本发明涉及疾病治疗领域，特别地涉及年龄相关性黄斑变性(amd)的神经再生药物及疗法。发明背景年龄相关性黄斑变性(amd)、色素性视网膜炎(rp)、晚期青光眼和糖尿病性视网膜病等是常见的致盲疾病[1]。目前对于恢复视力或延缓视力退化是一项悬而未决的难题，因此，这些致盲疾病亟需有效的治疗方法，[2]。最近有研究发现在某些脑区和视网膜中可进行基因重编程，并原位再生出神经元，这些研究结果为挽救视觉系统的神经退行性疾病和改善视觉带来了曙光(综述参见[2])。在中枢神经系统中，过表达转录因子如nd1[3；4；5]、ascl1[6]、sox2[7]或者敲降ptbp1[8]可在体内将星形胶质细胞重编程为功能性神经元，并修复退化或受损的大脑。在视网膜中，穆勒细胞是一种主要的胶质细胞，具有较强的再生能力。在一些低等脊椎动物中，这种类型的细胞能自发地修复损伤后的视网膜[9；10]，而哺乳动物则没有这种自我修复的能力(综述参见[2])。近年来，相继有研究报道利用不同方法在成年的哺乳动物中可成功将穆勒细胞转化为视网膜神经细胞，其中有部分研究通过视网膜神经再生恢复了实验动物退化的视力。这些方法包括在穆勒细胞中过表达不同转录因子，如ascl1[11；12]，oxt2、crx和nrl[13]，或math5和brn3([33])，或者敲低基因ptbp1等[8]。有些方法还需要特定的处理，例如表观遗传修饰[11]、stat信号传导途径的抑制[12]、用连环蛋白预处理触发穆勒细胞的增殖或提高再生效率[13]。不同的方法能使穆勒细胞转变成不同的视网膜神经元，应用于具有感光细胞转导基因缺陷的小鼠的模型[13]，或者具有神经节细胞损伤的青光眼模型[14][8]。值得一提的是，由于amd疾病机理仍未阐明，早期预防可能无法在此疾病模型中发挥最佳功效。干性amd是一种严重的感光细胞退化性疾病，其由视网膜色素上皮(rpe)的损伤引起。移植rpe、感光细胞或两者同时移植的治疗策略已经在干性amd患者或动物中获得一定疗效并验证了部分理论(综述参见[15])。但感光细胞的来源主要来自干细胞或胚胎视网膜组织。从穆勒细胞再生感光细胞尚未在amd模型上进行验证。在本发明中，我们在amd模型中测试了感光细胞退化是否可以通过在穆勒细胞中过表达单个转录因子ascl1而得到修复。本发明证明，通过基于ascl1的基因治疗进行的体内转分化可以在amd模型动物中再生感光细胞，并且即使在疾病晚期也可以一定程度上挽救损失的视力，因此可能是未来临床治疗的潜在方案。发明概述首先提供了一种年龄相关性黄斑变性(amd)的神经再生治疗方法，包括：通过过表达单一神经元转录因子ascl1将穆勒胶质细胞(mg)重编程为光感受器细胞样细胞，从而治疗年龄相关性黄斑变性(amd)。在该方面的一个实施方案中，所述单一神经元转录因子ascl1通过腺相关病毒(aav)载体引入到所述穆勒胶质细胞(mg)中。在该方面的一个实施方案中，所述腺相关病毒(aav)载体血清型为aav9。在该方面的一个实施方案中，所述腺相关病毒(aav)载体通过视网膜下注射方式进行。其次，提供了一种年龄相关性黄斑变性(amd)的神经再生治疗药物，其包含：装载转录因子ascl1编码序列的病毒载体，所述药物被配制为用于处理穆勒胶质细胞(mg)使其过表达ascl1将其重编程为感光细胞，从而治疗年龄相关性黄斑变性(amd)带来的视觉退化。在该方面的一个实施方案中，所述病毒载体为腺相关病毒(aav)载体。在该方面的一个实施方案中，所述腺相关病毒(aav)载体为aav9血清型。在该方面的一个实施方案中，所述腺相关病毒(aav)载体被配制为可通过视网膜下注射方式施用的形式。在另一方面，提供了一种用于实施以上方面的年龄相关性黄斑变性(amd)的神经再生治疗方法的试剂盒，其包括含编码神经元转录因子ascl1的腺相关病毒(aav)载体，在穆勒胶质细胞(mg)中过表达ascl1以将其重编程为感光细胞，从而治疗年龄相关性黄斑变性(amd)。本发明不限于以上所描述的特定方面和具体实施方案，而是可以通过本领域技术人员已知的其它等同方式来实现本发明的目的。附图简述现在参照以下附图来详细说明本发明。图1.小鼠视网膜中穆勒胶质(mg)细胞通过过表达ascl1转化为感光细胞。(a)显示了在mg特异性启动子gfap启动下表达gfp或ascl1-gfp的aav9载体的图谱。(b)显示了病毒进入视网膜是通过视网膜下腔注射方式的示意图。(c)显示了ascl1组中mg细胞在病毒注射后的第3、5、10天(dpi)表现的形态结构，以及在相对较早的时间点观察病毒的效力。sox9(红色)染色显示mg细胞的细胞核。星号指向共定位的gfp+sox9+细胞，表明ascl1感染的mg细胞数量随时间而增加。比例尺为20μm。(d)显示了视网膜在gfp组(对照，上排)或ascl1-gfp组(下排)中病毒注射后2、4、8周(wpi)的情况。视网膜切片中gfp(绿色，病毒感染细胞)、视紫红质(红色，视杆细胞)和dapi(蓝色，细胞核)染色的共聚焦显微图像。白色箭头表示在ascl1组(而非对照组)中视紫红质和gfp的共定位，其表明含ascl1病毒感染的mg细胞转化为视杆样感光细胞。方框内的图像为共标记细胞的放大细节。os，外段层；is，内段层；onl，外核层；inl，内核层。