葛根多糖在制备治疗和/或预防犬骨关节炎药物中的应用

1.本发明涉及动物医药技术领域，具体涉及葛根多糖在制备治疗和/或预防犬骨关节炎药物中的应用。


背景技术：

2.犬骨关节炎(osteoarthritis，oa)是由于生活环境、行为习惯、外部损伤以及机体老化等原因在犬临床上出现的一种关节退行性疾病，是最常见的骨科疾病。主要导致关节软骨发生退行性变化、滑膜病变、骨质增生，并伴有关节其他部位退行性改变，逐渐发展为慢性炎症。患骨关节炎的病犬在临床上主要表现为关节疼痛、肿胀，以及功能性活动障碍，膝关节炎患病严重者出现摩擦音，有些病例表现为跛行。据统计年龄在一岁以上的犬有20％患有不同程度的骨关节炎，同时犬骨关节炎的发病率随年龄增加而升高，5岁以上的病例占95％，10岁以上的老龄犬病例占50％，因此临床上常将年龄作为一种诊断依据。
3.骨关节炎发生发展过程中总伴随着炎症因子的分泌并引起一系列反应。在oa进展过程中，包括软骨和滑膜关节都参与了炎症过程。物理或生理刺激下关节组织中滑膜和软骨组织的组成成分软骨细胞和滑膜细胞的性质发生改变，产生凋亡甚至坏死，形成肥大细胞分泌炎症因子。包括骨关节炎在内的所有炎症免疫细胞分泌的炎症因子都是主要参与者。在骨关节炎早期，tnf-α和il-1β由活化的软骨细胞、滑膜细胞和单核细胞产生，其独立或和其他细胞因子协同驱动炎症级联反应。
4.该病病程长，具有反复发作的特点，且随着病程的延长，软骨细胞的修复力逐渐下降，最终将造成不可修复的损伤，严重影响病犬的生活质量。因此临床上常以减轻疼痛、抑制炎症反应等为主要治疗手段减轻病犬的疼痛和活动障碍等症状。
5.葛根，最早记载于《神农本草经》，在中国传统疗法中用于治疗感冒、腹泻、高血压和糖尿病。多糖是葛根中的有效成分之一。很多研究证实了多糖的多种生物学活性，如免疫调节、抗氧化、调节肠道菌群。近年来一些研究证实来自中草药的多糖在治疗和预防骨关节炎方面有显著作用。当归多糖(aps)通过调节mir-92a/klf4轴和抑制nf-κb和p38mapk信号通路来保护atdc5细胞免受lps诱导的损伤；通过激活软骨细胞erk1/2依赖性自噬，显着挽救了snp诱导的细胞凋亡。枸杞多糖(lbp)可通过抑制jnk和nf-κb信号通路发挥抗炎作用，减少软骨细胞的炎症因子水平。
6.鉴于上述缺陷，本发明创作者经过长时间的研究和实践终于获得了本发明。


技术实现要素：

7.本发明的目的在于解决如何将葛根应用于制备治疗犬骨关节炎的药物中的问题，提供了一种葛根多糖在制备治疗和/或预防犬骨关节炎药物中的应用。
8.所述药物中葛根多糖用量与犬体重之间关系满足：每1kg犬重，葛根多糖用量为11.0μg。
9.所述药物中葛根多糖含量为0.05％～0.1％。
10.为了实现上述目的，本发明公开了一种葛根多糖在制备治疗和/或预防犬骨关节炎药物中的应用，药物中的葛根多糖通过减少软骨细胞损伤、滑膜细胞损伤从而实现对犬骨关节炎的防治。
11.所述葛根多糖的制备方法包括以下步骤：
12.s1，将葛根加入煮沸的蒸馏水中，保持微沸状态持续4h，得到的液体倒出后，对液体4000rpm离心20min；
13.s2，收集步骤s1中溶液的上清液，向残渣中加入沸水并保持微沸状态持续2h，再次收集上清液并离心；
14.s3，将步骤s2中两次得到的上清液合并，真空旋转蒸发浓缩；
15.s4，将步骤s3中浓缩的多糖溶液和无水乙醇以1:4的体积比搅拌混合，4℃过夜；
16.s5，将步骤s4中得到的溶液的上清弃去，4000rpm离心20min收集沉淀，反复醇沉后再将沉淀烘干，除去蛋白质、淀粉和小分子物质并烘干得到葛根粗多糖；
