红景天或红景天苷在制备保护和/或调节细胞外泌体的制剂中的应用

1.本发明涉及化合物技术领域，尤其是涉及一种红景天或红景天苷在制备保护和/或调节细胞外泌体的制剂中的应用。


背景技术：

2.外泌体作为药物递送载体作为当前热门探索的方向，它可以向肿瘤细胞运送组分，影响肿瘤的进展、转移和耐药等行为。而反过来说，也可以将外泌体作为药物递送的媒介，为其构建靶向性，使其用于递送治疗剂，从而扩展现有精准治疗的给药方式。
3.外泌体是近年来干细胞领域的热词，被认为是干细胞领域的下一个风口。间充质干细胞外泌体源自于干细胞，但又与干细胞有着很大的区别，它更加灵活，更容易改造，是皮肤修复、抗衰老以及多种疾病治疗的新方向外泌体。
4.外泌体(exosome)是一类直径30-150nm，具有完整膜结构的细胞外囊泡，主要负责细胞间的物质运输和信息传递，它的存在就像是细胞之间的“快递小王子”，是细胞之间交流信息、交换物质的载体。干细胞里有外泌体，肿瘤细胞里也有外泌体。外泌体的在医疗领域的应用主要包括疾病诊断和治疗两个方面。在诊断方面，尤其是在血液和体液等液态标本中检测外泌体标志物，可用于获取疾病相关信息的试验诊断，比如肿瘤早期诊断、疗效的预后评估。在治疗方面，研究报道，天然未经过工程化改造的外泌体在对其有较多摄取的脏器相关疾病中具有治疗作用。而工程化改造的外泌体很可能会增加外泌体的适用范围，甚至具有作为临床药物的应用潜力。外泌体作为药物递送载体也是当前热门探索的方向，它可以向肿瘤细胞运送组分，影响肿瘤的进展、转移和耐药等行为。
5.外泌体包含丰富的蛋白质、rna及dna等生物活性物质。干细胞外泌体与干细胞具有相似的生物学性能，但更加安全稳定高效，具有更强而复杂的信号分子转运和调控能力，为无细胞移植治疗的情况下实现组织再生、组织修复提供了新策略、新方法。
6.近年来，间充质干细胞外泌体的临床研究应用越来越广泛，被认为是皮肤的“修复神器”，是修复心脏功能的新主流，是抗衰老的新风口，同时，间充质干细胞外泌体还被应用到了新型冠状病毒感染的治疗研究当中。
7.因此，对细胞外泌体生物发生、释放、活性的研究，对于外泌体结构和功能及其在组织工程、临床医学和医药开发中的应用具有十分重要的意义。
8.红景天，景天科红景天属(rhodiola)植物红景天的干燥根和根茎，为青藏高原特色名贵中药材，因其可明显增强机体对一系列化学、生物学以及身体应激源的抵抗力而被研究人员归为“适应原”性药物。红景天苷(salidroside，sal) 为其有效活性成份之一。大量研究证实，红景天苷具有抗缺氧、抗疲劳、抗辐射、抗衰老、保肝等作用。上世纪70年代以来，人们陆续发现红景天苷在抗炎抗氧化、免疫调节、抑制肿瘤、清除自由基和抗菌抗病毒等方面有独特疗效，部分中成药或保健品已进入临床试验。而在心血管领域，红景天苷还具有显著的促进一氧化氮合成、减少前列素积累、抑制线粒体通透性转换孔开放等功能，以及
增强心肺系统的耐缺氧能力。但至今其在干细胞药理和疗法等方面研究还较少。
9.迄今一直未见红景天及红景天苷对外泌体作用等相关方面的报道。


技术实现要素：

10.本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种红景天或红景天苷在制备保护和/或调节细胞外泌体的制剂中的应用。
11.为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
12.第一目的，本发明提供了红景天或红景天苷在制备保护和/或调节细胞外泌体的制剂中的应用。
13.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述红景天或红景天苷调节细胞外泌体生物发生、释放、活性和代谢物含量，所述红景天或红景天苷保护细胞外泌体的结构。
14.优选地，红景天苷来源于红景天植物，或者人工合成的单体化合物。
15.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述红景天或红景天苷在低氧条件下保护和/或调节细胞外泌体。
16.低氧可以促进细胞外泌体的生物生长，并且，红景天苷联合低氧条件预处理更能有效促进细胞外泌体分泌增加，有利于细胞外泌体的生成。
17.经过低氧及红景天苷处理后细胞外泌体并未改变其形态和结构，在透射电子显微镜下观察，可见细胞外泌体视野分布，部分成团簇拥，呈清晰“茶杯托”状双层膜结构。
