一种木犀草素在制备治疗胃癌前疾病的药物中的应用

1.本发明涉及药物新用途技术领域，具体地，本发明涉及小分子化合物木犀草素(luteolin,lut)在制备治疗胃癌前疾病的药物中的应用。


背景技术：

2.胃癌(gastric cancer,gc)是第五大常见癌症，也是全球第三大癌症死亡原因。众所周知，胃癌是一种黏膜级联变化：浅表性胃炎
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慢性萎缩性胃炎(chronic atrophic gastritis,cag)
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肠上皮化生(intestinal metaplasia,im)
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上皮内瘤变
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胃癌。这其中，两个被认为是最终恶性转化关键的肿瘤前事件对胃癌的发生至关重要。im是肠型胃癌发生的主要前体胃病变，会成倍增加肠型gc的风险；此外，伴随分泌酸的壁细胞丢失、颈部黏膜细胞增生、成熟的主细胞重编程而出现的初始化生
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解痉多肽表达化生(spasmolytic polypeptide expressing metaplasia,spem)被认为是im、上皮内瘤变和最终腺癌的潜在细胞来源。目前尚无有效针对im与spem的治疗药物，根除幽门螺杆菌对于胃癌前疾病具有积极作用，但其阻断和逆转作用尚需进一步研究。中药组方虽可改善im或spem患者的症状、阻止进一步发展，但相关药方所用药味过多、剂量偏大，需长期服用，加重患者的经济负担，同时大处方成分复杂，起效成分不明，其毒副作用也难以阐明。因此，积极从中药组方中探索高效、经济、无毒副作用的单体药物，是临床面临的现实问题。
3.木犀草素(luteolin,lut)是一种黄酮类化合物，广泛存在于金银花、荆芥、芽甘蓝、甜椒、落花生等天然植物中，具有明显的抗炎和抗癌特性，可对抗多种人类恶性肿瘤，如肺癌、乳腺癌、胶质母细胞瘤、前列腺癌、结肠癌和胰腺癌；部分吸收uva和uvb辐射来抵御紫外线辐射，减少不良的光生物效应；此外，在角化细胞和成纤维细胞以及多种免疫细胞(如巨噬细胞、肥大细胞、中性粒细胞、树突状细胞和t细胞)上也具有抗氧化和抗炎活性；可改善神经退行性疾病、脑外伤和脑卒中患者的认知功能下降，增强神经保护作用。在消化系统方面，lut通过诱导g2/m细胞周期阻滞和细胞凋亡来抑制小剂量奥沙利铂诱导的胃癌细胞的增殖，还可通过p53依赖通路诱导hct116结肠癌细胞凋亡和自噬。其可通过抑制促炎介质il-1β、il-6、il-8、il-17、il-22、tnf-α等，并调控多种信号通路发挥作用。然而目前尚无研究lut在胃癌前疾病尤其是im和spem中的防治作用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供小分子化合物木犀草素(lut)的新用途，特别是防治胃肠上皮化生(im)和解痉多肽表达化生(spem)的用途，为阻断或逆转胃癌前疾病提供一种新途径。
5.为了实现上述目的，本发明提供采用以下技术方案：
6.以上实验结果说明，lut可以在体外抑制鹅去氧胆酸(chenodeoxycholic acid，cdca)诱导的胃肠上皮化生，改善细胞的生长状态，下调肠上皮化生的指标。体内实验证实lut可防治spem的形成，注射和口服给药均具有明显效果，对其他器官无毒副作用，提示lut
可作为防治im和spem药物干预的一种新手段。