17.s6，称取适量葛根粗多糖用葡聚糖凝胶蒸馏水洗脱，收集滤液，收集多糖峰得到纯化葛根多糖。
18.所述步骤s5中采用sevag法除去蛋白质，采用酶解法除去淀粉，采用透析除去小分子物质。
19.与现有技术比较本发明的有益效果在于：本发明通过葛根多糖ppl-1促进巨噬细胞增值、抑制lps在巨噬细胞中产生的损伤，表明ppl-1具有免疫调节作用以及抗炎作用，通过研究研究ppl-1对原代软骨细胞和滑膜细胞、以及lps诱导的损伤的影响，评价ppl-1作为潜在抗关节炎药物对oa大鼠、犬的疗效。结果表明ppl-1对体外的软骨细胞和滑膜细胞无副作用；但ppl-1能够在10-1.25μg/ml浓度范围内，明显减轻lps诱导的软骨细胞损伤；ppl-1能够在1.6-0.2μg/ml浓度范围内，明显减轻lps诱导的滑膜细胞损伤。采用木瓜蛋白酶和l-半胱氨酸注射sd大鼠膝关节腔建立骨关节炎(oa)模型，结果表明中剂量ppl-1能明显改善oa造成的关节肿大症状，关节宽度明显减小；he染色后电镜图，结果显示ppl-1中剂量组关节表面光滑，软骨细胞排列整齐，细胞损失较少，说明ppl-1能减少oa过程中软骨细胞的损失。
附图说明
20.图1为葛根多糖ppl-1的洗脱曲线；
21.图2为ppl-1对大鼠原代软骨细胞增值能力的影响，
*
p＜0.05，
**
p＜0.01，vs the lps group，n＝5；
22.图3为ppl-1对大鼠原代滑膜细胞增值能力的影响；
23.图4为ppl-1对lps诱导的软骨细胞损伤的影响；
24.图5为ppl-1对lps诱导的滑膜细胞损伤的影响；
25.图6为ppl-1对lps诱导的软骨细胞凋亡的影响；
26.图7为ppl-1对lps诱导的滑膜细胞凋亡的影响；
27.图8为ppl-1对oa鼠的影响，(a)为实验第13到25天大鼠右膝关节宽度，(b)为he染色后电镜图。
具体实施方式
28.以下结合附图，对本发明上述的和另外的技术特征和优点作更详细的说明。
29.一、葛根多糖的制备
30.葛根(市购，生产企业为上海华鹰药业有限公司)经过石油醚回流法去除脂质和色素等杂质，烘干后用破壁机粉碎，密封保存。称取100g葛根放入2l的玻璃烧瓶中，加入1l煮沸的蒸馏水，保持微沸状态持续4h。将瓶中的液体倒出后离心20min(4000rpm)。收集上清，并将残渣倒回烧瓶中，加入500ml的沸水并保持微沸状态持续2h，再次收集上清并离心。将两次得到的上清液合并，通过真空旋转蒸发浓缩至适当体积。将浓缩的多糖溶液和无水乙醇(95％)以1:4的体积比搅拌混合，4℃过夜。将上清小心弃去，4000rpm离心20min收集沉淀，反复醇沉后再将沉淀烘干，sevag法除去蛋白质，酶解法除去淀粉后，透析除去小分子物质并烘干得到葛根粗多糖(ppl)。准确称取适量ppl用葡聚糖凝胶蒸馏水洗脱，自动部分收集器收集滤液，苯酚-硫酸法检测管中洗脱液的多糖含量，收集多糖峰得到纯化多糖ppl-1。
31.ppl及ppl-1的得率分别为2％和28％。另外，ppl-1经葡聚糖凝胶g-100的洗脱曲线如图1所示，我们收集此峰对应管中的洗脱液并干燥即可得到葛根多糖ppl-1。ppl-1的中性糖含量为64％，糖醛酸含量为21％的酸性多糖。
32.二、葛根多糖体外活性分析
33.1、ppl-1对大鼠原代软骨细胞增值能力的影响
34.使用mtt法测量ppl-1对关节软骨细胞增值的影响。从7周龄sd大鼠膝关节软骨组织中获取的软骨细胞在37℃、5％co2的培养箱中正常培养。取2-7代的软骨细胞消化、计数，并稀释为每毫升4
×
