1.本发明属于水产养殖
技术领域：
：，具体涉及促黄体素释放激素(lhrh-α)在制备罗非鱼卵巢损伤修复的药物中的应用。
背景技术：
：：2.随着我国现代工业化的迅猛发展，重金属污染问题日益严重。工业废弃物带来的重金属残留，经由水和土壤等进入动植物体内，再通过食物链系统层层传递，逐渐进入人体，对人类健康造成威胁1.。作为水生态系统中的重要组成部分，鱼类处于食物链的高端，对水体中的重金属污染十分敏感2.。目前对重金属污染的研究主要集中在重金属污染物在鱼体内的富集和对生理活动影响方面[3-6]，环境中的复合重金属暴露对养殖鱼类的生理毒性和种群繁育的具体影响，还不甚清楚，特别是鱼类在多种重金属复合水相暴露时对卵巢的损伤及修复研究较少。[0003]铜和镉是广西壮族自治区大部分罗非鱼主产区养殖水域中主要存在的两种重金属污染物[7]。铜(cu)是所有生物体必需的微量营养素，在许多生物过程中发挥着关键作用，包括抗氧化和细胞增殖等[8-9]。然而，过量的铜则会对鱼类的正常生长发育产生不利影响[10-12]。与之相反，cd对鱼类来说则完全是一种非必需元素，也是环境中毒性最强的重金属之一[13]。鱼体内过量积累的cd会产生一系列不利影响，对鱼类的代谢和免疫系统产生毒性[14]。此外，镉会严重影响鱼类的生殖轴(hpg)调控[15]，抑制血清中的激素水平[16]。已有研究表明：铜镉复合暴露会在鱼体内发生相互作用，对鱼类的生殖功能产生大于加和的损伤[17]。过量摄入的铜和镉在鱼体内通过增加卵母细胞的闭锁来降低卵巢的生殖能力，且显著影响鱼体雌激素的合成和受体的转录[18]。故而，利用注射激素类药物弥补鱼体在铜、镉复合水相暴露过程中的激素缺口，修复铜镉复合暴露鱼类的卵巢损伤具有可行性的。[0004]雌激素类药物根据来源的不同，主要分为人工合成和天然来源两种。人工合成的激素类药物主要有雌二醇(e2)、人绒毛膜促性腺激素(humanchorionicgonadotropin，hcg)、促黄体素释放激素(luteinizinghormone-releasinghormone，lhrh-α)等。17β-e2即雌激素，注射17β-e2可通过反馈作用调节金钱鱼下丘脑中部分性类固醇激素合成通路相关基因的表达[19]，并可直接诱导罗非鱼体内卵黄蛋白原vtg的产生[20]，具有促卵巢发育、促卵母细胞成熟的作用。同样，人绒毛膜促性腺激素和促黄体素释放激素分别是鱼体内促黄体生成素释放激素(lrh)和促性腺激素释放激素gnrh的类似物。lrh是促性腺激素gth的一种，gth和gnrh通过与其在性腺中的受体相互作用，调节性腺类固醇的生成和发育，导致性腺的最终成熟[21]。体内注射hcg和lhrh-α均可以诱导鱼类卵巢的发育和卵母细胞的成熟[22-23]。天然来源的激素也被称作植物雌激素。植物雌激素由于与雌二醇结构相似，可以与雌激素受体(er)结合从而发挥雌激素样作用[24]。香豆雌酚是一种效用最明显的植物雌激素，西伯利亚鲟鱼经腹腔注射一定剂量的香豆雌酚可有效诱导其体内卵黄蛋白的产生[25]。证实植物雌激素同样具有鱼人工合成激素类似的促卵母细胞成熟功能。[0005]针对广西罗非鱼主养区养殖水域中主要存在的铜、镉污染，课题组前期研究了罗非鱼在铜、镉水相暴露后在各组织的蓄积情况和对卵巢的损伤，发现铜、镉能在罗非鱼体内富集并对卵巢产生一定的损伤。但目前针对罗非鱼铜、镉水相复合暴露造成的卵巢损伤进行修复的研究鲜见报道。[0006]参考文献：[0007][1]马挺军,林炳荣,贾昌喜.再生水养殖鱼体内重金属残留及食用风险分析[j].中国农学通报,2010,26(5):332-336.[0008][2]孔祥臻,何伟,秦宁,等.重金属对淡水生物生态风险的物种敏感性分布评估[j].中国环境科学,2011,31(9):1555-1562.[0009][3]wangx,satot,xingb,etal.healthrisksofheavymetalstothegeneralpublicintianjin,chinaviaconsumptionofvegetablesandfish[j].scienceofthetotalenvironment,2005,350(1):28-37.[4]cheungkc,leunghm,wongmh.metalconcentrationsofcommonfreshwaterandmarinefishfromthepearlriverdelta,southchina[j].archivesofenvironmentalcontaminationandtoxicology,2008,54(4):705-715.