一种包含天然多糖的结核亚单位疫苗的制作方法

本发明属于疫苗领域，具体而言，本发明涉及一种包含天然多糖的结核亚单位疫苗。

背景技术：

1、由于常规bcg疫苗对肺结核的预防无效、结核耐药菌株的出现以及hiv感染导致的结核合并感染等因素，肺结核的发病及死亡率目前居高不下，形势十分严重。根据世界卫生组织(who)估算，当前全球约有17亿人感染了结核分枝杆菌，约占全球总人口的23％。在感染了结核分枝杆菌的人群(latent tuberculosis infection，ltbi)中，约有10％-15％的人在一生中的某个时候会发展为结核病，因此研制新型结核预防疫苗和治疗性疫苗非常迫切。

2、结核疫苗根据其种类可分为全菌疫苗、dna疫苗和亚单位疫苗等。亚单位疫苗能特异性地诱导体液免疫和细胞免疫，并且使用安全，是理想的疫苗形式。亚单位疫苗的原理是将结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis，mtb)生长过程中分泌的具有免疫保护作用的蛋白或多肽分离纯化作为抗原，联合佐剂制成疫苗。目前，结核亚单位疫苗的候选抗原以esat6、cfp10、mpt32、mpt64、hsp65等为主。由于人群中存在遗传多样性，单个蛋白抗原虽然会具有一定的免疫保护性，但抗原谱窄，还不足以引起有效的免疫保护，因此多数学者认同多种蛋白联合效果优于单一蛋白，将多个抗原或多肽融合表达有助于提高疫苗的免疫保护率。

3、目前所有进入临床试验阶段的结核亚单位疫苗均由多个抗原组成；多以结核杆菌保护性抗原为基础，主要包括结核杆菌分泌蛋白(多由rd1区基因编码，rd1区是mtb在长期传代过程中丢失的重要保护性抗原，仅存在于致病性分枝杆菌中，而且在bcg及环境分枝杆菌中丢失)和细胞壁蛋白以及休眠期结核杆菌表达的抗原物质等。另外，结核亚单位疫苗需要有效的佐剂辅助才能引起理想的免疫应答，不同的免疫佐剂可以引起th1或th2不同方向的免疫反应。

4、因此，在研制新型结核亚单位疫苗时，需要从抗原与佐剂两个方面加以考虑。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明旨在提供一种新型结核亚单位疫苗，其以潜伏感染蛋白作为抗原并组合结核杆菌保护性抗原，并加入天然提取的结核多糖并组合常规使用的铝佐剂、poly ic，以实现更高免疫原性和更持久的保护作用。

2、本发明的技术方案如下。

3、一方面，本发明提供一种结核亚单位疫苗，其包括从结核杆菌中提取的天然多糖，并包括蛋白esat6、ag85b、hspx、rv1738和rv2626中的一个、多个或全部。

4、其中，蛋白esat6、ag85b、hspx、rv1738和rv2626独立存在，或者以融合蛋白的形式存在。根据本发明的具体实施方式，蛋白esat6、ag85b、hspx形成重组融合蛋白；和/或，蛋白rv1738和rv2626形成重组融合蛋白，被包括于本发明的疫苗中。

5、在本发明中，术语“从结核杆菌中提取的天然多糖”是指从结核分枝杆菌的细胞壁、尤其是细胞壁最外层提取的多糖；其可以与术语“结核杆菌的天然多糖”、“结核天然多糖”、“结核多糖”等互换使用。

6、优选地，所述天然多糖通过包括以下步骤的方法得到：

7、(1)脱脂：

8、向结核分枝杆菌中加入丙酮，在60-80℃下回流2-4小时，之后停止反应；待反应体系降至20-30℃后抽滤并加入丙酮淋洗滤饼，然后在20-25℃下晾干过夜，得固体；

9、(2)破壁：

10、向步骤(1)得到的固体中加入naoh，在60-80℃下搅拌3-5小时，降温；

11、(3)沉降：

12、待反应体系降至20-35℃时，调节ph值至4-5，之后在20-25℃下静置10-20小时；之后抽滤，用水冲洗滤饼，得溶液；

13、(4)纯化：

14、通过超滤去除所述溶液中分子量50kda以上的杂质和分子量3kda以下的杂质，然后将所得溶液浓缩；

15、(5)脱色：

16、将所述溶液脱色，得无色透明溶液；

17、(6)冻干：

18、将所述无色透明溶液减压浓缩，冻干，得固体。

19、步骤(1)中，优选地，以1g(灭活湿菌重):2ml的比率加入丙酮，然后在70℃油浴中氮气保护下加热回流3小时。优选地，待反应体系降至室温后抽滤并以1g(灭活湿菌重):0.4ml的比率加入丙酮淋洗滤饼，然后室温晾干过夜。

20、步骤(2)中，优选地，以1g(灭活湿菌重):4ml的比率加入0.5n naoh。优选地，于71℃油浴中氮气保护下搅拌4小时，于冷水浴中降温。

21、步骤(3)中，优选地，待反应体系降至30℃时，在搅拌下加入6m hcl调节ph值至4.5，之后在氮气保护下室温静置过夜。优选地，次日对溶液进行抽滤，以1g(灭活湿菌重):8ml的比率加入去离子水冲洗滤饼。

