一种隔山消提取物及其制备方法、检测方法和应用与流程

1.本发明涉及中药分析领域，具体涉及一种隔山消提取物及其制备方法、检测方法和应用。


背景技术：

2.隔山消，别名隔山撬、隔山牛皮消、白首乌、白何首乌、山瓜蒌，为萝藦科植物隔山消的块根，秋季采收、洗净、切片，晒干；性味味甘，微苦，性微温；功能主治补肝肾；强筋骨；健脾胃；解毒。主肝肾两虚；头昏眼花；失眠健忘；须发早白；阳痿；遗精；腰膝酸攀登；脾虚不运；脘腹胀满；仞欲不振；泄泻；产后乳少；鱼口疮毒。现代研究表明，隔山消主要含有c21甾类、苯乙酮类、多糖、磷脂等多种化学成分，具有促进胃肠道运动的作用、免疫调节作用、抗肿瘤作用、抗衰老作用、保肝等作用。
3.标准汤剂又称标准煎液，是一种传统的临床广泛使用的用药形式，标准汤剂系遵循中医药理论，按照临床汤剂煎煮方法规范化煎煮，固液分离，经适当浓缩制备或经适宜方法干燥制得，作为衡量中药配方颗粒是否与临床汤剂基本一致的标准参照物。
4.中药配方颗粒，是在中医药理论指导下，以规范炮制加工的中药饮片为原料，采用提取、低温浓缩、瞬间干燥等工艺技术而制成的颗粒剂。它既可供临床灵活组方，调配冲服，又可作为中药制剂的工业原料，也为中医临床用药提供新的途径。与传统的中药煎剂相比，配方颗粒服用方便，服用量小，
5.目前，隔山消标准汤剂和配方颗粒的制备及其检测方法均未见文献报道。


技术实现要素：

6.本发明要解决的技术问题是：提供一种隔山消提取物及其制备方法和检测方法，以对中药配方颗粒的质量控制与标准研究进行规范，实现中药配方颗粒整体的质量控制和有效监督。
7.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
8.本发明提供一种隔山消提取物的制备方法，包括如下步骤：
9.(1)取隔山消饮片，加水煎煮，过滤得滤液；其中，所述水煎煮次数为2次，第一次水煎煮加10～12倍隔山消饮片重量的水，第二次水煎煮加8～10倍隔山消饮片重量的水，第一次水煎煮时间为35～55min，第二次水煎煮时间为25～40min；
10.(2)将步骤(1)滤液浓缩、干燥得到隔山消提取物。
11.优选的是，上述制备方法中，步骤(2)中，所述滤液浓缩的温度为60～65℃；优选地，所述滤液浓缩至浓缩液密度为1.05～1.12g/ml。
12.优选的是，上述制备方法中，所述隔山消提取物的出膏率为7.1～21.1％。
13.优选的是，上述制备方法中，所述干燥包括冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥、微波干燥和红外干燥中的一种。
14.优选的是，上述制备方法中，所述干燥为冷冻干燥，所述冷冻干燥分成三个阶段：
a.预冻：预冻温度为-55～-50℃；b.一次干燥：干燥温度-45～0℃；c.二次干燥进行解析：干燥温度为10～30℃；优选地，预冻时间为2～5小时，优选为3小时；一次干燥时间为35～45小时，优选为38小时；二次干燥时间为5～7小时，优选为6小时；更优选地，在步骤(2)中，一次干燥的真空度为0～0.2mbar。
15.优选的是，上述制备方法中，所述干燥为喷雾干燥，所述喷雾干燥进风温度为165～195℃，出风温度为100～110℃；优选地，所述喷雾干燥前还包括将隔山消提取物和麦芽糊精混合的步骤；更优选地，混合温度为60～100℃；进一步优选地，以隔山消饮片加入重量计，麦芽糊精的加入量为5～20％。
16.本发明还提供一种由上述制备方法制得的隔山消提取物；优选地，按干燥品计，所述隔山消提取物中对羟基苯乙酮的质量含量为0.25-0.98mg/g；更优选地，以重量百分比计，对羟基苯乙酮的转移率为22.58-83.92％。
17.本发明还提供上述一种隔山消提取物的鉴定方法，包括通过薄层色谱法鉴定所述隔山消提取物；所述薄层色谱法包括如下步骤：a.制备隔山消提取物供试品溶液和隔山消对照品溶液；b.将隔山消提取物供试品溶液和隔山消对照品溶液分别点于同一硅胶g薄层板上，加展开剂展开，取出晾干，喷以显色剂使斑点显色，检测，即得；
18.优选地，所述隔山消提取物供试品溶液通过包括如下步骤制得，取隔山消提取物1-3g，加水溶解，经离子交换后洗脱得到洗脱液，蒸干得到残渣，用甲醇溶解残渣即得；优选所述隔山消对照品溶液通过包括如下步骤制得，取隔山消药材1-3g，加水加热回流、过滤，经离子交换后洗脱得到洗脱液，蒸干得到残渣，用甲醇溶解残渣即得；
19.更优选地，所述展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水，进一步优选地，所述甲苯、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为20:20:1:1。
20.本发明还提供一种上述隔山消提取物中对羟基苯乙酮质量含量的检测方法，包括下述步骤：
21.(1)参照物溶液的制备
22.称取对羟基苯乙酮对照品，加入溶剂制成参照物溶液；
23.(2)供试品溶液的制备
24.称取隔山消提取物，加入溶剂进行提取；
25.(3)高效液相色谱分析
26.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以有机溶剂为流动相a，0.1％磷酸水溶液为流动相b进行梯度洗脱，吸取参照物溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪进行分析。
27.优选的是，上述检测方法中，步骤(1)所述溶剂选自50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇、50％甲醇、75％甲醇和甲醇中的一种或两种以上，优选为75％乙醇；优选地，步骤(2)所述溶剂选自50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇、50％甲醇、75％甲醇和甲醇中的一种或两种以上，优选为75％乙醇。
28.优选的是，上述检测方法中，步骤(2)中所述提取采用回流、振摇或超声中一种，优选为超声提取。
29.优选的是，上述检测方法中，步骤(2)中所述提取时间为15-60min，优选为60min。
30.优选的是，上述检测方法中，步骤(3)所述有机溶剂选自乙腈或甲醇，优选为乙腈。
31.优选的是，上述检测方法中，步骤(3)中所述梯度洗脱的条件为：在0-15min，流动
相a为10％
→
21％，流动相b为90％
→
79％，15-18min，流动相a为21％
→
21％，流动相b为79％
→
79％，18-23min，流动相a为21％
→
90％，流动相b为79％
→
10％，23-27min，流动相a为90％
→
10％，流动相b为10
→
90％，27-30min，流动相a为10％
→
10％，流动相b为90
→
90％。
32.本发明还提供一种上述隔山消提取物的特征图谱的检测方法，包含下述步骤：
33.(1)参照物溶液的制备
34.称取对羟基苯乙酮对照品，加入溶剂制成参照物溶液；
35.(2)供试品溶液的制备
36.称取隔山消提取物，加入溶剂进行提取；
37.(3)超高效液相色谱分析
