1.本发明属于生物医用材料
技术领域：
：，具体涉及一种用于疾病组织渗透给药的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料及其制备方法和应用。
背景技术：
：：2.血液中的钙化蛋白颗粒是一类复合了蛋白分子和无机钙盐的胶体纳米颗粒，其主要成分为磷酸钙、胎球蛋白a和白蛋白等[文献1：smithetal.,phosphorylatedfetuin-a-containingcalciproteinparticlesareassociatedwithaorticstiffnessandaprocalcificmilieuinpatientswithpre-dialysisckd.nephroldial.transplant2012,27:p.1957-1966.]。在正常人体内，钙化蛋白颗粒通过酸性蛋白与钙离子结合形成非晶态磷酸钙，从而阻碍了生物矿化进一步发生，最终通过巨噬细胞和肾脏代谢清除[文献2：paschetal.,phosphate,calcificationinblood,andmineralstress:thephysiologicbloodmineralbufferingsystemanditsassociationwithcardiovascularrisk.int.j.nephrol.2018,2018:9182078.]。作为体内真实存在的内源性纳米材料，钙化蛋白颗粒具有更好的生物安全性，但在药物载体领域的应用尚无人报道。[0003]传统的药物载体主要包括二氧化硅、碳纳米球等，难以在体内快速降解、代谢[文献3：lietal.,mesoporouscarbonnanospheresfeaturedfluorescentaptasensorformultiplediagnosisofcancerinvitroandinvivo.acsnano.2015,9(12):p.12096-12103.]。同时，肿瘤等疾病组织内部往往缺少毛细血管网，有非常致密的细胞外基质和非常高的细胞密度，导致传统纳米药物载体材料难以渗透疾病组织深处，无法实现有效的治疗[文献4：matsumotoetal.,vascularburstsenhancepermeabilityoftumourbloodvesselsandimprovenanoparticledelivery.naturenanotechnology.2016,11:533-538.]。国内外学者已通过减小纳米药尺寸等方法，来降低纳米药在肿瘤等疾病组织内部的渗透阻力，但依然难以解决纳米药物载体渗透、扩散能力弱等问题[文献5：zhouetal.,enzyme-activatablepolymer-drugconjugateaugmentstumourpenetrationandtreatmentefficacy.naturenanotechnology.2019,14(8):799-809.]。技术实现要素：[0004]本发明目的是针对现有药物载体体内降解性能和生物安全性不高，难以渗透疾病组织深处，无法实现有效治疗的领域瓶颈问题，提出一种用于疾病组织渗透给药的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料及其制备方法和应用。[0005]本发明仿照真实人体内蛋白分子抑制生物矿化的微观原理，通过湿化学沉淀法制备蛋白分子与非晶态磷酸钙的复合材料，形成复杂纳米网络结构提高了杂化材料的非晶态稳定性，保证了材料在体内的降解性能，具有更好的生物安全性和稳定性，复杂的纳米网络结构可以高效掺杂荧光分子等标记物和肿瘤治疗药物，并依靠其较小的纳米颗粒尺寸和杂化的蛋白分子的协同作用，实现对疾病组织深处的有效穿越和扩散。与现有的磷酸钙药物载体相比，仿生制备的钙化蛋白纳米材料的成分组成和微观结构与人体血液中存在的钙化蛋白颗粒相似，从而较现有的药物载体具有更好的生物安全性和降解性能。[0006]本发明的技术方案如下：[0007]本发明提供一种用于疾病组织渗透给药的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的制备方法，包括以下步骤：[0008](1)在细胞培养液中加入钙盐和镁盐试剂，活性蛋白分子，青链霉素混合液，搅拌均匀，制得混合溶液；[0009](2)将溶解有磷酸盐的细胞培养液滴加至步骤(1)制备的混合溶液中，生成的乳浊液在室温下搅拌孵育，得到悬浊液；[0010](3)将步骤(2)中得到的悬浊液通过透析袋清洗，然后过滤膜除菌并冷冻干燥，即获得用于疾病组织渗透给药的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料。[0011]作为优选，步骤(1)中，所述青链霉素混合液中青霉素的含量为10000u/ml，链霉素的含量为10mg/ml；所述青链霉素混合液的加入体积是细胞培养液体积的0-3％；和/或[0012]所述钙盐在细胞培养液中的浓度为0.1-2g/l；和/或[0013]所述镁盐在细胞培养液中的浓度为0-0.5g/l；和/或[0014]搅拌均匀后，将ph调节至8-10。