植物乳杆菌MA2在制备预防或改善由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病中的应用

植物乳杆菌ma2在制备预防或改善由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病中的应用
技术领域
1.本发明属于微生物技术领域，涉及植物乳杆菌ma2，尤其是一种植物乳杆菌ma2在制备预防或改善由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病中的应用。


背景技术：

2.近年来，越来越多的研究证明，肠道菌群失调与慢性肾脏疾病(chronic kidney disease，ckd)的发生关系密切，从ckd患者或动物模型的粪便中发现，肠道菌群在数量、组成及比例上发生明显的改变，如乳酸杆菌、双歧杆菌等益生菌的数量明显减少，大肠杆菌等条件致病菌的数量显著增加，通过给予益生菌，可以改善肠道菌群失调，进而缓解ckd。
3.不同益生菌调节的生理功能不尽相同，具有菌株特异性，因而通过其功能特性选用合适菌株进行干预试验最为重要。lactobacillusplantarum ma2是天津科技大学益生菌资源开发与应用实验室王艳萍教授从西藏kefir粒中分离得到的一株植物乳杆菌，于2009年4月9日保藏于中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，保藏号为cgmcc no.3005。王艳萍教授团队通过大量试验已经证明了l.plantarum ma2具有调节肠道菌群、抗抑郁及焦虑样、降胆固醇、抗氧化、改善ad等作用，本专利申请对其改善ckd的相关研究进行了总结。
4.目前为止，关于益生菌在体外培养时能代谢降解肌酐、尿素氮以及尿酸，同时灌胃动物后，仍表现出降解肌酐、尿素氮、尿酸的能力的报道仍然很少，本发明的出现对辅助治疗肾损伤，恢复肾脏功能具有重要意义。
5.通过检索，发现如下几篇与本发明专利申请相关的专利公开文献：
6.1、植物乳杆菌zdy2013在制备缓解肾损伤产品中应用(cn112553115a)，所述的植物乳杆菌zdy2013极耐酸耐胆盐，能在胃肠液中保持较高的存活率，并能抑制食源性致病菌的增长。此外，还能因为能调节肠道菌群多样性，达到改善宿主胃肠道健康。具有缓解肾脏纤维化，改善炎症表观症状，调节氧化应激，调控炎症因子的表达，达到有效防治高盐饮食诱导的肾损伤功效。
7.2、一种具有降低血糖功能的复合植物乳杆菌制剂及其应用(cn109136151a)，本发明提供一种复合菌，由植物乳杆菌ss18-5和植物乳杆菌ss18-37组成。复合菌中，植物乳杆菌ss18-5和植物乳杆菌ss18-37的cfu配比为1:(0.01-100)。植物乳杆菌ss18-5，保藏编号为cgmcc no.14917。植物乳杆菌ss18-37，保藏编号为cgmcc no.14918。本发明还保护复合菌在制备产品中的应用；所述产品的用途为治疗和/或预防糖尿病。本发明对糖尿病具有良好的降低血糖效果，同时显著改善胰岛素抵抗，对心脏、肝脏、肾脏、脾脏和胰腺具有保护功效。本发明具有广阔的市场应用前景。
8.通过对比，本发明专利申请与上述专利公开文献存在本质的不同。


技术实现要素：

9.本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种植物乳杆菌ma2在制备预
防或改善由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病中的应用。
10.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
11.一种植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ma2在制备预防或改善由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病药物或功能性食品中的应用，所述植物乳杆菌的名称为：ma2，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：cgmcc no.3005，保藏日期：2009年4月9日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
