一种多肽类纳米疫苗及其制备方法与应用与流程

1.本发明涉及生物免疫技术领域，尤其涉及一种多肽类纳米疫苗及其制备方法和应用。


背景技术：

2.疫苗对保障人类健康，改善生活质量和促进社会发展做出了巨大的贡献。
3.疫苗一般分为两类：预防性疫苗和治疗性疫苗。熟知的预防性疫苗主要用于疾病的预防，接收者为健康个体或新生儿，例如百白破疫苗、新型冠状病毒肺炎疫苗等；治疗性疫苗主要用于患病的个体，接受者为患者，是在已感染病原微生物或已患有某些疾病的机体中，通过诱导特异性的免疫应答，达到治疗或防止疾病恶化的天然、人工合成或用基因重组技术表达的产品或制品，例如治疗性乙肝疫苗、治疗性胰腺癌疫苗等，属于特异性主动免疫疗法。目前，治疗性疫苗主要包括亚单位疫苗、免疫复合物型疫苗、多肽类疫苗等。
4.近年来，全球恶性肿瘤的发病率及死亡率，每年保持约3.9％和2.5％的增幅，且恶性肿瘤死亡占居民全部死因的23.91％，寻求有效提高癌症患者生存率，改善患者生存质量的治疗方式已成为一大研究难点。此时，以免疫学为基础的肿瘤免疫疗法在癌症治疗领域展现出了极大优势。肿瘤免疫疗法是利用机体免疫系统特异性杀伤肿瘤细胞的治疗方法，该方法可以抑制肿瘤生长并使机体产生免疫记忆，可有效抑制恶性肿瘤的增殖、转移和复发，目前主要包括单克隆抗体治疗、过继细胞疗法和肿瘤疫苗等。
5.肿瘤疫苗可以利用dna、rna、蛋白质或肽等肿瘤相关抗原（taa）去调节免疫系统。在疫苗进入人体后，抗原会被存在于外周的巨噬细胞或树突状细胞（dcs）等抗原呈递细胞（apcs）表面的模式识别受体（prrs）识别，将其转运至引流淋巴结或脾脏等免疫器官。由于抗原的不同，有的直接被b细胞识别，有的呈递给免疫器官中的t细胞，产生针对不同肿瘤抗原的特异性t细胞，也能重新激活休眠和失能的t细胞，从而激发新的或促进已有的抗肿瘤免疫反应，实现诱导并增强肿瘤特异性t细胞对癌症的应答。且这种免疫不同于免疫检查点阻断诱导的广泛免疫，肿瘤疫苗可以实现对肿瘤的精确免疫。近年来宫颈癌、前列腺癌等相关肿瘤疫苗也已有上市产品。
6.利用肿瘤表面特异性抗原多肽制备的多肽疫苗，提供了靶向特定表位的最直接方式，多肽疫苗含有的特定多肽表位由t细胞受体识别，可以刺激产生肿瘤特异性t细胞，精准杀伤肿瘤，减轻自身的不良炎症反应。
7.随着癌症共享抗原和突变源抗原的鉴定，预计多肽癌症疫苗的应用范围将大为扩展，有很大的造福患者的潜力。且基于抗原多肽的癌症疫苗安全性高、易于制造，且它们可以直接监测t细胞对抗原肽的cd4+和cd8+t细胞反应，这一点在疫苗开发中非常关键。
8.但目前基于多肽的肿瘤疫苗大多存在以下几个问题：第一抗原肽容易在递送中途被降解；第二难以共递送免疫佐剂，而在没有免疫佐剂的情况下，未成熟的抗原呈递细胞与抗原接触后触发免疫反应的几率较低。第三，多肽类疫苗的抗原肽序列多样，理化性质各异，现有的载体难以适用于所有的肽类抗原。


技术实现要素：

9.本发明提供一种多肽类纳米疫苗及其制备方法与应用，能够适用于种类繁杂、结构多样、理化性质各异的多种抗原肽，且提供了抗原佐剂一体化的递送方案。
10.为解决上述技术问题，本发明采用了以下方案：一种多肽类纳米疫苗，包括载体和负载于所述载体上的佐剂，所述载体为β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺（β-cd-pei）和抗原肽通过交联剂交联得到的纳米颗粒，所述交联剂为还原响应型交联剂。
11.优选的，所述佐剂包裹于β-环糊精的空腔中，或者通过静电作用负载于所述载体表面。
12.优选的，所述佐剂为疏水型佐剂或离子型佐剂，所述疏水型佐剂包裹于所述β-环糊精的空腔中，所述离子型佐剂通过静电作用负载于所述载体表面。
13.优选的，所述疏水型佐剂为瑞喹莫德（r848）或咪喹莫特（r837）。
14.优选的，所述离子型佐剂为寡脱氧核苷酸（cpg）或聚肌苷酸胞苷酸（poly i:c）。