38.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以有机溶剂为流动相a，以水相为流动相b进行梯度洗脱，吸取参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行分析。
39.优选的是，上述检测方法中，步骤(1)所述溶剂选自水、50％甲醇、75％乙醇、乙醇、50％甲醇、75％甲醇和甲醇中的一种或两种以上，优选为甲醇；优选地，步骤(2)所述溶剂选自水、50％甲醇、75％乙醇、乙醇、50％甲醇、75％甲醇和甲醇中的一种或两种以上，优选为甲醇。
40.优选的是，上述检测方法中，步骤(2)中所述提取采用回流、振摇或超声中一种，优选为超声提取。
41.优选的是，上述检测方法中，步骤(2)中所述提取时间为15～60min，优选为30min。
42.优选的是，上述检测方法中，步骤(3)所述有机溶剂选自乙腈或甲醇，优选为甲醇。
43.优选的是，上述检测方法中，步骤(3)中所述梯度洗脱的条件为：在0-7min，流动相a为23％
→
24％，流动相b为77％
→
76％，7-11min，流动相a为24％
→
27％，流动相b为76％
→
73％，11-14min，流动相a为27％
→
29％，流动相b为73％
→
71％，14-18min，流动相a为29％
→
32％，流动相b为71
→
68％，18-20min，流动相a为32％
→
38％，流动相b为68％
→
62％，20-28min，流动相a为38％
→
38％，流动相b为62％
→
62％，28-28.1min，流动相a为38％
→
23％，流动相b为62％
→
77％，28.1-30min，流动相a为23％
→
23％，流动相b为77％
→
77％。
44.优选的是，上述检测方法中，步骤(3)所述水相选自水、0.1％甲酸溶液、0.05％磷酸溶液和0.1％乙酸溶液，优选为0.1％甲酸溶液。
45.本发明还提供上述隔山消提取物在用于制备保健食品、中药药品的用途；优选地，所述中药药品为标准汤剂、胶囊剂、片剂、冲剂或配方颗粒。
46.一种标准汤剂，通过上述的隔山消提取物制备得到。
47.一种配方颗粒，将上述的隔山消提取物通过添加辅料制得。
48.本发明的有益效果：
49.1.本发明为中药配方颗粒的质量提供了一个标准，实现了中药配方颗粒整体的质量控制和有效监督。
50.2.本发明采用隔山消药材制备隔山消提取物，所述隔山消提取物的出膏率为7.1-21.1％，出膏率较高，所述隔山消提取物中对羟基苯乙酮的质量含量为0.25-0.98mg/g，对羟基苯乙酮的转移率为22.58-83.92％。经过6个月加速稳定性试验，对羟基苯乙酮含量、水分含量相对稳定、特征图谱相对保留时间及相对峰面积相对稳定，耐吸潮，未产生杂质成
分，将所制备得到的隔山消提取物进行高效液相色谱及超高效液相色谱分析，所述方法专属性好，重复性良好，稳定性好。
51.3.本发明建立的特征图谱方法，采用超高相液相色谱，具有简便、稳定、精密度高及重现性好等特点，而且所得提取物指纹图谱的峰多，峰型好，易于鉴别，准确可靠。
52.4.本发明建立的特征图谱方法，方法简单省时，环保，对一批制剂的分析仅用30min，能大大缩短检测分析时间，提高生产效率，使得大样本抽样检测，实时监控产品的质量成为可能。
附图说明
53.图1为测定实施例一制得隔山消提取物中对羟基苯乙酮质量含量及转移率的高效液相色谱图；
54.图2为隔山消提取物中对羟基苯乙酮质量含量及转移率的测定方法专属性考察高效液相色谱图；
55.图3为隔山消提取物中对羟基苯乙酮质量含量及转移率的测定方法线性关系考察图；
56.图4为实施例一隔山消提取物中对羟基苯乙酮质量含量及转移率的检测方法中不同色谱柱的高效液相色谱图；
57.图5为实施例一隔山消提取物中对羟基苯乙酮质量含量及转移率的检测方法中不同色谱仪的高效液相色谱图；
58.图6为实施例一隔山消提取物中对羟基苯乙酮质量含量及转移率的检测方法中不同柱温的高效液相色谱图；
59.图7为实施例一隔山消提取物中对羟基苯乙酮质量含量及转移率的检测方法中不同流速的高效液相色谱图；
60.图8为隔山消提取物在190-400nm范围内的吸收光谱；
61.图9为实施例一隔山消提取物特征图谱检测方法中流动相为乙腈-0.05％磷酸溶液和甲醇-0.05％磷酸溶液的超高效液相色谱图；
62.图10为实施例一隔山消提取物特征图谱检测方法中流动相为甲醇-水的超高效液相色谱图；
63.图11为实施例一隔山消提取物特征图谱检测方法中流动相为甲醇-0.05％磷酸溶液的超高效液相色谱图；
64.图12为实施例一隔山消提取物特征图谱检测方法中流动相为甲醇-0.1％甲酸溶液的超高效液相色谱图；
65.图13为实施例一隔山消提取物特征图谱检测方法中流动相为甲醇-0.1％乙酸溶液的超高效液相色谱图；
66.图14为实施例一隔山消提取物特征图谱检测方法中不同色谱柱的超高效液相色谱图；
67.图15为实施例一隔山消提取物特征图谱检测方法中不同柱温的超高效液相色谱图；
68.图16为实施例一隔山消提取物特征图谱检测方法中不同流速的超高效液相色谱
图；
69.图17为实施例一制得隔山消提取物的特征图谱；
70.图18为隔山消特征图谱检测方法专属性考察色谱图；
71.图19为隔山消特征图谱检测方法整体性考察色谱图；
72.图20为隔山消提取物共有峰测定结果；
73.图21为实施例五制得隔山消配方颗粒特征图谱；
74.图22为实施例五制得隔山消配方颗粒薄层色谱鉴定结果。
具体实施方式
75.为使本发明实施例的目的、技术方案和技术效果更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。以下所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。结合本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
76.在本发明的一个具体实施方式中，本发明提供一种隔山消提取物的制备方法，包括如下步骤：
77.(1)取隔山消饮片，加水煎煮，过滤得滤液；其中，所述水煎煮次数为2次，第一次水煎煮加10～12倍隔山消饮片重量的水，第二次水煎煮加8～10倍隔山消饮片重量的水，第一次水煎煮时间为35～55min，第二次水煎煮时间为25～40min；
78.(2)将步骤(1)滤液浓缩、干燥得到隔山消提取物。
79.根据本发明，在步骤(2)中，将滤液进行减压浓缩，在温度为60-65度下进行浓缩，浓缩至密度为1.05-1.12g/ml，调节固含量为10-14％。
80.根据本发明，所述干燥包括但不限于冷冻干燥、真空干燥、喷雾干燥、微波干燥和红外干燥中的一种。
81.在本发明的一个优选实施方式中，步骤(2)干燥为冷冻干燥，所述冻冻干燥分成三个阶段：a.预冻：预冻温度为-55～-50℃；b.一次干燥：干燥温度-45～0℃；c.二次干燥进行解析：干燥温度为10～30℃；
82.其中，预冻时间为2～5小时，优选为3小时；一次干燥时间为35-45小时，优选为38小时，一次干燥的真空度为0-0.2mbar；二次干燥时间为5～7小时，二次干燥的真空度为0mbar；
83.为了有利于冻干粉形态完好、颜色均匀和保留有效物质，一次干燥过程中，在-45℃冷冻2-3h，在-35℃冷冻6-7h，在-30℃冷冻18-20h，在-25℃冷冻9-10h，在-20℃冷冻2-3h，在-10℃冷冻1-2h，在0℃冷冻1-2h。
