一种博落回散与黄酮类天然超分子水凝胶及其作为抗菌消炎药物的应用

本发明涉及博落回散-黄酮苷超分子水凝胶药物的制备方法及其抗菌消炎应用，尤其是对临床上甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌具有良好的抑制活性；并对mrsa感染的皮肤伤口愈合具有促进作用，属于药物化学及制药学领域。

背景技术：

1、细菌感染是目前人类面临的巨大威胁之一。随着抗生素的滥用，出现了越来越多的耐药细菌，甚至是多重耐药的“超级细菌”。每年，耐药性感染在全球范围内造成约70万人死亡，大多数发生在发展中国家；到2050年，细菌耐药性每年会造成全球1000万人死亡。并且，细菌对人类的威胁有多种方式。因此，开发选择性强，毒性低，副作用小的新型抗生素对抗耐药细菌，发展多层面的抗菌策略迫在眉睫。

2、在细菌感染造成的疾病中，伤口感染是医学领域中最常见的现象之一。皮肤作为人体最大的器官是保护我们的第一道屏障，皮肤创面感染通常会导致创面难以愈合甚至引发其他感染相关疾病如脓皮病甚至是脓毒症。因此具有防污染、防二次创伤及促进细胞再生，且兼顾水凝胶和抗菌双重功能的抗菌水凝胶已成为研发的热点；首先其柔软的特点使其对周围细胞组织的机械损伤达到最小化，并且水凝胶具有很好的渗透性，便于代谢物质和营养物质的运输和传送。正是由于水凝胶独特的性能，使其受到医学领域的广泛关注和研究，如用于药物载体和伤口敷料等。但既往报道的水凝胶多是以高分子聚合物为主，天然活性小分子自组装形成水凝胶的报道较少，尤其是二元天然小分子自组装水凝胶的报道更少。

3、中药是天然抗生素的来源之一，很多中药成分都具有明确的抗菌作用。中药博落回的野生资源分布广泛，入药治跌打损伤、关节炎、汗斑、恶疮、蜂螫伤及麻醉镇痛、消肿。而博落回提取物因其强效的抗菌效果在动物饲料添加剂与植物杀菌剂方面已经被广泛使用。博落回散是我国二类中兽药制剂，并被批准为首个中兽药类药物饲料添加剂(批准文号：兽药添字180415250，兽药添字180415329)，是由从天然植物博落回中提取的苯并菲啶类生物碱(主要是血根碱、白屈菜红碱)制成的散剂，具有抗菌消炎、开胃等功能，常用于猪、鸡、肉鸭、淡水鱼类、虾、蟹、龟和鳖的生产，广泛作为畜禽饲用替抗使用，但其应用形式非常单一，主要为粉末形式添加、内服使用，缺少丰富灵活的应用场景。本发明受启发于药辅合一理念，根据博落回散中主要成分的结构特点使其与其他中药成分如黄芩所含有的天然抗菌抗炎的黄酮类成分相结合，开发出了天然抗菌无载体超分子水凝胶。

技术实现思路

1、在现有技术的基础上，本发明旨在开发一种基于博落回散与黄酮苷类的新型无载体水凝胶制剂。发明人惊讶地发现，博落回散的主要成分血根碱与白屈菜红碱，与黄芩苷和野黄芩苷等黄酮苷类成分，不需要借助载体分子可直接形成水凝胶，可在原有粉末状内服产品的基础上开拓口服凝胶剂、外用凝胶剂等新的应用形式，并具备更优良的抗菌消炎活性。此发明对于从天然中药中发现和开发结构明确的天然水凝胶药物具有重大的研究意义。

2、本发明的目的之一是提供由博落回及其散有效成分与-黄酮苷超分子形成的水凝胶态化合物及其制备方法。

3、本发明的目的之二，是提供具体的由博落回散生物碱成分血根碱和白屈菜红碱分别与黄酮苷类成分黄芩苷和野黄芩苷两两组合，形成的4种超分子水凝胶态化合物，以及上述化合物的制备方法。

4、本发明的目的之三是提供所得超分子水凝胶态化合物的应用，具体为4种二元无载体超分子水凝胶态化合物的体外抗菌、抗炎、抗感染及促愈应用，所述的各水凝胶态化合物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌等常见致病细菌及它们的生物膜都具有非常好的选择性抑制作用，且不影响益生菌，在替代传统抗生素临床应用上具有很大潜力，可用于预防或治疗常见致病菌导致的体内感染、伤口感染、炎症、创面不愈等的药物。