[0010][5]omarwa,salehys,mariem-as.integratingmultiplefishbiomarkersandriskassessmentasindicatorsofmetalpollutionalongtheredseacoastofhodeida,yemenrepublic[j].ecotoxicologyandenvironmentalsafety,2014,110：221-231.[0011][6]pandeys,parvezs,ansarira,etal.effectsofexposuretomultipletracemetalsonbiochemical,histologicalandultrastructuralfeaturesofgillsofafreshwaterfish,channapunctatebloch[j].chemico-biologicalinteractions,2008,174(3):183-192.[0012][7]alimb,tripathird,raiun,etal.physico-chemicalcharacteristicsandpollutionleveloflakenainital(up,india):roleofmacrophytesandphytoplanktoninbiomonitoringandphytoremediationoftoxicmetalions[j].chemosphere,1999,39(12):2171-2182.[0013][8]王志芳.广西罗非鱼主产区养殖池塘的重金属和抗生素检测及风险评价[d].广西大学,2018.[0014][9]gaetkelm,chow-johnsonhs,chowck.copper:toxicologicalrelevanceandmechanisms[j].archivesoftoxicology,2014,88(11):1929-1938.[0015][10]clara,balsano,cristiana,etal.iscopperanewtargettocounteracttheprogressionofchronicdiseases？[j].metallomics,2018,10(12):1712-1722.[0016][11]shawbj,handyrd.dietarycopperexposureandrecoveryinniletilapia,oreochromisniloticus[j].aquatictoxicology,2006,76(2):111-121.[0017][12]amshokre.effectofcopperonhematological,biochemicalchangesandreproductivehormonesoftheniletilapiaoreochromisniloticus[j].egyptianjournalofaquaticbiologyandfisheries,2020,24(2):1-18.ofsteroidbiochemistryandmolecularbiology,1991,38(3):293-299.技术实现要素：[0031]有鉴于此，本发明的目的在于提供一种lhrh-α在制备罗非鱼卵巢损伤修复的药物中的应用，对重金属胁迫罗非鱼卵巢的恢复促进效果。[0032]本发明提供了lhrh-α在制备罗非鱼卵巢损伤修复的药物中的应用。[0033]优选的，所述罗非鱼卵巢损伤是由重金属污染引起的。[0034]优选的，所述重金属包括铜和镉。[0035]优选的，所述罗非鱼卵巢损伤修复包括提升血清中激素和卵黄蛋白原含量和提高卵巢中性激素相关基因表达。[0036]优选的，所述血清中激素包括gnrh、gth和17β-e2。[0037]优选的，所述卵巢中性激素相关基因包括cyp11a1、cyp17、cyp19、17β-hsd和3β-hsd。[0038]本发明提供了雌激素类物质在提高罗非鱼体重中的应用。[0039]优选的，所述雌激素类物质包括雌二醇、人绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素和香豆雌酚中的一种或几种。[0040]本发明提供了一种促进罗非鱼生长的药物，包括雌激素类物质和药学上可接受的辅料，所述雌激素类物质包括雌二醇、人绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素和香豆雌酚中的一种或几种。[0041]本发明提供了lhrh-α在制备罗非鱼卵巢损伤修复的药物中的应用。本发明实施例以雌性吉富罗非鱼为实验动物，构建铜、镉复合水相暴露后药物修复的鱼类模型，评价四种激素类药物对铜、镉损伤罗非鱼卵巢的修复效果，雌二醇、人绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素和香豆雌酚均对重金属胁迫罗非鱼卵巢的恢复有促进作用，其中卵巢重金属含量检测、激素水平检测和qrt-pcr分析表明，lhrh-α对重金属胁迫罗非鱼卵巢的恢复促进效果较佳。