84.在本发明的又一优选实施方式中，其中，在步骤(1)中，隔山消饮片在加水煎煮之前，进行适度破碎，并进行浸泡，浸泡时间为30min。
85.根据本发明，在步骤(1)中，所述过滤时趁热过滤，所述过滤采用100-300目筛网进行过滤，优选为100目进行过滤。
86.优选的，所述筛网为泰勒筛网(美国泰勒公司)或滤布(新乡中新化工有限责任公司)。
87.在本发明的又一优选实施方式中，步骤(2)所述干燥为喷雾干燥，喷雾干燥具有干
燥效率高、干燥速度快，干燥时间短，对有效成分破坏少，干膏粉均匀，细腻，含水量低，溶解性好等优点，适合中试和商业化大生产；另外，喷雾干燥时热风进入时的热风温度与出风温度的控制是很重要，它决定着产品的质量以及干燥松密度，发明人经过研究发现，喷雾干燥进风口温度为165-195℃，出风口温度为100-110℃，该温度下产品成型好、质量高。
88.在喷雾干燥过程中，为了防止隔山消提取物清膏中混有异物堵塞管道，干燥前需对清膏进行加热处理，使物料温度保持在60-100℃。为了使干燥容易进行，减少粘壁和结块问题，干燥前向清膏中加入辅料，例如麦芽糊精，进一步优选地，以煎煮时加入的隔山消饮片重量计，辅料的添加量为5-20％，效果更好。
89.本发明还提供一种隔山消提取物的鉴定方法，包括通过薄层色谱法鉴定所述隔山消提取物；所述薄层色谱法包括如下步骤：a.制备隔山消提取物供试品溶液和隔山消对照品溶液；b.将隔山消提取物供试品溶液、隔山消对照品溶液和分别点于同一硅胶g薄层板上，加展开剂展开，取出晾干，喷以显色剂使斑点显色，检测，即得；优选地，隔山消提取物供试品溶液通过包括如下步骤制得，取隔山消提取物1-3g，加水溶解，采用离子交换树脂，例如大孔树脂柱进行洗脱收集洗脱液，蒸干洗脱液得到残渣，用甲醇溶解残渣即得；优选所述隔山消对照品溶液通过包括如下步骤制得，取隔山消药材1-3g，加水加热回流、过滤，采用离子交换树脂，例如大孔树脂柱进行洗脱收集洗脱液，蒸干洗脱液得到残渣，用甲醇溶解残渣即得；优选地，所述展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水，更优选地，所述甲苯、乙酸乙酯、甲醇和水的体积比为20:20:1:1。
90.本发明还提供一种隔山消提取物中对羟基苯乙酮质量含量的检测方法，包括下述步骤：
91.(1)参照物溶液的制备
92.称取对羟基苯乙酮对照品，加入溶剂制成参照物溶液；
93.(2)供试品溶液的制备
94.称取隔山消提取物，加入溶剂进行提取；
95.(3)高效液相色谱分析
96.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以有机溶剂为流动相a，0.1％磷酸水溶液为流动相b进行梯度洗脱，吸取参照物溶液和供试品溶液注入高效液相色谱仪进行分析。
97.根据本发明，进行高效液相色谱分析时，所述梯度洗脱的条件为：在0-15min，流动相a为10％
→
21％，流动相b为90％
→
79％，15-18min，流动相a为21％
→
21％，流动相b为79％
→
79％，18-23min，流动相a为21％
→
90％，流动相b为79％
→
10％，23-27min，流动相a为90％
→
10％，流动相b为10
→
90％，27-30min，流动相a为90％
→
90％。
98.根据本发明，上述参照物溶液的制备方法为：取对羟基苯乙酮对照品适量，精密测定，加溶剂制成每1ml含对羟基苯乙酮10μg的溶液。
99.上述供试品溶液的制备方法为：取隔山消提取物0.1-0.15g，精密称定，加入25ml溶剂，称定重量，采用回流或振荡溶解或超声方式进行提取，优选为超声提取，再称定重量，用溶剂补足减失重量，摇匀，过滤得到滤液。
100.根据本发明，进行高效液相色谱分析时，所使用的色谱柱可以为菲罗门superlu c18(柱长250mm，内径4.6mm，粒径为5μm)、安捷伦zorbax ecl ipse plus c18(柱长250mm，内径4.6mm，粒径为5μm)或岛津inerts i l ods-hl c18(柱长250mm，内径4.6mm，粒径为5μ
m)；优选为菲罗门superlu c18(柱长250mm，内径4.6mm，粒径为5μm)。
101.根据本发明，进行高效液相色谱分析时，所使用的色谱柱的柱温为30-40℃，优选为30℃。
102.根据本发明，进行高效液相色谱分析时，所使用的流速可以为0.9-1.2ml/min，优选为1.0ml/min。
103.本发明还提供一种隔山消提取物的特征图谱的检测方法，包含下述步骤：
104.(1)参照物溶液的制备
105.称取对羟基苯乙酮对照品，加入溶剂制成参照物溶液；
106.(2)供试品溶液的制备
107.取隔山消提取物，加入溶剂进行提取；
108.(3)超高效液相色谱分析
109.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以有机溶剂为流动相a，以水相为流动相b进行梯度洗脱，吸取参照物溶液和供试品溶液注入超高效液相色谱仪进行分析。
110.根据本发明，上述参照物溶液的制备方法为：取对羟基苯乙酮对照品适量，精密测定，加溶剂制成每1ml含对羟基苯乙酮10μg的溶液。
111.上述供试品溶液的制备方法为：取隔山消提取物0.1-0.15g，精密称定，加入25ml溶剂，称定重量，采用回流或振荡溶解或超声方式进行提取，优选为超声提取，再称定重量，用溶剂补足减失重量，摇匀，过滤得到滤液。
112.根据本发明，进行高效液相色谱分析时，水相可以为水、0.1％甲酸溶液、0.05％磷酸溶液或0.1％乙酸溶液中的一种，优选为0.1％甲酸溶液，其中，所述梯度洗脱的条件为：在0-7min，流动相a为23％
→
24％，流动相b为77％
→
76％，7-11min，流动相a为24％
→
27％，流动相b为76％
→
73％，11-14min，流动相a为27％
→
29％，流动相b为73％
→
71％，14-18min，流动相a为29％
→
32％，流动相b为71
→
68％，18-20min，流动相a为32％
→
38％，流动相b为68％
→
62％，20-28min，流动相a为38％
→
38％，流动相b为62％
→
62％，28-28.1min，流动相a为38％
→
23％，流动相b为62％
→
77％，28.1-30min，流动相a为23％
→
23％，流动相b为77％
→
77％。
113.根据本发明，进行超高效液相色谱分析时，所使用的色谱柱可以为迪马科技有限公司的dikma c18-a(2.1*150mm，1.8μm)、沃特世科技有限公司的acquity uplct3(2.1*150mm，1.8μm)或广州绿百草科学仪器有限公司的shodex c18u 2d(2.1*150mm，1.9μm)，优选为迪马科技有限公司的dikma c18-a(2.1*150mm，1.8μm)。
114.根据本发明，进行超高效液相色谱分析时，所使用的色谱柱的柱温为25-35℃，优选为30℃。
115.根据本发明，进行超高效液相色谱分析时，所使用的流速可以为0.2-0.3ml/min，优选为0.3ml/min。