18.所述调节指代的是红景天或红景天促进细胞外泌体的生物生成、释放，提高细胞外泌体的活性和代谢物含量，以及保护细胞外泌体的结构。
19.与常氧组相比，低氧及低氧联合红景天苷预处理能有效促进细胞外泌体分泌增加。
20.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述细胞包括干细胞、内皮细胞、免疫细胞、血小板、平滑肌细胞中的至少一种。
21.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述红景天或红景天苷在低氧条件下调控细胞mirna的表达。
22.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述红景天或红景天苷在低氧条件下调控smpd2及tsg101的表达。
23.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述低氧条件指氧气的体积含量低于21％，优选地，氧气的体积含量为8％～15％；更优选地，氧气的体积含量为 5％。
24.在低氧条件下，加入红景天苷预处理细胞，获得细胞外泌体的代谢物提高。
25.作为本发明所述应用的优选实施方式，在体系中，所述红景天苷的浓度为 25-200μm，优选地，所述红景天苷的浓度为50μm。
26.本发明在低氧的条件下，加浓度为50μm的红景天苷后的细胞外泌体的代谢谱出现明显波峰。
27.本发明还提供一种细胞外泌体的制备方法，在低氧条件下或低氧条件联合红景天苷促进细胞外泌体的生成，所述低氧条件下指氧气的体积含量低于21％。
28.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述制剂为注射制剂、冻干粉针剂、乳剂、胶囊制剂、颗粒剂、散剂、片剂、丸剂中的任意一种。
29.作为本发明所述应用的优选实施方式，所述红景天苷在制剂中的重量百分含量大于10％。
30.与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
31.本发明提供了一种红景天或红景天苷在制备保护和/或调节细胞外泌体的制剂中的应用，其中红景天或红景天苷联合低氧条件可以调节细胞外泌体生物发生、释放、稳定性、活性、内容物组成和代谢物含量，保护细胞外泌体的结构和功能，因此，红景天或红景天苷等有效成分可用于制备外泌体生物制品的药物、试剂、生物制品和辅助佐剂，应用于细胞外泌体的生成、保存、扩增、复苏、培养、处理、分化和使用等科学研究、实验操作、药品制备、疾病治疗、整形美容、生物修复、器官移植相关领域。
附图说明
32.图1为western blot结果显示adscs外泌体特异性标志蛋白cd63、cd9、 tsg101表达情况；
33.图2为不同视野下经低氧及红景天苷处理后adscs外泌体后透射电镜图；
34.图3为各处理组adscs外泌体的粒径大小图，波峰所示直径约90-150nm；
35.图4为nta检测各组外泌体粒子统计图；
36.图5为红景天苷及低氧预处理对adscs外泌体生物发生的影响结果图。
具体实施方式
37.为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
38.下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如《分子克隆》(new york:cold spring harbor laboratory press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。以下实施例涉及的红景天苷来源于红景天。
39.实施例1、脂肪间充质干细胞(adscs)外泌体的提取及鉴定
40.一、实验方法：
41.1.红景天苷及低氧预处理：
42.adscs按1:3传代培养至第7代后，接种于10cm培养皿中，生长至镜下 60％细胞融合，更换低糖dmem培养基血清饥饿24小时，分别采取预处理条件(5％ o2低氧、50μm sal、5％ o2低氧联合50μm sal)，设置常氧组(21％ o2、 n组)、常氧加药组(ns组)、缺氧组(h组)、缺氧加药组(hs组)进行分组培养48小时后进行处理实验。