[0015]作为优选，所述细胞培养液种类包括dmem细胞培养液、1640细胞培养液；和/或[0016]所述活性蛋白分子包括胎牛血清、胎球蛋白、白蛋白；所述活性蛋白分子的加入体积是细胞培养液体积的5-50％。[0017]作为优选，步骤(2)中，首先将磷酸盐溶解于细胞培养液中，并通过氢氧化钠调节溶液ph，然后将得到的溶液滴加至等体积的步骤(1)制备的混合溶液中，在室温下搅拌生成乳浊液。[0018]作为优选，步骤(2)中，所述磷酸盐在细胞培养液中的浓度为0.1-2g/l；和/或[0019]所述滴加速率为1-20ml/min；和/或[0020]所述溶液的ph调节至8-10；和/或[0021]所述搅拌孵育的时间为1-4h。[0022]作为优选，步骤(3)中，所述透析袋的截留分子量为8000-18000；和/或[0023]所述冷冻干燥的温度为-60～(-40)℃。[0024]本发明还提供一种用于疾病组织渗透给药的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料，是应用上述的方法制备得到的。[0025]本发明还提供一种用于疾病组织渗透给药的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料在负载荧光试剂或肿瘤药物分子中的应用。[0026]作为优选，将荧光试剂或肿瘤药物分子加入步骤(1)的混合溶液中。[0027]作为优选，所述荧光试剂的浓度为0.05-0.2g/l；所述肿瘤药物分子的浓度为0.05-0.2g/l。[0028]与现有技术相比，本发明的有益效果体现在：[0029]1.仿照真实人体内蛋白分子抑制生物矿化的微观原理，通过湿化学沉淀法制备出蛋白分子与非晶态磷酸钙的复合材料，材料中复合的蛋白分子可以通过结合非晶态磷酸钙团簇的钙离子，从而形成复杂的纳米网络结构，有效抑制非晶态磷酸钙的晶化作用，从而大幅提高材料在体内的降解性能和生物安全性。[0030]2.与现有的纳米药物载体相比，本发明的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料具有较小的颗粒尺寸和杂化的蛋白分子，两者通过协同作用可以有效破坏细胞间的连接，有助于渗透并穿越缺少毛细血管的肿瘤疾病组织深处，实现对肿瘤等血液难以到达的疾病组织深处的有效穿透和扩散。[0031]3.本发明方法仿生制备的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料具有复杂的纳米网络结构，可以高效掺杂荧光分子等标记物和肿瘤药物分子，并依靠其较小的颗粒尺寸，在疾病组织深处有效渗透和扩散后完全降解并释放药物、荧光分子，实现对疾病组织深处的有效穿越和扩散，从而实现疾病治疗和荧光显影的目的。附图说明[0032]附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：[0033]图1为非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的xrd结果。[0034]图2为非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的tem形貌结果。[0035]图3为(a)0μg/ml、(b)800μg/ml和(c)1600μg/ml浓度的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料体外细胞毒性研究结果。[0036]图4为非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的tg/dsc结果。[0037]图5为(a)0μg/ml(对照组)和(b)445μg/ml浓度的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料穿越内皮细胞层的ve-cadherin免疫荧光染色图。[0038]图6为负载荧光分子的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料与细胞共培养形貌图。具体实施方式[0039]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均购自常规生化试剂公司。[0040]本发明是模拟真实人体内蛋白分子抑制生物矿化的微观原理，通过湿化学沉淀法制备出蛋白分子与非晶态磷酸钙的复合材料，即钙化蛋白纳米材料。[0041]本发明的用于疾病组织渗透给药的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的制备方法如下：[0042](1)在细胞培养液中加入钙盐和镁盐试剂，活性蛋白分子，青链霉素混合液，搅拌均匀，制得混合溶液；[0043](2)将溶解有磷酸盐的细胞培养液滴加至步骤(1)制备的混合溶液中，生成的乳浊液在室温下搅拌孵育，得到悬浊液；[0044](3)将步骤(2)中得到的悬浊液通过透析袋清洗，然后过滤膜除菌并冷冻干燥，即获得用于疾病组织渗透给药的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料。