(e)显示对照组和ascl1-gfp组中2、4和8wpi的gfp+细胞中纤毛的数量统计柱状图。2wpi、4wpi和8wpi分别有n＝3、3、4只小鼠。图2.amd小鼠模型的形态和功能分析。(a)上排图：正常视网膜和注射碘酸钠后1周(amd)的视网膜中的玻璃膜疣样结构的眼底照片。下排图：正常和amd小鼠中视网膜的oct(光学相干断层扫描)图像。白色方框表示上图中的放大区域。(b)苏木精和伊红(h&e)染色的视网膜代表性图片；上图显示了带有晶状体的完整视杯，且上图中的加框区域在下方显示放大细节。(c)上图：正常视网膜和amd 1周视网膜中的onl层数量。下图：两组中从中央到周边区域的视网膜厚度。与正常组相比，在amd小鼠模型中onl的层数明显减少，并且视网膜厚度显著变薄。每组n＝3只小鼠。**,p<0.01，t检验分析。(d)正常和amd 1周小鼠的rpe染色代表性图片，紧密连接蛋白用zo-1(红色)染色和细胞核用dapi(蓝色)染色。与正常小鼠中rpe的清晰六边形结构相比，zo-1染色表明naio3注射的amd小鼠中rpe的六边形结构受损。比例尺为20μm。(e)显示了两组中完整的rpe面积占总rpe面积的百分数统计。正常小鼠中rpe面积完整，但amd造模1周后的小鼠中rpe则完全消失。zo-1，紧密连接蛋白-1；rpe，视网膜色素上皮。正常小鼠和amd 1周小鼠分别n＝3，3。****p<0.0001，t检验分析。数据以平均值±sd表示。(f)显示了在naio3注射后第1周、第5周和第9周，正常小鼠、amd小鼠中用gfap和dapi染色的视网膜切片的共聚焦显微图像。gfap(紫色)呈现了激活的穆勒胶质细胞的突起。onl层(dapi、蓝色)的变化(虚线)和gfap的增加表明了amd小鼠模型中随时间变化的损伤程度和应激水平。比例尺为20μm。(g)显示在暗适应(暗视)条件下，正常小鼠和amd 1周小鼠视网膜随增加强度的光刺激(从0.1到3.0cd·s/m2)而发生视网膜电位变化的记录。箭头表示闪光开始。(h)为显示正常小鼠和amd小鼠中暗视a波的幅度和到达峰值所需时间的柱状图。注意，在amd小鼠模型中，a波幅度显著降低，并且到达a峰所需时间显著增加(红色柱状)。正常小鼠和amd 1小鼠周中分别n＝6，4。*p<0.05，***p<0.001，采用bonferroni校正的双因素方差分析。数据以平均值±sd表示。(i)在暗视条件下，两组小鼠在32cd·s/m2强度闪光下的视网膜电信号反应。c波表示对感光细胞刺激的rpe电信号反应(正常小鼠，黑线；amd 1周小鼠，红线)(j)是显示正常小鼠和amd小鼠在暗视c波的幅度和到达峰值所需时间的柱状图。在amd小鼠中，c波的达峰时间比正常小鼠长。正常小鼠和amd 1周小鼠中分别n＝6，4。**p<0.01，t检验分析。数据以平均值±sd显示。图3.显示了在ascl1介导的体内重编程后，amd小鼠中onl有部分挽救。(a)实验设计和时间线。(b-c)是显示amd小鼠模型的视网膜退行性损伤的代表性图像。上排图：损伤4周和8周未治疗的amd小鼠视网膜玻璃膜疣样结构，以及amd损伤且给予治疗4周和8周后的小鼠视网膜玻璃膜疣样结构。治疗方法为视网膜下腔注射gfp(对照)或ascl1-gfp的aav9病毒。下排图：在病毒注射后4周和8周，amd小鼠视网膜的h&e染色代表性图像。(d)amd小鼠病毒注射8周后onl细胞层数统计，以及从中央到周边的视网膜厚度的定量分析。在注射病毒后8周的amd小鼠中，对照组中几乎没有感光细胞残留，而ascl1组的onl中有1-2层光感受器细胞。对于amd 9w、amd1w+g8w和amd1w+a8w，分别n＝3、3、3只小鼠。*p<0.05，非配对t检验。数据以平均值±sd表示。(e)显示了注射病毒2、4和8周时视网膜切片中的gfp、recoverin(恢复蛋白)(红色，视杆和视锥细胞)和dapi染色的图像；onl以虚线描绘。感染病毒的gfp+细胞中有recoverin的阳性染色表明，穆勒胶质细胞表达感光细胞的特异性基因。gfap染色(紫色)显示了穆勒胶质细胞突起的结构。与ascl1组相比，在未治疗的amd损伤8周组中，onl(dapi，蓝色)细胞层数极少，并且几乎没有recoverin阳性染色。比例尺为20μm。(e1-e3)损伤并接受治疗4周的ascl1-gfp组中gfp和recoverin共定位的细胞放大图像(对应于上述e图中的白色框)。比例尺为5μm(f)显示gfp和recoverin(恢复蛋白)双阳性细胞的柱状统计图，其表明在接受治疗2、4和8周时onl中转化的感光样细胞。病毒注射2、4和8周分别对应n＝3、3、3只小鼠。***p<0.001，具有bonferroni校正的双因素方差分析。数据以平均值±sd表示。(g)显示在对照组和ascl1-gfp组中，接受治疗4周时zo-1和dapi染色的rpe代表性图像。在对照组和ascl1-gfp组中，未显示可分辨的zo-1染色六边形结构。比例尺为20μm。(g1-g3)病毒注射后4周的对照组中rpe放大图(对应于4wpi gfp中的白色框)。(g4-g6)病毒注射后4周的ascl1-gfp组中rpe的放大图(对应于4wpi ascl1-gfp中的白色框)。