基于生物正交点击化学反应捕获BMSCs在骨领域中的应用

基于生物正交点击化学反应捕获bmscs在骨领域中的应用
技术领域
1.本发明属于医学领域，具体涉及骨领域，尤其涉及一种基于生物正交点击化学反应在骨领域中的应用。


背景技术：

2.钛基材料是最常用的生物医用金属材料，但钛材料具有生物惰性，植入骨组织后常导致钛-骨界面成骨能力弱，组织纤维化，尤其是疏松的骨组织，钛植入物易发生无菌性松动等。如何将钛材料惰性表面改性成生物活性表面，促钛植入物骨整合是生物材料研究的热点。
3.骨髓中的间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,bmscs)是参与钛植入物界面骨整合的重要种子细胞，bmscs可以募集到钛植入物表面并促成骨分化，最终在钛植入物表面形成连续的骨组织，提高植入物-骨界面的结合力。因此，钛植入物要实现良好的骨整合，需要依赖bmscs的促成骨分化能力。此外，其可用于骨再生修复领域。
4.生物正交点击化学是一个全新的领域。生物正交反应，最早由美国bertozzi教授提出，是指能够在活体生物内进行的，且不干扰活体生物正常生理化学过程的一类化学反应。生物正交功能基团修饰是一种功能强大的代谢修饰策略，通过细胞代谢工程，在细胞或生物体培养液中添加含叠氮基团、炔烃、醛基等功能基团的糖、脂、氨基酸类似物，通过生物体自身新陈代谢将这些结构类似物替换掉糖类、脂类等天然分子，再与携带反应基团的标记物发生点击化学反应，而形成稳定的共价连接，最终实现功能基团的化学标记。细胞代谢工程利用活体或细胞的天然代谢过程，且对细胞代谢过程的一系列中间产物和终产物生物活性影响极小，是一种理想的无损修饰方式。
5.贻贝仿生多肽改性钛材料表面是一种简便、高效的方法，通过一步浸泡法即可将携带生物活性大分子的仿生多肽接枝到钛材料表面，形成生物活性表面，发挥生物活性分子的促骨整合和骨再生修复作用。但是，这种依赖生物活性分子的改性方法，易受环境的影响，且易失活、降解等，而且bmsc的数量是有限的，而在钛材料植入骨组织后募集并进入到钛-骨界面的干细胞数量更少。因此，亟需发明一种新的可用于骨领域的钛材料。


技术实现要素：

6.本发明设计了一种基于生物正交反应的促进钛植入物骨整合和骨再生修复策略，通过不受环境影响的，且不干扰细胞正常生理功能的，更加稳定的生物正交反应化学基团来替代生物活性分子，来实现间充质干细胞的捕获并使其结合于材料表面，发挥干细胞的成骨分化，促进骨整合和骨再生修复。
7.具体的，本发明的技术方案如下：
8.本发明第一个方面公开了一种钛植入物，接枝有叠氮基团n3的骨髓间充质干细胞与贻贝仿生多肽修饰的钛材料结合，得到所述钛植入物。
9.优选的，骨髓间充质干细胞通过叠氮基团与钛材料表面的dbco基团发生生物正交
点击化学反应，被捕获并结合于钛材料表面。
10.优选的，所述钛植入物为钛螺钉。
11.本发明第二个方面公开了一种基于生物正交点击化学反应促进骨整合和/或骨再生修复的方法，将通过生物正交点击化学反应得到的钛植入物植入动物体内，促进骨整合和/或骨再生修复。
12.优选的，接枝有叠氮基团n3的骨髓间充质干细胞与贻贝仿生多肽修饰的钛材料结合，得到所述钛植入物。
13.优选的，使用多糖处理骨髓间充质干细胞使得骨髓间充质干细胞表面接枝了叠氮基团n3。
14.更优选的，所述多糖的浓度为0-100μmol/l。
15.在本发明的一些具体实施例中，所述多糖的浓度为20-30μmol/l。
16.优选的，利用fmoc固相合成法合成dbco修饰的贻贝仿生多肽。
17.更优选的，所述贻贝仿生多肽通过dopa基团与钛表面的tio2发生配位作用从而接枝到所述钛材料表面。
18.本发明第三个方面公开了上述的钛植入物在骨领域中的应用。优选的，公开了上述的钛植入物在骨整合和/或骨再生修复中的应用。