43.2.细胞上清提取外泌体
44.adscs生长至60％细胞融合，更换无外泌体完全培养基继续培养48小时，收集各处理组细胞上清，采用超速离心法提取外泌体，低温(4℃)300g，10min 去除细胞，取上清；低温2000g，10min去除细胞碎片，取上清；低温10000g， 30min去除大囊泡，取上清。上清用0.22μm滤网过滤，然后以130000g，4℃， 90min超高速离心，弃上清，加入pbs洗脱，再次130000g离心90min，以100μlpbs收集重悬外泌体(adscs外泌体)，分装-80℃长期保存。
45.3.外泌体鉴定
46.提取adscs外泌体后采用nanosight tracking系统(nta)检测exosomes 的大小和
浓度；western blot检测cd9、cd63和tsg101等外泌体表面标志物；电镜观察adscs外泌体形态。
47.二、实验结果：
48.1.western blot：
49.利用超高速离心法，本技术从培养液中收集了adscs外泌体，并对其进行鉴定检测，通过western blot表明adscs外泌体特异性标记物cd63、cd9、 tsg101(图1)的表达与其母细胞adscs相比显著升高。
50.2.透射电镜：
51.透射电子显微镜下观察，可见adscs外泌体视野分布，部分成团簇拥，呈清晰“茶杯托”状双层膜结构，经低氧及红景天苷共同处理后adscs外泌体并未改变其形态和结构(图2，不同视野下)。
52.3.nanosight nta：
53.分别对adscs采取预处理条件(5％ o2低氧、50μm sal、5％ o2低氧联合 50μm sal)进行分组培养48小时，收集上清提取外泌体(按照上述实验方法)。各组外泌体用pbs稀释约100倍定容至1ml，利用nta对各处理组进行粒度计数及分析粒径大小，检测外泌体直径约为90-150nm(参考图3)。通过nta 粒子计数，与常氧组相比，低氧及红景天苷共同预处理能有效促进adscs外泌体分泌增加(参考图4)，红景天苷和低氧条件下分别预处理也可以促进adscs 外泌体分泌增加，低氧及红景天苷共同预处理效果更佳。
54.实施例2、红景天苷及低氧共同预处理对adscs外泌体生物发生的影响
55.一、实验方法：
56.1.引物合成(广州艾基生物)：大鼠rab27a、rab27b、tsg101、smpd2、β-actin。
57.表1 rab27a、rab27b、smpd2、tsg101和β-actin引物序列
[0058][0059]
注：f：forward sequence；r:reverse sequence
[0060]
2.总rna提取：
[0061]
1)向培养皿中加入1ml trizol，静置5min，反复吹打皿使其充分裂解，混匀后全部液体转移至1.5ml无酶ep管中。
[0062]
2)加入氯仿200ul，反复上下颠倒混匀，室温静置2-3分钟，于预冷的高速离心机中12000g 4℃离心15分钟。
[0063]
3)吸出上层水相，加入500ul异丙醇，上下颠倒混匀，放置-20℃3小时，于预冷的高速离心机中12000g 4℃离心10分钟，弃上清。
[0064]
4)加入0.5ml 75％乙醇混合，于预冷的高速离心机中12000g 4℃离心15 分钟，弃上清。
[0065]
5)重复步骤4)，75％乙醇洗脱三次。
[0066]
6)室温晾干，rna沉淀变为无色透明，加入20ul rnase-free h2o溶解 rna，测量浓度及纯度后进行逆转录，剩余rna于-80℃保存。
[0067]
3.mrna逆转录：
[0068]
表2 cdna合成和gdna去除
[0069][0070]
备注：x为rna浓度(1μg)
[0071]
42℃15min；85℃5s；4℃hold；
[0072]
4.实时荧光定量pcr：
[0073]
根据genstar 2
×
realstar green power mixture(with rox)说明书设置两步法，扩增条件为95℃10min(预变性)
→
(95℃15s，60℃1min)
×
40 cycles
→
荧光融解得到融解曲线。每个循环结束时，仪器会自动收集并分析荧光强度。每个标本重复检测2次，扩增过程中，扩增曲线、融解曲线及融解峰值曲线是判断扩增质量的重要指标。
[0074]
表3 pcr反应液配置体系