116.本发明还提供上述隔山消提取物在用于制备保健食品、中药药品的用途；优选地，所述中药药品为标准汤剂、胶囊剂、片剂、冲剂或配方颗粒。
117.本发明还提供一种标准汤剂，通过上述的隔山消提取物制备得到。
118.本发明还提供一种隔山消配方颗粒，其包括将隔山消提取物与药用辅料经干法制粒得到。
119.干法制粒主要是指不用润湿剂或液态粘合剂而制成的颗粒，它是把药物和辅料混合均匀，压缩成大的片状或条带状后，粉碎程所需大小颗粒的方法。该法靠压缩力使离子间产生结合力，其制备方法有重压法和辊压法。与传统的湿法制粒相比，省去了制软材、干燥、整粒的过程，工艺简单，并且克服了辅料用量大的缺点，能大大提高载药量。而中药配方颗粒的相关法规要求中药配方颗粒成品仅尽量不加或少加辅料，所以，宜选择干法制粒为中药配方颗粒的制粒方法。所述药用辅料包括但不限麦芽糊精、硬脂酸镁、二氧化硅、滑石粉或微晶纤维素，可改变粉体性质，改善物料外观和流动性，便于贮存和运输、溶解度、孔隙率和比表面积等的控制。考虑到颗粒粒度、流动性、一次成品率、堆密度、溶化性等综合性能，在干法制粒中加入辅料的量应≦0.3％(以清膏的重量计)。用料过多时会带来一些性能上的缺陷，比如硬脂酸镁用量过多时，由于其疏水性，会使得溶出迟缓。
120.根据本发明，为了保证颗粒的一次成品率和颗粒粒度，所述干法制粒的进料速度为70～110r/min，优选轧辊压轮转速为5～15r/min，液压压力为5～10mpa。
121.下面通过具体实施例来进一步说明本发明的有益效果。
122.本发明中使用的原料或试剂均购自市场主流厂家，未注明生产厂商者或者未注明浓度者，均为可以常规获取的分析纯级的原料或试剂，只要能起到预期的作用，并无特别限制。
123.本实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
124.以下，利用实施例、对比例更具体说明本发明，但本发明的技术范围不限定于这些示例。需要说明的是，只要不是特别地记载，那么本发明中使用的全部的百分率、份、比率基于质量。其中，实施例和对比例所用到的原料信息和试验设备的信息分别如表1和表2所示：
125.表1本发明所用到的原料信息
126.原料名称纯度/批号出售厂家隔山消饮片yp2104-1贵州省毕节市田坝桥镇隔山消饮片yp2104-2贵州省毕节市林口村隔山消饮片yp2104-3贵州省毕节市对坡镇隔山消饮片yp2104-4贵州省毕节市大银镇隔山消饮片yp2104-5贵州省毕节市杨场凉镇隔山消饮片yp2104-6贵州省毕节市野角乡隔山消饮片yp2104-7贵州省毕节市望厂坡隔山消饮片yp2104-8贵州省毕节市下寨隔山消饮片yp2104-9贵州省高坡镇隔山消饮片yp2104-10贵州省高坡水塘村隔山消饮片yp2104-11贵州省龙里县羊场隔山消饮片yp2104-12贵州省龙里县干坝隔山消饮片yp2104-13贵州省龙里县永告村隔山消饮片yp2104-14贵州省龙里县丘家庄隔山消饮片yp2104-15贵州省毕节市鸭池镇对羟基苯乙酮111897-201602中国食品药品检定研究所
127.表2本发明所用的实验设备的信息
128.设备名称型号出售厂家电陶瓷壶ymw-5湖州市港钿工艺制作厂旋转蒸发仪re-5205a上海亚荣生化仪器厂旋转蒸发仪yre2000-b巩义市予华仪器有限责任公司真空冷冻干燥机trl-0.5大连双瑞科技有限公司超高效液相色谱仪watersacquity/h-class沃特世科技有限公司高效液相色谱仪agilent1260infinity安捷伦科技有限公司数控超声清洗仪kq-500db昆山市超声仪器有限公司硅胶g薄层板10cm*10cm国药集团化学试剂有限公司多功能提取浓缩机组ts-ns-200上海顺仪实验设备有限公司喷雾干燥机组zipg-5常州恒干干燥设备有限公司干法制粒机gzl100-30l石家庄科源机械设备有限公司
129.下述实施例中隔山消浓缩液含固率采用如下方法测定：
130.参照2020年版《中国药典》第四部通则2201浸出物测定法中“热浸法”浸出物含量的测定：精密称取浓缩液10g，置已恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，置干燥器中冷却30min，迅速精密称定重量，计算得到浓缩液含固率。
131.实施例一
132.1.隔山消提取物的制备方法
133.(1)取隔山消饮片(批号yp2104-1)100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮直接加入到10倍隔山消饮片重量的水中，浸泡30分钟，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸40分钟，煎液经300目筛网趁热过滤；第二次煎煮加8倍隔山消饮片重量水，武火加热煮沸后文火保持微沸30分钟，煎液用300目筛网趁热过滤，合并两次滤液；
134.(2)将滤液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至100ml的浸膏，测量其密度为1.11、出膏率为14.64％；在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为1ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干，先进行预冻，预冻温度为-50℃，预冻时间为3小时，然后进行一次干燥，干燥温度依次为-45℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-10℃和0℃，真空度为0.2mbar，干燥时间分别为2小时、6小时、18小时、9小时、2小时和1小时，接着进行二次干燥，干燥温度依次为10℃、20℃和30℃，真空度为0mbar，干燥时间分别为1小时、1小时和4小时，取出，轧铝盖，得到隔山消提取物，所述隔山消的出膏率和水分质量含量按下述公式计算，
135.出膏率＝浓缩液重量*浓缩液含固率/饮片投料量*100％
136.水分质量含量＝水份重/样品重*100％
137.2.隔山消提取物的对羟基苯乙酮质量含量及转移率的测定方法
138.2.1对检测方法的条件的优化
139.2.1.1参照物溶液的制备
140.取对羟基苯乙酮对照品适量，精密称定，置于已编号的10ml容量瓶内，加75％乙醇制成每1ml含对羟基苯乙酮10μg参照物溶液，摇匀，即得。
141.2.1.2供试品溶液的制备
142.取实施例一制得隔山消提取物约0.14g，精密称定，置于具塞锥形瓶内，加入25ml溶剂，称定重量，提取处理一段时间，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内。
143.2.1.3高效液相色谱分析
