S63845在制备抗新冠病毒感染药物中的应用

s63845在制备抗新冠病毒感染药物中的应用
技术领域
1.本发明属于医药领域，具体涉及s63845化合物的新用途。


背景技术：

2.冠状病毒（coronavirus）是目前已知的最大正链rna病毒，是脊椎动物重要的致病源，具有广泛的感染范围。冠状病毒能感染包括人、家畜、禽类、蝙蝠、小鼠及其它野生动物的呼吸、胃肠、肝及中枢神经系统。序列比对分析发现，sars-cov-2具有典型的冠状病毒基因组，属于β冠状病毒属，与sars-cov接近，因此，sars-cov-2具有冠状病毒的基本特征。新冠病毒基因组rna约为30 kb，编码约9860个氨基酸。基因组包含2个侧翼非翻译区（utrs）, 具有5’端帽子和3’端polya尾巴结构，5’端长的开放阅读框（orf1a/b）占整个基因组开放阅读框的三分之二。其编码产生的复制酶复合体能够被木瓜样蛋白酶（plpro）和3c样蛋白酶（3clpro）水解，产生16个非结构蛋白，包括nsp3、nsp5、nsp12（rna依赖的rna聚合酶）、nsp13（解旋酶hel）、核酸外切酶以及其它可能参与病毒转录和复制的nsps。3’端长的开放阅读框主要编码病毒结构蛋白：刺突蛋白（s）、包膜蛋白（e）、膜蛋白（m）和核衣壳蛋白（n）。
3.新冠病毒感染患者的临床表现为发热、干咳、浑身酸痛乏力，逐步发展为呼吸困难和病毒性肺炎；进一步发展会导致重症患者多器官损伤和衰竭，甚至死亡。尽管目前fda已经紧急批准了吉利德（remdesivir）、辉瑞（paxloivid）和默沙东（molnupiravir）的治疗新冠的药物，但这些药物价格昂贵且作用有效，无法有效遏制新冠病毒的蔓延。
4.现有技术中的抗新冠药物大多数为核苷酸类的，结构上相对比较复杂，生产上对技术难度、设备、场地的要求都很高，因此药物价格昂贵，且目前已批准的药物都是紧急使用授权的，使用条件要求高，并存在一定的药物副作用。
5.目前国内尚无针对该病毒的特异性药物，临床中仍以对症支持治疗为主。因此，研究能有效预防和治疗新型冠状病毒感染中的临床药物刻不容缓。
6.s63845是一种新型的、选择性的细胞抗凋亡蛋白（mcl-1）抑制剂。s63845通过抑制mcl-1，诱导癌细胞系的死亡，因此具有有效的抗肿瘤活性。在小鼠实验中，s63845耐受良好，没有明显的体重减少。经查阅相关资料，未发现s63845能够抑制新冠病毒复制的相关报道。通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前，我们对s63845的利用有限，仅了解到其可以作为抗肿瘤的药物，基于s63845作为药物的优势以及目前对其利用有限，我们希望能够开发s63845的新用途。
7.基于目前治疗新冠病毒药物的不足，我们希望能够探索s63845对新冠病毒的机理，从而为治疗新冠病毒提供副作用小但治疗效果更佳的药物奠定理论基础。