[0042]本发明提供了一种促进罗非鱼生长的药物，包括雌激素类物质和药学上可接受的辅料，所述雌激素类物质包括雌二醇、人绒毛膜促性腺激素、促黄体素释放激素和香豆雌酚中的一种或几种。实验证明，注射激素类药物能够促进铜镉污染的罗非鱼体重上升。附图说明[0043]图1为罗非鱼体重和g.s.i指数的变化，其中a:罗非鱼体重的变化；b：罗非鱼g.s.i指数的变化；*：与同一时间段内的空白对照组相比差异显著(p《0.05)；#：与同一时间段内的阴性对照组相比差异显著(p《0.05)；[0044]图2为罗非鱼卵巢重金属含量的变化，a:罗非鱼卵巢cu含量的变化；b：罗非鱼卵巢cd含量的变化；*：与同一时间段内的空白对照组相比差异显著(p《0.05)；#：与同一时间段内的阴性对照组相比差异显著(p《0.05)；[0045]图3为罗非鱼血清激素含量的变化，其中a:罗非鱼血清gnrh含量的变化；b：罗非鱼血清gth含量的变化；c:罗非鱼血清e2含量的变化；d：罗非鱼血清vtg含量的变化；*：与同一时间段内的空白对照组相比差异显著(p《0.05)；#：与同一时间段内的阴性对照组相比差异显著(p《0.05)；[0046]图4为罗非鱼卵巢性激素相关基因mrna水平表达的变化，其中a:罗非鱼卵巢cyp11a1的mrna水平表达的变化；b：罗非鱼卵巢cyp17的mrna水平表达的变化；c:罗非鱼卵巢cyp19的mrna水平表达的变化；d：罗非鱼卵巢17β-hsd的mrna水平表达的变化；e：罗非鱼卵巢3β-hsd的mrna水平表达的变化*：与同一时间段内的空白对照组相比差异显著(p《0.05)；#：与同一时间段内的阴性对照组相比差异显著(p《0.05)。具体实施方式[0047]本发明提供了lhrh-α在制备罗非鱼卵巢损伤修复的药物中的应用。[0048]在本发明中，所述罗非鱼卵巢损伤优选是由重金属污染引起的。所述重金属优选包括铜和镉。[0049]在本发明中，所述罗非鱼卵巢损伤修复优选包括提升血清中激素和卵黄蛋白原含量和提高卵巢中性激素相关基因表达。所述血清中激素优选包括gnrh、gth和e2。所述卵巢中性激素相关基因优选包括cyp11a1、cyp17、cyp19、17β-hsd和3β-hsd。[0050]本发明提供了雌激素类物质在提高罗非鱼体重中的应用。[0051]在本发明中，所述雌激素类物质优选包括e2、hcg、lhrh-α和香豆雌酚中的一种或几种。所述提高罗非鱼体重是暴露在铜和镉污染的水相中。所述水相中cu2+的浓度为300μg/l，cd2+浓度为100μg/l。罗非鱼本发明实施例证明与注射pbs液受铜镉污染的罗非鱼相比，e2、hcg、lhrh-α和香豆雌酚均能不同程度提高罗非鱼的体重，且呈显著性差异。[0052]本发明提供了一种促进罗非鱼生长的药物，包括雌激素类物质和药学上可接受的辅料，所述雌激素类物质包括e2、hcg、lhrh-α和香豆雌酚中的一种或几种。[0053]在本发明中，所述药物优选为注射剂。所述辅料优选为生理盐水。当仅含有一种活性成分时，所述药物中，所述e2的浓度优选为2.5～10μg/g体重，更优选为8μg/g体重；所述hcg的浓度优选为0.6～1.5iu/g体重，更优选为1.0iu/g体重；lhrh-α的浓度优选为0.05～0.20μg/g体重，更优选为0.15μg/g体重；所述香豆雌酚的浓度优选为0.025～0.10μg/g体重，更优选为0.05μg/g体重。[0054]本发明对所述药物的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的注射剂型药物的制备方法即可。所述药物的使用方法为，当药物中仅含一种活性成分时，所述e2的注射剂量为10μg/g，hcg的注射剂量为1.5iu/g，lhrh-α的注射剂量为0.20lu/g，香豆雌酚的注射剂量为0.10mg/g。[0055]下面结合实施例对本发明提供的lhrh-α在制备罗非鱼卵巢损伤修复的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。[0056]实施例1[0057]雌激素类物质对铜镉污染引起的罗非鱼损伤的影响[0058]1材料与方法[0059]1.1试验材料[0060]实验用鱼为5月龄的吉富罗非鱼雌鱼，来源于广西水产科学研究院的国家级罗非鱼良种场(广西南宁)，平均体长(15.38±2.13cm)、平均体重(110±13.84g)。所用饲料购于百洋产业投资集团股份有限公司生产的罗非鱼全价膨化配合颗粒，每天投喂量为鱼体重的1～1.5％，实验水温为自然温度(25～32℃)。