15.优选的，所述β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺的结构式为：；其中，n为自然数。
16.优选的，所述还原响应型交联剂（pnc-dtde-pnc）的结构式为：。
17.优选的，所述抗原肽为具有预防性或者治疗性的抗原。例如来源于肿瘤基因组突变的新抗原，病毒表面特异性表达的多肽等。
18.优选的，所述抗原肽为抗原卵清蛋白ova抗原肽siinfekl、靶向ct26的抗原肽qaivrgcsmpgpwrsgrllvsrrwsve、靶向b16f10m27的抗原肽lcpgnkyem、靶向mc38的抗原肽asmtnmelm、靶向肝癌细胞hhcc的抗原肽slivhlnev、靶向黑色素瘤的hla-a2限制性抗原肽ylepgpvta、抗原肽elagigiltv、抗原肽fvgefftdv以及破伤风类毒素肽aqyikanskfigitel、模型肽ffqnk。
19.优选的，所述载体的粒径为30~1000 nm。
20.本发明还提供上述多肽类纳米疫苗的制备方法，包括如下步骤：（1）将β-cd-pei、还原响应型交联剂和抗原肽于二甲亚砜中交联反应，得到所述载
体；（2）将所述佐剂和所述载体在溶液中共孵育，即得所述多肽类纳米疫苗。
21.优选的，步骤（1）中所述β-cd-pei、所述还原响应型交联剂和所述抗原肽的摩尔比为0.5~4:1~4:1~3.5。
22.优选的，步骤（1）中所述β-cd-pei由如下方法制得：（1-1-1）向β-环糊精（β-cd）的naoh溶液中加入对甲苯磺酰氯，搅拌反应得到产物β-cd-ots；（1-1-2）将β-cd-ots与聚乙烯亚胺（pei）于二甲亚砜（dmso）中搅拌反应，得到β-环糊精修饰的聚乙烯亚胺（β-cd-pei）。
23.所述β-cd-ots的结构式为：。
24.优选的，步骤（1-1-1）和步骤（1-1-2）还包括对得到的产品后处理的步骤。
25.优选的，步骤（1）中所述还原响应型交联剂由如下方法制得：（1-2-1）将2-羟乙基二硫化物（dtde）、吡啶和对硝基氯甲酸苯酯（pnc）于无水二氯甲烷中反应，得到还原响应型交联剂pnc-dtde-pnc。
26.优选的，所述载体中β-cd与所述疏水型佐剂的摩尔比是1~20:1。
27.优选的，步骤（1）中所述交联反应的时间为12~72 h。
28.优选的，步骤（2）中所述共孵育的时间为1~12 h。
29.本发明还提供上述多肽类纳米疫苗在制备抗肿瘤疫苗中的应用。
30.本发明的有益效果在于：（1）本发明的纳米疫苗的载体中β-cd-pei的空腔及静电作用可实现不同抗原及佐剂的负载。
31.（2）本发明利用pnc-dtde-pnc的两端基团可将β-cd-pei的氨基和多肽的氨基进行交联，进一步，交联剂上的二硫键在细胞内被还原裂解，能实现在细胞胞浆内抗原多肽的释放。每条肽链至少含有1个游离氨基，本发明采用的交联剂pnc-dtde-pnc适用于连接任意肽链，为构建通用型纳米疫苗载体提供可能。
32.（3）本发明的纳米疫苗为纳米粒子形态，能够增加树突状细胞（dcs）对抗原和佐剂的摄取，有利于淋巴结靶向递送，从而有利于进一步的生物运用，使药物更多富集于淋巴结部位。其上调表面共刺激分子及细胞因子的分泌，有利于激发机体的免疫应答，提高抗肿瘤效果。传统游离状态的肿瘤疫苗，难以靶向淋巴结，药物富集程度有限。
33.（4）本发明采用的原料价格较低，易于获得，制备方法简单，易于生产，具有抗原多肽的制备通用性，有较好的应用前景。
附图说明
34.图1是实施例1制备的抗原肽多佐剂疫苗的红外吸收光谱图。
35.图2是实施例1制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗的粒径分布图。
36.图3是实施例1制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗的电镜图。
37.图4是实施例1制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗的淋巴结ivis（红外成像系统）成像。