104个细胞的细胞悬液，接种100μl在96孔板上，待8h细胞特贴壁后更换为不同剂量ppl-1(20-0.01μg/ml)的dmam完全培养基，继续培养12h后每孔加入10μl5mg/ml mtt溶液，轻轻晃动培养板将mtt混匀后放入培养箱内避光孵育4h。之后小心移去孔内上清加入150μldmso，酶标仪检测各孔570nm处的光密度(od)值。
35.由图2可以看出，ppl-1没有明显的促进或抑制软骨细胞增值的能力。
36.2、ppl-1对大鼠原代滑膜细胞增值能力的影响
37.使用mtt法测量ppl-1对关节滑膜细胞增值的影响。从7周龄sd大鼠膝关节滑膜组织中获取的滑膜细胞在37℃、5％co2的培养箱中正常培养。取2-7代的滑膜细胞消化、计数，并稀释为每毫升4
×
104个细胞的细胞悬液，接种100μl在96孔板上，待8h细胞特贴壁后更换为不同剂量ppl-1(25-0.1μg/ml)的dmam完全培养基，继续培养12h后每孔加入10μl5mg/ml mtt溶液，轻轻晃动培养板将mtt混匀后放入培养箱内避光孵育4h。之后小心移去孔内上清加入150μl dmso，酶标仪检测各孔570nm处的光密度(od)值。
38.由图3可以看出，ppl-1没有明显的促进或抑制滑膜细胞增值的能力。
39.3、ppl-1对lps诱导的软骨细胞损伤的影响
40.使用mtt法测量ppl-1对lps诱导的软骨细胞损伤的影响。取2-7代的软骨细胞消化、计数，并稀释为每毫升5
×
104个细胞的细胞悬液，接种100μl在96孔板上，待8h细胞贴壁后更换为含有10μg/ml lps的dmam完全培养基，继续培养48h后每孔加入不同剂量ppl-1培养12h，之后每孔加入10μl5 mg/ml mtt溶液，轻轻晃动培养板将mtt混匀后放入培养箱内避光孵育4h。之后小心移去孔内上清加入150μldmso，酶标仪检测各孔570nm处的光密度(od)值。
41.检测结果见图4。通过图4可看出，ppl-1在10-1.25μg/ml浓度范围内，明显减轻lps诱导的软骨细胞损伤。
42.4、ppl-1对lps诱导的滑膜细胞损伤的影响
43.使用mtt法测量ppl-1对lps诱导的滑膜细胞损伤的影响。取2-7代的滑膜细胞消化、计数，并稀释为每毫升5
×
104个细胞的细胞悬液，接种100μl在96孔板上，待8h细胞贴壁后更换为含有10μg/ml lps的dmam完全培养基，继续培养48h后每孔加入不同剂量ppl-1(1.6-0.2μg/ml)培养12h，之后每孔加入10μl 5mg/ml mtt溶液，轻轻晃动培养板将mtt混匀后放入培养箱内避光孵育4h。之后小心移去孔内上清加入150μl dmso，酶标仪检测各孔570nm处的光密度(od)值。
44.检测结果见图5。通过图5，可看出ppl-1能够在0.2～1.6μg/ml浓度内明显减轻lps诱导的滑膜细胞损伤。
45.5、ppl-1对lps诱导的软骨细胞凋亡的影响
46.使用流式细胞仪和细胞凋亡坏死试剂盒检测ppl-1对lps诱导的软骨细胞凋亡的影响。将2-7代的滑膜细胞消化、计数后稀释为每毫升2
×
105个细胞的细胞悬液，接种1ml在12孔板上，8h贴壁后更换为含有10μg/ml lps的dmam完全培养基，继续培养48h后每孔加入不同剂量ppl-1培养12h，之后按照细胞凋亡试剂盒说明书处理细胞，之后通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。
47.检测结果见图6。由图6(g)可看出，ppl-1能够在1.6-0.2μg/ml浓度内明显减轻lps诱导的软骨细胞凋亡。
48.6、ppl-1对lps诱导的滑膜细胞凋亡的影响