144.以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(菲罗门superlu c18，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5.0μm)；以乙腈为流动相a，0.1％磷酸水溶液为流动相b，按表3中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速1.0ml/min，检测波长为276nm。理论板数按对羟基苯乙酮峰计算应不低于10000。分别吸取10μl2.1.1中参照物溶液、2.1.2中供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行分析。
145.表3洗脱梯度
[0146][0147][0148]
2.1.4对羟基苯乙酮的质量含量和对羟基苯乙酮的转移率按下述公式计算：
[0149]
其中，
[0150]w对羟基苯乙酮
＝a
供
×c对
×v供
×
10-3
/(m
供
×a对
)
[0151]w饮
＝a
饮供
×c对
×v饮供
×
10-3
/(m
饮供
×a对
)
[0152]
对羟基苯乙酮转移率＝(m
提
×w对羟基苯乙酮
)/(m
饮
×w饮
)
[0153]
式中：
[0154]w对羟基苯乙酮
——隔山消提取物中对羟基苯乙酮的质量含量，mg/g；
[0155]w饮
——隔山消饮片中对羟基苯乙酮的质量含量，mg/g；
[0156]a对
——参照物溶液的高效液相色谱谱图中羟基苯乙酮对应吸收峰面积；
[0157]a供
——供试品溶液的高效液相色谱谱图中羟基苯乙酮对应吸收峰面积；
[0158]a饮供
——饮片供试品溶液的高效液相色谱谱图中羟基苯乙酮对应吸收峰面积；
[0159]c对
——参照物溶液对照品的浓度，μg/ml；
[0160]m供
——供试品溶液中隔山消提取物的绝干质量，g；
[0161]m饮供
——饮片供试品溶液溶液中隔山消饮片的绝干质量，g；
[0162]v供
——供试品溶液的体积，ml；
[0163]v饮供
——饮片供试品溶液的体积，ml；
[0164]m提
——制得隔山消提取物的绝干质量，g；
[0165]m饮
——原料隔山消饮片的绝干质量，g。
[0166]
2.1.5制备条件的优化
[0167]ⅰ不同提取溶剂的考察
[0168]
取实施例一制得隔山消提取物约0.14g，精密称定，每份平行2个样品，分别置于具塞锥形瓶内，依次精密加入25ml水、50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇、50％甲醇、75％甲醇、甲
醇，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得各供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪中，按照2.1.3色谱条件进行色谱分析，以对羟基苯乙酮计，按照上述方法计算不同提取溶剂对其含量的影响，确定最佳的提取溶剂，具体结果详见表4：
[0169]
表4不同提取溶剂对隔山消提取物中对羟苯乙酮含量的影响
[0170][0171]
由表4可知：不同溶剂对隔山消提取物中对羟基苯乙酮的含量影响差异显著，综合考虑其含量及目标峰峰形，选择75％乙醇做为提取溶剂。
[0172]ⅱ提取方式的考察
[0173]
取实施例一制得隔山消提取物约0.14g，精密称定，共3份，每份平行2个样品，分别置于具塞锥形品内，依次精密加入25ml75％乙醇，称定重量，分别超声(功率500w，频率40khz)30min、回流处理30min、振摇处理30min，取出冷却至室温后，用75％乙醇补重，混匀，过滤，收集续滤液。取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，即得各供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按照2.1.3色谱条件进行色谱分析，以对羟基苯乙酮计，按照上述方法计算不同提取方式对其含量的影响，确定最佳的提取方式，具体结果详见表5所示：
[0174]
表5不同提取方式对隔山消提取物中对羟基苯乙酮含量的影响
[0175][0176]
由表5可知：不同提取方式对隔山消提取物中对羟基苯乙酮的含量影响差异并不明显，综合考虑样品处理效率，选择超声提取进行提取。
[0177]ⅲ不同提取时间的考察
[0178]
取实施例一制得隔山消提取物约0.14g，精密称定，共3份，每份平行2个样品，分别置具塞锥形品内，依次精密加入25ml75％乙醇，称定重量，分别超声处理(功率500w，频率40khz)15min、30min、60min，取出冷却至室温后，用75％乙醇补重，混匀，过滤，收集滤液。取适量滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，即得各供试品溶液，备用。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按照2.1.3色谱条件进行色谱分析，以对羟基苯乙酮计，按照上述方法计算不同提取时间对其含量的影响。具体结果详见表6所示：
[0179]
表6不同提取时间对隔山消提取物中对羟基苯乙酮含量的影响
[0180][0181]
由表6结果可知：不同提取时间对隔山消提取物中对羟基苯乙酮含量影响差异不显著，综合考虑时间成本及其含量差异，选择超声提取60min。
[0182]
采用上述进行优化的条件制备隔山消提取物供试品溶液和隔山消饮片供试品溶液，方法如下：
[0183]
取实施例一制得隔山消提取物约0.14g，精密称定，置于具塞锥形瓶内，加入25ml75％乙醇，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)60min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，即得隔山消提取物供试品溶液。
[0184]
隔山消饮片供试品溶液的制备
[0185]
取隔山消饮片(批号yp2104-1)约1.0g，精密称定，置于具塞锥形瓶内，加入25ml75％乙醇，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)60min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取出滤液，过0.22μm的微孔滤膜，置于液样品瓶内，即得隔山消饮片供试品溶液。
[0186]
按照上述优化后的方法进行检测，实施例一制备的隔山消提取物高效液相色谱谱图如图1所示，根据谱图和对羟基苯乙酮质量含量计算公式及转移率的计算公式，得出对羟基苯乙酮的质量含量为0.68mg/g，对羟基苯乙酮的转移率为45.61％。
[0187]
2.2对检测方法的方法学的考察
[0188]
2.2.1专属性考察
[0189]
分别精密吸取上述2.1中优化条件后制得的隔山消提物供试品溶液、
[0190]
2.1.1中对羟基苯乙酮参照物溶液与75％乙醇各10μl，按照上述2.1.3色谱条件进行测定，结果见图2。
[0191]
由图2可知，该分析方法对隔山消提取物中对羟基苯乙酮的含量测定具有专属性。
[0192]
2.2.2峰纯度
[0193]
分别精密吸取10μl上述2.1中优化条件后制得的隔山消提取物供试品溶液、2.1.1中对羟基苯乙酮对照品溶液，按照上述2.1.3色谱条件进行测定，即得目标峰的峰纯度，结果见图2和表7所示。
[0194]