38.图5是实施例1制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的抑瘤生长曲线。
39.图6是实施例3制备的模型肽多佐剂纳米疫苗的红外吸收光谱图。
40.图7是实施例4制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗的电镜图。
41.图8是实施例4制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗的淋巴结ivis成像。
42.图9是实施例4制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的抑瘤生长曲线。
43.图10是实施例4制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的肿瘤重量图。
44.图11是实施例4制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的肿瘤图。
45.图12是实施例5制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗的电镜图。
46.图13是实施例5制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的抑瘤生长曲线。
47.图14是实施例5制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的肿瘤图。
48.图15是实施例5制备的抗原肽多佐剂纳米疫苗和其他对比材料的预防性抑瘤曲线。
具体实施方式
49.实施例11. β-cd-pei合成：（1）第一步合成β-cd-ots：β-cd (50 g, 44.0 mmol ) 溶解于500ml 0.4n的naoh溶液中，冰水浴冷却至5℃，对甲苯磺酰氯（35 g, 184mmol）在5分钟内慢慢加入不断搅拌的溶液中。混合溶液在5℃搅拌30分钟，然后过滤。滤液用饱和盐酸中和后搅拌1h。然后过滤样品，滤饼用水洗3次，水洗后样品置于60℃真空干燥箱干燥一夜，得产物β-cd-ots。
50.（2）第二步合成β-cd-pei：pei600（1.1 g，1.8 mmol）与β-cd-ots（2.1 g，1.8 mmol）溶解于适量dmso中，混合物在氮气保护下搅拌3天，随后溶液透析，冻干，得到β-cd-pei。采用核磁共振、质谱进行结构鉴定。
51.2. pnc-dtde-pnc交联剂的合成：将dtde（4.0 g，46.7 mmol）和吡啶（7.4 g，93.4 mmol，使用前用5a分子筛静置过夜除水）溶于10 ml无水二氯甲烷中，n2保护，冰水浴条件下，在2 h内缓慢加入pnc的二氯甲烷溶液（10.3 g，5.1 mmol，溶于10 ml无水二氯甲烷），随后避光反应20 h。旋转干燥后用硅胶柱层析纯化（展开剂：二氯甲烷）。利用核磁共振和质谱确定pnc-dtde-pnc的合成。
52.3.1. 纳米疫苗载体的构建：抗原肽peptide（序列为qaivrgcsmpgpwrsgrllvsrrwsve）、β-cd-pei、以及pnc-dtde-pnc溶于1 ml dmso中，在25 ℃下搅拌24~72h，用1500 da透析袋于纯水中透析除去dmso，通过调整投料比及反应时间控制纳米粒子的粒径、形貌及稳定性。
53.制得的多肽类纳米疫苗载体的结构式如下：
。
54.3.2 负载佐剂的纳米疫苗的构建：将r848、cpg和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育1~12h，r848通过β-cd的空腔包合，cpg通过静电作用吸附在载体上。通过控制投料比例和共孵育的时间，可调整佐剂的负载量，以控制最佳比例的免疫佐剂。