[0075][0076]
5.实时荧光定量pcr数据处理
[0077]
qpcr反应结束后，扩增仪会自动分析并计算结果。以β-actin作为内参，采用2-δδct值相对定量方法进行数据分析，δct实验组＝ct实验组目标基因
ꢀ‑
ct实验组内参；δct对照组＝ct对照组目标基因-ct对照组内参；δδct＝δ ct实验组-δct对照组。2-δδ
ct用于最后数据的统计，表示实验组与对照组相对倍数关系。
[0078]
6.统计学分析：
[0079]
所有计量资料采用平均值
±
标准误(means
±
sem)表示,应用graphpadprism 8.0统计软件分析数据。多组均数比较釆用anova，以p＜0.05表示有显著的统计学意义。
[0080]
二、实验结果：
[0081]
1.红景天苷和缺氧调节脂肪间充质干细胞mirna的表达：
[0082]
外泌体作为一种远程通讯工具，在细胞生长融合60％-90％过程中外泌体的分泌最为活跃，在细胞过度融合可造成外泌体分泌的抑制。为了研究sal和低氧预处理对adscs外泌体生物发生途径的影响，在n(21％ o2+dmso)、ns (21％ o2+50μmol/l sal)、h(5％ o2+dmso)和hs(5％ o2+50μmol/l sal) 预处理后，进行分组培养48h及72h，细胞生长融合度分别达到90％及100％。通过qpcr检测囊泡运输rab gtpases(rab27a,b)、神经酰胺(nsmase)、 escrt(tsg101)外泌体生物发生相关基因mrna的表达。
[0083]
参考图5，结果显示，预处理通过上调rab27b水平调控脂肪间充质干细胞外泌体的分泌，rab27b表达与外泌体分泌量成正相关，rab27a的表达在细胞对数生长期内呈负相关调控；以hs组最为显著，72h后各预处理组的rab27b表达水平均出现下降(图5-a)，rab27a表达水平在48h中呈下降趋势，于72h后显示出无差异表达(5-b)。smpd2与tsg101在48h中无差异表达，于72h 分别出现smpd2下调及tsg101表达增加，神经酰胺途径受到抑制，提示在细胞密度融合的情况下外泌体生物发生途径可能由神经酰胺途径向escrt依赖途径的转变。同时，能观察到72h药物及低氧预处理对smpd2及tsg101的表达具有调控作用，以h组最为显著(图5-c及图5-d)。
[0084]
实施例3、红景天苷及低氧共同预处理对adscs外泌体代谢组学的影响
[0085]
一、实验方法：
[0086]
质谱仪条件：
[0087]
色谱柱：kinetex 2.6u c18；
[0088]
进样量：2μl；
[0089]
流动相a：0.1％甲酸水，流动相b：乙腈；
[0090]
色谱：流速0.3ml/min；
[0091]
t＝0min,2％ b；t＝2.0min,2％ b；t＝7.0min,70％ b；
[0092]
t＝14min,90％ b；t＝16min,100％ b；and t＝20min,100％ b。
[0093]
质谱：
[0094]
采集模式：esi+和esi-；tof ms-ida-tof msms(ida+dbs触发，8-15 msms，根据扫描点数来进行确定，扫描点数8个点以上)。
[0095]
扫描范围：tof ms range:50-1000；accumulation time:0.1s(or 0.15s)tofmsms range:40-1000；accumulation time:0.05s。
[0096]
化合物参数：dp：80/-80；ce:35
±
15/-35
±
15。
[0097]
源气参数：cur:35；gs1:55；gs2:55；temp:550℃；is:5500/-4500。
[0098]
二、实验结果：
[0099]
低氧及红景天苷共同预处理(hs组)能促进adscs的增殖及adscs外泌体产量，为了解不同浓度的红景天苷对低氧状态下adscs外泌体代谢物质的影响，作为横向对比，对
adscs进行低氧，同时添加不同浓度的红景天苷预(0， 25，50，100，200μm)处理，获取外泌体进行代谢组分析，结果显示在50μm 红景天苷加药后的外泌体代谢谱出现明显波峰。
[0100]
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。