12.进一步地，所述植物乳杆菌ma2为活菌或热灭活菌株。
13.进一步地，所述药物或功能性食品以植物乳杆菌ma2活菌或热灭活植物乳杆菌ma2为有效成分，制成医学上、食品中能够接受的剂型。
14.进一步地，所述剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂或饮剂。
15.进一步地，所述饮剂包括有效量的植物乳杆菌ma2活菌或热灭活植物乳杆菌ma2和无菌生理盐水或乳制品、豆乳制品辅料。
16.进一步地，所述无菌生理盐水的质量体积浓度为0.6-0.9％，所述乳制品为牛乳，所述豆乳制品为大豆乳。
17.进一步地，所述由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病所引发的特征包括体重下降、精神萎靡、肾脏损伤、肾间质纤维化、机体炎症反应、肠道黏膜屏障受损。
18.进一步地，所述药品或功能性食品包括有效剂量的植物乳杆菌ma2及医学上或食品中能够接受的辅料。
19.进一步地，所述植物乳杆菌ma2活菌的有效量为109cfu/日，热灭活植物乳杆菌ma2菌体含量为109cfu/日。
20.进一步地，所述植物乳杆菌ma2体外培养时能够清除常见的尿毒症毒素及慢性肾病的特征；
21.所述植物乳杆菌ma2及其灭活菌株在动物实验时，有效干预治疗并改善小鼠慢性肾脏疾病。
22.进一步地，所述常见尿毒症毒素为肌酐、尿素、尿酸。
23.进一步地，所述慢性肾脏疾病特征包括体重减轻，精神萎靡，肠道黏膜通透性增加，血液中肌酐、尿素、尿酸等尿毒症毒素升高，肾脏损伤、氧化应激及肾间质纤维化等。
24.本发明取得的优点和积极效果为：
25.1、本发明经过体外实验确定了植物乳杆菌ma2具有清除肌酐、尿素、尿酸等尿毒症毒素的能力，动物体内实验表明，通过灌胃植物乳杆菌ma2及其灭活菌株，可以改善由腺嘌呤诱导的小鼠慢性肾脏疾病，包括外观形态、体重、精神状态、肾脏损伤、炎症反应以及肠道黏膜屏障通透性等。本发明发现了植物乳杆菌ma2(lactobacillusplantarum ma2)的一种新用途，尤其是关于其在改善慢性肾脏疾病中的新用途，提供一种高质量的益生菌干预治疗慢性肾脏疾病的新方法和新手段。
26.2、本发明通过体外培养的方法将以植物乳杆菌ma2活菌为有效成分，制成医学上或食品中可以接受的剂型，分别加入到含有肌酐、尿素、尿酸的人工肠液中，摇床混合，观察了植物乳杆菌ma2对于肌酐、尿素、尿酸的利用能力，结果表明：l.plantarum ma2体外能够显著利用肌酐、尿素、尿酸等尿毒症毒素。
27.本发明通过构建腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病小鼠模型，观察并测定了以植物乳杆
菌ma2活菌(或热灭活植物乳杆菌ma2)为有效成分，制成医学上或食品中可以接受的剂型对ckd小鼠模型体重、外观形态、肾脏器官指数、肾脏损伤、肾间质纤维化、炎症因子的表达及肠道上皮细胞屏障损伤的影响，结果发现：l.plantarum ma2及其灭活菌株能够显著改善小鼠外观形态及体重。
28.以上试验结果证明了以植物乳杆菌ma2活菌为有效成分，制成医学上或食品中可以接受的剂型，不仅体外培养时，具有清除肌酐尿素、尿酸等常见的尿毒症毒素的作用，动物实验表明，以植物乳杆菌ma2活菌(或热灭活植物乳杆菌ma2)还能够显著改善腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病所带来的生长抑制、精神萎靡、肾脏损伤、肾间质纤维化以及炎症反应和肠道黏膜通透性，为应用益生菌及后生元干预治疗慢性肾脏疾病的临床研究提供了理论依据。
29.3、本发明将植物乳杆菌ma2用于制备预防或改善由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病药物或功能性食品中，提供一种用于预防或改善慢性肾脏疾病的药物或功能性食品，该药物或功能性食品无副作用，可以作为常规治疗慢性肾脏疾病的安全替代药物。
附图说明
30.图1为本发明中各组小鼠肾脏形态图(其中，从左至右依次为control(空白组)、model(模型组)、postive(阳性药物组)、ma2(植物乳杆菌ma2组)、inactive ma2(热灭活植物乳杆菌ma2组))；