55.图1为负载抗原肽的双佐剂纳米疫苗的红外吸收光谱图、图2为此纳米疫苗的粒径、图3为此纳米疫苗的电镜图，由图可知在3324.12 cm-1
处有n-h吸收峰，说明在本实施例中交联剂与多肽上的氨基连接，本实施例获得的纳米疫苗载体的粒径为346
ꢀ±ꢀ
39.7 nm。
56.实施例2纳米疫苗淋巴结富集能力考察：按照官能团比例β-cd-pei600:peptide:pnc-dtde-pnc=1:3:4将抗原肽peptide（序列为qaivrgcsmpgpwrsgrllvsrrwsve）、β-cd-pei以及pnc-dtde-pnc溶于1 ml dmso中，控制ph在7.4左右，再加入20 ulcy-7荧光染料孵育24~72 h，制备得到荧光标记的纳米疫苗。
57.皮下注射100 ul纳米疫苗到balb\c小鼠的尾根部（左右两侧各50 ul）中。分别在注射后6、12及24 h处死小鼠取出腹股沟淋巴结（lns）进行离体成像的拍摄。
58.如图4所示，纳米疫苗组小鼠双侧腹股沟在6 h，12 h，24 h均有较强荧光，游离组（注射游离态β-cd-pei、peptide、r848和cpg）仅在12 h有微弱荧光，这说明所制备的纳米疫苗具有较强的淋巴结富集能力。
59.考察β-cd-pei-抗原肽双佐剂纳米疫苗的抑瘤效果：于day0于小鼠右上臂注射肿瘤细胞，给药前随机分成pbs组、游离组和纳米疫苗组，于day7及day14于尾根部给药。
60.如图5所示，与pbs组相比其余两组均减小，纳米疫苗组与游离组也有差异，具有统计学意义。
61.实施例3按照官能团比例β-cd-pei600:peptide:pnc-dtde-pnc=1:3:4将模型肽（序列为ffqnk，仅氨基）、β-cd-pei以及pnc-dtde-pnc溶于1 ml dmso中，在25 ℃下搅拌24~72h，用1500 da透析袋于纯水中透析除去dmso。将r848、cpg和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育1~12h制得负载模型肽的双佐剂纳米疫苗。图6为负载模型肽的双佐剂纳米疫苗的红外吸收光谱图，由图可知本实施例中交联剂与多肽上的氨基连接，在3312.65 cm-1
处有n-h吸收峰。
62.实施例4
1. 负载抗原肽（序列为siinfekl）的双佐剂纳米疫苗的构建：将与实施例1相同方法合成的β-cd-pei、与实施例1相同方法合成的pnc-dtde-pnc交联剂和抗原肽peptide（序列为siinfekl）按照官能比例β-cd-pei600:peptide:pnc-dtde-pnc=1:3:4溶于1 ml dmso中，在25 ℃下搅拌24~48 h，用1500 da透析袋于纯水中透析除去dmso。将r848、cpg和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育12h制得负载双佐剂的多肽纳米疫苗。
63.图7为纳米疫苗的电镜图，本实施例获得的纳米疫苗载体的粒径为197.8
±
11.1 nm。
64.2. 纳米疫苗淋巴结富集能力考察：按照官能团比例β-cd-pei600:peptide:pnc-dtde-pnc=1:3:4将抗原肽（序列为siinfekl）、β-cd-pei以及pnc-dtde-pnc溶于1 ml dmso中，控制ph在7.4左右，再加入20 ulcy-7荧光染料孵育24~72 h，制备得到荧光标记的纳米疫苗。
65.皮下注射100 ul纳米疫苗到balb\c小鼠的尾根部（左右两侧各50 ul）中。分别在注射后6、12及24 h处死小鼠取出腹股沟淋巴结（lns）进行离体成像的拍摄。
66.如图8所示，纳米疫苗组小鼠双侧腹股沟在6 h，12 h，24 h均有较强荧光，游离组在6h，12 h虽有荧光但荧光强度明显比纳米疫苗组弱，24h荧光基本消失，这说明所制备的纳米疫苗具有较强的淋巴结富集能力。
