者，每个产物组40名；
[0744]
表62.研究程序
[0745]
[0746][0747]
上述各种实施方式可被组合，以提供进一步的实施方式。本说明书中引用的或申请数据页中列举的所有美国专利、美国专利申请公开、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利公开以它们的整体通过引用并入本文。如果必要，可改进实施方式的方面，以
采用各种专利、申请和公开的概念，以提供仍进一步的实施方式。鉴于上述详细说明，可对实施方式进行这些和其他改变。
[0748]
一般而言，在随附的权利要求中，使用的术语不应解释为将权利要求限于说明书中公开的实施方式和权利要求，而是应解释为包括所有可能的实施方式，以及等同于这些权利要求的完整范围。因此，权利要求不限于本公开。