技术实现要素：

8.针对现有技术存在的问题，本发明提供了s63845在制备抗新冠病毒感染药物中的应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
9.本发明的目的是提供化合物s63845的新用途。
10.所述化合物s63845，其结构式如下所示：。
11.第一方面，本发明所提供的化合物s63845新用途为下述中至少一种：s63845或其药学上可接受的盐在制备预防和治疗新型冠状病毒感染药物的应用；s63845或其药学上可接受的盐在制备抑制n蛋白调控细胞凋亡产品的应用；s63845或其药学上可接受的盐在制备抑制新冠病毒复制或抑制新冠病毒蛋白表达产品的应用；s63845或其药学上可接受的盐在制备抑制新冠病毒结构蛋白n对mcl-1相互作用产品的应用；第二方面，本发明还要求保护一种产品，本发明所要求保护的产品，其活性成分为s63845或其药学上可接受的盐；所述产品具有如下任一用途：预防和治疗新型冠状病毒感染药物；抑制n蛋白调控细胞凋亡；抑制新冠病毒复制；抑制新冠病毒结构蛋白n对mcl-1相互作用。
12.本发明中，所述产品可为药物或药物制剂。本发明所述产品除含有s63845或其药学上可接受的盐外，还可含有适宜的载体或赋形剂。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液、膏剂、霜剂等多种形式；上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
13.本发明通过对绿色荧光蛋白gfp的荧光检测和蛋白表达水平检测以及分泌到细胞培养液中的病毒数量进行检测。显示s63845为3μm时对新冠病毒蛋白的表达和病毒核酸的复制均具有较好的抑制作用。通过使用分子生物学和细胞生物学实验，结果显示s63845是通过抑制新冠病毒结构蛋白n对mcl-1的相互作用来发挥抗病毒效果的。n抑制凋亡，n和mcl-1相互作用，s638345抑制n抑制的凋亡，s63845又是mcl-1的抑制剂，mcl-1是抑制凋亡的，基于此，可以推论得到s63845是通过抑制n和mcl-1间的关系来促进细胞凋亡的。
14.上述实验结果分子靶点清晰，表明s63845有开发成抗新冠病毒的有效药物而应用于临床，并且可以作为临床上潜在的抗病毒药物进一步开发的广阔前景。
15.综上所述，本发明的优点及积极效果为：以s63845作为治疗新冠的药物，相对现有治疗手段的优势是：1.药物结构相对简单；2.药物作用靶点清晰；3.药物在低浓度条件下（3μm）就可以发挥抗新冠病毒的作用；4.药物使用成本低，使用简单方便；5.药物在细胞水平上没有明显副作用。
附图说明
16.图1是一种sars-cov-2 trvlp感染系统的构建和表达验证图。
17.图2是一种新冠病毒n蛋白抑制细胞凋亡的检测示意图。
18.图3是一种新冠病毒n蛋白特异性和抗凋亡蛋白mcl-1相互作用的检测示意图。
19.图4是一种s63845抑制n蛋白调控细胞凋亡的检测示意图。
20.图5是一种s63845抑制新冠病毒复制的检测示意图。
具体实施方式
21.为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
22.下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。
23.实施例1 sars-cov-2 trvlp 感染系统的构建实施例中用gfp蛋白替换n蛋白的新冠病毒基因组（图1-a）来自于同行赠与。含有gfp蛋白替换n蛋白的新冠病毒基因组构建过程及序列已经记载到该文献中: ju x, zhu y, wang y, li j, zhang j, gong m, et al. (2021) a novel cell culture system modeling the sars-cov-2 life cycle. plos pathog17(3):e1009439。
24.我们将此基因组在体外转录为rna，然后将rna通过电转的方式转染稳定表达n蛋白的caco-2细胞，成功获得缺损n蛋白的新冠病毒，将其命名为sars-cov-2 trvlp（图1-b）。该trvlp可以在稳定表达n蛋白的caco-2细胞中完成一次完整的病毒复制周期。因为其产生的子代病毒缺失n蛋白，因此不具备感染性，可以在生物防护二级实验室（p2）中进行后续的实验。
25.实施例2新冠病毒n蛋白可以显著性抑制细胞凋亡发生本实施例中用到的a549细胞和thp-1细胞购自于美国模式培养物集存库（atcc），并且由本实验室保存。带有新冠病毒结构蛋白（n, m, e）以及辅助蛋白（3a）的质粒pcdna3.1-n/m/e/3a由申请人本实验室制备。
26.质粒pcdna3.1的结构及序列参见如下网址：https://www.addgene.org/23252/新冠病毒结构蛋白n, m, e以及辅助蛋白3a的基因序列参见如下网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/mn908947.3质粒pcdna3.1-n/m/e/3a制备过程如下：n,m,e,3a基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，以上述合成的基因为模板，用特异性的引物通过pcr的方法来扩增目的基因，将其克隆到pcdna3.1载体上。
27.引物序列如下：n: forward bamhi 5'-gcggatccatgtctgataatggacccca-3'reverse xbai 5'-gctctagattaggcctgagttgagtcag-3'm: forward bamhi 5'
‑ꢀ
gcggatccatggcagattccaacggta-3'reverse ecori 5'
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gcgaattcttactgtacaagcaaagca-3'e: forward bamhi 5'
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gcggatccatgtactcattcgtttcgg-3'reverse xhoi ecori 5'