19.与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
20.本发明设计发现了一种新型钛植入物，该钛植入物基于生物正交点击化学反应得到，其不干扰细胞正常生理功能的，可充分发挥干细胞的成骨分化，且性质更加稳定，可用于促进骨整合和骨再生修复，为骨损伤患者带来了福音。
附图说明
21.图1为多糖对大鼠bmscs细胞干性标志表达的影响。流式细胞术检测不同浓度多糖处理后bmscs表面cd90、cd29、cd34和cd45的表达结果(a)及进一步定量分析结果(b)。(n＝3，“*”表示具有统计学差异，“ns”表示各组间均无统计学差异)
22.图2为多糖对大鼠bmscsalp活性的影响。大鼠bmscs成骨诱导7天后alp染色结果(a)和alp活性测定(b)。(n＝3，“*”表示具有统计学差异，*p《0.05，**p《0.01)
23.图3为多糖对大鼠bmscs钙结节形成的影响。大鼠bmscs成骨诱导14天后茜素红染色结果(a)和茜素红定量分析(b)。(n＝3，“*”表示具有统计学差异，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001)
24.图4为多糖对大鼠bmscs成骨基因表达的影响。大鼠bmscs成骨诱导7天后成骨相关基因alp(a)和opn(b)的表达。(n＝3，“*”表示具有统计学差异，*p《0.05，**p《0.01，****p《0.0001)
25.图5为多糖对大鼠bmscs软骨分化的影响。大鼠bmscs成软骨诱导14天后甲苯胺蓝染色结果。
26.图6为多糖对大鼠bmscs成脂分化的影响。大鼠bmscs成脂诱导14天后，油红o染色结果(a)，及pcr检测成脂相关基因adiponectin(b)和ppar-γ(c)的表达。(n＝3，“*”表示具有统计学差异，*p《0.05，****p《0.0001)
27.图7为不同浓度多糖处理的大鼠bmscs与荧光探针结合后的显色示意图。
28.图8为不同浓度多糖处理的大鼠bmscs与荧光探针结合后的荧光定量。流式细胞术(a)测定不同浓度多糖处理的大鼠bmscs与荧光探针反应后荧光强度及定量结果(b)。(n＝3，“*”表示具有统计学差异，*p《0.05，****p《0.0001)
29.图9为设计合成的仿生多肽ei-ms质谱分析。分析结果显示合成的多肽[m-h]-为1825.0。
[0030]
图10为仿生多肽修饰对钛材料表面各类元素的影响。xps(a)和eds(b)表征钛片表面化学元素组成结果，n元素含量对照组4.95％，实验组8.49％，n/ti原子比从0.75提高至2.46(n＝3)。
[0031]
图11为仿生多肽修饰对钛材料表面粗糙程度的影响。原子力显微镜观察钛片表面形态结果。
[0032]
图12为仿生多肽修饰对钛材料表面亲疏水性的影响。普通钛片和多肽接枝后钛片的水接触角测量(a)及定量结果(b)。(n＝3，“*”表示具有统计学差异，**p《0.01)
[0033]
图13为bmsc-n3与钛表面dopa-dbco结合后的钙结节形成能力。成骨诱导14和21天，茜素红染色(a)和茜素红定量(b)结果。(n＝3，“ns”表示不存在统计学差异)
[0034]
图14为钛螺钉-骨界面影像学评价。micro ct扫描定量分析螺钉周围骨整合情况。(n＝5，“*”表示具有统计学差异，*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001)
[0035]
图15为钛螺钉-骨界面组织学评价。硬组织切片钛螺钉-骨界面形态学和定量分析结果。(n＝3，“*”表示具有统计学差异，**p《0.01，***p《0.001，****p《0.0001)
[0036]
图16为钛螺钉抗拔出力测试结果。具体为各组钛螺钉载荷位移曲线和最大抗拔出力分析结果。(n＝3，“*”表示具有统计学差异，*p《0.05，****p《0.0001)
