一种氧化锌/磷酸锌纳米棒复合抗菌涂层及其制备方法和应用与流程

1.本发明涉及医用材料领域技术领域，具体涉及一种氧化锌/磷酸锌纳米棒复合抗菌涂层及其制备方法和应用。


背景技术：

2.随着生物材料产业的发展，临床上医用材料在人体组织损伤修复方面有着广泛的应用。例如生物医用金属材料钛及钛合金已经广泛应用于人工关节、牙科植入体、骨科假体等领域；生物医用高分子材料聚醚醚酮也在椎间融合器、颅面损伤修复方面有着广泛的应用。然而在实际临床应用中，医用材料仍面对着细菌感染这个亟需解决的问题。术后感染的发生在很大程度上影响着手术的效果，而某些植入体术后感染往往是灾难性的。例如人工关节置换手术的植入体术后感染需要二次手术清创处理，给患者带来严重的生理、精神和经济负担。术后感染一般是由粘附并定殖于医用材料表面的细菌引起的。因此在医用材料表面制备抗菌涂层，能够极大程度上减少术后感染的发生。另外，在材料表面引入抗菌涂层时需要同时对其生物学毒性进行考量，使抗菌涂层具有优异抗感染性能的同时不能延缓甚至阻碍组织的修复进程。
3.因此，在医用材料表面制备同时兼具抗感染和促组织愈合能力的涂层对于医用材料领域具有重要意义。


技术实现要素：

4.为解决上述技术问题，本发明提供一种氧化锌/磷酸锌纳米棒复合抗菌涂层及其制备方法和应用。
5.为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
6.本发明第一方面提供一种氧化锌/磷酸锌纳米棒复合抗菌涂层的制备方法，该方法包括先在医用材料表面制备氧化锌纳米棒涂层；再通过在磷酸盐或磷酸氢盐溶液中水浴处理的方法将所述氧化锌纳米棒涂层中的氧化锌转换成磷酸锌，从而制得具有纳米形貌的氧化锌/磷酸锌纳米棒复合抗菌涂层。
7.优选的，该方法具体包括以下步骤：步骤一、在医用材料表面制备氧化锌种子层，然后通过水热处理在所述氧化锌种子层上形成氧化锌纳米棒涂层，获得负载有氧化锌纳米棒涂层的医用材料；步骤二、将所述负载有氧化锌纳米棒涂层的医用材料浸入至磷酸盐或磷酸氢盐溶液中进行磷酸化处理，通过调控反应条件控制氧化锌向磷酸锌的转换比例，获得氧化锌/磷酸锌纳米棒复合抗菌涂层。
8.优选的，所述步骤二的反应条件为：控制反应体系的ph值为8.0-10.0，温度为20℃-100℃，反应时间为1h-24h。
9.优选的，所述步骤二的反应条件为：控制反应体系的ph值为8.0，温度为60℃，反应时间为2h。
10.优选的，所述磷酸盐或磷酸氢盐溶液为磷酸钾、磷酸钠、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾或磷酸二氢钠中的一种或多种混合。即，所述磷酸盐或磷酸氢盐溶液包括且不限于钾盐，也可以是其他金属元素的磷酸盐或磷酸氢盐。
11.优选的，所述磷酸盐或磷酸氢盐溶液的浓度为0.01mol/l-0.5mol/l。
12.优选的，所述磷酸盐或磷酸氢盐溶液的浓度为0.1mol/l。
13.优选的，所述步骤一具体包括以下步骤，配制混合溶液：将醋酸锌(zn(ch3coo)2·
2h2o)与乙醇胺(ethanolamine)溶解于乙醇中，并且室温搅拌5h，形成混合溶液；其中，所述醋酸锌、乙醇胺和乙醇的浓度均为0.05mol/l；进行旋涂处理：将样品固定于旋涂仪，并取60μl以上所述混合溶液滴加于所述样品的表面后，将所述样品至于烘箱中于120℃处理10min；制备形成氧化锌种子层的样品：将所述旋涂处理重复三次后，将所述样品转移至马弗炉中于500℃处理30min，从而在样品表面形成氧化锌种子层；制备氧化锌纳米棒涂层：将形成氧化锌种子层的样品放入水热釜中，在含有0.025mol/l硝酸锌(zn(no3)2·
6h2o)和0.025mol/l六亚甲基四胺(hexamethylenetetramine)的水溶液中于90℃处理5h，获得所述氧化锌纳米棒涂层。其中，所述的样品为医用材料、医用植入材料。
14.本发明第二方面提供一种氧化锌/磷酸锌纳米棒复合抗菌涂层，如上述的氧化锌/磷酸锌纳米棒复合抗菌涂层的制备方法所制得的氧化锌/磷酸锌纳米棒复合抗菌涂层。
