小球藻提取物及乳酸杆菌发酵产物在护理产品中的应用的制作方法

1.本发明涉及护肤品技术领域，更具体地，涉及一种小球藻提取物及乳酸杆菌发酵产物在护理产品中的应用。


背景技术：

2.小球藻(chlorella)属是在地球上从寒带到热带的范围内广泛分布的绿藻类，是直径2～10μm的近似球形的单细胞生物。小球藻含丰富的蛋白质、脂质、食用纤维、生物素、纤维素、不饱和脂肪酸、生物活性多糖、核酸、维生素、微量元素、矿物质、叶酸与叶绿素等。小球藻提取物广泛应用于各类化妆品中，通常作为皮肤调理剂存在，具有促进胶原蛋白及弹力蛋白合成等功效。
3.乳酸杆菌乳杆菌属乳酸杆菌科，因发酵糖产生大量乳酸而命名。乳酸杆菌发酵产物中含乳酸、胜肽、菌体多糖、过氧化氢、抑菌素、类黄酮、微生物及矿物质等，具有软化角质、促成胶原蛋白再生等功效。
4.现有技术虽然有将小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物应用于化妆品中，但是，通常是将其作为一种辅助的促进胶原蛋白合成的组分，目前对其是否有其他用途，还尚未有研究表明。同时，由于小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物均是来源天然、安全性较高的组分，可广泛添加于各类日化用品中，因此，对其用途的挖掘显得至关重要；有利于在小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物高安全性的基础上，提供更多功效的安全护理产品，以满足更多的护理需求。


技术实现要素：

5.本发明旨在克服上述现有技术的至少一种不足，提供一种小球藻提取物及乳酸杆菌发酵产物在护理产品中的应用，通过小球藻提取物和乳酸杆菌的复配应用，便于制备出具有平衡肌肤微生态、舒缓肌肤和降低防腐剂含量的护理产品，满足更多的肌肤护理需求，且安全性高，适用人群广。
6.本发明的一个目的在于，提供小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物联合在制备平衡肌肤微生态、舒缓肌肤和/或降低防腐剂用量的护理产品中的应用。通过小球藻提取物和乳酸杆菌复配组合物实现平衡肌肤微生态、舒缓肌肤和降低防腐剂用量功效。
7.正常的皮肤微生态系统存在着竞争和制约关系，当皮肤菌群存在不正常的增加、减少甚至消失，都会导致皮肤微生态被破坏。而皮肤微生态的变化与皮肤上多种炎症性反应和感染性疾病相关，如特应性皮炎、痤疮和慢性伤口等炎症性反应。因此，皮肤微生物菌群平衡是皮肤正常的基础，维持着皮肤环境的稳定。
8.然而，当皮肤过度清洁、化学物质刺激、药物(特别是抗生素)、皮肤自由基增多使得皮脂过氧化等都会破坏菌群平衡，会导致致病菌外植与侵入，当常驻菌群失调时，则会导致皮肤屏障功能受损，进而容易引起皮肤水油不平衡、敏感、炎症等问题。
9.而在本发明的一个以上实施例中，本发明人发现通过添加小球藻提取物和乳酸杆
菌发酵产物，能有效的调整失衡的肌肤微生态至正常肌肤微生态，即平衡肌肤微生物菌落，使肌肤回复的正常状态。通过小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物制备相应的护理产品，能解决现有技术在平衡皮肤微生态产品上的缺失问题。同时，本发明人还发现通过将小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物联用，能提供显著的保湿、舒缓肌肤的效果。即通过小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物，能显著提升相应护肤功效，从多个方面提高护肤效果。
10.除此之外，本发明还发现小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物具有降低防腐剂用量的功效。具体地，防腐剂是指对微生物的生长具有持续的抑制作用的物质。防腐剂的重要特点是能在不同情况下抑制腐败作用，特别是在一般灭菌作用不充分时仍具有持续性的防腐抑菌效果。化学合成类防腐剂以其成本低、防腐效果好、应用方便等优点在化妆品行业得到广泛应用，但化学防腐剂存在不同程度的毒副作用，用量大时对皮肤有刺激性风险。而在本发明的一个以上实施例中，本发明进行有防腐功效测试，并验证了小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物还具有降低防腐剂使用量的用途。添加小球藻提取物、乳酸杆菌中的至少一种，能在保障防腐效果的前提下，减少防腐剂用量。