图4.ascl1处理后的amd小鼠的功能改善。(a)显示暗视条件下小鼠视网膜的电信号变化。箭头表示闪光开始。(b)显示不同组中暗视a波和c波的幅度。每个组中分别n＝3、4、4只小鼠。ascl1治疗后的小鼠a波幅度显著增高。*p<0.05，**p<0.01，bonferroni校正的双因素方差分析，或单因素anova分析后tukey检验。数据以平均值±sd表示。(c-d)显示了视动行为学测试系统及结果。(c)左图为实景拍摄小鼠观察旋转带状图案时的照片；右图为视动行为学测试的卡通示意图。解释了小鼠视觉跟随带状旋转图案而作出的头部移动现象。(d)显示不同组小鼠的视敏度。amd造模1周后小鼠的视敏度显著低于正常小鼠，而在病毒注射后8周的amd小鼠中，ascl1组的视敏度高于对照组。每个组中分别n＝5、5、6、6。*p<0.05，**p<0.001，单因素方差分析并进行tukey's检验。数据以平均值±sd表示。(e-f)显示了黑/白箱测试系统及结果。(e)黑/白箱测试的示意图和箱内小鼠的移动轨迹(红线)。(f)不同组中，小鼠在黑箱中停留的时间的百分比。每个组中分别n＝5、3、3。*p<0.05，**p<0.01，单因素方差分析并进行tukey's检验。数据以平均值±sd表示。图5.显示了在amd视网膜中利用aav9 gfap::ascl1-gfp使mg细胞原位转化为感光细胞的示意图。图6.显示正常小鼠在注射gfp或ascl1-gfp后的细胞转化类型。(a-f)显示了病毒注射四周时用r/g视蛋白(r/g opsin,视锥细胞标志物，a)或钙结合蛋白(calbindin,水平细胞标志物，b)、pkcα(双极细胞标志物，c)、钙网膜蛋白(calretinin,无长突细胞标志物，d)、pax6(双极细胞标志物，e)和rbpms(神经节细胞标志物，f)以及gfp(绿色)和dapi(蓝色)染色的视网膜切片代表性图像。(a，b)白色箭头指示在注射ascl1-gfp的视网膜中gfp与视蛋白(a)或钙结合蛋白(b)的共标记(下排图)，但在gfp对照组则没有共标记(上排图)。方框区域中为共标记细胞的放大细节(c，d，e，f)。在gfp或ascl1-gfp组中未发现gfp与pkcα(c)、钙网膜蛋白(d)、pax6(e)或rbpms(f)的共标记。opl，外丛状层；ipl，内丛状层。比例尺为20μm。图7.显示gfp(对照)组或ascl1-gfp组中amd小鼠的病毒感染区域。(a)显示病毒注射后3天、2、4和8周时视网膜平铺片中的gfp阳性区域。小鼠左右眼通过视网膜下腔从颞侧至鼻侧分别注射对照病毒和带神经元转录因子ascl1的病毒，两种病毒均为具有gfap启动子的aav9病毒。结果表明对照组和ascl1组的病毒感染面积基本一致。比例尺为1mm。(b)显示对应视网膜平铺片病毒感染区域的视网膜切片。对照组和ascl1组中在病毒注射后2、4、8周时感染面积相似。比例尺为200μm。图8.显示注射ascl1-gfp的amd小鼠视网膜中被病毒感染(有gfp信号)和未感染病毒(无gfp信号)区域的比较。(a，b，c)病毒注射后2、4和8周时，用gfp、gfap、恢复蛋白和dapi染色的视网膜切片的图像。带gfp(绿色)信号区域表示有被病毒感染的mg细胞，而无信号区域则显示无病毒感染的mg细胞。与被感染的区域相比，在无信号组中，onl(dapi，蓝色)中感光细胞层数更少，recoverin(恢复蛋白染色,红色)也逐渐消失。比例尺为20μm。发明详述在许多与视觉相关的疾病中，视觉丧失主要是由于视网膜神经元的退化而引起的[17]。当视网膜损伤时，穆勒胶质细胞的激活过程至关重要[9]。在鸟类[10]和鱼类[9]中，当穆勒细胞被激活时，它们会去分化、增殖，然后再分化为视网膜神经元，且由此再生出新的视网膜。在哺乳动物中，穆勒胶质细胞也会被激活，但它们没有去分化的能力。近年来，研究人员试图利用哺乳动物视网膜中的穆勒细胞来实现神经再生，并在已丧失视力的成年小鼠中部分恢复视觉功能[8；11；12；13；29]。通过在不同的损伤/疾病模型中使用不同的因子，使穆勒细胞重编程为不同类型的视网膜神经元。例如，ascl1与其他处理手段结合主要将穆勒细胞重编程为无长突细胞和双极细胞[11；12]，oxt2、crx和nrl的组合将穆勒细胞转变为视杆感光细胞[13]，而math5和brn3的组合将穆勒细胞转变为视网膜神经节细胞([33])。在本发明中，使用单个的转录因子ascl1将穆勒细胞重编程为视杆细胞、视锥细胞和水平细胞。这与前人运用ascl1的过表达与抑制组蛋白去乙酰化酶的hdac抑制因子曲古司他汀a(tsa)组合并使穆勒细胞重编程为无长突细胞和双极细胞的实验结果有很大的不同[11；12]。得出不同的结果可能因为所使用的小鼠疾病/损伤模型不同，如在青光眼模型中，敲低mg细胞中的ptbp1会使其转变为神经节细胞[8]，但在感光细胞退化的rd10小鼠中，敲低ptbp1则会使mg细胞转变为感光细胞。我们还在正常视网膜中观察到细胞重编程，表明视网膜损伤不是穆勒细胞重编程的必要条件，这与xiang's lab([33])观察的结果一致。