49.使用流式细胞仪检测ppl-1对lps诱导的滑膜软骨细胞凋亡的影响。将2-7代的滑膜细胞消化、计数后稀释为每毫升2
×
105个细胞的细胞悬液，接种1ml在12孔板上，8h贴壁后更换为含有10μg/ml lps的dmam完全培养基，继续培养48h后每孔加入不同剂量ppl-1培养12h，之后按照细胞凋亡试剂盒说明书处理细胞，之后通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。
50.检测结果见图7。通过图7(g)可看出ppl-1能够在1.6-0.2μg/ml浓度内明显减轻lps诱导的滑膜细胞损伤。
51.三、葛根多糖体内试验分析
52.1、ppl-1对患有oa的sd大鼠影响
53.将15只七周龄sd雄性大鼠，体重200～250g，随机分为5组，每组3只。在第1、4、7和10天，除正常对照组，其余各组腹腔注射10％水合氯醛3.5ml/kg麻醉后，将提前制备好的4％木瓜蛋白酶和0.03mol/ll-半胱氨酸二比一混合液以0.3ml/kg的剂量注射入右膝关节腔建立骨关节炎模型。在第13、16、19、22和25天关节注射治疗药物。各组所给药物和剂量：
①
模型组(oa+生理盐水)
②
正常对照组
③
ppl-1高剂量组(oa+ppl-11.5μg/kg)
④
ppl-1中剂量组(oa+ppl-11.0μg/kg)
⑤
ppl-1低剂量组(oa+ppl-10.5μg/kg)。每三天测量大鼠膝关节宽度。第26天处死大鼠后取大鼠右膝关节组织，甲醛固定后脱钙，制备石蜡切片，he染色后观察组织细胞病理形态。
54.实验结果如图8所示。图8(a)为实验第13到25天大鼠右膝关节宽度，可看到造模后造模组的大鼠右膝关节宽度明显增大，第3次注射ppl-1溶液后ppl-1中剂量组较模型组关节宽度明显减小，说明关节注射中剂量ppl-1能明显改善oa造成的关节肿大症状。图8(b)为
he染色后电镜图，结果显示ppl-1中剂量组关节表面光滑，软骨细胞排列整齐，细胞损失较少，说明ppl-1能减少oa过程中软骨细胞的损失。
55.2、ppl-1对oa犬的影响
56.选取20只不同品种、性别、年龄，具有关节炎临床症状的犬只。将犬只随机分为2组，每组10只，试验组喂食在犬的食品中添加0.05％-0.1％葛根多糖ppl-1的宠物食品，对照组喂食不含葛根多糖ppl-1的宠物食品，试验12周。观察记录实验犬的关节表现及关节指数，观察记录疼痛或不适、晨僵、关节肿胀、步行痛等。采用国际骨关节的评分标准lequesne指数对对犬关节的影响进行评分(见表1)。
57.表1国际骨关节lequesne指数评分标准
[0058][0059]
备注：均分小于0.5，表示轻度功能障碍；均分处于0.5～1.33之间，表示中度功能障碍；处于1.33～2.33之间，表示重度功能障碍；大于2.33分以上表示功能障碍极其严重。
[0060]
试验开始时，试验组和对照组的lequesne平均指数分别为1.27
±
0.20、1.23
±
0.18，两组之间差异不显著(p＞0.05)；试验结束时，试验组和对照组的lequesne平均指数分别为1.06
±
0.13、1.29
±
0.22，两组之间差异显著(p＜0.05)；表明葛根多糖对缓解犬关节炎的症状有效，可以预防或辅助治疗犬关节炎。
[0061]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，对本发明而言仅仅是说明性的，而非限制性的。本专业技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效，但都将落入本发明的保护范围内。