7.本发明的第一方面，提供一种lut在制备预防和/或治疗im的药物中的应用。
8.在一种实施方式中，所述的im是由胆汁酸诱导。
9.本发明的第二方面，提供一种lut在制备预防和/或治疗spem的药物中的应用。
10.在一种实施方式中，所述的spem是由他莫昔芬诱导。
11.在一种实施方式中，上述的lut给药方式为注射和口服给药均可。
12.在一种实施方式中，所述药物中，lut为唯一活性成分。
13.在一种实施方式中，所述药物中，lut与其他活性成分混合。
14.在一种实施方式中，lut的使用浓度为小于等于10μm。
15.本发明相对于现有技术获得了如下显著的进步：
16.本发明首次验证了lut能显著改善经胆汁酸干预后的胃黏膜上皮细胞状态，下调肠上皮化生特异性分子cdx2、muc2、klf4的表达。体内实验证实，lut可防治他莫昔芬诱导的spem小鼠模型，显著改善小鼠的精神状态和活动变化，显著改善小鼠的胃黏膜形态和胃组织病理，下调spem标志物tff2的表达。所用的起效剂量对正常胃黏膜上皮细胞及其他器官均无毒副作用，且验证了注射和口服两种给药方式，使lut成为防治胃癌前疾病(im、spem)的一种安全有效新手段，为逆转和阻断胃癌前疾病带来新的思路。
附图说明
17.附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
18.图1.lut分子结构图。
19.图2.lut对正常胃黏膜上皮细胞存活率的影响。共设6组不同浓度的lut，分别为：0μm、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm，检测0h、24h、48h 3个时间点细胞存活率。
20.图3.lut对胆汁酸诱导的肠上皮化生细胞模型生长状态的影响。lut浓度为10μm，干预细胞模型24h。
21.图4.lut对胆汁酸诱导的肠上皮化生细胞模型特异性分子cdx2、klf4在mrna和蛋白水平的影响。
22.图5.lut对胆汁酸诱导的肠上皮化生细胞模型特异性分子muc2在mrna和蛋白水平的影响。
23.图6.lut对spem小鼠模型胃组织形态的影响。本研究设2种给药方式(注射20mg/kg、口服40mg/kg)。
24.图7.lut对spem小鼠模型胃黏膜病理的影响。
25.图8.lut对spem小鼠模型标志物tff2表达的影响。
26.图9.lut对spem小鼠模型其他器官病理状态的影响。器官包括肝、心、脾、肾、大肠、小肠。
27.图10.三组样本主成分分析结果图。d：正常组；c：模型组；l：lut治疗组。
28.图11.差异表达基因火山图。group1：正常组；group2：模型组；group3：lut治疗组。图中横坐标为log2foldchange值，纵坐标为-log10padj或-log10pvalue，蓝色的虚线表示差异基因筛选标准的阈值线。
29.图12.差异表达基因聚类热图。d：正常组；c：模型组；l：lut治疗组。横坐标为样品名，纵坐标为差异基因fpkm归一化后的数值，颜色越红，表达量越高，越绿，表达量越低。热图中还添加了每个基因所属的染色体，基因长度以及基因的生物学类型。
30.图13.差异基因go富集分析散点图。图中横坐标为注释到go term上的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标为go term。
31.图14.差异基因kegg富集散点图。图中横坐标为注释到kegg通路上的差异基因数与差异基因总数的比值，纵坐标为kegg通路。
32.图15.差异基因rt-qpcr验证结果。
33.图16.nctd抑制胃癌细胞系ags、sgc 7901及正常胃黏膜上皮细胞ges-1的增殖情况。
34.图17.nctd结构式及干预胆汁酸诱导的胃肠上皮化生指标的表达情况。
