眼镜蛇粉或其水提物在制备抗肝癌药物中的应用的制作方法

1.本发明属于医药技术领域，具体涉及一种眼镜蛇粉或其水提物在制备抗肝癌药物中的应用。


背景技术：

2.肝癌是指发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌两种，人们日常说的肝癌指的多是原发性肝癌。肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，hcc)是全球性第五大常见肿瘤，具有预后恶劣和死亡率高等特点，致死率高居癌症死亡率前列。肝细胞癌(hcc)的发病机制极其复杂的，可以有多种原因，包括慢性乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染、接触黄曲霉毒素b1、酒精性和非酒精性脂肪性疾病等。肝癌以起病隐匿、高转移率和高复发率和高度异质性为特点，早期易转移与治疗后易复发成为引起患者死亡的最主要原因。
3.现有的治疗肝癌的方法包括手术切除术、放疗和化学药物治疗等，但由于肝癌本身的高复发性和高转移性的特点，其治疗的预后效果仍不理想。根治性切除术后，早期肝癌患者5年生存率显著延长，但复发转移仍是肝癌根治术的主要问题。化学药物治疗在肝癌的晚期治疗中发挥着重要作用，然而，肿瘤耐药性的产生导致化疗无效或疗效逐渐降低严重影响了患者的预后。因此，肝癌的治疗是一个棘手的问题，寻找肝癌治疗的新方法、新药物刻不容缓。中医中药治疗采取辨证施治、攻补兼施的方法，有助于改善全身状况和症状，是近年来的研究热点。
4.中药材用来治疗包括癌症在内的各种疾病已经有数千年的历史了，具有抗肿瘤活性的中药材可以为开发抗癌药物提供潜在的候选药物。眼镜蛇（学名：naja）为眼镜蛇属动物的通称，是眼镜蛇科的一属，其成员大多被统称为眼镜蛇。眼镜蛇的药材基源为眼镜蛇科动物眼镜蛇naja naja (linaeus)除去内脏的全体，具有通经络，袪风湿的作用，主风湿痹痛；中风瘫痪；小儿麻痹症。干燥的蛇体中含有具降压作用的肌苷（inosine）和甲状旁腺提取物。目前对于眼镜蛇的研究大都是关于眼镜蛇毒方面，在眼镜蛇毒的抗肿瘤方面已有较多的研究报道。如，题名为《眼镜蛇毒细胞毒素对人肝癌细胞增殖抑制活性及作用机制的研究》，作者：王艳，林礼务，陈志奎等，这篇文献公开了眼镜蛇毒细胞毒素（ctx）对人肝癌bel-7404细胞具有明显的抑制增殖作用。蛇毒是毒蛇从毒腺中分泌出来的一种液体，眼镜蛇的毒腺斜位于头部后侧上方，与尖牙相连。目前对于眼镜蛇毒的抗肿瘤、抗肝癌方面已有相关的研究报道，但对于去除内脏和头部后的眼镜蛇干燥蛇体的抗肝癌方面，尚未见有相关报道。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种眼镜蛇粉或其水提物在制备抗肝癌药物中的应用。本发明首次公开了眼镜蛇粉或其水提物具有抑制肝癌细胞增殖和肿瘤生长的作用，可用于制备抗肝癌的药物，为肝癌的治疗提供了新的药物来源。
6.为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：眼镜蛇粉或其水提物在制备抗肝癌药物中的应用。
7.所述的眼镜蛇为眼镜蛇科动物眼镜蛇naja naja (linaeus)除去内脏的全体，眼镜蛇粉是由去除内脏和头部后的干蛇段粉碎而得。
8.所述的眼镜蛇粉水提物的提取方法为：称取眼镜蛇粉，加入4-16倍量的纯净水浸泡1-2h，然后加热煮沸0.5-2h，过滤，滤渣再水提2次，每次加4-12倍量水，加热煮沸0.5-2.0h，合并滤液，即得眼镜蛇粉水提物。制得的眼镜蛇粉水提物在应用时可根据实际需要进行适当浓缩。
9.上述的眼镜蛇粉或其水提物选择性添加药剂学上允许的常规辅料，按照常规工艺制成临床可接受的用于抗肝癌的药物制剂。
10.上述的眼镜蛇粉或其水提物在制备抗肝癌药物中的应用，所述的眼镜蛇粉或其水提物可单独或与其他药物一起制成抗肝癌的药物制剂。
11.上述的眼镜蛇粉或其水提物在制备抗肝癌药物中的应用，所述的抗肝癌药物包括抑制肝癌细胞增殖和/或肿瘤生长的药物。