15.本发明第三方面也提供如上述的氧化锌/磷酸锌纳米棒复合抗菌涂层在医用材料领域的应用，尤其适用于医用植入材料领域。
16.相较于现有技术，本发明提供的技术方案至少具有以下优点：
17.本发明提供一种氧化锌/磷酸锌纳米棒复合抗菌涂层及其制备方法和应用。该制备方法首先在医用材料表面制备氧化锌纳米棒涂层，然后在磷酸盐或磷酸氢盐溶液中水浴处理将氧化锌纳米棒涂层中的氧化锌部分转换成降解速率更低的磷酸锌。通过调控水浴处理的参数可以调控磷酸锌的转换比例，从而调控涂层的整体降解速率。该涂层可以均匀、高效地制备于形状复杂的医用材料表面，其工艺过程简单、成本低廉、适用于批量及工业化生产。
18.制得的具有纳米形貌的氧化锌/磷酸锌复合涂层不但具有良好的抗感染能力，而且大大降低了原有氧化锌纳米棒涂层的生物学毒性。其中，通过控制合适的磷酸锌转换比例，可以达到在降解过程中释放的适量锌离子，从而实现促进组织愈合的目的。
19.将该氧化锌/磷酸锌复合涂层作为抗菌涂层应用在医用领域，可以获得兼具抗感染和促愈合双重功能的医用材料，可以减少植入后感染情况的发生，特别是骨科硬组织植入材料表面，例如金属基的钛及钛合金、医用不锈钢等。与此同时，该涂层赋予医用材料表面抗感染能力的同时，没有生物学毒性，并且可以促进组织修复。
附图说明
20.一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定，除非有特别申明，附图中的图不构成比例限制。
21.图1a是实施例1中ti-zno样品表面的扫描电子显微镜照片；
22.图1b是实施例1中ti-znp0.5样品表面的扫描电子显微镜照片；
23.图1c是实施例1中ti-znp1样品表面的扫描电子显微镜照片；
24.图1d是实施例1中ti-znp2样品表面的扫描电子显微镜照片；
25.图1e是实施例1中ti-znp3样品表面的扫描电子显微镜照片；
26.图2是实施例2中将ti-zno样品在含有0.1m磷酸氢二钾(k2hpo4·
3h2o)的水溶液中于60℃、70℃和80℃处理2h后所获得样品的扫描电子显微镜照片；
27.图3a是实施例3中ti-zno样品表面的透射电子显微镜照片；
28.图3b是实施例3中ti-znp1样品表面的透射电子显微镜照片；
29.图3c是实施例3中ti-znp2样品表面的透射电子显微镜照片；
30.图4a是实施例4中各组样品的x射线衍射分析；
31.图4b是实施例4中各组样品的x射线光电子能谱全谱谱图；
32.图4c是实施例4中各组处理样品表面元素的原子百分比；
33.图4d是实施例4中各组处理样品表面的亲疏水性；
34.图5是实施例5中各组样品表面经过划痕实验后的扫描电子显微镜照片；
35.图6是实施例6中各组样品在hank’s缓冲液中浸泡30天后锌离子的释放趋势；
36.图7是实施例7中各组样品在hank’s缓冲液中浸泡30中各时间点样品表面的扫描电子显微镜照片；
37.图8是实施例8中骨髓间充质干细胞在各组样品表面培养后的增殖情况；
38.图9a是实施例9中骨髓间充质干细胞在各组样品表面向成骨细胞诱导分化后碱性磷酸酶的活性；
39.图9b是实施例9中骨髓间充质干细胞在各组样品表面向成骨细胞诱导分化后细胞的胶原分泌情况；
40.图9c是实施例9中骨髓间充质干细胞在各组样品表面向成骨细胞诱导分化后细胞外基质的矿化情况；
41.图10a是实施例10中通过平板涂布法检测在各组样品表面培养的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的存活情况照片；
42.图10b是实施例10中计算得到的各组样品表面对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抗菌率。
具体实施方式
43.为了解决现有技术中存在的问题，发明人发现氧化锌纳米棒涂层具有制备工艺简单、成本低廉、适合制备在大面积复杂表面等优势。更重要的是，氧化锌纳米棒涂层具有广谱抗菌活性，有望在医用材料领域作为抗菌涂层得到广泛应用。一般认为，氧化锌纳米棒阵列的广谱抗菌性能来自于三方面：1)涂层降解释放的锌离子的杀菌作用；2)氧化锌本身作为半导体材料产生的活性氧自由基(ros)对于细菌的细胞膜、细胞质以及遗传物质的破坏作用；3)纳米棒形貌对细菌的细胞壁的物理穿刺作用。然而氧化锌纳米棒涂层在生理条件下降解速率过快，降解过程中突释出大量的锌离子，并且与氧化锌产生的ros的综合作用下对组织细胞也会产生较强的毒性。因此，为改善氧化锌纳米棒涂层的抗菌应用前景，有必要对其降解速率进行调节，从而在维持其良好的抗菌性能的前提下使其同样具有良好的促组织修复功能。