11.即通过本发明一个以上实施例发现，小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物复配使用，至少具有平衡肌肤微生物菌落、舒缓肌肤、降低防腐剂用量的用途。基于该用途，有利于制备出相应的护理产品，从而满足现有技术对平衡肌肤微生态、舒缓肌肤、低防腐剂的护理产品需求。
12.进一步地，平衡肌肤微生态包括调节肌肤上丙酸杆菌属、不动杆菌属、棒状杆菌属、葡萄球菌属、拟杆菌属、普雷沃氏菌属、魏斯氏菌属、双歧杆菌属、乳酸杆菌属和/或水栖菌属的菌群丰度。在本发明的一个以上实施例中，至少验证了小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物对上述微生物起到调节作用，并调节至正常肌肤微生态水平。
13.进一步地，防腐剂包括苯氧乙醇和/或乙基己基甘油。在本发明的一个以上实施例中，添加小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物后，能在有效减少防腐剂苯氧乙醇、乙基己基甘油用量的同时保持良好的防腐效能。
14.进一步地，护理产品包括护肤保湿水、护肤精华液、护肤膏霜、护肤乳液、护肤舒缓液、护肤面膜。
15.本发明的又一目的在于提供小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物联合降低护肤品中防腐剂用量的应用方法，将小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物加入护肤品中。即提供小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物组合物降低护肤品中防腐剂用量的应用方法，包括步骤：将小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物组合物加入护肤品中。如前所述，在本发明的一个以上实施例中，通过添加小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物，护肤品中的防腐剂用量得以降低，同时又保障了防腐功效。
16.进一步地，防腐剂包括苯氧乙醇和/或乙基己基甘油。
17.更进一步地，防腐剂包括苯氧乙醇和乙基己基甘油。
18.本发明的再一目的在于提供一种护肤组合物，包含小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物。
19.本发明的再一目的在于提供一种保湿护肤品，包括：a相：甘油2～4份；edta-2na 0.03～0.06份；透明质酸钠0.03～0.06份；泛醇0.3～0.6份；peg-40氢化蓖麻油0.05～0.15份；
b相：防腐剂0.7～1份；以及，选自小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物中的至少一种；所述防腐剂为苯氧乙醇和乙基己基甘油的混合物。
20.在本发明的一个以上实施例中，使用小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物的保湿护肤品能显著改善皮肤角质层含水量，起到显著保湿功效。所述小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物复配使用，起到协同增效的作用，使皮肤角质层含水量得以明显改善。
21.进一步地，小球藻提取物为2份；和/或，乳酸杆菌发酵产物为2份。
22.进一步地，所述苯氧乙醇和乙基己基甘油的比例为9∶1。
23.进一步地，包括：a相：甘油3份；edta-2na 0.05份；透明质酸钠0.05份；泛醇0.5份；peg-40氢化蓖麻油0.1份；b相：防腐剂0.8份；小球藻提取物2份；乳酸杆菌发酵产物2份。
24.本发明的再一目的在于提供前述保湿护肤品的制备方法，包括步骤：s1、将a相各物料加入主锅中，升温至80～85℃，搅拌溶解，保温10～15min；s2、降温至40～45℃，加入b相各物料于主锅中，搅拌均匀；s3、降温至38℃，质检，出料即得所述保湿护肤品。
