可干预代谢综合征的短双歧杆菌CCFM683及应用

可干预代谢综合征的短双歧杆菌ccfm683及应用
技术领域
1.本发明涉及可干预代谢综合征的短双歧杆菌ccfm683及应用，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.代谢综合征(metabolic syndrome，ms)是一组以中心性肥胖、高血糖病(糖尿病或糖调节受损)、血脂异常(包括高tg和/或低hdl-c血症)以及高血压等表现同时存在，以糖代谢、脂代谢异常为病理改变基础的多种危险因素聚集，促发ii型糖尿病和动脉粥样硬化等各种心脑血管疾病发生发展的临床综合征。近年来，随着我国经济社会水平的不断发展，大众的生活水平不断提高，饮食结构中碳水化合物、油脂的比重日益增加，而诸多工作条件的限制，让人们有久坐不动的习惯。这些外部环境因素结合自身的遗传因素共同导致了我国人群代谢综合征患病率的大幅提高。据研究表明，全国约有7700万名代谢综合征患者，即每8个成年人中就有1人患有代谢综合征。在我国超过60岁的老年人代谢综合征的患病率为25％，且随年龄增长患病率也逐渐升高。因此，寻求一种合适的缓解代谢综合征的手段是十分必要的。
3.目前针对代谢综合征采用的治疗措施主要是加强运动改善饮食并结合药物治疗，目标均为控制并改善代谢综合征的各项危险因素，主要包括降低体重的药物如奥利司他、氯卡色林；减轻胰岛素抵抗的如二甲双胍、噻唑烷二酮类；降低血脂的贝特类药物如非诺贝特；降胆固醇的他汀类药物如辛伐他汀；降血压的血管紧张素转换酶抑制剂类药物如卡托普利等。这些药物针对代谢综合征的各项单一风险因素具有良好的疗效，但是，长期服用这些药物对胃肠道和肝肾功能会造成副作用。
4.有大量研究报道，肠道菌群对人体的生理代谢起着极为重要的作用，肠道菌群结构失调和多种疾病相关，包括胃肠疾病(结肠炎和便秘等)、代谢性疾病(肥胖、高血脂和糖尿病等)。代谢综合征的发生与肠道菌群失调也具有密切关系，常用的肠道菌群调节制剂有益生菌和益生元等。益生菌是可食用的对人体健康有益的微生物，具有潜在的缓解血糖、血脂代谢异常、调节肠道菌群结构的功能。


技术实现要素：

5.本发明提供了短双歧杆菌(bifidobacterium breve)ccfm683在制备预防和/或缓解代谢综合征的药物中的应用；所述短双歧杆菌(bifidobacterium breve)ccfm683，已于2015年12日04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏号为cgmcc no.11828，并公开于公开号为cn106038611a的专利申请文件中。
6.在一种实施方式中，所述预防和/或缓解代谢综合征具体体现在：
7.(1)显著降低代谢综合征哺乳动物的空腹血糖；
8.(2)显著降低代谢综合征哺乳动物的胰岛素抵抗指数；
9.(3)显著降低代谢综合征哺乳动物的每日饮食摄入量；
10.(4)显著降低代谢综合征哺乳动物白色脂肪指数和升高棕色脂肪指数；
11.(5)调节代谢综合征哺乳动物血清中低密度脂蛋白胆固醇含量，使其降低至正常水平。
12.在一种实施方式中，所述代谢综合征表现的症状包括高血糖、高血脂和/或肝脏氧化应激。
13.在一种实施方式中，所述短双歧杆菌ccfm683在药物中的含量≥1
×
108cfu/g或1
×
108cfu/ml。
14.在一种实施方式中，所述药物还含有药学上可接受的辅料。
15.在一种实施方式中，所述药学上可接受的辅料包括填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂中的一种或多种。
16.在一种实施方式中，所述药物的剂型为颗粒剂、胶囊剂、片剂、丸剂或口服液。
17.在一种实施方式中，所述药物为微生物制剂，含有所述短双歧杆菌ccfm683的湿细胞或冻干后的细胞。
18.在一种实施方式中，所述微生物制剂中短双歧杆菌ccfm683的活菌数≥1
×
106cfu/g。
19.在一种实施方式中，所述微生物制剂的制备方法包括：
20.(1)在合适的培养基培养所述短双歧杆菌ccfm683；
21.(2)收集所述短双歧杆菌ccfm683细胞，将所述短双歧杆菌ccfm683细胞与保护剂混合。
22.在一种实施方式中，所述制备方法具体为：将短双歧杆菌ccfm683接种到mmrs培养基中，37℃厌氧条件下培养18-20h，收集菌体，用保护剂重悬菌体细胞，使菌浓度达到1
×
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cfu/ml，然后悬浮液在37℃厌氧条件下培养50-70min，干燥。