31.图2为本发明中各组小鼠肾脏病理观察图(control(空白组)：灌胃生理盐水；model(模型组)：灌胃腺嘌呤混悬液；postive(阳性药物组)：灌胃腺嘌呤混悬液和阳性药物；ma2(植物乳杆菌ma2组)：灌胃腺嘌呤混悬液和植物乳杆菌ma2菌液；inactive ma2(热灭活植物乳杆菌ma2组)：灌胃腺嘌呤混悬液和热灭活植物乳杆菌ma2菌液)；
32.图3为本发明中各组小鼠肾脏炎症相关因子il-1β相对表达量的柱形图(数据是以均值
±
s.d；与空白组相比，
##
p＜0.01；与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.05；control(空白对照组)：灌胃生理盐水；model(模型组)：灌胃腺嘌呤混悬液；postive(阳性药物组)：灌胃腺嘌呤混悬液和阳性药物；ma2(植物乳杆菌ma2组)：灌胃腺嘌呤混悬液和植物乳杆菌ma2菌液；inactive ma2(热灭活植物乳杆菌ma2组)：灌胃腺嘌呤混悬液和热灭活植物乳杆菌ma2菌液)；
33.图4为本发明中各组小鼠结肠中claudin-1蛋白相对表达量以及肾脏中lps含量的结果图(a：claudin-1，b：lps；数据是以均值
±
s.d；与模型组相比，**p＜0.01；control(空白对照组)：灌胃生理盐水；model(模型组)：灌胃腺嘌呤混悬液；postive(阳性药物组)：灌胃腺嘌呤混悬液和阳性药物；ma2(植物乳杆菌ma2组)：灌胃腺嘌呤混悬液和植物乳杆菌ma2菌液；inactive ma2(热灭活植物乳杆菌ma2组)：灌胃腺嘌呤混悬液和热灭活植物乳杆菌ma2菌液)；
34.图5为本发明中各组小鼠肾脏中与氧化应激程度相关酶活性的柱形图(a：gsh-px，b：mda；数据是以均值
±
s.d；与空白组相比，
##
p＜0.01；与模型组相比，*p＜0.05，**p＜0.01；control(空白对照组)：灌胃生理盐水；model(模型组)：灌胃腺嘌呤混悬液；postive(阳性药物组)：灌胃腺嘌呤混悬液和阳性药物；ma2(植物乳杆菌ma2组)：灌胃腺嘌呤混悬液和植物乳杆菌ma2菌液；inactive ma2(热灭活植物乳杆菌ma2组)：灌胃腺嘌呤混悬液和热
灭活植物乳杆菌ma2菌液)。
具体实施方式
35.下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
36.具体实施例中所涉及的各种实验操作，均为本领域的常规技术，本文中没有特别注释的部分，本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等予以实施。
37.一种植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)ma2在制备预防或改善由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病药物或功能性食品中的应用，所述植物乳杆菌的名称为：ma2，分类名称为：植物乳杆菌，保藏编号为：cgmcc no.3005，保藏日期：2009年4月9日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
38.较优地，所述植物乳杆菌ma2为活菌或热灭活菌株。
39.较优地，所述药物或功能性食品以植物乳杆菌ma2活菌或热灭活植物乳杆菌ma2为有效成分，制成医学上、食品中能够接受的剂型。
40.较优地，所述剂型包括片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊剂或饮剂。
41.较优地，所述饮剂包括有效量的植物乳杆菌ma2活菌或热灭活植物乳杆菌ma2和无菌生理盐水或乳制品、豆乳制品辅料。
42.较优地，所述无菌生理盐水的质量体积浓度为0.6-0.9％，所述乳制品为牛乳，所述豆乳制品为大豆乳。
43.较优地，所述由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病所引发的特征包括体重下降、精神萎靡、肾脏损伤、肾间质纤维化、机体炎症反应、肠道黏膜屏障受损。
44.较优地，所述药品或功能性食品包括有效剂量的植物乳杆菌ma2及医学上或食品中能够接受的辅料。
45.较优地，所述植物乳杆菌ma2活菌的有效量为109cfu/日，热灭活植物乳杆菌ma2菌体含量为109cfu/日。