25.本技术保湿护肤品制备方法简单，易于操作，具有适合大规模生产的特点。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果为：发现了小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物的新用途，通过小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物具有平衡肌肤微生物菌落的功能，调节失衡的肌肤微生态至正常肌肤微生态，恢复肌肤屏障，改善肌肤状态。同时，本发明人还发现小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物可应用于肌肤舒缓中，有效祛红和舒缓肌肤。除了将小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物应用于护肤品中以提升护肤效果外，本发明人还发现小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物添加与护肤品中后，可减少防腐剂的用量，同时又保障了防腐效果；基于小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物的安全性，能显著减少防腐剂等成分对肌肤表面的损害，减少护肤品的不良反应。即，小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物组合物搭配使用，能够在平衡肌肤微生物菌群的同时，还能减少化学防腐剂的用量，降低了化学防腐剂在用量大的情况下对皮肤的刺激性效果，改善了现有化学防腐剂毒副作用大的问题，同时具有较好的防腐能力，抗菌谱宽，抗菌范围广。因此，小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物可应用护肤品中，提供一种具有平衡肌肤微生物菌落功能、舒缓肌肤、低防腐剂的护肤品；也可以利用小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物提供针对性促进肌肤微生物菌落平衡、增强舒缓肌肤效果、降低防腐剂用量的产品。基于本发明提供的新用途，便于制备出具有平衡肌肤微生物菌落、舒缓肌肤和低防腐剂含量的护理产品，满足更多的肌肤护理需求，且安全性高，适用人群广。
具体实施方式
27.应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本技术提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本技术所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
28.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根
据本技术的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
29.现结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实施例仅是为了解释本发明，但不构成对本发明的限制。在以下实施例中所用到的试验样本及试验过程包括以下内容(如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照试剂公司所推荐的条件；下述实施例中所用的试剂、耗材等，如无特殊说明，均可从商业途径得到)。
30.本实施例提供一种保湿护肤品，包括以下重量份数组分：
31.a相：甘油2～4份；edta-2na 0.03～0.06份；透明质酸钠0.03～0.06份；泛醇0.3～0.6份；peg-40氢化蓖麻油0.05～0.15份；
32.b相：防腐剂0.7～1份；
33.所述防腐剂为苯氧乙醇和乙基己基甘油的混合物。
34.上述保湿护肤品制备方法，包括步骤：s1、将a相各物料加入主锅中，升温至80～85℃，搅拌溶解，保温10～15min；s2、降温至40～45℃，加入b相各物料于主锅中，搅拌均匀；s3、降温至38℃，质检，出料即得所述保湿护肤品。
35.本实施例还提供一种保湿护肤品，b相还包括选自小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物中的至少一种。制备方法包括以下步骤：s1、将a相各物料加入主锅中，升温至80～85℃，搅拌溶解，保温10～15min；s2、降温至40～45℃，加入b相各物料于主锅中，搅拌均匀；s3、降温至38℃，质检，出料即得所述保湿护肤品。实施例1
36.本实施例依据配方1～10的组分比例，按照以下步骤分别制备保湿护肤品：s1、将a相各物料加入主锅中，升温至80～85℃，搅拌溶解，保温10～15min；s2、降温至40～45℃，加入b相各物料于主锅中，搅拌均匀；s3、降温至38℃，检查合格，出料即得所述保湿护肤品。
37.制备获得分别对应于配方1～10的保湿护肤品。
38.表1
实验例1
39.小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物组合物在平衡肌肤微生态、保湿、舒缓肌肤上的作用