5、为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

6、1.通过探索不同ph值、加热温度、摩尔比投料以及离心转速等，确定制备博落回散或其有效成分与黄酮类成分形成超分子水凝胶态化合物的制备工艺。采用核磁、质谱等技术手段确定其结构信息。

7、所述制备方法包括以下步骤：

8、(1)加热使博落回散或血根碱、白屈菜红碱溶解于水中。

9、(2)黄酮苷(黄芩苷、野黄芩苷、汉黄芩苷、芦丁)混悬于水中，加热，调节ph得澄清透明溶液。

10、(3)将步骤(1)、(2)中所制备博落回散或血根碱、白屈菜红碱水溶液与黄酮苷水溶液混合搅拌，离心得沉淀或胶体，水洗后离心，重复三次，冷冻干燥得棕黄色粉末。

11、优选地，步骤(1)、(2)中所述的加热温度为35-80℃，例如45℃、55℃、65℃、75℃。

12、优选的，博落回散或其有效成分和黄酮苷称取摩尔量比例为1:0.1至1:10，进一步可为1:0.5-1:5，并具体可以为1:0.1、1:0.5、1:1、1:2、1:5、1:10等比例。

13、优选地，步骤(3)所述混合温度为室温至35℃。

14、优选地，步骤(1)、(2)、(3)所述用水为去离子水。

15、优选地，步骤(2)所述ph调节剂为有机或无机碱。例如氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠、氨水。

16、优选地，步骤(2)所述ph＝7-9，例如ph＝7、ph＝8、ph＝9等。

17、优选地，步骤(3)所述离心纯化时的离心转速为5000-13000rpm，例如5000rpm、5500rpm、6000rpm、6500rpm、7000rpm、7500rpm、8000rpm、8500rpm、9000rpm、9500rpm或13000rpm。

18、2.通过对不同菌种的mic值测定，评估所得肽分子水凝胶态化合物的抑菌效果。

19、抑菌效果的评估包括以下步骤：

20、通过肉汤稀释法检测化合物及对照组对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、屎肠球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的mic值。

21、3.以血根碱-黄芩苷超分子水凝胶态化合物为例，对本发明所得的超分子水凝胶态化合物进行流变学研究；以最难抑制和清除的mrsa为例，通过扫描电镜观察超分子水凝胶态化合物对mrsa等多种致病菌以及生物膜的体外抑菌效果。以最难抑制和清除的mrsa为例，通过建立小鼠皮肤伤口感染细菌动物模型，观察治疗后小鼠的伤口愈合率、细菌生长情况以及皮肤病理组织变化评估其对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(mrsa)等细菌的抑菌效果。

22、通过细胞安全性实验、体外溶血实验以及小鼠心脾肺肾病理切片进行超分子水凝胶态化合物安全性评价。

23、以血根碱-黄芩苷水凝胶态化合物为例，本技术的超分子水凝胶态化合物的流变学以及其对mrsa等细菌的体外与体内抑菌效果评价包括以下步骤：

24、(1)扫描电镜观察1/3mic给药浓度对细菌的形态学影响。

25、(2)xtt方法评估超分子水凝胶态化合物对细菌生物膜的抑制效果。

26、(3)扫描电镜观察超分子水凝胶态化合物对mrsa等菌类的生物膜的影响。

27、(4)建立小鼠皮肤伤口感染mrsa动物模型，将小鼠分为阴性对照组(control)、阳性对照组(mrsa)和给药组，给药组具体给予血根碱-黄芩苷水凝胶(ba-san)。

28、(5)经过12天的治疗周期后，比较治疗期间的伤口愈合情况与12天后小鼠皮肤的病理组织情况，评估超分子水凝胶态化合物预防/治疗/抑制感染引起的炎症、促进mrsa感染的伤口愈合情况。