44.发明人经过研究发现，通过对材料表面制备的氧化锌纳米棒涂层进行磷酸化处
理，将其部分转换成磷酸锌，可以在维持其纳米棒状形貌和优异抗菌性能的前提下，降低涂层的降解速率。合适的降解速率下释放出的锌离子不但不会引发生物学毒性，而且能够促进组织细胞的修复功能。
45.基于此，本发明提供一种在医用材料表面制备具有纳米棒形貌的氧化锌/磷酸锌复合涂层的方法。该涂层既拥有良好的抗感染性能，又不会产生生物学毒性并且能够促进组织修复。
46.下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
47.下面以金属基医用骨科植入材料纯钛作为基底，在其表面构建氧化锌/磷酸锌纳米棒复合涂层来证明本发明的可行性。
48.实施例1
49.将直径14mm、厚2mm的医用级纯钛片材经2000目砂纸打磨后，依次用丙酮、酒精、去离子水超声清洗干净。该预处理后样品标记为ti。
50.将醋酸锌(zn(ch3coo)2·
2h2o)与乙醇胺(ethanolamine)溶解于乙醇中，使其浓度都为0.05m并且室温搅拌5小时。将ti固定于旋涂仪并取60μl以上溶液滴加于ti表面后，将样品至于烘箱中于120℃处理10min。以上处理重复三次后，样品转移至马弗炉中于500℃处理30min，从而在ti表面形成zno“种子层”。然后将样品放入水热釜中，在含有0.025m硝酸锌(zn(no3)2·
6h2o)和0.025m六亚甲基四胺(hexamethylenetetramine)的水溶液中于90℃处理5h，从而获得氧化锌纳米棒涂层。所获得样品标记为ti-zno。其中，“m”为“mol/l”。
51.进一步将ti-zno在含有0.1m磷酸氢二钾(k2hpo4·
3h2o)的水溶液中于60℃处理若干小时后，可将氧化锌纳米棒阵列部分转换成磷酸锌。所获得样品分别标记为ti-znp0.5、ti-znp1、ti-znp2、和ti-znp3，其中数字表示处理的小时数。
52.使用扫描电子显微镜(sem)观察不同样品的表面形貌。图1a-e分别为氧化锌纳米棒涂层、ti-znp0.5、ti-znp1、ti-znp2、和ti-znp3的sem图片。由图可见当反应0.5h时，表面形貌相比于氧化锌纳米棒涂层基本没有变化。反应1h后纳米棒底部开始转化成块状，而此变化在2h和3h后更加明显。
53.实施例2
54.将实施例1中的ti-zno在含有0.1m磷酸氢二钾(k2hpo4·
3h2o)的水溶液中于60℃、70℃和80℃处理2h后，使用扫描电子显微镜(sem)观察不同样品的表面形貌(图2)。由图可见随着温度的升高，纳米棒底部转换成块状的趋势更加明显，说明温度的升高更有利于氧化锌向磷酸锌的转换。
55.实施例3
56.使用透射电子显微镜(tem)观察各组样品表面。图3a-c分别为氧化锌纳米棒涂层、ti-znp1和ti-znp2的tem图片。由图3a可见，1.92nm的晶面间距对应于氧化锌晶体。而在反应1h的样品(图3b)和2h的样品(图3c)中，可以同时观察到氧化锌和磷酸锌的晶体结构。说明在经过在磷酸氢盐溶液中处理后，氧化锌纳米棒涂层中的部分氧化锌转换成了磷酸锌。
57.实施例4
58.使用x射线衍射(xrd)分析涂层的晶体结构。由图4a可知ti-znp1和ti-znp2样品表面的涂层同时存在着氧化锌和磷酸锌两种晶型。
59.对样品表面进行x射线光电子能谱(xps)宽场扫描，得到图4b所示的xps全谱谱图。
其中特征峰的强度代表了表面该元素含量的高低。对比不同组样品的图谱可知，ti-znp1和ti-znp2样品表面增加了磷元素的特征峰。图4c为由xps结果分析得到的材料表面各个元素的原子百分比，可见ti和ti-zno样品表面基本不含磷元素，而ti-znp1和ti-znp2样品表面的磷元素含量大大增加，说明在磷酸氢盐中的水热处理能够将氧化锌成功转化成磷酸锌。