40.本研究对120名年龄在18-45岁之间的受试者进行测试，所有受试者的皮肤类型都有发炎反应倾向性，将受试者平均分成4组，每组30名，参加符合医学研究伦理原则的双盲随机临床研究。每组的受试者每天早晚在面部分别使用配方4、5、6、7样品，每次使用1ml。在当天开始测试前d0和测试后的第28天d
28
，分别测试皮肤微生物群落(通过皮肤非侵入性地采集皮肤贴片，对120个皮肤样本微生物进行16srrna测序，分析属菌群结构、多样性及基因
功能)、皮肤角质层含水量、面部皮肤红斑数量和红斑面积数值。
41.一、小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物组合物在平衡肌肤微生物群落上的作用
42.1、16srrna测序检测
43.16srrna测序是指对环境样本16s ribosomal rna的基因(即16srdna)高变区进行pcr扩增及高通量测序的一种技术，可对特定环境下细菌和古菌的微生物种类和丰度进行有效鉴定。16s序列由9个高变区组成(v1-v9)，中间穿插着保守区，是最常用的细菌分类标准。通过提取环境样品的dna，并扩增其中16srdna基因；检测16srrna基因序列变异和丰度，反映环境样本中细菌的分类和丰度。16s序列可以用来鉴定绝大多数细菌。基于illumina miseq测序平台，可以一次性完成多个样本的平行测序，提供环境样本物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。通过16s第三区(v3)及第四区(v4)进行测序，共长约为459bp，可识别大部分人体微生物种类(准确度达到属一级别)。
44.本实施例中，则利用16srrna测序进行了皮肤微生物群的检测。具体地，面部取样进行皮肤微生物群分析(16s-rdna序列，宏基因组分析)；获得多样性指数、细菌构成以及生物菌群丰度和多样性稳定状态。
45.所述16s rrna测序标准操作流程包括以下步骤：
46.(1)采用qiaamp dna提取试剂盒进行抽提，并对抽提的dna进行检测；
47.(2)采用荧光分光光度计检测dna的浓度，并用1％的琼脂糖凝胶电泳检测dna的质量；
48.(3)调整dna溶液浓度，dna工作液保存于4℃，储存液保存于-20℃；
49.(4)针对样本16s rrna gene的v3-v4区进行pcr扩增；
50.(5)胶回收纯化：针对目标条带进行割胶回收，得到纯化的样本；
51.(6)各样本定量：利用qubit荧光定量仪对各个样品定量；
52.(7)采用标准的illuminatruseq dna文库制备实验流程(illuminatruseq dna sample preparation guide)构建上机文库；使用illuminamiseq pe300进行上机测序。
53.2、试验结果：
54.本实施例进行了物种组成分析。为了得到每个otu对应的物种分类信息，采用rdp classifier贝叶斯算法对97％相似水平的otu代表序列进行分类学分析，并分别在各个分类学水平：domain(域)，kingdom(界)，phylum(门)，class(纲)，order(目)，family(科)，genus(属)，species(种)统计各样本的群落组成。
55.根据97％的相似度对所有序列进行otu(operational taxonomic units)划分并进行生物信息统计分析。根据分类学分析结果，可以得知一个或多个样品在各分类水平上的分类学比对情况。现通过菌群结构属物种相对丰度变化来展示数据。
56.健康面部皮肤中菌群结构属物种相对丰度情况，如表2所示。
57.表2丙酸杆菌属0.600不动杆菌属0.002棒状杆菌属0.102葡萄球菌属0.050拟杆菌属0.035
普雷沃氏菌属0.028魏斯氏菌属0.038双歧杆菌属0.005乳酸杆菌属0.025水栖菌属0.005
58.对于配方4、5、6、7受试组，测试结果如表3所示
59.表3表3
60.测试结果显示，使用含有小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物组合物的保湿水，早晚使用28天后，可以使受损肌肤的紊乱微生物菌群恢复到与健康皮肤接近的、较为稳定平衡的皮肤微生物菌群状态。
61.二、小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物组合物在皮肤保湿的作用
62.1、角质层含水量测试
63.测试仪器：皮肤水份测试仪corneometer cm825(数值越大代表角质层含水量越高，单位c.u.)