29、(6)用mtt方法评估加药培养24h、48h的mdck细胞存活率，评价超分子水凝胶态化合物的细胞毒性。

30、(7)药物与大鼠红细胞共同孵育，用酶标仪测量各给药组在570nm的溶血率，评价超分子水凝胶态化合物的溶血性。

31、(8)取给药12天小鼠的心、肝、脾、肺、肾的组织器官，比较正常小鼠与给药组小鼠组织的病理情况，评价超分子水凝胶态化合物的体内安全性。

32、本发明的具体研究结果阐述如下：

33、一、水凝胶的形成

34、发明人发现：博落回散或博落回散有效成分与部分黄酮类化合物可以形成超分子水凝胶。可以形成水凝胶的原料化合物组合有博落回散-黄芩苷、博落回散-野黄芩苷、血根碱-黄芩苷、血根碱-野黄芩苷、白屈菜红碱-黄芩苷、白屈菜红碱-野黄芩苷；而博落回散-汉黄芩苷、博落回散-芦丁、血根碱-汉黄芩苷、白屈菜红碱-汉黄芩苷、血根碱-芦丁、白屈菜红碱-芦丁不能形成水凝胶，只能形成沉淀。所选的4种(黄芩苷、野黄芩苷、汉黄芩苷、芦丁)黄酮类化合物结构相似，但细微的官能团变化会导致产物形成不同的形态。此外,发明人还发现其它具有类似结构的生物碱如药根碱、巴马汀并不能与黄芩苷、野黄芩苷等黄酮苷形成水凝胶。尽管药根碱、巴马汀结构与血根碱和白屈菜红碱高度相近，但按照所述制备方法却不能与黄酮类成分形成水凝胶,经过结构分析比对可知血根碱具备两个亚甲二氧基环，白屈菜红碱具备一个亚甲二氧基环，且二者在氮原子上存在甲基结构，这都是药根碱、巴马汀所不具备的，推测形成本发明所述的水凝胶需要生物碱成分具备特定的亚甲二氧基环或氮甲基，首次提出并初步证实了无载体超分子水凝胶的形成需要某些关键官能团存在的观点。

35、综上所述，本发明使用的两类成分中均仅有特定的结构类型才能制备形成水凝胶，能否成功制备水凝胶具有极低的可预见性。并且，以血根碱-黄芩苷水凝胶为例，本发明的超分子水凝胶态化合物表现出较好的流变性能，在频率与剪切应力的变化下，储能模量均大于损耗模量，证明了该化合物可以稳定保持水凝胶态且流动性良好，适合包括外用在内各类场景的应用。

36、二、水凝胶态化合物的抗菌、抗感染、抗炎、促愈的预防或治疗效果

37、体外实验中，各超分子水凝胶药物对多种致病菌及非致病菌作用效果见于实施例4表2、实施例6表3，可以证明本发明获得的超分子水凝胶态化合物均具备对致病菌的高选择抑制性，而对有益菌群仅有微弱影响。其中，以代表性化合物血根碱-黄芩苷水凝胶为例，其对mrsa的抑菌mic值为3.75μm；50μm药物浓度下对mrsa生物膜的清除率为81.84％。扫描电镜结果也显示，血根碱-黄芩苷为代表的本发明水凝胶态化合物能破坏细菌表面结构，促进菌体变形裂解，具有显著的清除生物膜能力。并且，从表2中可见，本发明中的超分子水凝胶态化合物还展现出比原料单体药物显著更强、选择性更高的抗菌能力。

38、动物体内实验中，在12天的治疗期间内，不同时间点血根碱-黄芩苷水凝胶组的皮肤再生速度均大于mrsa组与control组。12天后组织病理学切片表明血根碱-黄芩苷水凝胶组切片与正常皮肤相似，表皮层与真皮层结构分明，有较多毛囊生长，较少的炎症因子、较多的胶原纤维沉积；而mrsa组的皮肤还在愈合之中，可见肉芽组织，并且未见毛囊恢复，还有较多的炎症因子，胶原纤维沉积量较少。12天后血根碱-黄芩苷水凝胶治疗组的炎症因子tnf-α、il-1β明显低于mrsa组，具有显著的抗炎能力。

39、结合上述内容可知，与现有技术相比，本发明有如下优点：

40、本发明中，将利用博落回散有效成分与黄芩提取物中的特定黄酮类成分自组装直接形成超分子水凝胶，无需借助辅料载体。组成博落回散的两种主要成分血根碱与白屈菜红碱单独使用均具有一定的抗菌作用，而黄酮类成分黄芩苷与野黄芩苷分别具有微弱的非特异性抗菌作用，当这两类成分两两组合时生成具有新结构的超分子水凝胶，不仅自组装合成的超分子药物相对于单体成分而言显著增强了特异性抗菌效果，该种增强难以在不经过试验验证的前提下被提前预见，而且组装后还带来形态上的变化，提供其他应用形式的可能，相对于现有技术中将中药单体成分配合高分子载体材料制备凝胶的技术方案，本发明无需添加辅料即可制成水凝胶制剂，减少了原料使用，在提高药效的基础上，还具有很好的安全性和简便性，在应用于抗菌、抗感染、抗炎以及促进细菌感染的伤口愈合方面具有潜在应用价值。