12.本发明的有益效果为：1、本发明首次公开了眼镜蛇粉或其水提物具有抑制肝癌细胞增殖和肿瘤生长的作用，可用于制备抗肝癌的药物，为肝癌的治疗提供了新的药物来源。
13.2、本发明所述的眼镜蛇粉是由去除内脏和头部后的眼镜蛇干蛇段粉碎而得，相比于眼镜蛇毒的成分复杂以及由于眼镜蛇毒细胞毒素作用的非特异性而较难实际广泛应用于临床抗肿瘤的情况，本发明所提供的眼镜蛇粉或其水提物的提取制备方法简单，而且更易于临床应用，应用前景好。
14.3、本发明通过对眼镜蛇粉及其水提物进行抗肝癌作用的实验研究，实验结果表明，眼镜蛇粉及其水提物均有明显抗肝癌作用，可用于制备抗肝癌的药物。
具体实施方式
15.实施例1眼镜蛇粉的制作：将去除内脏和头部后的眼镜蛇naja naja (linaeus)干蛇段进行粉碎得到眼镜蛇粉；眼镜蛇粉水提物的提取方法为：称取眼镜蛇粉，加入15倍量的纯净水浸泡2h，然后加热煮沸2h，过滤，滤渣加10倍量水，加热煮沸2h，过滤，滤渣加10倍量水，加热煮沸1h，过滤，合并滤液，即得眼镜蛇粉水提物。
16.实施例2眼镜蛇粉的制作：将去除内脏和头部后的眼镜蛇naja naja (linaeus)干蛇段进行粉碎得到眼镜蛇粉；眼镜蛇粉水提物的提取方法为：称取眼镜蛇粉，加入4倍量的纯净水浸泡1h，然后加热煮沸0.5h，过滤，滤渣再水提2次，每次加4倍量水，加热煮沸0.5h，合并滤液，即得眼镜蛇粉水提物。
17.实施例3眼镜蛇粉的制作：将去除内脏和头部后的眼镜蛇naja naja (linaeus)干蛇段进
行粉碎得到眼镜蛇粉；眼镜蛇粉水提物的提取方法为：称取眼镜蛇粉，加入10倍量的纯净水浸泡1.5h，然后加热煮沸1.5h，过滤，滤渣再水提2次，每次加8倍量水，加热煮沸1.0h，合并滤液，即得眼镜蛇粉水提物。
18.实施例4眼镜蛇粉的制作：将去除内脏和头部后的眼镜蛇naja naja (linaeus)干蛇段进行粉碎得到眼镜蛇粉；眼镜蛇粉水提物的提取方法为：称取眼镜蛇粉，加入16倍量的纯净水浸泡2h，然后加热煮沸2h，过滤，滤渣再水提2次，每次加12倍量水，加热煮沸2.0h，合并滤液，即得眼镜蛇粉水提物。
19.实施例5 药效试验眼镜蛇粉或其水提物抗肝癌作用的实验研究：1材料1.1动物：昆明种小鼠，体重18～22g，雌雄各半，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，生产许可证号：scxk（湘）2019-0004。广西中医药大学实验动物中心资质号：syxk桂2019-0001。饲养环境：室温20～30℃，相对湿度60%～80%。
20.1.2药物与试剂眼镜蛇为眼镜蛇科动物眼镜蛇naja naja (linaeus)除去内脏的全体。眼镜蛇粉由去除内脏和头部的干蛇段粉碎而得，由广西金圣堂生物医药科技有限公司提供，超微细粉由广西中医药大学药剂实验室加工制备。眼镜蛇超微细粉混悬液高剂量组配制：精密称取眼镜蛇超微细粉20g，加纯净水至80ml。眼镜蛇超微细粉混悬液低剂量组配制：精密称取眼镜蛇超微细粉10g，加纯净水至80ml。眼镜蛇水提液高剂量组溶液制备：称取眼镜蛇粉200g，加15倍纯净水浸泡2h，加热煮沸2h，过滤，滤渣加10倍量水，加热煮沸2h，过滤，滤渣加10倍量水，加热煮沸1h，过滤，合并滤液，浓缩定容至200gml。眼镜蛇水提液低剂量组溶液制备：取眼镜蛇水提液高剂量组溶液60ml，加水定容至120ml。
21.新生牛血清（厂家：浙江天杭生物科技股份有限公司，批号：21100201）；rpmi.1640不完全培养液（厂家：江苏凯基生物技术股份有限公司，批号：20220106）；环磷酰胺一水合物（厂家：上海麦克林生化科技有限公司，批号:c13640176）；二甲基亚砜（dmso）（厂家：solarbio，710n0311）；cck-8试剂盒（厂家：medchemexpress，批号：149170）。
22.1.3细胞株：h22细胞购于南京凯基生物有限公司。
23.1.4仪器：sw-cj