22、步骤(4)中，优选地，采用中空纤维超滤膜进行超滤，先去除分子量50kda以上的杂质，用水冲洗滤膜后，再去除分子量3kda以下的杂质。优选地，将溶液浓缩为超滤前体积的1/10。

23、步骤(5)中，优选地，采用阴离子交换树脂进行脱色，以水作为洗脱液，收集含糖洗脱液。

24、步骤(6)中，优选地，将所述无色透明溶液在45-50℃、优选45-48℃下减压浓缩至1/3体积，冻干，得白色絮状固体。

25、在本发明提供的结核亚单位疫苗中，蛋白esat6、ag85b、hspx、rv1738和rv2626可以独立存在，或者以融合蛋白的形式存在。这些蛋白的氨基酸序列如下所示。

26、蛋白esat6(seq id no:1；uniprot accession no.:p9wnk7)：

27、mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatatelnnalqnlartiseagqamastegnvtgmfa

28、蛋白ag85b(seq id no:2；uniprot accession no.:p9wqp1)：

29、fsrpglpveylqvpspsmgrdikvqfqsggnnspavylldglraqddyngwdintpafewyyqsglsivmpvggqssfysdwyspacgkagcqtykwetfltselpqwlsanravkptgsaaiglsmagssamilaayhpqqfiyagslsalldpsqgmgpsliglamgdaggykaadmwgpssdpawerndptqqipklvanntrlwvycgngtpnelgganipaeflenfvrssnlkfqdaynaagghnavfnfppngthsweywgaqlnamkgdlqsslgag

30、蛋白hspx(seq id no:3；uniprot accession no.:p9wmk1)：

31、attlpvqrhprslfpefselfaafpsfaglrptfdtrlmrledemkegryevraelpgvdpdkdvdimvrdgqltikaerteqkdfdgrsefaygsfvrtvslpvgadeddikatydkgiltvsvavsegkptekhiqirstn

32、蛋白rv1738(seq id no:4；uniprot accession no.:p9wls3)：

33、mcgdqsdhvlqhwtvdisidehegltrakarlrwrekelvgvglarlnpadrnvpeigdelsvaralsdlgkrmlkvsthdieavthqparlly

34、蛋白rv2626(seq id no:5；uniprot accession no.:p9wja3)：

35、mttardimnagvtcvgehetltaaaqymrehdigalpicgdddrlhgmltdrdivikglaagldpntatagelardsiyyvdanasiqemlnvmeehqvrrvpvisehrlvgivteadiarhlpehaivqfvkaicspmalas

36、蛋白esat6、ag85b、hspx、rv1738和rv2626可以以2种、3种、4种或5种形成的融合蛋白的形式存在于本发明的亚单位疫苗中。优选地，蛋白esat6、ag85b、hspx形成重组融合蛋白；和/或，蛋白rv1738和rv2626形成重组融合蛋白。

37、在由esat6、ag85b、hspx形成的重组融合蛋白中，三者的顺序可以为n’-esat6-ag85b-hspx-c’。和/或，在由蛋白rv1738和rv2626形成的重组融合蛋白中，二者的顺序可以为n’-rv1738-rv2626-c’。

38、在本发明提供的重组融合蛋白中，各个蛋白的氨基酸序列之间可以经由接头序列(linker)相连接。由此，由蛋白esat6、ag85b、hspx形成的重组融合蛋白的结构可示为n’-esat6-linker-ag85b-linker-hspx-c’。由蛋白rv1738和rv2626形成的重组融合蛋白的结构可示为n’-rv1738-linker-rv2626-c’。

39、根据本发明的具体实施方式，所述重组融合蛋白中可以采用柔性接头，例如富含gs的柔性接头。例如，所述接头序列包含一个或多个gggsg，例如(gggsg)n，n＝1-5的整数，优选n＝1、2或3，更优选n＝2或3。

40、根据本发明的具体实施方式，由esat6、ag85b、hspx形成的重组融合蛋白(“esat6-ag85b-hspx”，可简称“eah”)包含以下氨基酸序列(seqid no:6)：

41、n’-mteqqwnfagieaaasaiqgnvtsihslldegkqsltklaaawggsgseayqgvqqkwdatatelnnalqnlartiseagqamastegnvtgmfagggsggggsggggsgfsrpglpveylqvpspsmgrdikvqfqsggnnspavylldglraqddyngwdintpafewyyqsglsivmpvggqssfysdwyspacgkagcqtykwetfltselpqwlsanravkptgsaaiglsmagssamilaayhpqqfiyagslsalldpsqgmgpsliglamgdaggykaadmwgpssdpawerndptqqipklvanntrlwvycgngtpnelgganipaeflenfvrssnlkfqdaynaagghnavfnfppngthsweywgaqlnamkgdlqsslgaggggsggggsgattlpvqrhprslfpefselfaafpsfaglrptfdtrlmrledemkegryevraelpgvdpdkdvdimvrdgqltikaerteqkdfdgrsefaygsfvrtvslpvgadeddikatydkgiltvsvavsegkptekhiqirstn-c’