尽管本发明中重编程的功效可能通过多次补充而得到增强，但简单的应用(注射一次aav-gfap-ascl1病毒)就能够部分挽救amd小鼠的视觉功能。因此，我们的研究为应用单个转录因子如ascl1以通过重编程mg细胞来治疗视网膜疾病提供了可能性。在大脑中，转录因子ascl1可以在体内将星形胶质细胞转化为功能性神经元[6]。在视网膜中，ascl1在视网膜损伤后显著上调，并在斑马鱼中重编程mg细胞[9]，但直到最近几年，其在哺乳动物的视网膜中几乎没有作用。2013年的一项体外实验表明，ascl1的过表达成功地诱导哺乳动物穆勒细胞成为神经源性视网膜祖细胞[30]。随后在nmda损伤后的幼鼠视网膜中，ascl1成功地诱导穆勒细胞转化为表达无长突细胞、双极细胞和感光细胞标志物的细胞[31]。这与我们在amd中穆勒细胞转化为感光细胞的发现相一致。但在成年小鼠中，之前的研究发现单独的ascl1表达或在nmda/光诱导损伤情况下的ascl1表达未能将mg细胞重编程为功能性神经元。通过tsa进行的表观遗传修饰解决了该问题，并在nmda损伤后将成年小鼠视网膜中的mg细胞重编程为无长突细胞和双极细胞，但未产生感光细胞或神经节细胞[11]。然而，当与lin28一起使用时，ascl1可以在成年小鼠的受损视网膜中将穆勒细胞重编程为感光细胞、中间神经元和神经节细胞[32]，尽管转化率还有待提高。jorstad的最近研究[12]表明，stat信号传导抑制asc1重编程穆勒细胞的能力，并且stat抑制剂增加了穆勒细胞在ant条件(ascl1+nmda损伤+tsa)下产生视网膜中间神经元的能力。在本发明中发现，单独的ascl1过表达能够在正常视网膜或naio3损伤的成年哺乳动物视网膜中启动mg细胞重编程过程，并主要将其转化为感光细胞。小鼠视网膜中转化而来的感光细胞可能主要是视杆感光细胞。此外，在本发明中，转化的感光细胞在amd中显示出功能的显著改善。因此，ascl1在哺乳动物视网膜中具有将穆勒细胞转化为多种类型神经元的潜力。综上所述，发明人发现，单个转录因子ascl1可以将成年小鼠视网膜中的穆勒细胞转化为感光细胞，且在amd鼠模型中部分地挽救视觉功能。因此，通过过表达ascl1的穆勒细胞重编程可能为治疗包括amd和感光细胞变性疾病提供新的策略。在本发明中，我们通过过表达神经元转录因子ascl1，成功地在正常视网膜和amd视网膜模型中将穆勒细胞重编程为感光细胞(如图5所示)。在几乎没有感光细胞存活的amd晚期模型中，该策略恢复了部分感光细胞层，并显著地改善了动物的视网膜对光刺激的反应和视力敏锐度，并且恢复了对亮度的感受能力。本发明的有效性在本发明中，我们通过视网膜下腔注射的方式使ascl1表达在穆勒细胞里，有很好的靶向性。该病毒感染了几乎四分之一的视网膜，其感染面积在对照组与ascl1组之间基本相同(图7)。视网膜只有部分范围的病毒感染表明对受损的感光细胞的重编程效力可能受到限制。事实上，当我们比较同一视网膜上有或无病毒感染的区域时(图8)，在感染区域(即具有gfp信号的区域)中观察到onl比未感染区域(无gfp信号)更厚。虽然部分范围的感染可能限制了视觉恢复，但我们的研究表明，即使仅有一小部分视网膜神经元被挽救，视觉行为可以得到改善。因此，即使是到了较为严重的amd晚期阶段，将穆勒细胞转化为感光细胞也带来了amd治疗的可能性。未来的研究可以注重优化aav病毒载体或病毒构建，以提高感染率和转化效率。以下实施例仅用于阐明本发明的目的，而不意图将本发明限于所给出的具体实施方案。实施例1.材料和方法动物从广东省实验动物中心(中国广州)获得6周龄雄性c57bl/6j小鼠，并在实验前适应2周。所有动物均在标准实验室条件下饲养，光暗周期为12:12小时，并定期供应食物和水。所有动物程序均根据国家卫生研究院的实验动物护理和使用指南进行，并由暨南大学伦理委员会批准。采取一切适当的措施以尽量减少使用的动物的数量和它们的痛苦。naio3诱导的amd模型诱导视网膜色素上皮(rpe)损伤以模拟amd模型，按照前期的方案步骤[16]，将naio3注射到小鼠静脉内：将c57bl/6j小鼠置于圆筒形约束装置中并露出尾部，按小鼠体重将25mg/kg的碘酸钠通过尾静脉注射到小鼠体内[16]。动物在尾部针孔止血后放回笼子。腺相关病毒的产生本发明中，使用单链腺病毒相关病毒(ssaav)载体paav-gfaps::gfp和paav-gfaps::mascl1-p2a-gfp。gfaps启动子是从2.2kb gfa2启动子衍生的合成681-bpgfaabc1d[17]。mascl1(ncbi参考序列id nm_008553.5)的开放阅读框由biotech，llc.合成并亚克隆。所有质粒首先通过测序验证，然后包装以产生aav血清型9(aav9)。该病毒包装由biotech，llc.进行，接着通过碘克沙醇梯度超速离心进行纯化和随后浓缩。本发明中使用的所有aav均于0.001％pluronic f-68溶液(poloxamer188溶液，caisson laboratories)中稀释。本发明中所有病毒的滴度为1.0×1013gc/ml，并稀释至1.0×1012gc/ml用于视网膜下腔注射。视网膜下注射通过腹腔注射三溴乙醇(0.14ml/10g体重)对动物进行麻醉，并用0.5％托吡卡胺溶液(santen pharmaceutical co.,japan)散瞳。