[0045]作为本发明的一些实施方式，步骤(1)中，首先将钙盐和镁盐溶解于细胞培养液中，然后加入活性蛋白分子和青链霉素混合液，并通过氢氧化钠调节ph获得混合溶液。[0046]作为本发明的一些实施方式，步骤(1)中，所述青链霉素混合液中青霉素的含量为10000u/ml，链霉素的含量为10mg/ml；所述青链霉素混合液的加入体积是细胞培养液体积的0-3％。与加入青链霉素混合液相比，若不加入青链霉素混合液，会导致材料在使用过程中容易染菌。[0047]作为本发明的一些实施方式，步骤(1)中，所述钙盐在细胞培养液中的浓度为0.1-2g/l。[0048]钙盐在细胞培养液中浓度大于2g/l会在加入磷酸盐后快速晶化，无法稳定非晶状态，小于0.1g/l会难以生成沉淀。[0049]作为本发明的一些实施方式，步骤(1)中，所述镁盐在细胞培养液中的浓度为0-0.5g/l。[0050]作为本发明的一些实施方式，步骤(1)中，混合后搅拌速率为100-500rpm。选择该搅拌速率范围是为了搅拌均匀。[0051]作为本发明的一些实施方式，步骤(1)中，搅拌均匀后，将ph调节至8-10。[0052]作为本发明的一些实施方式，步骤(1)和(2)中，所述细胞培养液种类包括但不限于dmem细胞培养液、1640细胞培养液等。[0053]作为本发明的一些实施方式，步骤(1)中，所述的钙盐和镁盐包括但不限于氯化钙和氯化镁，硝酸钙和硝酸镁等。[0054]作为本发明的一些实施方式，步骤(1)中，所述的活性蛋白分子包括但不限于胎牛血清、胎球蛋白、白蛋白等。所述活性蛋白分子的加入体积是细胞培养液体积的5-50％。[0055]活性蛋白分子的加入量大于细胞培养液体积的50％会出现蛋白析出，小于细胞培养液体积的5％会快速晶化，无法稳定非晶状态。[0056]作为本发明的一些实施方式，步骤(2)中，首先将磷酸盐溶解于细胞培养液中，并通过氢氧化钠调节溶液ph，然后将得到的溶液滴加至等体积的步骤(1)制备的混合溶液中，在室温下搅拌生成乳浊液。[0057]作为本发明的一些实施方式，步骤(2)中，磷酸盐在细胞培养液中的浓度为0.1-2g/l。[0058]磷酸盐在细胞培养液中的浓度大于2g/l会快速晶化，无法稳定非晶状态，小于会0.1g/l难以生成沉淀。[0059]作为本发明的一些实施方式，步骤(2)中，滴加速率为1-20ml/min。[0060]作为本发明的一些实施方式，步骤(2)中，溶液的ph调节至8-10。[0061]ph高于10会生成碱性副产物，低于8难以生成沉淀。[0062]作为本发明的一些实施方式，步骤(2)中，搅拌孵育的时间为1-4h。[0063]作为本发明的一些实施方式，步骤(2)中，混合后搅拌速率为100-500rpm。选择该搅拌速率范围是为了搅拌均匀。[0064]作为本发明的一些实施方式，步骤(2)中，所述磷酸盐包括但不限于磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢铵和磷酸氢二铵，可以为其中的一种或多种。[0065]作为本发明的一些实施方式，步骤(3)中，将步骤(2)中得到的悬浊液加入透析袋中，使用50-200倍体积的去离子水搅拌清洗24小时、换液三次后，进行冷冻干燥得到用于疾病组织渗透给药的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料；其中，透析袋的截留分子量为8000-18000。[0066]作为本发明的一些实施方式，步骤(3)中，所述冷冻干燥的温度为(-60℃)-(-40)℃。[0067]制备得到的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料为非晶状态，粒径范围为10-100nm，蛋白含量为5-30wt.％。[0068]所述非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料可以破坏组织中细胞间连接，从而渗透至缺乏毛细血管的肿瘤等疾病组织深处，实现对疾病组织深处的有效渗透和扩散。其中，钙化蛋白纳米载体材料的有效渗透浓度为10-445μg/ml。[0069]作为本发明的一些实施方式，步骤(1)中，将荧光试剂加入步骤(1)的混合溶液中，使最终获得的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料具有荧光效果。其中，使用的荧光试剂的初始浓度为0.05-0.2g/l，初始浓度是指将荧光试剂溶于细胞培养液中的浓度。所述荧光试剂包括但不限于吲哚菁绿(icg、ir-820)、异硫氰酸荧光素(fitc)等。[0070]作为本发明的一些实施方式，步骤(1)中，将药物分子加入步骤(1)的混合溶液中，使最终获得的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料具有治疗效果。