23.在一种实施方式中，每升所述mmrs培养基含有：胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、柠檬酸氢二铵2g、醋酸钠5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.5g、一水合硫酸锰0.25g，吐温80 1ml与0.5g半胱氨酸。
24.在一种实施方式中，所述保护剂含有脱脂奶粉、麦芽糊精、海藻糖中的一种或多种。
25.在一种实施方式中，所述保护剂含有：100g/l-150g/l脱脂奶粉、100g/l-150g/l麦芽糊精、140g/l-160g/l海藻糖。
26.在一种实施方式中，将收集的菌体用磷酸盐缓冲液清洗2-4次，所述磷酸盐缓冲液ph为6.8-7.2。
27.在一种实施方式中，所述干燥可以采用任意一种菌液干燥工艺进行干燥，包括但不限于真空冷冻干燥。
28.在一种实施方式中，所述真空冷冻干燥是在-15～-20℃预冻8-14h后进行真空冷冻干燥。
29.本发明还提供了所述短双歧杆菌(bifidobacterium breve)ccfm683在制备有助于维持血脂健康水平和/或有助于维持血糖健康水平的保健品中的应用。
30.在一种实施方式中，所述保健品包括但不限于益生菌菌粉、益生菌发酵果汁等。
31.本发明还提供了短双歧杆菌ccfm683在制备预防和/或缓解高脂饮食导致的血糖
异常升高和/或血清低密度胆固醇异常升高的药物中的应用。
32.有益效果：本发明提供了短双歧杆菌ccfm683在改善代谢综合征方面的新用途，具体地，所述改善代谢综合征包括：降低代谢综合征个体空腹血糖水平；降低代谢综合征个体胰岛素抵抗指数；降低代谢综合征小鼠的每日饮食摄入量；降低代谢综合征个体白色脂肪，升高棕色脂肪；降低代谢综合征个体血清低密度脂蛋白胆固醇。本发明所述的短双歧杆菌ccfm683可用于制备缓解代谢综合征的保健品或药物，具有非常广泛的应用前景。
附图说明
33.图1表示短双歧杆菌ccfm683对代谢综合征小鼠空腹血糖的影响；
34.图2表示短双歧杆菌ccfm683对代谢综合征小鼠胰岛素抵抗指数的影响；
35.图3表示短双歧杆菌ccfm683对代谢综合征小鼠每日饮食摄入量的影响；
36.图4表示短双歧杆菌ccfm683对代谢综合征小鼠白色脂肪指数和棕色脂肪指数的影响；
37.图5表示短双歧杆菌ccfm683对代谢综合征小鼠的血清低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)的影响；
38.(注：*p《0.05，**p《0.01，***p《0.001，***p《0.0001)。
具体实施方式
39.通过下述实施例将能够更好地理解本发明。
40.在本发明中，如无特殊说明，用于说明浓度或比例的“％”或百分比均为重量百分比。
41.实施例1：短双歧杆菌ccfm683对代谢综合征小鼠空腹血糖的调节作用
42.取体重20-21g的健康雄性c57bl/6j小鼠24只，适应环境1周，随机分为3组：空白对照组(nc)、高脂模型对照组(hfd)、短双歧杆菌ccfm683干预组(ccfm683)，每组小鼠8只。培养短双歧杆菌ccfm683，将菌泥与保护剂(100g/l-150g/l脱脂奶粉、100g/l-150g/l麦芽糊精、140g/l-160g/l海藻糖)按1:2(w/v，即1g菌泥：2ml保护剂溶液)混合，在-15～-20℃预冻8-14h后进行真空冷冻干燥得到冻干菌粉，冻干菌粉重悬于生理盐水中，使罗伊氏乳杆菌在生理盐水菌悬液中的浓度为1
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cfu/ml，用于小鼠灌胃，实验动物分组及处理方法见表1。
43.表1实验动物分组
44.组别只数/组处理时常饲料处理方法(每天灌胃)nc812周对照饲料0.2ml生理盐水+冻干保护剂hfd812周高脂饲料0.2ml生理盐水+冻干保护剂ccfm683812周高脂饲料0.2ml含ccfm683的生理盐水悬液
45.试验期间定期监测小鼠体重。试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，测量空腹血糖。腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，心脏采血，辅以颈椎脱臼法处死。血液样本3000
×
g、4℃条件下离心15min，取上清，-80℃冻存用于测定相关血清指标。部分肝脏收集后迅速置于预冷的生理盐水中漂洗去血，放入多聚甲醛中固定，剩余部分肝脏于液氮中速冻并转移至-80℃冻存，后续制成肝匀浆以用于测定相关指标，具体制备方法如下：称取一定量肝脏组
织，按1：9比例加入生理盐水进行组织研磨，3000r离心10min，取上清冻存于-80℃备用。