表7标峰以及峰纯度的匹配值
[0195]
目标峰对羟基苯乙酮峰纯度匹配值999.63
[0196]
由图2以及表7可知：该指标成分的纯度值为999.63，大于999，表明其峰纯度符合分析要求。
[0197]
2.2.3线性关系考察
[0198]
精密称取对羟基苯乙酮参照物适量，置已编号的10ml容量瓶内，加75％乙醇制成每1ml含对羟基苯乙酮0.1mg参照物溶液，摇匀，即得参照物储备液，置冰箱内备用。
[0199]
取对羟基苯乙酮参照物储备液并将其稀释为50、20、10、5、2.5倍，即得不同浓度对羟基苯乙酮对照品溶液，按照2.1.3色谱条件进行上机检测，以浓度为横坐标，峰面积值为纵坐标，考察对羟基苯乙酮的线性范围。线性考察结果见图3和表8所示。
[0200]
表8对羟基苯乙酮线性考察
[0201]
编号对羟基苯乙酮浓度(μg/ml)峰面积值(mau)对羟基苯乙酮-12.00116.5100对羟基苯乙酮-25.00311.8070对羟基苯乙酮-310.00639.4815对羟基苯乙酮-420.001311.266对羟基苯乙酮-640.002575.004
[0202]
由图3和表8可知，对羟基苯乙酮在2.00μg/ml-40.00μg/ml范围内其浓度与峰面积值呈良好的线性关系，相关系数r＝0.9998。
[0203]
2.2.4精密度考察
[0204]
取2.1中优化条件后制得的隔山消提取物供试品溶液，平行6份，每份进样2针，分别进样10μl，注入高效液相色谱仪，按照2.1.3色谱条件进行色谱分析，按照上述方法计算对羟基苯乙酮含量，以对羟基苯乙酮计，采用外标一点法进行计算目标峰的rsd(％)值，具体结果详见如表9所示。
[0205]
表9隔山消提取物含量测定方法精密度实验结果
[0206][0207][0208]
由表9可知，目标峰对羟基苯乙酮的rsd(％)值为0.29，小于2.0％，表明该方法精密度良好。
[0209]
2.2.5稳定性考察
[0210]
取实施例一制备的隔山消提取物，按照2.1中优化后的条件制备隔山消提取物的供试品溶液，按照2.1.3色谱条件进行色谱分析，分别在供试品溶液制备后的0，2，4，6，8，12，24小时进样，进样体积10μl，按照上述方法计算对羟基苯乙酮含量，以对羟基苯乙酮计，采用外标一点法进行计算目标峰含量的rsd(％)值，具体结果详见表10所示。
[0211]
表10稳定性考察
[0212][0213]
由表10可知，目标峰对羟基苯乙酮在24h内含量的的rsd(％)值为0.45％，小于2.0％，说明该溶液在24小时内稳定性良好。
[0214]
2.2.6重复性考察
[0215]
取实施例一制备得到的隔山消提取物共6份，按2.1中优化后的条件制备成隔山消提取物供试品溶液，进样体积10μl。按2.1.3中色谱条件进行色谱分析，按照上述方法计算
对羟基苯乙酮含量，以对羟基苯乙酮计，采用外标一点法进行计算目标峰含量的rsd(％)值，具体结果详见表11。
[0216]
表11重复性实验结果
[0217][0218]
由表11可知，目标峰对羟基苯乙酮含量的rsd(％)值为0.70％，小于2.0％，表明该方法的重复性良好。
[0219]
2.2.7中间精密度考察
[0220]
选择6个实验人员，分别在两个不同日期以及两台不同色谱仪(沃特世h-class plus和安捷伦hplc 1260ⅱ)下操作，取2.1中优化条件后制得的隔山消提取物供试品溶液，按2.1.3色谱条件进行色谱分析，按照上述方法计算对羟基苯乙酮含量，以供试品溶液中对羟基苯乙酮计，采用外标一点法进行计算目标峰含量的rsd(％)值，具体结果详见表12。
[0221]
表12测定方法中间精密度实验结果
[0222][0223][0224]
由表12可知，目标峰对羟基苯乙酮含量的中间精密度rsd(％)值为0.68％，均小于
2.0％，表明该方法的中间精密度良好。
[0225]
2.2.8准确度试验
[0226]
取已知含量隔山消提取物(对羟基苯乙酮含量651.3381μg/g)约0.14g，精密称定共6份，依次分别精密加入75％乙醇制备的对羟基苯乙酮参照物1ml(浓度45.6887μg/ml)，另精密加24ml75％乙醇，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)60min，放冷，再称定重量，用75％乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，即得隔山消提取物供试品溶液。分别精密吸取对羟基苯乙酮参照物溶液与隔山消提取物供试品溶液各10μl，注入高效液相色谱仪，按照2.1.3色谱条件进行色谱分析，按照上述方法计算对羟基苯乙酮含量，以对羟基苯乙酮计，采用外标一点法进行计算目标峰的含量，并按以下列公式计算回收率及rsd(％)值，结果如表13所示。
[0227][0228]
表13含量测定方法加样回收实验结果
[0229][0230]
由表13可知：隔山消提取物中对羟基苯乙酮的回收率范围在92％-97％范围之内，且rsd％(1.56％)小于2.0％，表明该含测方法的准确度良好。
[0231]
2.2.9耐用性考察
[0232]
2.2.9.1不同色谱柱考察
[0233]
比较了菲罗门、安捷伦、岛津三种色谱柱对隔山消提取物中对羟基苯乙酮色谱峰峰形及分离度的影响。
[0234]
取2.1中优化条件后制得的隔山消提取物供试品溶液，按2.1.3中色谱条件测定，以对羟基苯乙酮计，记录色谱数据。实验结果如图4以及表14所示。
[0235]
表14不同色谱柱对隔山消提取物中对羟基苯乙酮色谱峰的影响
35对羟基苯乙酮2.3537655998.07 40对羟基苯乙酮2.0637348997.92
[0250]
由图6以及表16可知，三种柱温下色谱峰峰形及分离效果均较好，30℃条件下色谱图的基线无漂移，与其他两个温度相比较其峰形无显著差异。考虑到色谱柱的耐受性及分析所需时间，因此选择柱温为30℃。
[0251]
2.2.9.4不同流速考察
[0252]
取2.1中优化条件后制得的隔山消提取物供试品溶液，按2.1.3中色谱条件测定，其中，流动相的流速分别选择0.9ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min，比较0.9ml/min、1.0ml/min、1.2ml/min不同流速对隔山消提取物中对羟基苯乙酮色谱峰峰形及分离度的影响。实验结果如图7以及表17所示。
[0253]
表17不同流速对隔山消提取物中含测目标峰的检测结果
[0254][0255][0256]
由图7以及表17可知，三种流速下色谱峰形及分离效果均较好。流速为1.0ml/min时对羟基苯乙酮的各项参数较好，基线无飘移，且峰形差异不显著，故本实验选择流速为1.0ml/min。
[0257]
3.隔山消提取物的特征图谱的检测方法
[0258]
3.1对检测方法的条件的优化
[0259]
3.1.1参照品溶液的制备
[0260]
取对羟基苯乙酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含对羟基苯乙酮100μg的对照品溶液，摇匀，即得。
[0261]
3.1.2供试品溶液的制备