[0061]cuso4·5h2o(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司，cdcl2·2.5h2o(分析纯)购于天津市大茂化学试剂厂。[0062]1.2实验方法[0063]将挑选出的雌罗非鱼在曝气的清水中驯养14d。驯养期间，每天喂食2次，每次投放饲料量为鱼体重的1～1.5％。[0064]整个实验期分成二个阶段：铜、镉水相联合暴露阶段(30d)和修复阶段(7d)，合计37天。[0065]水相联合暴露阶段：将实验鱼分成二组，空白对照组50尾，水相暴露组300尾。空白对照组所用的水为曝过气的自来水，水相暴露组水体中的cu2+浓度为300μg/l，cd2+浓度为100μg/l。每天更换三分之一的重金属溶液并采用虹吸法除去罗非鱼的代谢产物和剩余饵料。[0066]修复阶段：将铜和镉水相联合胁迫处理30d的罗非鱼分成六组，分别注射pbs(阴性对照组)、10μg/g罗非鱼体重的二甲基亚砜dmso(溶剂组)、10μg/g罗非鱼体重的雌二醇(e2，e2组)、1.5iu/g罗非鱼体重的人绒毛膜促性腺激素(hcg组)、0.20iu/g罗非鱼体重的促黄体素释放激素组(lhrh组)和0.10mg/g罗非鱼体重的香豆雌酚(couestrol组)，注射完毕后，放入到清水中饲养7d。[0067]分别在联合暴露实验进行至30d和暴露后修复满7d时进行采样，采样时用0.01％ms-222麻醉剂先对罗非鱼进行麻醉，整个操作在冰上进行。测量每组罗非鱼的体长和体重。尾静脉采血，将采集的血液常温静置1h后，放入4℃冰箱过夜，8000rpm/min5min，取上清，置于-80℃冰箱备用。解剖罗非鱼取出卵巢组织，称重，计算罗非鱼的性腺指数gsi，然后将卵巢组织分成二份经液氮冷冻后，置于放入-80℃冰箱中以备后续实验。[0068]1.3铜、镉含量的检测[0069]参照罗永巨等报道的方法(罗永巨.镉对吉富罗非鱼毒性效应及繁殖力影响的研究[d].南京农业大学,2015.)，采用电感耦合等离子体质谱法(icp-ms)测定卵巢组织内的铜、镉离子含量。具体步骤为：称量待测卵巢样品记为mg(精确值0.0001g)，置于含有1ml硝酸的10ml消解管中，将消解管放入石墨消解仪中，在120℃中完全消解；待消解管冷却后加入超纯水定容至10ml，静置30min，用电感耦合等离子体质谱仪测定溶液中的铜或镉浓度(μg/ml)，计算出卵巢组织中铜、镉离子含量。[0070]1.4血清中激素含量测定[0071]按照上海桥杜生物科技有限公司提供的elisa相应试剂盒操作说明测定血清中促性腺激素(gonadotriphinhormone，gth)、促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasinghormone，gnrh)、雌二醇(estradiol，e2)和卵黄蛋白原(vitellogeni，vtg)含量。[0072]1.5基于rt-qpcr检测卵巢组织的相关基因表达情况[0073]1.5.1总mrna的提取[0074]将每组中的卵巢组织取出后在冰冻条件下研磨，按照takararnaisoplus试剂说明书对卵巢组织进行裂解，匀浆仪破碎卵巢组织，提取卵巢组织中的totalmrna。[0075]1.5.2反转录[0076]将提取的rna样本稀释到500ng后，按照takaraprimescripttmrtmastermix(perfectrealtime)试剂盒说明书进行反转录操作，反应体系如下表1，反应条件：37℃15min延伸，85℃，5s灭活反转录酶，4℃保存。反应得到的cdna置于-20℃保存。[0077]表1反转录体系[0078][0079]1.5.3扩增[0080]按照tbgreenpremixextaq试剂盒说明书将mrna逆转录成cdna，实时定量pcr采用sybr绿色荧光染料试剂(预混物，takara生物技术有限公司)使用实时荧光定量pcr仪(abisystemsequencedetector7500)进行检测，扩增条件为：95℃，30s预变性、95℃，5spcr反应，60℃，30s(40次循环)、解离。反应体系如表2所示。试验结果以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，使用2-δδct方法计算所有基因的表达水平。用于标记mrna表达检测的引物的寡核苷酸序列如表3。[0081]表2qrt-pcr反应体系[0082][0083]表3引物序列[0084][0085]1.6统计分析[0086]采用spss22对各项指标进行分析，采用单因素方差分析，one-wayanalysisofvariance(ano-va)方法,采用dunnett's多重比较进行检验，观察各组间差异是否显著。