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1f洁净工作台（厂家：苏净集团苏州安泰空气技术有限公司）；tdz4-ws低速台式离心机（厂家：湘仪离心机仪器有限公司）；galaxy 170s co2培养箱（厂家：new srunswick）；酶标仪；model eclipse ts2显微镜(厂家：nikon corporation)；l-204电子天平（梅特勒-托利多中国分公司）。spectramaxiid3酶标仪(厂家：molecvlab devices)。
24.2.实验方法2.1抗肿瘤作用研究2.1.1细胞培养将肝癌h22细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，轻轻振摇，使管中
液体迅速融化；待冻存管内液体完全溶解，取出用酒精棉球擦拭冻存管的外壁，在超净工作台上将其打开，用消毒过的胶头滴管吸取细胞液加入到离心管中，再缓慢加入含有10%新生牛血清的1640细胞培养液，离心（1000rpm，5min），弃上清液，沉淀部分即得细胞，加入2ml含rpmi1640完全培养液冲洗离心管，转入培养瓶，再加入5ml含rpmi1640完全培养液，使沉淀细胞形成细胞悬液，置5%co2培养箱，37℃培养，3天～5天长满，分瓶，换入新鲜完全培养液继续培养。
25.2.1.2细胞冻存取对数生长期的h22细胞，0.4%trypan blue，显微镜下计数活细胞，活细胞数应大于90%。并于1000rmp/min离心5min，去除培养液，加入配制好的冻存液(含10%dmso的rpmi1640完全培养)，冻存液中细胞的终浓度为5
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106个/ml～1
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107个/ml，吹打至细胞混匀，分装于无菌冻存管，密封，用冻存盒进行冻存于-80℃超低温冰箱冷冻。
26.2.1.3 h22细胞悬液的制备无菌离心（1000rpm，5min）收集h22细胞，用无菌生理盐水悬浮，调整细胞浓度为1.0
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106个/ml，备用。取雌性昆明小鼠18只，用75%酒精消毒腹部皮肤后，以0.2ml/只接种上述h22细胞，于12天后，无菌抽取腹水，于超净工作台内用无菌生理盐水稀释细胞数至1.0
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107个/ml。
27.2.1.4分组与给药小鼠18～22g，雌雄各半。将适应3天的小鼠随机分成6组，即模型对照组、环磷酰胺阳性对照组（0.015g/kg）、蛇粉高（7.5g/kg）、低（3.75g/kg）剂量组和蛇粉水提物高（30g/kg）、低（15g/kg）剂量组，每组10只。除模型组给生理盐水外，各组动物空腹灌胃给予相应药物，给药容积为30ml/kg。每天灌胃给药一次，连续三周，各鼠每隔3天称重并调整给药体积。给药第22天将制备的肿瘤悬液以0.2ml/只无菌接种于各小鼠右侧腋部。接种后阳性组腹腔注射环磷酰胺一水合物（给药剂量为0.015g/kg，给药体积为20ml/kg），余组均腹腔注射生理盐水，每天一次，同时各给药组均按上述方法继续灌胃给药10天。
28.2.1.5观察指标与观察方法末次药后第二天，小鼠颈椎脱臼处死，迅速解剖取出瘤块，剔除脂肪组织，称瘤质量，并计算抑瘤率。
29.瘤重抑制率=（空白组平均瘤质量－给药组平均瘤质量）/ 空白组平均瘤质量
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100%2.3 统计学处理应用excel对所得实验数据进行t检验。计量资料用表示，采用单因素方差分析，两两比较采用t检验，p≤0.05表示有显著性差异， p≤0.01表示有非常显著性差异。
30.3.实验结果3.1蛇粉及水提物抗肿瘤作用由表1结果可知，与模型对照组比较，蛇粉水提物高、低剂量组，蛇超微细粉高、低剂量组均可降低瘤质量 (p＜0.05～0.01)，瘤重抑制率分别为56.42%、41.51%、69.06%、49.81%。
31.4.小结实验结果表明，眼镜蛇粉及眼镜蛇粉水提物均有明显抗肝癌作用。