为了能够清晰地观察眼睛内的视网膜和针，将一片盖玻片与一滴透明质酸钠凝胶(中国启盛生物制剂有限公司)一起放在角膜上。使用30号的针在颞侧穿刺角膜边缘，然后用10μl注射器(cal84853，hamilton)的34号钝头针在显微镜(leica stemi 305)下插入上述刺穿部位中。对于每只动物，将aav9 gfap::gfp(对照，每只眼0.5ul)或aav9gfap::ascl1-gfp(每只眼0.5ul)分别注射入右眼或左眼鼻侧的视网膜下腔中。注射后将一滴0.2％卡波姆眼用凝胶(bausch+lomb,berlin,germany)涂抹于角膜上。术后小鼠在安全的加热垫上直至完全清醒。光学相干断层扫描和眼底照相为了在活体动物上观察视网膜结构和眼底图像，在micron iv视网膜成像显微镜(phoenix research laboratories,pleasanton,ca)上进行光学相干断层扫描(oct)成像和眼底照相。具体如下，腹腔注射三溴乙醇(0.14ml/10g体重)对小鼠进行麻醉，并用0.5％托吡卡胺溶液散瞳。然后将眼睛移近显微镜的镜头，调整焦距以通过明场引导oct获得清晰的图像。使用与显微镜相同供应商开发的图像处理软件discover在视神经乳头附近获取代表性图像。组织处理对于石蜡切片，通过注射过量麻醉处死小鼠，快速摘除眼睛和解剖，在4℃下将带晶状体的眼杯置于4％多聚甲醛(pfa，sigma，p6148)中24小时。固定后，用梯度乙醇(70％、80％、90％、95％、100％)对组织进行脱水。然后用二甲苯使组织透明，最后在组织包埋机(leica eg115)中用石蜡包埋。使用切片机(leica rm2245)在视神经乳头部位进行连续切片，厚度为5μm。对于冷冻切片，通过注射过量麻醉处死小鼠，快速摘除眼睛和解剖，并在室温下将眼杯置于pfa中30分钟。然后将眼杯在0.01m磷酸盐缓冲液(pbs)中清洗，在4℃下用含30％蔗糖的0.01m pbs过夜脱水，并包埋在最佳切片温度的化合物(o.c.t；tissue-tek,usa)中。视网膜纵向切片，厚度为14μm(thermo scientific，cyrostar nx50)。对于平铺片，将视网膜从眼杯分离，用眼科剪从视网膜边缘往中心切4刀，使视网膜呈四叶草形状，然后用移液管将其转移到载片上，展平并用盖玻片封好用于成像。对于rpe染色，在视网膜从眼杯移除后，将仍附着于眼杯的pre从边缘往中心切割成对称的8个部分。然后将组织在1xpbs内转移至显微镜载片，并冲洗3次，每次5分钟。随后对pre组织进行免疫荧光染色。免疫荧光染色和其他染色为了进行视网膜神经胶质细胞和神经元的标志物的免疫染色，将视网膜的冷冻切片在室温下用pbs、5％驴血清、3％牛血清白蛋白(bsa)、0.5％triton x-100封闭1小时，并在4℃下与相同封闭溶液稀释的一抗孵育过夜。然后，将切片与pbs中的二抗孵育，并在室温下用dapi(4’,6-二脒基-2-苯基吲哚，1:2000，roche，70508621)复染2小时。在一抗孵育结束更换二抗之前，用pbs冲洗切片3次，每次10分钟。然后用vectashield antifade防荧光淬灭封片剂和盖玻片将组织封存好。使用的一抗包括：鸡抗gfp(1:1000，abcam，ab13970)、大鼠抗gfap(1:1000，invitrogen，13-0300)、兔抗sox9(1:1000，millipore，ab5535)、小鼠抗视紫红质(1:1000，millipore，mab5356)、兔抗恢复蛋白(1:1000，millipore，ab5585)、兔抗视蛋白(1:1000,millipore,ab5405)、小鼠抗钙结合蛋白(1:1000,sigma,c9848)、小鼠抗pkcα(1:1000,santa cruz,sc-8393)、兔抗钙网膜蛋白(1:1000,swant,7697)、兔抗pax6(1:1000,abcam,ab195045)、兔抗rbpms(1:1000,invitrogen,pa5-31231)、zo-1抗体(invitrogen,33-9100,1:1000)。使用的二抗如下：山羊抗鸡488(1:1000)、驴抗兔555(1:1000)、驴抗小鼠555(1:1000)、山羊抗大鼠647(1:1000)、驴抗兔647(1:1000)。为了观察视网膜的结构，将石蜡包埋的视网膜切片脱蜡和复水，然后按照h&e染色试剂盒方案(beyotime biotechnology，c0105)进行苏木精和伊红(h&e)染色处理。成像和处理在zeiss荧光显微镜iamger z2(carl zeiss,oberkochen,germany)下，对视网膜平铺片上的病毒感染面积进行观察。对于免疫染色的视网膜切片，使用zeiss lsm700共焦显微镜(carl zeiss)拍摄荧光图像，选取gfp阳性感染区域。对于h&e染色切片，使用zeissimager a2显微镜(carl zeiss)拍摄全视网膜切片的图像。为统计免疫荧光阳性细胞的数量或分析两种不同标志物的共标记，从gfp阳性区域获取z-叠层图像并应用zen软件进行计数。