其中，使用的药物分子的初始浓度为0.05-0.2g/l，初始浓度是指将荧光试剂溶于细胞培养液中的浓度。所述药物分子包括但不限于阿霉素(dox)、氟尿嘧啶(5-fu)等。[0071]参考以下实施例将更详细地叙述各实施方式。以下实施例仅为说明性目的并非旨在限制实施方式的范围。[0072]实施例1[0073]本实施例的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的制备方法如下：[0074]溶液配置：称量0.042g的无水氯化钙，溶于50ml的dmem培养基中，加入10ml胎牛血清和1ml青链霉素混合液搅拌均匀，搅拌速率为400rpm，并用氢氧化钠调节溶液ph至9.0，得到溶液a。称量0.038g的十二水合磷酸氢二钠和0.028g的二水合磷酸二氢钠溶于50ml的dmem培养基中，用氢氧化钠调节溶液ph至9.0，搅拌均匀，搅拌速率为400rpm，得到溶液b。[0075]所述青链霉素混合液中青霉素的含量为10000u/ml，链霉素的含量为10mg/ml。[0076]湿化学沉淀：将上一步配置好的50ml溶液b以5ml/min的速度滴加入50ml溶液a中，以500rpm的转速在室温下搅拌孵育4小时。[0077]清洗：反应结束后将得到的悬浊液加入8000分子量的透析袋中，使用5l的去离子水搅拌清洗24小时、换液三次，过滤膜除菌。[0078]冷冻干燥：将清洗后的产物放入-20℃冰箱冷冻6小时，然后放入冷冻干燥机中在-55℃进行冷冻干燥处理，得到非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料。[0079]对制备得到的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料进行检测：[0080]1、xrd检测结果证明非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料为非晶态(图1)。[0081]图1为非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的xrd结果。[0082]2、tem结果证明非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的颗粒尺寸为20-50nm(图2)。[0083]图2为非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的tem形貌结果。[0084]3、通过含有不同浓度纳米材料的dmem细胞培养基体外培养人内皮细胞实验，24小时后显示细胞生长状态良好，材料无细胞毒性，具有良好的生物相容性(图3)。[0085]图3为(a)0μg/ml、(b)800μg/ml和(c)1600μg/ml浓度的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料体外细胞毒性研究结果。[0086]4、通过tg/dsc分析证明非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料中蛋白含量为18.9wt.％(图4)。[0087]图4为非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的tg/dsc结果。[0088]5、将非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料与人内皮细胞共培养4小时后，使用荧光倒置显微镜观察细胞在不同浓度的s-cpp1作用下ve-cadherin的形态，与对照组相比，非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的加入破坏了钙粘着蛋白，从而实现穿越组织间的细胞屏障。[0089]图5为(a)0μg/ml(对照组)和(b)445μg/ml浓度的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料穿越内皮细胞层的ve-cadherin免疫荧光染色图。[0090]实施例2[0091]本实施例的活性镁元素掺杂的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的制备方法如下：[0092]溶液配置：称量0.038g的无水氯化钙和0.008g六水合氯化镁，溶于50ml的dmem培养基中，加入10ml胎牛血清和1ml青链霉素混合液搅拌均匀，搅拌速率为400rpm，并用氢氧化钠调节溶液ph至9.0，得到溶液a。称量0.038g的十二水合磷酸氢二钠和0.028g的二水合磷酸二氢钠溶于50ml的dmem培养基中，用氢氧化钠调节溶液ph至9.0，搅拌均匀，搅拌速率为400rpm，得到溶液b。[0093]所述青链霉素混合液中青霉素的含量为10000u/ml，链霉素的含量为10mg/ml。[0094]湿化学沉淀：将上一步配置好的50ml溶液b以5ml/min的速度滴加入50ml溶液a中，以500rpm的转速在室温下搅拌4小时。