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cgctcgagttagaccagaagatcagga-3'
3a: forward bamhi 5'
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gcggatccatggatttgtttatgag-3'reverse ecori ecori 5'
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gcgaattcttacaaaggcacgctagt-3'本实施例中用到的dmem和rpmi1640培养基购自gibco公司；lipo2000购自invitrogen；flag，gapdh抗体购自sigma；caspase-3抗体购自cst；staurosporine购自selleck；细胞凋亡流式检测试剂盒购自bd。
28.本实施例中的实验方法如下：首先使用lipo2000分别将质粒pcdna3.1-n/m/e/3a（2μg）转染a549细胞和thp-1细胞，转染48小时后,加入细胞凋亡激活剂staurosporine（5μm）刺激细胞4小时。
29.实验结果显示：细胞凋亡通路中关键蛋白caspase-3的切割成熟体蛋白clev-caspase-3可以被新冠病毒n蛋白显著性抑制（如图2-a所示）。
30.实施例3新冠病毒n蛋白特异性和抗凋亡蛋白mcl-1相互作用本实施例中a549细胞购自于美国模式培养物集存库（atcc），并且由本实验室保存。带有抗凋亡家族蛋白（mcl-1,bcl-xl,bcl-2和bcl-w）的质粒pcaggs-ha-mcl-1/bcl-xl/bcl-2/bcl-w由申请人本实验室制备。
31.关于质粒pcaggs的结构及序列参见如下网址：https://www.addgene.org/65974/mcl-1的基因序列参见如下网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nm_021960.5bcl-xl(bcl2l1)的基因序列参见如下网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nm_138578.3bcl-2的基因序列参见如下网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/xm_047437733.1bcl-w的基因序列参见如下网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/nm_004050.5重组质粒过程如下：提取a549细胞的rna，逆转率为cdna, 使用mcl-1,bcl-xl,bcl-2和bcl-w的特异性的引物以上述cdna为模板，通过pcr的方法来扩增目的基因，将其克隆到pcaggs载体上。
32.本实施例中dmem培养基购自gibco公司；lipo2000购自invitrogen；flag，ha抗体购自sigma。
33.本实施例中的实验方法如下：使用lipo2000将质粒pcdna3.1-n（3μg）和质粒pcaggs-ha-mcl-1/bcl-xl/bcl-2/bcl-w（3μg）转染a549细胞，转染24小时后,通过免疫共沉淀实验来探究新冠病毒n蛋白和抗凋亡家族蛋白间的相互作用。
34.实验结果显示：只有抗凋亡家族蛋白中的mcl-1可以和n蛋白具有相互作用（图3-a），同样的，n蛋白也只和抗凋亡家族蛋白中的mcl-1蛋白相互作用（图3-b）。
35.实施例4s63845可以抑制n蛋白调控的细胞凋亡本实施例中a549和thp-1细胞购自于美国模式培养物集存库（atcc），并且由本实验室保存。
36.本实施例中dmem和rpmi1640培养基购自gibco公司；caspase-3和mcl-1抗体购自
cst；gapdh抗体购自sigma；n蛋白抗体购自abclone： staurosporine和s63845购自selleck；细胞凋亡流式检测试剂盒购自bd。
37.本实施例中的实验方法如下：使用慢病毒感染系统分别构建新冠病毒n蛋白稳定表达的a549细胞和thp-1细胞，先加入mcl-1的特异性抑制s63845（3μm）处理细胞4小时，再加入细胞凋亡激活剂staurosporine（5μm）刺激细胞4小时。
38.流式细胞结果显示：和对照组细胞相比，s63845处理后，n蛋白不能抑制晚期细胞的凋亡（pi
+
和annexin
+
双阳性细胞，图4-a,b），同样的，n蛋白也不能抑制clev-caspase-3的表达水平（图4-c,d）。
39.实施例5 s63845可以抑制新冠病毒的感染本实施例中用到的caco-2细胞购自于美国模式培养物集存库（atcc），并且由本实验室保存。
40.本实施例中用到的dmem培养基购自gibco公司；gapdh抗体购自sigma ；gfp蛋白抗体购自abclone： s63845购自selleck。
41.本实施例中的实验方法如下：发明人使用慢病毒感染系统感染新冠病毒n蛋白稳定表达的caco-2细胞，先加入mcl-1的特异性抑制剂s63845（3μm）处理细胞4小时，再加入sars-cov-2 trvlp（moi=0.5）感染细胞48小时。
42.荧光结果显示：和对照处理细胞相比，s63845处理后，sars-cov-2的复制水平显著性降低（gfp荧光可表征病毒复制水平，图5-a）。
43.接下来，申请人通过使用荧光绝对定量pcr的方法检测细胞上清中病毒的拷贝数。使用的模板是新冠病毒的m基因，引物序列如下：forward：5
’‑
gtgccactccatggcactat-3’，reverse: 5
’‑
tccttgatgtcacagcgtcc-3’。实验结果结果显示：和对照处理细胞相比，s63845处理后，细胞上清中sars-cov-2的拷贝数显著性降低（图5-b）,同样的，western-blot结果也证明细胞中gfp蛋白的表达水平也显著性降低（图5-b）。
[0044] 本实施例通过对绿色荧光蛋白gfp的荧光检测和蛋白表达水平检测以及分泌到细胞培养液中的病毒数量进行检测。结果显示s63845（3 μm）对新冠病毒蛋白的表达和病毒核酸的复制均具有较好的抑制作用。
[0045]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。