为了测量视网膜切片上全视网膜的厚度，采用imagej进行定量分析，同时计算onl的层数。视网膜电位记录为了记录视网膜对光刺激的反应，动物在erg记录前暗适应过夜。第二天，腹腔注射三溴乙醇(0.14ml/10g)对小鼠进行麻醉，并将其置于加热垫上。麻醉后涂抹0.5％托吡卡胺于小鼠角膜上散瞳，erg用接触角膜表面的镀金线圈电极作为活性电极进行记录。将不锈钢针电极分别皮下插入两眼的颞部附近和尾部作为参照电极和接地电极。所有操作均在暗红光下进行，按照之前文献所报道的操作步骤[18]。在暗适应(暗视条件)下，小鼠用0.1、1.0和3.0cd·s/m2的不同强度的绿色闪光进行刺激。为了记录rpe的c波响应，采用了强度为32cd·s/m2的200ms绿色闪光。erg数据通过reti扫描系统(roland consult，reti-scan,germany)的放大器以2khz的采样速率收集，并在50hz低通滤波后用retiport软件(roland)进行分析。a波幅度是通过测量基线到第一个负峰的幅度，而c波幅度是则是从基线到第二正峰的幅度，通常在光照开始1s后。视动测试为了评估动物的视敏度，用上述的视动系统对小鼠进行了测试。具体如下，将可以自由活动的小鼠放在一个高台上，其周围由四个计算机屏幕围绕，这些屏幕显示移动的垂直光栅条带，光栅的宽度不断变窄(黑白对比度100％，移动速度为12周期/度)，程序用matlab软件(mathworks,natick ma,usa)编写。对于每种宽度的光栅，顺时针旋转1分钟，然后逆时针旋转1分钟。小鼠只要能看到旋转的光栅，它们会不自觉地用头跟踪光栅的旋转，产生视动反射。对头部运动进行录像，然后人工判断可以诱发小鼠产生视动反应的最大空间频率(即最细的光栅)，将其定义为小鼠的视敏度。用于测试正常小鼠和碘酸钠损伤后1周的amd小鼠(amd1wk)的光栅频率包括0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45和0.5周期/度(cpd)，而对于amd损伤后9周的动物，应用0.1、0.175、0.2、0.25、0.3、0.325、0.35、0.375cpd。黑白箱测试为了测试小鼠趋暗避明的视觉能力，进行了黑白箱测试，按照前文献报道的方式操作[19]。具体如下，将小鼠置于黑箱中央(中国北京万浩科技有限公司)，并允许其在黑箱和有光照明的白箱之间自由移动。记录小鼠的运动轨迹，并通过noldus ethovision xt8.0软件自动量化5分钟测试期间小鼠在黑箱中停留的时间，并计算其占总时长的百分比。统计分析所有数据均以平均值±sd表示。用prism graphpad 9进行anova或student t-检验。p值<0.05被认为具有显著性的统计学差异。n表示每组的动物数。2.结果2.1在小鼠视网膜中ascl1将müller胶质细胞重编程为感光细胞视网膜中的穆勒胶质(mg)细胞对各种损伤作出反应，并显著上调其丝状蛋白，即胶质纤维酸性蛋白(gfap)，作为应对损伤的防御策略[20；21；22；23]。因此，使用aav9病毒为载体，可以通过gfap启动子来启动gfp或ascl1-gfp在mg细胞中特异表达(图1a)。aav9gfap::ascl1-gfp病毒及其对照病毒aav9 gfap::gfp通过视网膜下腔注射进入小鼠视网膜(图1b)。通过gfp和sox9(内核层中mg细胞核的标志物)的共标记(图1c中*)表明，在病毒注射后3天(dpi)，ascl1-gfp病毒已经在穆勒细胞中表达。在病毒注射后的5和10天时，ascl1-gfp仍在mg细胞中表达，并且显示出mg细胞的典型结构，其突起跨越整个视网膜层次(图1c)。然后，我们在病毒注射后第2、4和8周(wpi)继续监测ascl1-gfp感染的mg细胞(图1d)。有趣的是，在ascl1-gfp组中2wpi时，开始检测到一些伸入外段层(os)中的gfp+纤毛(图1d中的白色三角形)，但在对照gfp组中未检测到(图1d)。这些纤毛通常来源于感光细胞而非mg细胞的细胞体。为了测试ascl1-gfp感染的mg细胞是否转化为感光细胞，用视杆感光细胞特异性标志物视紫红质进行免疫染色，发现gfp阳性的纤毛确实与视紫红质阳性染色有共标(图1d)。值得注意的是，这种gfp+/视紫红质+黄色纤毛在整个2-8wpi期间仅在ascl1-gfp组中检测到，而在对照gfp组中未检测到，表明这些gfp+感光细胞是通过表达ascl1从mg细胞转化而来的(图1d)。我们对总共10只ascl1-gfp感染的动物进行了分析，并与10只gfp对照病毒感染的动物进行了比较，发现在每个ascl1-gfp感染的视网膜中，均有大量进入os层的gfp+纤毛，而对照组有gfp感染的视网膜均未显示在os层中的gfp+纤毛(图1e)。这些结果表明aav9 gfap::ascl1-gfp在早期感染期间特异性地感染小鼠视网膜中的mg细胞，然后其逐渐转化为感光细胞，且其纤毛结构进入os层。为了进一步研究ascl1过表达后mg细胞可能转化成哪些其他类型的细胞，检测了多种视网膜神经元标志物，包括对红绿视蛋白(视锥细胞外段标志物)、钙结合蛋白(水平细胞)、pkcα(视杆双极细胞)、钙网膜蛋白(无长突细胞)、pax6(无长突和神经节细胞)和rbpms(视网膜神经节细胞)，进行了免疫荧光染色(图6)。