42、或包含与seq id no:6所示氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。

43、由rv1738、rv2626形成的重组融合蛋白(“rv1738-rv2626”，可简称“1738-2626”)包含以下氨基酸序列(seq id no:7)：

44、n’-mcgdqsdhvlqhwtvdisidehegltrakarlrwrekelvgvglarlnpadrnvpeigdelsvaralsdlgkrmlkvsthdieavthqparllygggsggggsgmttardimnagvtcvgehetltaaaqymrehdigalpicgdddrlhgmltdrdivikglaagldpntatagelardsiyyvdanasiqemlnvmeehqvrrvpvisehrlvgivteadiarhlpehaivqfvkaicspmalas-c’

45、或包含与seq id no:7所示氨基酸序列具有至少85％同一性的氨基酸序列。

46、本发明的上下文中使用的术语“同一性”是指两个氨基酸序列(或下文的核苷酸序列)的相似性。“同一性”可以使用本领域公知算法或软件对两个序列进行对比而确定，用百分比(％)表示。术语“至少85％同一性”是指不小于85％的任意数值(不限于整数)的同一性百分比，例如至少86％同一性、至少87％同一性、至少88％同一性、至少89％同一性、至少90％同一性、至少91％同一性、至少92％同一性、至少93％同一性、至少94％同一性、至少95％同一性、至少96％同一性、至少97％同一性、至少98％同一性、至少99％同一性、乃至100％同一性。由“至少85％同一性”导致的至多25％氨基酸序列差异可存在于接头序列中。

47、优选地，在本发明提供的结核亚单位疫苗中，重组融合蛋白esat6-ag85b-hspx与重组融合蛋白rv1738-rv2626二者混合组成疫苗抗原。优选地，在所述疫苗中，两种重组融合蛋白的质量比为0.2-10:0.2-10，优选0.2-2:0.2-2，更优选1:1。

48、进一步地，本发明提供的结核亚单位疫苗还包含铝佐剂和poly ic。优选地，所述铝佐剂为氢氧化铝(al(oh)3)佐剂和/或磷酸铝(alpo4)佐剂，优选为氢氧化铝佐剂。在本发明中，poly ic是指polyinosinic–polycytidylic acid(poly(i)·poly(c))。

49、优选地，在本发明提供的结核亚单位疫苗中，所述天然多糖、铝佐剂和poly ic的质量比为0.2-1:0.2-1:0.2-1；优选1:1:1。

50、在本发明的上下文中，铝佐剂的含量或浓度均以al3+的含量或浓度计。

51、与现有技术相比，本发明提供了一种新型的结核亚单位疫苗。

52、本发明提供的结核亚单位疫苗中包含具有强免疫原性的mtb保护性抗原蛋白ag85b和esat6，同时加入了3个潜伏感染蛋白hspx、rv1738和rv2626。蛋白hspx由rv2031c编码，在缺氧条件下，其表达可以达到mtb潜伏感染状态下蛋白表达总量的25％；rv1738是由94个氨基酸组成的功能未知蛋白，在缺氧条件下，rv1738也是表达量增高明显的蛋白之一。hspx、rv1738和rv2626均是潜伏感染的重要蛋白，选择这3个潜伏感染蛋白与高免疫原性的esat6/ag85b发挥协同作用，对于潜伏感染病人的治疗将会起到重要的作用。

53、本发明提供的结核亚单位疫苗中还包含从结核杆菌中提取的天然多糖。不受限于任何理论，实验证明，本发明提供的天然多糖兼具抗原和佐剂的功能。此外，本发明提供的结核亚单位疫苗中还包含容易大规模合成的poly ic(tlr3的激动剂)和常规铝佐剂作为复合佐剂。

54、因此，本发明提出的结核亚单位疫苗采用了5个结核蛋白组成抗原复合物，既包括了强免疫原性的esat6、ag85b，又包括3个结核杆菌重要的潜伏感染蛋白，使疫苗既能预防结核杆菌感染，又能预防已感染结核杆菌的感染者发生结核病，起到预防性治疗的作用；此外，在该结核亚单位疫苗中加入结核杆菌中天然存在的多糖，与这些结核蛋白组合使用，能够显著增加ifn-γ的分泌。就结核疫苗的保护效力而言，细胞免疫的作用要远远高于体液免疫。实验证明，从结核杆菌中提取的天然多糖能显著促进了th1型免疫反应的细胞因子和趋化因子分泌，诱导机体固有免疫和适应性免疫系统产生偏向于th1型的细胞和体液免疫反应，由此能够提高疫苗的免疫原性并且具有较好的安全性。

55、因此，和现有的进行临床测试结核疫苗组合物相比，本发明的结核亚单位疫苗将会有更高的免疫原性，对于疫苗对人群的保护作用将更持久和有效。