[0262]
取实施例一制得隔山消提取物约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入溶剂10ml，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取出滤液，即得，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内。
[0263]
3.1.3超高效液相色谱分析
[0264]
分别吸取10μl3.1.1中参照物溶液和3.1.2中供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行分析,采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以有机相为流动相a，以水相为流动相b，按表18中的规定进行梯度洗脱；以一定的柱温和流速在一定的检测波长下进行测定。
[0265]
表18梯度洗脱
acquity uplct3(2.1*150mm，1.8μm)；色谱柱3-shodex c18u 2d(2.1*150mm，1.9m)，柱温30℃，流动相流速为0.3ml/min，流动相a为甲醇，流动相b为0.1％甲酸溶液，隔山消提取物供试品溶液参照3.1.4.1中的制备方法，考察三根色谱柱对隔山消提取物特征图谱的出峰情况的影响。结果如图14以及表20所示。
[0281]
表20隔山消标汤特征图谱色谱柱考察结果(相对保留时间)
[0282]
色谱柱峰1峰2(s)峰3峰4峰510.7551.0001.2771.7093.291 20.7531.0001.3201.5782.859 30.8031.0001.3181.6102.893
[0283]
由图14以及表20可知：采用色谱柱1-dikma c18-a(2.1*150mm，1.8μm)的超高效液相色谱柱进行洗脱，色谱峰峰型较好，分离效果最佳，因此建议本方法采用型号为dikma c18-a(2.1*150mm，1.8μm)的超高效液相色谱柱。
[0284]
3.1.4.4不同柱温考察
[0285]
隔山消提取物供试品溶液参照3.1.4.1中的制备方法，流动相a为甲醇，流动相b为0.1％甲酸溶液，色谱柱为dikma c18-a(2.1*150mm，1.8μm)；流动相流速为0.3ml/min，比较30℃、35℃、40℃不同柱温对样品的分离效果，结果如图15和表21所示。
[0286]
表21隔山消提取物特征图谱柱温考察结果(相对保留时间)
[0287]
柱温峰1峰2(s)峰3峰4峰525℃0.7621.0001.2741.7073.14730℃0.7571.0001.2731.7063.26835℃0.7531.0001.2731.7023.387
[0288]
由图15和表21可知，柱温对出峰情况影响不大，但柱温为30℃时分离效果最佳，峰型较好，因此选择柱温30℃。
[0289]
3.1.4.5不同流速考察
[0290]
隔山消提取物供试品溶液参照3.1.4.1中的制备方法，流动相a为甲醇，流动相b为0.1％甲酸溶液，色谱柱为dikma c18-a(2.1*150mm，1.8μm)；柱温为30℃，对不同流速(0.2ml/min、0.25ml/min、0.3ml/min)洗脱情况进行考察。结果如图16和表22所示。
[0291]
表22隔山消提取物特征图谱流速考察结果(相对保留时间)
[0292]
流速峰1峰2(s)峰3峰4峰50.2ml/min0.7571.0001.2291.6082.5240.25ml/min0.7551.0001.2601.6672.8970.3ml/min0.7571.0001.2731.7063.268
[0293]
由图16和表22可知，流速对出峰情况影响不大，但当流速为0.3ml/min峰型最佳。因此选择0.3ml/min。
[0294]
3.1.4.6不同提取溶剂的考察
[0295]
取实施例一制得隔山消提取物约0.14g，精密称定，每份平行2个样品，分别置具塞锥形瓶内，分别精密加入10ml水、50％乙醇、75％乙醇、95％乙醇、50％甲醇、75％甲醇、甲醇，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足
减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得各供试品溶液。按照3.1.3中方法进样，色谱条件为：流动相a为甲醇，流动相b为0.1％甲酸溶液，色谱柱为dikma c18-a(2.1*150mm，1.8μm)；柱温为30℃，流速为0.3ml/min，记录峰面积。结果如表23所示。
[0296]
表23不同提取方式的提取效率对比(峰面积/称样量)
[0297]
特征水95％乙醇75％乙醇95％乙醇甲醇75％甲醇50％甲醇峰14882970989796785833984378982596378峰2229345261337268827226231273595249186267176峰311629171231716914788174891613616740峰439738629896561752861673145986763295峰515471184811963215538200141809419412
[0298]
由表23可知，提取溶剂为甲醇时并且提取效率较高，因此选择甲醇作为提取溶剂。
[0299]
采用上述优化后的条件来测定实施例一制得隔山消提取物的特征图谱，方法如下：
[0300]
供试品溶液的制备
[0301]
取实施例一制得隔山消提取物约0.15g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)30min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取出滤液，即得，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，得到隔山消提取物供试品溶液。
[0302]
分别吸取10μl3.1.1中参照物溶液和上述供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行分析,采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(dikma c18-a，2.1*150mm，1.8μm)；以甲醇为流动相a，以0.1％甲酸水溶液为流动相b，按表18中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃，流速为0.3ml/min。结果如图17所示。
[0303]
由图17可知，隔山消提取物的特征图谱中有5个特征峰，与参照物相应的峰为s峰，计算各特征峰与s峰的相对保留时间，其中，峰1的相对保留时间为0.76，峰2(s)的相对保留时间为1.00，峰3的相对保留时间为1.27，峰4的相对保留时间为1.71，峰5的相对保留时间为3.28。
[0304]
3.2对检测方法的方法学的考察
[0305]
3.2.1专属性考察
[0306]