根据实验结果采用graphpadprism5软件对进行制图。[0087]2结果[0088]2.1罗非鱼体重和g.s.i指数[0089]由图1可知，与空白对照组相比，铜、镉复合水相暴露30d显著降低了罗非鱼的体重和g.s.i值(分别下降了34.46％和60.00％)(p《0.05)。与阴性对照组相比，药物注射并恢复7d后，铜、镉复合水相暴露的罗非鱼体重有不同程度升高，其中香豆雌酚组的罗非鱼体重升高了61.18％，且差异显著(p《0.05)；而g.s.i指数变化则相反，均比阴性对照组低。因此，罗非鱼暴露在铜、镉复合水相中，其体重和g.s.i值会显著降低，暴露后注射4种药物短期内能提升其体重，但g.s.i值的改善作用不明显。[0090]2.2罗非鱼卵巢中铜、镉含量[0091]如图2所示，与空白对照组相比，铜、镉复合水相暴露30d的罗非鱼卵巢组织内cu的含量降低了68.48％，cd含量升高了319.25％，且差异均显著(p《0.05)。铜、镉复合水相暴露后，注射4种药物并恢复7d，各实验组的cu含量均显著低于空白对照组，cd含量均显著高于空白对照组(p《0.05)；同阴性对照组相比，各药物组的cu、cd含量均无明显差异(p》0.05)。[0092]2.3血清中激素及卵黄蛋白原含量[0093]如图3所示，铜、镉复合水相暴露30d降低了罗非鱼血清中的激素水平和卵黄蛋白原含量。铜、镉复合水相暴露30d后，同空白对照组相比，铜、镉复合水相暴露组的gnrh含量、gth含量和vtg含量分别下降了9.17％、13.01％和2.20％，差异均不显著(p》0.05)；e2含量则显著下降了17.55％(p《0.05)。注射药物并恢复7d后，各药物组罗非鱼血清中的激素水平仍低于空白对照组，vtg含量则观察到有明显升高。同阴性对照组相比，hcg组、lhrh组、e2组和cou组的gnrh含量分别上升了11.05％、17.41％、10.03％和12.41％；gth含量分别上升了14.92％、18.71％、19.22％和11.68％；hcg组、lhrh组和e2组的e2水平分别上升了49.31％、42.39％和45.91％，且差异均显著(p＜0.05)；与此同时hcg组中vtg含量升高了39.56％，且差异均显著(p＜0.05)；cou组的e2水平和除hcg组外所有药物组的vtg水平变化并不明显(p》0.05)。这些结果说明注射hcg、lhrh-α有助于提升血清中的gnrh、gth、e2的水平和vtg含量，特别是提升e2水平和vtg含量。[0094]2.5卵巢中性激素相关基因的含量[0095]如图4所示，铜、镉复合水相暴露30d均显著降低了罗非鱼卵巢中性激素相关基因的表达水平。同空白对照组相比，铜、镉复合水相暴露组罗非鱼卵巢中cyp11a1、cyp17、cyp19、17β-hsd和3β-hsd的表达水平分别下降了86.74％、77.54％、73.13％、91.04％和76.60％(p《0.05)。药物注射并恢复7d后，各药物组的性激素相关基因表达水平显著低于空白对照组，但同阴性对照组相比有明显升高：hcg组和lhrh组罗非鱼卵巢中cyp11a1的mrna表达水平分别上升了282.26％和255.08％，且差异显著(p＜0.05)；e2组和cou组罗非鱼卵巢cyp11a1的mrna表达水平分别上升了176.00％和161.23％，差异均不显著(p》0.05)；hcg组、lhrh-α组、e2组和cou组中cyp17的mrna表达水平分别上升了124.76％、124.25％、75.51％和102.30％，cyp19的mrna表达水平分别上升了62.18％、59.09％、35.58％和26.84％，且差异均不显著(p》0.05)；hcg组和lhrh-α组中17β-hsd的mrna表达水平分别上升了109.35％、111.63％和57.71％，且差异显著(p＜0.05)；cou组和e2组中17β-hsd的mrna表达水平则分别上升了57.71％和62.27％，差异不显著(p》0.05)；hcg组、lhrh-α组和e2组中3β-hsd的mrna表达水平分别上升了100.64％、113.16％和81.53％，且差异均显著(p＜0.05)。同时，cou组中3β-hsd的mrna表达水平则上升了69.66％，且差异均不显著(p》0.05)。这些结果说明注射4种药物均可提升罗非鱼卵巢中性激素相关基因的表达水平，特别是hcg和lhrh-α均能显著提升cyp11a1、17β-hsd和3β-hsd的基因表达水平。[0096]以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
：的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页12当前第1页12