67.3. 考察纳米疫苗的抑瘤效果：于day0于小鼠右上臂注射肿瘤细胞，给药前随机分成pbs组、游离组和纳米疫苗组，于day7及day14于尾根部给药。
68.如图9、10、11所示，纳米疫苗组小鼠的肿瘤体积和肿瘤重量相比pbs组和游离组明显减小，纳米疫苗组与pbs组、游离组的差异具有统计学意义，说明纳米疫苗能抑制肿瘤生长。
69.实施例51. 负载抗原肽（序列为asmtnmelm）的双佐剂纳米疫苗的构建：将与实施例1相同方法合成的β-cd-pei、与实施例1相同方法合成的pnc-dtde-pnc交联剂和抗原肽peptide（序列为asmtnmelm）按照官能团比例β-cd-pei600:peptide:pnc-dtde-pnc=1:3:4溶于1 ml dmso中，在25 ℃下搅拌24~48 h，用1500 da透析袋于纯水中透析除去dmso。将r848、cpg和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育1~12 h制得负载双佐剂的多肽纳米疫苗。
70.图12为制得的纳米疫苗的电镜图，本实施例获得的纳米疫苗载体的粒径为309.8
±
4.9 nm。
71.2. 考察纳米疫苗的抑瘤效果：于day0于小鼠右上臂注射肿瘤细胞，给药前随机分成pbs组、游离组和纳米疫苗组，于day7、day14及day21于尾根部给药。
72.如图13、14所示，纳米疫苗组小鼠的肿瘤体积均较pbs组和游离组小，纳米疫苗组2/5只小鼠肿瘤逐渐变小直至消失，说明纳米疫苗能抑制肿瘤生长。
73.3. 纳米疫苗肿瘤预防性能力评价：给药前随机分成pbs组、游离组和纳米疫苗组，于day-21、day-14及day-7于尾根部
给药，于day0于小鼠右上臂注射肿瘤细胞。
74.如图15所示，纳米疫苗组的肿瘤生长曲线均较pbs组和游离组平缓，说明纳米疫苗预防给药能一定程度上抑制肿瘤的生长速度。
75.实施例6将与实施例1相同方法合成的β-cd-pei、与实施例1相同方法合成的pnc-dtde-pnc交联剂和抗原肽peptide（序列为ylepgpvta）溶于1 ml dmso中，在25 ℃下搅拌12~36h，用1500 da透析袋于纯水中透析除去dmso。官能团比例β-cd-pei:peptide:pnc-dtde-pnc=0.5:3.5:4。
76.将聚肌苷酸胞苷酸（poly i:c）和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育12h，poly i:c通过静电作用吸附在载体上，制得负载poly i:c的多肽类纳米疫苗。本实施例获得的纳米疫苗载体的平均粒径约为140 nm。
77.实施例7将与实施例1相同方法合成的β-cd-pei、与实施例1相同方法合成的pnc-dtde-pnc交联剂和抗原肽peptide（序列为lcpgnkyem）溶于1 ml dmso中，在25 ℃下搅拌24~48 h，用1500 da透析袋于纯水中透析除去dmso。官能团比例β-cd-pei:peptide:pnc-dtde-pnc=4:1:3.5。
78.将r837和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育12h，r837通过β-cd的空腔包合在载体中，制得负载r837的多肽类纳米疫苗。本实施例获得的纳米疫苗载体的平均粒径约为430 nm。
79.实施例8将与实施例1相同方法合成的β-cd-pei、与实施例1相同方法合成的pnc-dtde-pnc交联剂和将模型肽（序列为ffqnk，仅氨基）溶于1 ml dmso中，在25 ℃下搅拌24~48h，用1500 da透析袋于纯水中透析除去dmso。官能团比例β-cd-pei:peptide:pnc-dtde-pnc=4:1:1。
80.将r848和制得的多肽类纳米疫苗载体在水溶液中共孵育12h，r848通过β-cd的空腔包合在载体中，制得负载r848的多肽类纳米疫苗。本实施例获得的纳米疫苗载体的平均粒径约为30 nm。