具体实施方式
[0037]
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案进行详细描述，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。
[0038]
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。本发明所用试剂和原料均市售可得。
[0039]
实施例1
[0040]
一、多糖修饰骨髓间充质干细胞的表征及生物学功能鉴定
[0041]
1.1.ac4mannaz多糖对大鼠bmscs的干性标志表达的影响
[0042]
为了评估ac4mannaz多糖处理后，bmscs的干细胞特性是否发生了变化，我们通过流式细胞术检测了bmscs细胞表面间充质干细胞标志物的变化情况。不同浓度多糖(0μmol/l、5μmol/l、25μmol/l、50μmol/l、100μmol/l)处理bmscs后，干细胞表面cd29、cd90、cd34和cd45的表达与未采用多糖处理的干细胞无显著差异(图1a)，cd29和cd90均高表达(超过99％)，而cd34和cd45显著低表达(低于5％)。进一步定量分析也表明，多糖处理后未影响bmscs表面cd29、cd90、cd34和cd45的表达(图1b)。
[0043]
1.2.ac4mannaz多糖对大鼠bmscs三系分化的影响
[0044]
我们通过分析细胞成骨、成软骨、成脂分化能力是否发生变化，评估多糖对bmscs分化能力的影响。
[0045]
1.2.1成骨分化：
[0046]
①
碱性磷酸酶(alp)染色：成骨诱导培养基诱导7天后，行碱性磷酸酶染色，结果显示：25μmol/l多糖处理后的bmscs与未采用多糖处理的bmscs两组间呈阳性染色的细胞量无明显差别，而空白对照组因未采用成骨诱导培养基诱导未见明显阳性染色(图2a)。alp活性的定量分析结果也表明，对照组和实验组之间无显著差异(图2b)。
[0047]
②
茜素红染色：成骨诱导14天后，行茜素红染色，结果显示对照组与实验组间染色强度无显著差异，表明25μmol/l多糖处理后的bmscs与未处理bmscs经成骨诱导后两组间钙结节沉积水平无差异，而空白对照组未见明显钙沉积(图3a)。茜素红定量染色结果，也表明对照组与实验组间无显著差异(图3b)。
[0048]
③
实时定量逆转录聚合酶链反应(qrt-pcr)：成骨诱导7天后，采用qrt-pcr测定成骨基因的转录水平，测定指标包括包括碱性磷酸酶(alp)和骨桥蛋白(opn)。如图4所示，多糖处理组成骨基因的表达与未处理组bmscs经成骨诱导后无明显差异。以上结果均表明，多糖处理bmscs后，bmscs的成骨分化能力未受影响。
[0049]
1.2.2成软骨分化：
[0050]
①
甲苯胺蓝染色：成软骨诱导培养基诱导14-16天后，行甲苯胺蓝染色，结果提示，对照组和实验组两组间呈阳性染色数量无明显差别，而空白对照组因未采用成软骨诱导培养基进行诱导培养，未见阳性染色区域(图5)。
[0051]
1.2.3成脂分化
[0052]
①
油红o染色：成脂诱导14-16天后行油红o染色，观察脂滴的形成情况。油o染色结果提示，对照组与实验组bmscs经成脂诱导培养基诱导14天后，均有大量的脂滴形成，两组间无明显差异(图6a)。
[0053]
②
逆转录-聚合酶链式反应(rt-pcr)：成脂诱导培养基诱导bmscs成脂分化7天后，行pcr测定成脂相关基因adiponectin和ppar-γ的转录水平。pcr结果显示：经成脂诱导培养基诱导后，对照组与实验组adiponectin和ppar-γ的表达无明显差异(图6b和c)。上述染色和pcr结果表明多糖处理对bmscs成脂分化能力无明显影响。
[0054]
1.3大鼠bmscs表面叠氮基团(n3)的检测
[0055]