35.图18.esculetin结构式、对ges-1增殖抑制作用及干预胆汁酸诱导的胃肠上皮化生指标的表达情况。
36.图19.formononetin对ges-1增殖抑制作用。
37.图20.formononetin结构式及干预胆汁酸诱导的胃肠上皮化生指标muc2、klf4的表达情况。
具体实施方式
38.以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。
39.实施例1体外实验
40.1.lut对正常胃黏膜上皮细胞存活率的影响
41.为了确定lut对正常胃黏膜上皮细胞的最大无毒浓度，我们选择了正常的胃黏膜上皮细胞系ges-1(本课题组实验室保存，1640培养基培养)作为研究对象。应用6组不同浓度(0、10μm、20μm、30μm、40μm、50μm)的lut(结构如图1所示，购自med chem express公司)分别处理ges-1细胞系0h、24h、48h，cck8试验检测细胞增殖，计算细胞存活率。结果如图2所示，加药前(0h)细胞存活率各组无差异，lut 10μm浓度干预24h、48h对细胞存活率均无影响，而其他浓度对细胞均产生抑制作用，说明lut 10μm浓度对正常细胞无毒副作用。
42.2.lut对胆汁酸诱导的肠上皮化生细胞模型生长状态和特异性分子表达的影响
43.根据cck-8试验的检测结果，lut 10μm的浓度并不会对细胞的增殖产生影响。故在cdca150μm浓度下处理ges-1细胞后，加入10μm浓度的lut干预24h，对比同期正常的ges-1细胞，镜下观察各组细胞的生长状态。
44.结果如图3所示，正常组(dmso)细胞生长状态良好，细胞形态规则，呈梭形，排列整齐，呈散在性生长，模型组(cdca)细胞生长状态较差，呈细长的三边形、多角形或纺锤形，并伴有伪足形成，细胞极性丧失、排列紊乱，药物干预组(cdca+lut)细胞生长状态、细胞形态、排列均有较大程度的恢复。
45.随后，我们采用rt-qpcr、western blot及免疫荧光技术在mrna和蛋白水平检测细胞肠化特异性分子cdx2、klf4、muc2的表达。结果如图4-5所示，经lut 10μm干预细胞后，cdx2、klf4、muc2在mrna和蛋白水平均有明显的下调，差异具有统计学意义。
46.实施例2体内实验
47.将c57bl/6小鼠(spf级，雄性，6-8周龄，由北京大学医学部实验动物科学部提供)随机分为4组，分别为正常组、spem模型组、lut治疗组(注射)、lut治疗组(口服)，每组6只，lut治疗组以腹腔注射(20mg/kg，每日1次)和口服(40mg/kg，每日1次)两种方式给予lut干预，连续7天，后除正常组外，其他三组采用他莫昔芬(tamoxifen,tmx)诱导spem小鼠模型(5mg/20g，每日1次，连续腹腔注射3天)，处死取胃组织进行he染色，免疫组化检测各组小鼠tff2的表达，同时留取肝、心、脾、肾、大肠、小肠组织，完成he染色。
48.肉眼观察胃黏膜形态，结果如图6所示，正常组小鼠鼠后胃胃黏膜厚度均匀，黏膜光滑有光泽，可见规则排列黏膜皱襞；模型组小鼠后胃胃黏膜厚度变薄，局部黏膜发白，光泽度差，黏膜皱襞排列不规则；lut治疗组(注射和口服)小鼠胃黏膜颜色、光泽度、皱襞排列均有所恢复。病理及免疫组化结果显示，模型组胃体腺壁细胞减少，表现为假幽门腺化生，胃体腺中底部的tff2表达增加，而lut治疗组(注射和口服)壁细胞数量增加，胃体部未见假幽门腺化生，胃体腺中底部的tff2表达不明显，如图7-8。其他器官he结果如图9所示，肝、心、脾、肾、大肠、小肠组织病理无异常，表明lut给药剂量对其他器官无毒副作用。
49.实施例3lut作用机制研究