46.结果如图1所示。模型组小鼠造模结束后空腹血糖达到6.32mmol/l。灌胃短双歧杆菌ccfm683后，小鼠空腹血糖降低至5.60mmol/l，接近空白组的4.81mmol/l，提示短双歧杆菌ccfm683对代谢综合征小鼠的血糖具有积极的调节作用。
47.实施例2：短双歧杆菌ccfm683降低胰岛素抵抗指数
48.c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例1，测量胰岛素抵抗指数(方法参考food funct.2021,12(9):3919-3930.)。结果如图2所示，模型组小鼠胰岛素抵抗指数达到2.35，而灌胃短双歧杆菌ccfm683后，小鼠胰岛素抵抗指数降低20％，达到1.88，接近空白组的1.58，提示短双歧杆菌ccfm683对胰岛素具有调控作用，进而对血糖起到改善作用。
49.实施例3：短双歧杆菌ccfm683降低代谢综合征小鼠每日饮食摄入量
50.c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。称重计算饮食摄入量。结果如图3所示。模型组小鼠每日饮食摄入量显著升高，达到12.73千卡/每天/每只，而灌胃短双歧杆菌ccfm683则明显降低了小鼠的每日饮食摄入，使得饮食摄入量达到10.64千卡/每天/每只，接近空白组的9.67千卡/每天/每只。提示短双歧杆菌ccfm683对高脂饮食小鼠的饮食量具有一定的调节作用。
51.实施例4：短双歧杆菌ccfm683降低白色脂肪指数，升高棕色脂肪指数
52.c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例1。解剖，收集附睾脂肪和棕色脂肪，称重，测量白色脂肪指数和棕色脂肪指数。结果如图4所示。模型组小鼠白色脂肪指数显著升高，灌胃短双歧杆菌ccfm683明显降低了小鼠的白色脂肪指数(白色脂肪/体重)，相对于模型组降低了32.3％，增加了棕色脂肪指数(棕色脂肪/体重)，是模型组的1.35倍，ccfm683灌胃小鼠明显降低了白色脂肪/棕色脂肪的值，比模型组降低了44.1％。
53.实施例5：短双歧杆菌ccfm683降低代谢综合征小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)的水平
54.c57bl/6j小鼠分组、造模及处理方法同实施例1，试验结束时，小鼠禁食不禁水12h，腹腔注射10％的水合氯醛溶液麻醉后，心脏采血。血样于3000
×
g、4℃条件下离心15min，取上清，按照试剂盒的检测方法测定血液中低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)的含量。
55.结果如图5所示。高脂饮食组小鼠血清低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)含量升高至1.07mmol/l，灌胃短双歧杆菌ccfm683可使血清低密度脂蛋白胆固醇的含量降低到0.69mmol/l，提示短双歧杆菌ccfm683对于血脂代谢具有积极作用。
56.实施例6：制备含短双歧杆菌ccfm683的微生物制剂
57.mmrs培养基：胰蛋白胨10g、牛肉浸膏10g、酵母粉5g、葡萄糖20g、柠檬酸氢二铵2g、醋酸钠5g、磷酸氢二钾2g、七水硫酸镁0.5g、一水合硫酸锰0.25g，吐温80 1ml，半胱氨酸0.5g，水定容至1000ml，调节ph至6.5，在119-123℃条件下灭菌15-25min。
58.保护剂：100g/l-150g/l脱脂奶粉、100g/l-150g/l麦芽糊精、140g/l-160g/l海藻糖。
59.将短双歧杆菌ccfm683接种到mmrs培养基中，37℃厌氧条件下培养18-20h，收集菌体，用保护剂重悬菌体细胞，使菌浓度达到10
10
cfu/ml，然后悬浮液在37℃厌氧条件下培养50-70min，干燥。
60.可选地，所述干燥是在-15～-20℃预冻8-14h后进行真空冷冻干燥。
61.实施例7：短双歧杆菌制备胶囊制品
62.本发明的短双歧杆菌ccfm683在mmrs培养基上培养24h，在温度4℃与4000r/min的条件下离心20min，用pbs冲洗两次，再加入以最后得到含短双歧杆菌ccfm683的粉剂重量计4％脱脂奶粉和6％乳糖混合10min，再加入无菌2％氯化钙和3％海藻酸钠，同时以150r/min搅拌10min，再静止固化30min，最后清洗过滤，得到的滤液进行冷冻干燥20h，得到含短双歧杆菌ccfm683的粉剂，把这种粉剂装入商业化的药用微胶囊，得到所述的胶囊制品。
63.虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。