为了检测大鼠bmscs表面是否接枝了叠氮基团n3，采用带dbco的荧光探针去检测细胞表面n3的表达。荧光染色结果表明，大鼠bmscs经含多糖培养基培养后，叠氮基团n3顺利接枝于细胞表面，与普通培养基相比，采用含多糖培养基培养的bmscs显示明显的荧光信号，而普通培养基培养的bmscs未见荧光信号(图7)。我们进一步测定不同浓度的多糖处理的bmscs是否表现不同强度的荧光，我们采用5μmol/l，25μmol/l、50μmol/l和100μmol/l多糖培养大鼠bmscs，荧光染色结果表明，随着多糖浓度的升高，bmscs表面荧光强度逐步升高(图7)。
[0056]
流式细胞术测定不同浓度多糖处理后bmscs表面荧光强度，结果也表明随着多糖浓度的提高(0至100μmol/l)，bmscs表面的荧光强度逐步升高(图8a)，荧光染色定量分析结果表明，随着多糖浓度的升高，bmscs表面的荧光强度升高，且各组间均存在统计学差异，50μmol/l和100μmol/l多糖处理后表面荧光强度明显高于25μmol/l(图8b)。但结合cck-8结果，这两种浓度下，bmscs增殖活力明显受到影响，因此，本研究中采用25μmol/l多糖干预细胞，细胞活力不受影响，并可检测到明显的荧光信号。
[0057]
二、贻贝仿生多肽修饰钛植入物表面的表征鉴定
[0058]
2.1xps和eds测定钛材料表面化学组成
[0059]
利用fmoc固相合成法合成dbco修饰的钛亲和性贻贝仿生多肽，多肽序列为：ac-(dopa)-gly-(dopa)-lys[(peg5)-(mpa)-(mal-dbco)]-(dopa)-gly-(dopa)。该多肽通过dopa基团可以与钛材料表面tio2发生配位作用，而接枝到钛材料表面。通过hplc和ei-ms质谱分析测定了多肽的纯度和分子量，结果显示该多肽纯度为97.35％，多肽的[m-h]-为1825.0，与计算所得的多肽分子量1825.94一致(图9)。
[0060]
为了明确钛材料表面接枝多肽后，化学元素组成的变化，xps能谱对钛片表面进行表征，结果显示，钛片接枝多肽后，表面元素组成呈明显的n1s信号增强表现，表明钛材料浸泡多肽后，多肽通过配位键成功接枝于钛材料表面，表现n元素组成的增强(图10a)。此外eds能量色散x射线光谱仪行元素的定量分析(图10b)，结果显示，钛片浸泡多肽后，n元素的含量显著高于浸泡前(对照组4.95
±
1.00％vs.实验组8.49
±
1.96％)，n/ti原子比从0.75提高至2.46。表明多肽接枝于钛材料表面后引入了n元素。
[0061]
2.2原子力显微镜检测钛片表面形态
[0062]
为了评估多肽接枝钛材料后，钛材料表面形态及粗糙程度，afm显微镜观察修饰及未修饰的钛材料表面。如图11所见，钛材料表面形态尚规则，而多肽接枝后钛材料表面粗糙程度明显增加，也间接证实多肽顺利接枝。
[0063]
2.3水接触角测定钛表面接枝多肽后的亲水/疏水性
[0064]
为了评估多肽接枝后钛材料表面的亲水疏水性，行水接触角测定。如图12，未接枝多肽的钛片本身显示出疏水性，水接触角平均值为45.80
±
4.67
°
，而接枝钛片后水接触角显著减少，平均值为22.60
±
2.96
°
，表明接枝多肽后改变了钛材料本身的疏水性，水接触角明显减小，亲水性明显增加，有利于钛材料发挥作用。
[0065]
实施例2
[0066]
一、基于生物正交点击化学反应促进钛植入物骨整合
[0067]
1.bmsc-n3与dopa-dbco多肽修饰的钛材料结合后的成骨分化能力
[0068]
为了检测修饰了叠氮基团的bmscs与dopa-dbco多肽修饰的钛材料结合后，细胞与材料表面发生化学反应bmscs的成骨分化能力是否受影响。将多糖修饰或未修饰的bmscs接种于不同钛材料表面，并行成骨诱导分化。
[0069]