50.为充分印证lut的治疗效果，我们对lut的作用机制进行了探索，同样采用cdca 150μm浓度下处理ges-1细胞后，加入10μm浓度的lut干预24h，对比同期正常的ges-1细胞，即分组为正常组(dmso)、模型组(cdca)、治疗组(cdca+lut)，通过转录组测序技术筛选差异基因，进行go功能富集分析和kegg通路富集分析。结果如图10-14所示，组间样本分散，组内样本聚合，三组共同的差异基因富集到胆汁酸和胆汁盐的运输、胞内运输、醛缩酮还原酶(nadp)活性、类维生素a代谢过程、细胞分化等，其机制可能涉及糖脂代谢、癌症的中心碳代谢、jak-stat信号通路等。通过rt-qpcr验证关键分子，结果如图15所示，jak-stat信号通路中ifnl1、il12rb2、tyk2分子经lut干预后明显下调，与细胞增殖相关的分子pappa2、细胞分化相关分子akr1c1、胆汁酸跨膜转运蛋白slco2b1经lut干预后亦明显下调，表明lut发挥的作用机制之一可能是通过ifnl1/il12rb2/tyk2途径影响胆汁酸跨膜转运活性并调控细胞生长、分化。
51.以上实验结果说明，lut可以在体外抑制cdca诱导的胃肠上皮化生，改善细胞的生长状态，下调肠上皮化生的指标。体内实验证实lut可防治spem的形成，注射和口服给药效果均良好，对其他器官无毒副作用，此外，lut在防治胃癌前疾病的作用机制之一可能是通过ifnl1/il12rb2/tyk2途径影响胆汁酸跨膜转运活性进而调控细胞生长、分化。提示lut可作为防治im和spem药物干预的一种新手段。
52.实施例4对比实验
53.为了探究胃癌与胃癌前疾病的治疗是否能使用相同的药物，我们进一步选择了3种用于治疗胃癌的化合物来进行如下实验验证(以下实验均在药物对正常胃黏膜上皮细胞无较大损伤的浓度下进行)：
54.一、去甲斑蝥素(norcantharidin，nctd)
55.去甲斑蝥素(norcantharidin，nctd)药品说明中明确记载该药物适用于食管癌、胃和贲门癌等。我们的实验同样证明nctd可明显抑制胃癌细胞系ags和sgc 7901的增殖，如图16a、16b所示。随后，我们检测了nctd抑制正常胃黏膜上皮细胞(ges-1)的增殖情况，发现损伤较小的浓度为10μm，如图16c所示，该浓度即最大有效无毒浓度。我们选用这个浓度并按照前述方法和实验条件，进行干预胆汁酸诱导的胃肠上皮化生。
56.结果显示，nctd干预胆汁酸诱导的胃肠上皮化生后，肠上皮化生指标cdx2、muc2、klf4在mrna水平并没有下降(图17b、17c、17d)，muc2表达在蛋白水平亦没有下调(图17e)。由此可以说明，nctd并不能抑制胆汁酸诱导的胃肠上皮化生。
57.二、七叶苷原(esculetin)
58.七叶苷原(esculetin)文献报道对胃癌有抗肿瘤作用。故我们采用esculetin干预ges-1，根据cck-8结果找到最大无毒浓度，即50μm(图18a)，故后选用这个浓度并按照前述方法和实验条件，进行干预胆汁酸诱导的胃肠上皮化生。
59.结果显示，esculetin干预胆汁酸诱导的胃肠上皮化生后，肠上皮化生关键指标cdx2、muc2在mrna水平并没有下调，只有klf4有所下调，如图18b所示，说明esculetin并不能抑制胆汁酸诱导的胃肠上皮化生。
60.三、芒柄花黄素(formononetin)
61.文献报道芒柄花黄素不仅对胃癌有抗肿瘤作用，对胃溃疡也有治疗作用。故我们采用formononetin干预ges-1，根据cck-8结果找到最大无毒浓度，即160μm(图19)，故后选用这个浓度并按照前述方法和实验条件，进行干预胆汁酸诱导的胃肠上皮化生。
62.结果显示，formononetin干预胆汁酸诱导的胃肠上皮化生后，肠上皮化生指标muc2在蛋白水平并没有下调，klf4在mrna水平亦没有下调(图20)，说明formononetin并不能抑制胆汁酸诱导的胃肠上皮化生。
63.显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。