[0095]清洗：反应结束后将得到的悬浊液加入8000分子量的透析袋中，使用5l的去离子水搅拌清洗24小时、换液三次，过滤膜除菌。[0096]冷冻干燥：将清洗后的产物放入-20℃冰箱冷冻6小时，然后放入冷冻干燥机中在-55℃进行冷冻干燥处理，得到活性镁元素掺杂的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料，粒径范围为10-100nm。[0097]实施例3[0098]本实施例的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的制备方法如下：[0099]溶液配置：称量0.042g的无水氯化钙和0.010g的fitc荧光试剂，溶于50ml的dmem培养基中，加入10ml胎牛血清和1ml青链霉素混合液搅拌均匀，搅拌速率为400rpm，并用氢氧化钠调节溶液ph至9.0，得到溶液a。称量0.038g的十二水合磷酸氢二钠和0.028g的二水合磷酸二氢钠溶于50ml的dmem培养基中，用氢氧化钠调节溶液ph至9.0，搅拌均匀，搅拌速率为400rpm，得到溶液b。[0100]所述青链霉素混合液中青霉素的含量为10000u/ml，链霉素的含量为10mg/ml。[0101]湿化学沉淀：将上一步配置好的50ml溶液b以5ml/min的速度滴加入50ml溶液a中，以500rpm的转速在室温下搅拌4小时。[0102]清洗：反应结束后将得到的悬浊液加入8000分子量的透析袋中，使用5l的去离子水搅拌清洗24小时、换液三次，过滤膜除菌。[0103]冷冻干燥：将清洗后的产物放入-20℃冰箱冷冻6小时，然后放入冷冻干燥机中在-55℃进行冷冻干燥处理，得到负载荧光分子的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料，粒径范围为10-100nm。[0104]检测：共聚焦显微镜图像证明负载荧光分子的非晶态仿生钙化蛋白纳米材料具有较好的荧光显影性能(图6)。[0105]图6为负载荧光分子的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料与细胞共培养形貌图。[0106]实施例4[0107]本实施例的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的制备方法如下：[0108]溶液配置：称量0.045g的无水氯化钙和0.010g的dox，溶于50ml的dmem培养基中，加入20ml胎牛血清和1ml青链霉素混合液搅拌均匀，搅拌速率为300rpm，并用氢氧化钠调节溶液ph至8.0，得到溶液a。称量0.038g的十二水合磷酸氢二钠和0.028g的二水合磷酸二氢钠溶于50ml的dmem培养基中，用氢氧化钠调节溶液ph至8.0，搅拌均匀，搅拌速率为300rpm，得到溶液b。[0109]所述青链霉素混合液中青霉素的含量为10000u/ml，链霉素的含量为10mg/ml。[0110]湿化学沉淀：将上一步配置好的50ml溶液b以1ml/min的速度滴加入50ml溶液a中，以300rpm的转速在室温下搅拌4小时。[0111]清洗：反应结束后将得到的悬浊液加入18000分子量的透析袋中，使用5l的去离子水搅拌清洗24小时、换液三次，过滤膜除菌。[0112]冷冻干燥：将清洗后的产物放入-20℃冰箱冷冻6小时，然后放入冷冻干燥机中在-50℃进行冷冻干燥处理，得到负载荧光分子的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料，粒径范围为10-100nm。[0113]实施例5[0114]本实施例的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料的制备方法如下：[0115]溶液配置：称量0.1g的无水氯化钙，溶于50ml的dmem培养基中，加入3ml胎牛血清和0.5ml青链霉素混合液搅拌均匀，搅拌速率为100rpm，并用氢氧化钠调节溶液ph至10.0，得到溶液a。称量0.1g的十二水合磷酸氢二钠溶于50ml的dmem培养基中，用氢氧化钠调节溶液ph至10.0，搅拌均匀，搅拌速率为500rpm，得到溶液b。[0116]所述青链霉素混合液中青霉素的含量为10000u/ml，链霉素的含量为10mg/ml。[0117]湿化学沉淀：将上一步配置好的50ml溶液b以20ml/min的速度滴加入50ml溶液a中，以300rpm的转速在室温下搅拌2小时。[0118]清洗：反应结束后将得到的悬浊液加入14000分子量的透析袋中，使用5l的去离子水搅拌清洗24小时、换液三次，过滤膜除菌。[0119]冷冻干燥：将清洗后的产物放入-20℃冰箱冷冻6小时，然后放入冷冻干燥机中在-40℃进行冷冻干燥处理，得到负载荧光分子的非晶态仿生钙化蛋白纳米载体材料，粒径范围为10-100nm。[0120]最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12当前第1页12