一种猪流行性腹泻亚单位疫苗及其制备方法和应用

本发明涉及疫苗制剂，具体涉及一种猪流行性腹泻亚单位疫苗及其制备方法和应用。

背景技术：

1、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，pedv)属于冠状病毒科冠状病毒alphacoronavirus属，是猪流行性腹泻(porcine epidemic diarrhea，ped)的病原体。该疾病具有发病快、传染性强、死亡率高的特点，并以急性水样腹泻、呕吐和脱水为主要症状。目前，pedv在全球养猪业中仍普遍存在，严重影响畜牧业健康发展，使得pedv等冠状病毒的致病机制及其防控成为研究人员关注的重点。

2、接种疫苗是目前防控ped的主要手段之一。目前市面上售卖的猪流行性腹泻疫苗主要都是传统的pedv灭活疫苗和弱毒疫苗。pedv灭活疫苗是通过加热或者化学试剂使pedv活病毒失活并配合佐剂使用的一种疫苗。灭活疫苗安全性更高且易于产业化。但是，在病毒灭活过程中，抗原的免疫原性可能会有一定损伤，灭活疫苗存在免疫持续期短、需要多次免疫等局限，通常需要多次免疫。与灭活疫苗相比，减毒疫苗免疫原性更强，通常单次免疫就可产生足够的免疫保护。但是，减毒疫苗最大的危害是存在退化为野生型毒株的风险，因此限制了减毒疫苗的适用性。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种猪流行性腹泻亚单位疫苗及其制备方法和应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的疫苗具有安全性高、免疫原性好、批次间稳定、生产成本低等优点，能够用于防治猪流行性腹泻。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种重组猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗，所述亚单位疫苗包括如下任一项所示的组合：

4、(1)s蛋白和药学上可接受的免疫佐剂；

5、(2)s1蛋白和药学上可接受的免疫佐剂；

6、(3)coes三聚体和药学上可接受的免疫佐剂。

7、进一步地，所述s蛋白的氨基酸序列如seq id no.1所示；所述s1蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述coes三聚体的氨基酸序列如seq id no.3所示。

8、进一步地，所述免疫佐剂为m401佐剂，所述s蛋白、所述s1蛋白和所述coes三聚体分别按照体积比1:1与所述m401佐剂混合制备亚单位疫苗；所述s蛋白、所述s1蛋白和所述coes三聚体的浓度均为100μg/ml。

9、进一步地，所述免疫佐剂为m103佐剂，所述s蛋白、所述s1蛋白和所述coes三聚体分别按照质量比1:1与所述m103佐剂混合制备亚单位疫苗；所述s蛋白、所述s1蛋白和所述coes三聚体的浓度均为100μg/ml。

10、本发明还提供了所述亚单位疫苗的制备方法，包括如下步骤：

11、(1)利用编码s蛋白、s1蛋白和coes三聚体的基因构建重组表达载体；

12、(2)将所述重组表达载体转入真核细胞表达，分别获取s重组蛋白、s1重组蛋白以及coes三聚体重组蛋白；

13、(3)将s重组蛋白、s1重组蛋白以及coes三聚体重组蛋白分别与佐剂混合，室温搅拌获取亚单位疫苗。

14、进一步地，步骤(2)所述真核细胞为哺乳动物细胞。

15、本发明还提供了所述亚单位疫苗在制备治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

16、本发明公开了以下技术效果：

17、本发明通过将表达pedv s蛋白、s1蛋白以及多个截短片段的功能表位(ntd、coe和b细胞表位)的基因串联蛋白，并进一步添加fd结构域，构建真核表达质粒，通过真核表达系统高效表达重组蛋白，利用该真核表达系统表达的重组蛋白纯化工艺简便，产量高，便于大规模生产。

18、本发明利用hek 293f悬浮表达系统得到的重组蛋白制备了亚单位疫苗，通过实验验证该疫苗具有安全性高、免疫原性好、批次间稳定、生产成本低，能够诱导小鼠和仔猪产生良好的免疫反应等优点，可以有效地预防或治疗猪流行性腹泻。

技术特征：

1.一种重组猪流行性腹泻病毒亚单位疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗包括如下任一项所示的组合：

2.根据权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述s蛋白的氨基酸序列如seq idno.1所示；所述s1蛋白的氨基酸序列如seq id no.2所示；所述coes三聚体的氨基酸序列如seq id no.3所示。

3.根据权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为m401佐剂，所述s蛋白、所述s1蛋白和所述coes三聚体分别按照体积比1:1与所述m401佐剂混合制备亚单位疫苗；所述s蛋白、所述s1蛋白和所述coes三聚体的浓度均为100μg/ml。

4.根据权利要求1所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述免疫佐剂为m103佐剂，所述s蛋白、所述s1蛋白和所述coes三聚体分别按照质量比1:1与所述m103佐剂混合制备亚单位疫苗；所述s蛋白、所述s1蛋白和所述coes三聚体的浓度均为100μg/ml。

5.一种如权利要求1-4任一项所述的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述真核细胞为哺乳动物细胞。

7.一种权利要求1-4任一项所述亚单位疫苗在制备治疗猪流行性腹泻的药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种猪流行性腹泻亚单位疫苗及其制备方法和应用，属于疫苗制剂技术领域。本发明公开的亚单位疫苗包括：(1)S蛋白三聚体和药学上可接受的免疫佐剂；(2)S1蛋白三聚体和药学上可接受的免疫佐剂；(3)COEs三聚体和药学上可接受的免疫佐剂。本发明的亚单位疫苗免疫小鼠和仔猪后能够产生较高水平的IgG抗体和中和抗体滴度，淋巴细胞比例和淋巴细胞中IFN‑γ、IL‑4浓度均表现出显著升高，表明亚单位疫苗具有较好的免疫效果。

技术研发人员：李彬,范宝超,任丽莉,郭玮璐,李澧,宋旭,赵淑庆,张雪,钱嘉莉,郭容利,张雪寒,朱雪蛟,李基棕,周金柱
受保护的技术使用者：江苏省农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/13