64.皮肤水分的测量基于国际公认的corneometer法，即电容法。测量是基于水和其他物质完全不同的介电常数。皮肤是弱导电介质，其导电系数会随着皮肤的含水量增加，因此，测试探头作用于皮肤时，根据皮肤的水分含量，测量电容器显示电容的变化。
65.2、检测结果
66.本实施例对配方4、5、6、7受试组进行了检测，检测结果如表4所示。
67.表4
样品使用前d0使用28天d
28
p配方467.11
±
12.2167.24
±
10.58n.s配方566.94
±
11.8769.95
±
11.370.0487配方666.85
±
10.8069.21
±
11.150.0497配方765.95
±
11.3770.94
±
11.980.0245
68.通过表4所示结果可知，使用小球藻提取物或乳酸杆菌发酵产物的保湿水均可以改善皮肤角质层含水量，而且小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物复配使用时，实现协同增效，皮肤角质层含水量明显得到改善。
69.三、小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物组合物在舒缓肌肤的作用
70.1、祛红测试：
71.使用美国visia微析皮肤影像分析仪(visiatm complexion analysis)测试皮肤发炎指数，在d0、d
28
分别分析测试者面部红斑数量和面积。
72.2、检测结果
73.本实施例对配方4、5、6、7受试组进行了检测，具体检测了红斑数量、红斑面积，并获得了如表5、6所示的结果。
74.表5
75.表6
76.使用28天含小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物组合物的保湿水后，面部红斑数量和面积变化率显示，小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物组合物搭配可以有效减缓皮肤发红数量和面积，有效祛红和舒缓肌肤。实验例2
77.小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物组合物降低防腐剂使用的作用
78.本实施例中按照水溶性化妆品防腐功效测试方法ctfa m-3(2007)进行测试，包括以下步骤：
79.(1)细菌悬浊液的制备：将金黄色葡萄球菌atcc6538、铜绿假单胞菌atcc9027和大肠杆菌atcc8739分别接种于大豆酪蛋白琼脂斜面培养基上，37℃培养24h。用5ml灭菌0.85％生理盐水冲洗菌苔，按照菌落总数测定方法测定细菌的菌落数，保证其菌落在108cfu/ml左右，将以上3种细菌悬浊液等体积混合，4℃备用。
80.(2)真菌悬浊液的制备：将白色假丝酵母atcc10231、黑曲霉atcc16404分别接种于马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，白色假丝酵母菌28℃培养48h，用5ml灭菌0.85％生理盐水冲洗菌苔，按照菌落总数测定方法测试真菌的菌落数，保证其菌落数在107cfu/ml左右；黑曲霉28℃培养5-7天，取5ml含0.05％吐温的灭菌0.85％生理盐水冲洗菌苔，按照菌落总数测试方法测试真菌的菌落数，保证其菌落数在107cfu/ml左右。将2种真菌悬浊液等体积混合，4℃备用。
81.(3)样品接种：
82.取上述称量好的配方1、2、3、8、9、10样品各2份(每份30g)，分别加入0.3ml混合细菌悬浊液和0.3ml混合真菌悬浊液，混合均匀。将样品置于室温(22.5
±
2.5)℃保存，并分别于第0、7、14、21、28天检测化妆品中的菌落数，以判断化妆品的防腐效能。
83.(4)样品检测：
84.称取1g或1ml待检测样品，加至9ml灭菌的生理盐水稀释瓶中，充分摇荡均匀，制成1:10的样品稀释液，再取1ml此稀释液加入到9ml生理盐水中，充分混匀稀释成1:100的样品稀释液，依次类推制成1:1000，1:10000等，稀释到适宜的倍数。根据每次的实验结果选取适宜稀释度的稀释液2ml，加入到2个灭菌培养皿中，每个培养皿中加入1ml。加入细菌悬浊液的化妆品采用大豆酪蛋白琼脂培养基，37℃培养48h计数；加入真菌悬浊液的化妆品采用马铃薯葡萄糖琼脂培养基，28℃培养72小时后计数。
85.结果计数：按gb 7918.2-87中菌落计数方法进行计数：
86.评价标准：化妆品防腐效果以菌落数下降的百分数作为评价指标。
87.式中：a0为初始加入微生物时化妆品中微生物的含量；an为不同检测时间化妆品中微生物的含量。
88.细菌于第7天时菌落总数下降99.9％，至第28天时无增长，真菌于第14天下降99.0％，至第28天时无增长，判断为防腐效果合格。其中细菌和真菌有一项不能达到以上标准判断为化妆品的防腐效果不合格。
89.本实施例对配方1、2、3、8、9、10受试组进行了检测，检测结果如下表7所示。
90.表7
91.结果如表7所示，通过防腐挑战测试，表明小球藻提取物、乳酸杆菌发酵产物组合物在能够降低防腐剂的添加量的同时，还可以保持良好的防腐效能。以配方9为例，添加2份小球藻提取物搭配2份乳酸杆菌发酵产物的组合物后，能够在仅添加0.8份防腐剂(苯氧乙醇∶乙基己基甘油＝9:1)用量的条件下，即达到甚至超过其他未加入小球藻提取物和乳酸杆菌发酵产物而添加有较多防腐剂的护肤品的防腐性能。
92.显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明技术方案所作的举例，而并非是对本发明的具体实施方式的限定。凡在本发明权利要求书的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。