第14及21天茜素红染色结果也表明，除空白对照组外，其余各组钙结节沉积阳性染色区域各组间无明显差异(图13a)，茜素红定量结果各组也没有明显差异(图13b)。早期成骨相关检测(alp染色)和后期骨基质矿化(茜素红染色)均表明，bmscs通过叠氮基团与钛材料表面dbco基团发生反应，被捕获并结合于钛材料表面，这一化学反应对bmscs成骨分化能力未受影响。
[0070]
2.bmsc-n3与tio
2-dopa-dbco促钛植入物骨整合的体内研究
[0071]
按照严格的无菌要求，进行动物实验，手术相关器械或其它物品均提前进行灭菌处理。通过反复多次预实验，熟练掌握了股骨外侧髁的暴露，确定了钛螺钉置入点。完成动物实验，并进行4周细致饲养后，收集股骨标本，进行实验。
[0072]
二、钛螺钉-骨界面影像学分析
[0073]
将收集的股骨标本，进行micro ct检查，评估钛螺钉表面新骨形成情况，比较各组骨整合的差异。在相同的感兴趣区域(volume ofinterest，voi)，多糖修饰的bmscs及多肽
修饰的钛螺钉组(bmscs-n3+tio
2-dbco组)各骨参数均明显优于其它组，该组显示出更高的骨体积分数(bv/tv)和骨表面积密度(bs/tv)，以及更低的骨表面积骨体积比(bs/bv)，且与其它组相比均有统计学差异。bmscs-n3+tio
2-dbco组钛螺钉周围骨小梁结构表现出最佳的骨整合状况：骨小梁数目(tb.n)平均值明显优于其它各组，且均具有统计学差异；骨小梁平均厚度(tb.th)平均值均优于其它组，除tio2+bmscs-n3组外，与其它组相比有统计学意义；而骨小梁分离度(tb.sp)平均值则低于其它各组，与不加bmscs的两组相比有统计学差异(图14)。
[0074]
以上micro ct的数据分析结果表明，n3基团修饰bmscs以及dbco多肽修饰钛材料，这种双修饰的策略可以显著提高钛植入物表面的骨整合。
[0075]
三、钛螺钉-骨界面组织学分析
[0076]
组织学研究是直接观察钛螺钉植入物周围骨组织形态的有效方法，我们采用硬组织切片甲苯胺蓝染色来研究各组钛螺钉周围的骨整合情况，如图15所示，单纯拧入钛螺钉，未注入bmscs组，钛螺钉周围骨组织生成明显少于其它几组，而bmscs-n3+tio2-dbco组则较其它组具有更好的骨长入，且可以看到有连续的骨基质覆盖螺钉表面。骨-植入物接触(bic)是定量分析骨整合程度的指标，如图15所示，bmscs-n3+tio
2-dbco组bic显著优于其它各组，表明该组具有良好的骨整合。以上结果表明，基于生物正交点击化学反应，bmscs和钛材料双重修饰后，细胞表面叠氮基团和材料表面的dbco基团发生点击化学反应，可以使更多的bmscs结合于材料表面，发挥bmscs的成骨分化作用，使钛螺钉具有更好的骨整合。
[0077]
四、钛螺钉-骨界面生物力学测试
[0078]
通生物力学测试检测钛螺钉的抗拔出力，评估螺钉与周围骨组织的骨整合情况。螺钉与周围骨组织结合越稳定，抗拔出力越强。如图16所示，与单纯钛螺钉组和钛螺钉修饰组相比，加入bmscs的各组抗拔出力明显提高，且bmscs-n3+tio
2-dbco组具有最好的抗拔出力，表明加入bmscs后提高了螺钉局部种子细胞的数量，bmscs在螺钉周围促成骨分化，提高了骨整合强度和抗拔出力。但是单纯加入bmscs，细胞可能难以大量结合于材料表面，大部分细胞会流失而不能发挥作用，而通过将叠氮基团修饰到bmscs表面，可以通过点击化学反应使bmscs-n3被tio
2-dbco大量捕获并结合于材料表面，使钛材料表面的种子细胞数量明显增加，更能提高骨整合效率。生物力学测试的结果与硬组织切片一致，表明生物正交点击化学修饰的策略可以很好的提高钛植入物周围骨整合，弥补钛材料生物惰性的缺点，防止钛材料松动等引起植入手术失败。
[0079]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。