有趣的是，除了ascl1-gfp感染细胞中有少量细胞同时表达视蛋白或钙结合蛋白(图6a-b)，对照gfp组或ascl1-gfp组中其他标志物阳性染色细胞均未表达gfp(图6)。表明ascl1可以把mg细胞转化为少量的视锥细胞和水平细胞，但未能转化为节细胞、双极细胞或无长突细胞。ascl1-gfp感染细胞的最显著特征是在ascl1-gfp组的几乎每个图像中均清楚地检测到纤毛(图6a-f)，这表明ascl1感染的mg细胞大多转化为感光细胞，尤其是os层中带有纤毛的视杆细胞。2.2年龄相关性黄斑变性(amd)小鼠模型的建立在发现ascl1介导的mg细胞向感光细胞转化后，接下来探索了这种神经再生基因疗法在amd治疗中的潜在应用。在amd中视网膜色素上皮(rpe)的损伤导致感光细胞死亡，因此我们通过注射能导致氧化应激反应和rpe损伤的碘酸钠(naio3，25mg/kg，尾静脉注射)得到小鼠amd疾病模型[16；24]。为了验证造模成功与否，我们首先使用光学相干断层扫描(oct)和眼底成像在小鼠活体中检查视网膜的形态特征(图2a)。在注射naio3后一周(amd 1周)，在amd小鼠中观察到玻璃膜疣样外观，但在正常组中未出现，这与amd的早期症状一致[25]。oct扫描还显示在amd小鼠中较薄的视网膜和模糊的rpe结构(amd 1wk；图2a)。然后，处死动物，并对视网膜切片进行组织学分析。he染色(图2b)证实amd小鼠中具有较少onl层数和较薄的视网膜整体厚度(图2c的上排为量化结果，amd小鼠有5.22±0.39层vs正常小鼠有13.11±1.92层，每组n＝3，p<0.001，student's t检验)。与正常小鼠(122.47-129.49μm)相比，amd 1wk小鼠中从中央到外周的视网膜总厚度也较薄(53.51-68.78μm)(图2c，下图)。正如预期一样，在naio3注射一周后，用zo-1对rpe进行染色，显示其形态受到显著破坏：在正常小鼠中，rpe显示出清晰的六边形形状，而在naio3注射后六边形的边界模糊并显示出无序的排布(图2d)。在损伤后1周后，amd组中rpe的完好区域(其被定义为具有清晰六边形的区域占总zo-1染色区域的百分比)几乎降至零(图2e，p<0.001vs正常)。之后，对naio3的长期效果进行检测，直至9周。通过细胞核的dapi染色(图2f，蓝色)显示amd小鼠的onl层数随时间而减少，并且至amd诱导后9周，onl层几乎完全消失。与此同时，伴随着onl层的减少，与正常小鼠相比，mg细胞中的gfap表达随着时间(从1周、5周至9周)显著增加(图2f，洋红色)，表明在该amd模型中mg细胞被激活并变成应激型的mg细胞。为了测试该模型的功能特性，进行了视网膜电位记录。正常小鼠中的视网膜神经元在暗适应条件(暗视)下对光刺激反应良好(图2g，黑线)。相比之下，在amd 1wk小鼠中，对于所有闪光强度的光响应均下降(图2g，红线)。在暗视设置下，amd 1wk小鼠中的a波幅度远低于正常小鼠(图2h，*p<0.05，**p<0.001，单因素方差分析并进行检验)，且到达a波峰值的所需时间显著增长(图2f，p<0.001；正常小鼠中n＝6，amd小鼠中n＝4)。受损的a波反应表明在该amd模型中感光细胞反应受损。与rpe的损伤一致，在amd模型中，rpe对光的响应(由c波指示)降低(图2i)。c波平均幅度从正常动物中的67.94±5.40μv显著下降至50.98±6.63μv(p<0.01；图2j)；且达到c波峰值所需的时间从正常组的1.23±0.02秒延长至amd组的1.34±0.05秒(p<0.01；图2j)。amd小鼠中暗视a波和c波的光响应减低分别对应感光细胞和pre细胞的功能丧失，进一步验证了amd小鼠模型成功建立。2.3在amd小鼠模型中ascl1将müller细胞转化为感光细胞样细胞并部分挽救退化的感光细胞在确定了amd模型的时间线和所注射基因的表达后，进一步检查ascl1是否可在amd小鼠模型中具有通过再生感光细胞的治疗效果。由于本发明的amd模型在1周时已经显示出明显的神经变性，并且体内细胞转化需要约2周，因此我们在naio3注射后1周视网膜下腔注射aav9 gfap::ascl1-gfp病毒，然后研究了naio3注射后2、4和8周的组织学变化(如图3a的实验设计)。在这些时间点，视网膜平铺片显示病毒的感染面积在各个时间点均大小一致，这表明病毒转染到视网膜上在amd模型中是成功的，并且病毒可以持续表达(图7a)。同时，在2、4和8wpi时间点对感染区域进行的冰冻切片，进一步证实了通过视网膜下腔注射能成功将病毒递送至视网膜(图7b)。有趣的是，眼底图像显示，ascl1感染4周后，与另一侧或未治疗的眼睛相比，玻璃膜疣样外观似乎减少(图3b，上行)。此外，4wpi时的h&e染色证实，尽管在amd组中视网膜厚度和onl层均显著减少，但ascl1治疗的amd小鼠的神经元损失较少(图3b，下排图)。到8wpi时，amd小鼠中的视网膜严重退化，而仅保留了一点点gcl和inl，但在ascl1治疗的视网膜中，仍清晰保留了一些onl层(图3c)。