46.较优地，所述植物乳杆菌ma2体外培养时能够清除常见的尿毒症毒素及慢性肾病的特征；
47.所述植物乳杆菌ma2及其灭活菌株在动物实验时，有效干预治疗并改善小鼠慢性肾脏疾病。
48.较优地，所述常见尿毒症毒素为肌酐、尿素、尿酸。
49.较优地，所述慢性肾脏疾病特征包括体重减轻，精神萎靡，肠道黏膜通透性增加，血液中肌酐、尿素、尿酸等尿毒症毒素升高，肾脏损伤、氧化应激及肾间质纤维化等。
50.具体地，相关制备及检测如下：
51.生物保藏说明：
52.本发明使用的植物乳杆菌ma2，于2009年4月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为cgmcc no.3005。且该植物乳杆菌ma2为公开的现有菌株，例如专利公开文献cn103355620a中已经公开。
53.实施例1
54.称取植物乳杆菌ma2菌粉，将其溶于1ml的可食用溶质中，浓度为109cfu，或称取植物乳杆菌ma2菌粉，将其溶于1ml的可食用溶质中，浓度为109cfu，经过121℃，20min高压灭活，即可得到本发明中所述的预防或改善慢性肾脏疾病的样品。
55.实施例2
56.向含有肌酐的人工肠液中加入实施例1中所述的未经热灭活的预防或改善慢性肾脏疾病的样品，37℃，150r/min摇床反应6h，然后4℃，8000r/min离心20min，收集上清液，采用碱性苦味酸法检测上清液中肌酐含量，结果如表1所示，与对照组相比，ma2组人工肠液中肌酐含量显著降低6.53％。
57.表1植物乳杆菌ma2体外降解肌酐能力
[0058][0059]
注：与对照相比，**p＜0.01
[0060]
实施例3
[0061]
向含有尿素的人工肠液中加入实施例1中所述的未经热灭活的预防或改善慢性肾脏疾病的样品，37℃，150r/min摇床反应6h，然后4℃，8000r/min离心20min，收集上清液，最后使用尿素检测试剂盒(脲酶波氏比色法)检测上清液中尿素含量，结果如表2所示，与对照组相比，ma2组人工肠液中尿素含量显著降低12.9％。
[0062]
表2植物乳杆菌ma2体外降解尿素能力
[0063][0064][0065]
注：与对照组相比，*p＜0.05
[0066]
实施例4
[0067]
向含有尿酸的人工肠液中加入实施例1中所述的未经热灭活的预防或改善慢性肾脏疾病的样品，37℃，150r/min摇床反应6h，然后4℃，8000r/min离心20min，收集上清液，最后使用尿酸试剂盒(尿酸酶比色法)检测上清液中尿酸含量，结果如表3所示，与对照组相比，ma2组人工肠液中尿酸含量显著降低8％。
[0068]
表3植物乳杆菌ma2体外降解尿酸能力
[0069][0070]
注：与对照组相比，*p＜0.05
[0071]
实施例2-4采用体外实验的方法，表明植物乳杆菌ma2具有显著地体外降解肌酐、
尿素、尿酸的能力。
[0072]
实施例5
[0073]
以spf级7周龄balb/c雄性小鼠(体重约20-23g)为实验材料，将其随机分成4组，每组10只，各组处理如下所示：空白对照组连续灌胃无菌生理盐水(其质量体积浓度为0.85％)6周；模型组：按腺嘌呤/体重方式连续灌胃100mg/kg腺嘌呤6周；l.plantarum ma2组：按腺嘌呤/体重方式连续灌胃100mg/kg腺嘌呤和服用实施例1中所述的未经热灭活的预防或改善慢性肾脏疾病的样品(每日服用1次，每次服用量为1
×
109cfu)6周；inactive l.plantarum ma2组按腺嘌呤/体重方式连续灌胃100mg/kg腺嘌呤和服用实施例1中所述的经热灭活的预防或改善慢性肾脏疾病的样品(每日服用1次，每次服用量为1
×
109cfu)6周。每周称量一次小鼠体重，并根据表4观察记录小鼠外观形态变化，最后一周解剖小鼠，观察肾脏形态并称重。
[0074]
表4评分方法
[0075][0076][0077]
小鼠实验期间体重变化、外观形态以及肾脏形态及肾脏指数评分，其中肾脏形态见图1。结果表明，经过灌胃l.plantarum ma2及其灭活菌株后，小鼠体重得到了恢复、竖发现象缓解、精神状态改善和肾脏水肿减轻，说明l.plantarum ma2及其灭活菌株可以显著改善由腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病引发的生长抑制、竖发现象及精神萎靡、肾脏水肿。