60.采用静态水接触角测试仪测试材料表面润湿性。图4d是各组样品的静态水接触角结果。横坐标为样品名称，纵坐标为接触角的度数。由图4d可知，未经处理的ti样品的接触角为60
°
左右；在ti表面制备了氧化锌纳米棒涂层后，接触角降低至22
°
左右；将氧化锌部分转换成磷酸锌后，接触角进一步降低。
61.实施例5
62.采用划痕实验检测所形成的涂层与基底之间的结合力。在样品表面形成划痕后，使用sem观察划痕两侧涂层的脱落情况。由图5可见，三种样品划痕边缘都未出现崩裂和大面积脱落的情况，说明本发明所制备的涂层与基底之间具有良好的结合力。
63.实施例6
64.将各组样品浸没入hank’s缓冲液中，保存于37℃，检测样品在模拟体内的生理条件下的锌离子的释放情况。由图6可知，各组样品在30天的检测周期内都可以持续释放出锌离子。其中ti-zno样品的释放速度最快，ti-znp1样品次之，ti-znp2样品释放锌离子的速度最慢。说明将氧化锌部分转换成磷酸锌后，能够显著降低锌离子的释放速率。
65.实施例7
66.将实施例6中所述保存于hank’s缓冲液中不同时间的样品取出，使用sem观察样品的表面形貌。如图7所示，ti-zno样品在溶液中浸泡5天后，表面的纳米棒状结构就开始崩塌；浸泡20天后，棒状结构完全消失，并形成孔洞状的腐蚀坑。而ti-znp1和ti-znp2样品在浸泡的30天过程中，表面形貌只有轻微改变。以上结果与实施例6中的结果吻合，说明将氧化锌部分转换成磷酸锌后，能够很大程度上减缓表面涂层的降解速率。
67.实施例8
68.将人来源的骨髓间充质干细胞接种并培养于各组样品表面。图8为细胞在样品表面培养1天、3天、5天后使用cck-8检测试剂盒获得的细胞的增殖情况。其中横坐标为细胞培养天数，纵坐标为检测试剂盒对应孔在450nm波长下的吸光度。吸光度越高表明增殖越快。由结果可见，培养在ti表面的细胞能够随培养时间的增加正常增殖，而ti-zno表面由于氧化锌较强的细胞毒性，其表面的细胞在培养1天以后即完全丧失活性。ti-znp1样品虽降低了ti-zno样品的毒性但与ti相比仍一定程度上抑制了细胞活性。而ti-znp2样品表面的细胞与ti表面的细胞基本相同。以上结果说明随着氧化锌纳米棒涂层中的部分氧化锌转换成了降解速度更慢的磷酸锌，大大降低了材料的生物毒性，并且随着反应时间的延长，磷酸锌的转换比例增加，涂层的细胞毒性也更低。
69.实施例9
70.使用骨诱导培养基培养各组样品表面的骨髓间充质干细胞3天、7天和14天，使其向成骨细胞分化，然后检测成骨细胞形成早期的标志性酶碱性磷酸酶(alp)的活性(图9a)、细胞分泌的胶原的情况(图9b)，以及细胞外基质的矿化(图9c)情况。结果中横坐标为细胞诱导天数，图9a纵坐标为alp的活性，并且其活性使用细胞内总蛋白含量做归一化处理；图9b-c纵坐标为检测试剂盒对应孔在570nm波长下的吸光度，吸光度越高表明细胞外基质矿
化程度越高。由结果可知ti-zno样品由于细胞毒性较强，成骨细胞难以在其表面正常生长，更难以向成骨细胞分化；ti-znp1表面培养的细胞具有一定的成骨细胞分化趋势；ti-znp2样品表面培养的细胞alp活性最高，在诱导21天后胶原分泌最多且细胞外基质的矿化程度最高。以上结果证明ti-znp2能够促进骨髓间充质干细胞向成骨分化。
71.实施例10
72.在各组样品表面培养细菌培养金黄色葡萄球菌和大肠杆菌来检测样品表面的抗菌性能。由图10a可见，ti表面无抗菌效果，zno表面抗菌效果最好，几乎可以杀灭表面的所有细菌。ti-znp1和ti-znp2表面的抗菌效果虽稍差，但是经计算抗菌率也在90％以上。以上结果证明ti-znp1和ti-znp2样品具有优异的抗感染能力。
73.本领域的普通技术人员可以理解，上述各实施方式是实现本技术的具体实施例，而在实际应用中，可以在形式上和细节上对其作各种改变，而不偏离本技术的精神和范围。任何本领域技术人员，在不脱离本技术的精神和范围内，均可作各自更动与修改，因此本技术的保护范围应当以权利要求限定的范围为准。