这三组之间的总视网膜厚度有少量差异(图3d，右)，但ascl1治疗后对onl层数有较大改善，显著高于其他组(图3d，左)。这些结果表明ascl1可以部分地挽救退化的感光细胞。为了进一步探索ascl1的这种作用是否是由于感光细胞的再生，我们使用了recoverin(恢复蛋白，视锥和视杆细胞的标志物)来研究ascl1过表达后的视网膜变化。与amd模型中视网膜神经元的逐渐丧失一致，recoverin阳性染色的细胞体随着时间变得更少(图3e，恢复蛋白，红色)和onl厚度显著减小(以白色点线描绘)。然而，我们发现，在整个2-8wpi期间，在ascl1-gfp感染的视网膜中，onl的许多胞体为gfp+，且这些细胞体与recoverin共标记(图3e，e1-e3中显示的实例)，这表明这些ascl1-gfp转化的细胞确实是感光细胞。比较8wpi时ascl1-gfp和单独gfp处理的视网膜的recoverin染色证实ascl1组中保留大量感光细胞(图3e，8wpi层的两层)。接下来，我们对总共9只ascl1-gfp感染的动物进行分析，并与amd小鼠中9只gfp对照病毒感染的动物进行比较。我们发现，在每一个ascl1-gfp感染的视网膜中，在onl中有gfp+和recoverin+的共标记，而单独gfp感染的视网膜均未显示出在onl层中的共定位(图3f)。值得注意的是，我们在amd小鼠和正常小鼠之间发现的一个区别，在ascl1介导的转化后，正常小鼠(图1d)中gfp+感光细胞样细胞将纤毛延伸超出onl层至os中，而在amd小鼠中纤毛未能生长到onl层外(图3e)，这表明amd小鼠随着rpe损伤和神经退化，纤毛的生长受到损害，且感光细胞也不健康。此外，用gfap染色的穆勒细胞随着时间的推移仍然保持较多数量，且ascl1组和gfp组之间没有发现明显差异。我们进一步研究了amd小鼠中是否可以通过ascl1挽救rpe受损的结构。在rpe平铺片中，对两组进行zo-1染色均显示结构无恢复(图3g)。这些结果表明，ascl1过表达无法挽救rpe的损害。鉴于在amd模型中发现视网膜的gfp+区域中的转化过程(图3e)，我们希望比较相同视网膜中与未感染区域的差异(如果存在)(图8)。在无gfp阳性信号的区域中，recoverin阳性染色的感光细胞随时间逐渐丧失，在8wpi时明显消失(图8c)；而在ascl1组中仍保留一些recoverin阳性细胞体。gfap染色(其标记mg细胞的突起)在无信号区域表现出比感染区域更有序的结构，表明在无gfp信号区中没有发生转化过程(图8a-c)。2.4ascl1能部分改善amd小鼠中视网膜对光刺激的反应和视觉行为为了研究过表达ascl1而再生出的感光细胞是否可改善视网膜功能，我们对注射ascl1的amd小鼠进行了erg和行为学测试。在amd 9wk小鼠中，对所有光强度(暗视0.1、1、3、32cd·s/m2)，几乎没有发现视网膜电位的波形(图4a，红线)，这与rpe和感光细胞的严重损失结果一致。相比之下，ascl1处理的amd小鼠中对光刺激的反应显示出明显的视网膜电位波形(图4a，蓝线)，而对照病毒处理的小鼠中未观察到反应(图4a，绿线)。统计量化表明(图4b)，在暗视1和3cd·s/m2下，ascl1组(蓝色条)的a波幅度明显大于其他两个组，表明感光细胞对光反应有所提高。不过所有三个组均未观察到明显的c波(图4a)，这可能是因为我们的amd模型中rpe细胞的严重缺失。在确定视网膜对光刺激的反应有改善后，我们测试了ascl1治疗是否能改善视觉行为。对于行为学测试，我们首先使用视动系统测试了小鼠的视觉敏锐度，根据条带旋转的方向，其分别给出注射ascl1或对照病毒的左眼或右眼的视觉敏锐度统计(图4c)。正常小鼠的视敏度为0.48±0.03cpd(n＝5)，而amd 1wk组的视敏度已显著降至0.35±0.02cpd(n＝5；p<0.0001)。在amd诱导后1周持续8周(相当于诱导后9周)注射单独gfp对照病毒的小鼠其视敏度明显降低(0.07±0.05cpd，n＝6)，而ascl1处理的amd小鼠其视敏度发生显著改善(0.15±0.04cpd，n＝6，p<0.01；图4d)。我们进一步进行了黑白箱测试以调查不同动物组之间区分明暗环境的视觉能力(图4e)。由于小鼠有夜间活动的习性，正常小鼠在它们能够自由活动时倾向于停留在黑暗的环境中。我们实验发现，正常小鼠有近70％的时间停留在黑箱中(图4f，黑色柱，n＝5)。在amd 9wk小鼠中，在暗箱中停留的时间减少至57.86±3.79％(图4f，棕色柱，n＝3；p<0.01vs.正常)，其接近50％，意味着在黑箱和白箱之间随机运动。病毒注射后8周，amd小鼠在黑箱中停留的时间明显延长，占总时间的67.40±4.29％(图4f，蓝色条，n＝3，p<0.05vs.amd 9wk)。请注意，黑白箱测试系统无法区分两只眼睛的视觉能力，因此数据显示，即使一只接受治疗的眼睛也有助于行为改善。参考文献[1]b.roska,and j.a.sahel,restoring vision.nature 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