[0078]
实施例6
[0079]
以spf级7周龄balb/c雄性小鼠(体重约20-23g)为实验材料，将其随机分成4组，每组10只，各组处理如下所示：空白对照组连续灌胃无菌生理盐水(其质量体积浓度为0.85％)6周；模型组：按腺嘌呤/体重方式连续灌胃100mg/kg腺嘌呤6周；阳性药物组：按腺嘌呤/体重方式连续灌胃100mg/kg腺嘌呤和服用200mg/kg海坤肾喜胶囊；l.plantarum ma2组：按腺嘌呤/体重方式连续灌胃100mg/kg腺嘌呤和服用实施例1中所述的预防或改善慢性肾脏疾病的药物(每日服用1次，每次服用量为1
×
109cfu)6周；inactivel.plantarum ma2组按腺嘌呤/体重方式连续灌胃100mg/kg腺嘌呤和服用实施例1中所述的经热灭活的预防或改善慢性肾脏疾病的样品(每日服用1次，每次服用量为1
×
109cfu)6周。最后一周解剖小鼠，收集血清、肾脏、结肠。
[0080]
采用酶联免疫elisa试剂盒检测小鼠血清中肌酐、尿素、尿酸、is、pcs、tmao水平，结果表明，与空白组相比，腺嘌呤混悬液诱导使ckd模型组小鼠血清肌酐、尿素、尿酸、is、pcs、tmao水平显著升高，分别为345％、255％、124％、122％、70.84％、96.64％，经植物乳杆菌ma2干预治疗后，血清肌酐、尿素、尿酸、is、pcs、tmao水平显著下降，分别为38.97％、42.29％、28.57％、39.63％、28.90％、40.84％；经过热灭活植物乳杆菌ma2干预治疗后，血清肌酐、尿素、尿酸、is、pcs、tmao水平显著下降，分别为28.57％、28.64％、18.12％、37.58％、31.57％、37.33％。说明了植物乳杆菌ma2及其灭活菌株能够通过降解肌酐、尿素氮、尿酸、is、pcs、tmao缓解ckd。
[0081]
采用he染色和masson染色分别观察肾脏损伤和肾间质纤维化程度，结果见图2。图2表明了与空白组相比，模型组小鼠肾脏出现明显的肾小管扩张、空泡化以及肾间质纤维化、胶原纤维沉积，经植物乳杆菌ma2及其灭活菌株干预治疗后，ckd小鼠模型肾脏纤维化及肾小管扩张等现象明显改善，说明植物乳杆菌ma2及其灭活菌株干预能够减轻肾脏损伤以及缓解肾间质纤维化和肾脏细胞凋亡。
[0082]
实时荧光定量pcr检测肾脏组织中炎症因子il-1β的表达，结果见图3。图3表明了与空白组相比，模型组小鼠肾脏中il-1β相对表达水平显著增加，经植物乳杆菌ma2及其灭活菌株干预治疗后，ckd小鼠模型肾脏中il-1β相对表达水平显著下降，说明了植物乳杆菌ma2及其灭活菌株能够有效改善腺嘌呤诱导ckd小鼠模型所引发的肾脏炎症反应以此延长ckd小鼠肾脏功能。
[0083]
采用实时荧光定量pcr检测结肠组织claudin-1蛋白的表达以及小鼠lps elisa酶联免疫检测试剂盒检测lps含量，结果见图4。图4表明了与空白组相比，模型组小鼠结肠中claudin-1蛋白相对表达水平显著降低，经植物乳杆菌ma2及其灭活菌株干预治疗后，ckd小鼠结肠claudin-1蛋白相对表达水平显著增加，以及lps含量减少，说明了植物乳杆菌ma2及其灭活菌株能够通过提高claudin-1蛋白相对表达水平恢复腺嘌呤诱导的ckd小鼠模型肠道黏膜屏障的完整性从而减少lps进入血液循环。
[0084]
采用酶联免疫elisa试剂盒检测小鼠肾脏中gsh-px、mda活性，结果见图5。图5表明了与空白组相比，模型组小鼠肾脏中gsh-px活性显著降低，mda活性显著增加，经植物乳杆菌ma2及其灭活菌株干预治疗后，ckd小鼠模型肾脏中gsh-px活性显著增加，mda活性显著降低。说明植物乳杆菌ma2及其灭活菌株能够通过调节肾脏中gsh-px、mda活性改善腺嘌呤诱导的ckd小鼠模型氧化应激程度缓解ckd。
[0085]
结论：通过小鼠外观形态、体重、肾脏形态、肾脏指数等表征指标以及血清中肌酐、尿素、尿酸水平、肾脏中炎症因子的相对表达水平、肠道黏膜屏障的通透性等生理生化指标，可以得出，l.plantarum ma2及其灭活菌株能够显著减轻腺嘌呤诱导的慢性肾脏疾病所带来的体重减轻、精神萎靡、肾脏损伤、肾间质纤维化及炎症反应等不良影响，为临床治疗肾脏损伤提供了依据。
[0086]
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。