分别吸取3.1中优化条件后制得的隔山消提取物供试品溶液与甲醇溶剂各1μl，注入液相色谱仪中，按3.1中优化条件后的色谱条件进行测定。结果如图18所示。
[0307]
由图18可知，溶剂对隔山消提取物图谱中的特征峰均没有干扰。
[0308]
3.2.2整体性考察
[0309]
吸取3.1中优化条件后制得的隔山消提取物供试品溶液1μl，按3.1中优化条件后的色谱条件进行测定，在梯度终点的流动相比例下延长一倍洗脱时间，特征图谱如图19所示。
[0310]
由图19可知，该色谱条件延长一倍洗脱时间后无明显色谱峰，表明该色谱条件基本满足了信息量最大的原则。
[0311]
3.2.3精密度考察
[0312]
吸取3.1中优化条件后制得的隔山消提取物供试品溶液，按3.1中优化条件后的色
谱条件进行测定，重复进样6次，进样量为1ul。考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性(标定5个特征峰，以峰2为参照峰)，实验结果如表24所示。
[0313]
表24隔山消提取物特征图谱精密度结果(相对保留时间)
[0314]
序号123456平均值rsd％峰10.7560.7550.7550.7550.7560.7560.7560.06峰2(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00峰31.2731.2741.2751.2741.2741.2741.2740.04峰41.7031.7061.7061.7061.7061.7071.7060.08峰53.2743.2863.2853.2933.2923.2783.2850.22
[0315]
由表24可知，各色谱峰相对保留时间的rsd《3.0％，说明该仪器精密度良好。
[0316]
3.2.4稳定性考察
[0317]
取实施例一制备的隔山消提取物，按照3.1中优化后的条件制备隔山消提取物的供试品溶液，按3.1中优化条件后的色谱条件进行测定，分别在供试品溶液制备后的0，2，4，6，8，12，24小时进样，进样体积1μl，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性(标定5个特征峰，以峰2为参照峰)，实验结果如表25所示。
[0318]
表25隔山消提取物特征图谱稳定性结果(相对保留时间)
[0319]
序号123456平均值rsd/％峰10.7580.7600.7600.7590.7570.7580.7590.15峰2(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00峰31.2731.2741.2731.2741.2731.2741.2740.04峰41.7071.7051.7041.7011.7031.7061.7040.13峰53.2353.2233.2203.2233.2653.2393.2330.58
[0320]
由表25可知，色谱峰相对保留时间的rsd《3.0％，说明该样品溶液比较稳定。
[0321]
3.2.5重复性考察
[0322]
取实施例一制备得到的隔山消提取物共6份，按3.1中优化后的条件制备供试品溶液，按3.1中优化条件后的色谱条件进行测定，进样体积1μl，考察特征峰相对保留时间和相对峰面积的一致性(标定5个特征峰，以峰2为参照峰)，实验结果如表26所示。
[0323]
表26隔山消提取物特征图谱重复性结果(相对保留时间)
[0324]
序号123456平均值rsd％峰10.7590.7580.7590.7580.7580.7580.7580.04峰2(s)1.0001.0001.0001.0001.0001.0001.0000.00峰31.2731.2731.2731.2731.2731.2731.2730.03峰41.7061.7081.7071.7081.7081.7071.7070.05峰53.2363.2443.2443.2433.2443.2403.2420.11
[0325]
由表26可知，各色谱峰相对保留时间的rsd《3.0％，说明该方法重复性良好。
[0326]
实施例二
[0327]
1.隔山消提取物的制备方法
[0328]
(1)取隔山消饮片(yp2104-2)100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮直
接加入到12倍隔山消饮片重量的水中，浸泡30分钟，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸35分钟，煎液经300目筛网趁热过滤；第二次煎煮加10倍隔山消饮片重量的水，武火加热煮沸后文火保持微沸25分钟，煎液用300目筛网趁热过滤，合并两次滤液；
[0329]
(2)将滤液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至100ml的浸膏，测量其密度为1.07g/ml、出膏率为11.2％；在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为1ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干，先进行预冻，预冻温度为-55℃，预冻时间为2小时，然后进行一次干燥，干燥温度依次为-45℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-10℃和0℃，真空度为0.2mbar，干燥时间分别为3小时、7小时、20小时、10小时、2小时、1小时和2小时，接着进行二次干燥，干燥温度依次为10℃、20℃和30℃，真空度为0mbar，干燥时间分别为1小时、1小时和5小时，取出，轧铝盖，得到隔山消提取物。
[0330]
2.对羟基苯乙酮质量含量及转移率的检测
[0331]
采用实施例一中的方法测得隔山消提取物中对羟基苯乙酮的质量含量为0.58mg/g，对羟基苯乙酮的转移率为38.41％。
[0332]
3.隔山消提取物的特征图谱的测定方法
[0333]
按照实施例一所示的检测方法测定隔山消提取物的特征图谱，其包含五个峰，分别为峰1的相对保留时间为0.76，峰2(s)的相对保留时间为1.00，峰3的相对保留时间为1.27，峰4的相对保留时间为1.71，峰5的相对保留时间为3.28。
[0334]
实施例三
[0335]
1.隔山消提取物的制备方法
[0336]
(1)取隔山消饮片(yp2104-2)100g，置电陶瓷壶中，加水煎煮两次，第一次煎煮直接加入到11倍隔山消饮片重量的水中，浸泡30分钟，武火(500w)煮沸后文火(200w)保持微沸55分钟，煎液经300目筛网趁热过滤；第二次煎煮加9倍隔山消饮片重量的水，武火加热煮沸后文火保持微沸40分钟，煎液用300目筛网趁热过滤，合并两次滤液；
[0337]
(2)将滤液转移至2000ml圆底烧瓶中，采用旋转蒸发仪减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至100ml的浸膏，测量其密度为1.06、出膏率为12.3％；在磁力搅拌下，分装至10ml棕色西林瓶中，每瓶分装体积为1ml，半加塞，分装完后转移至真空冷冻干燥机中冻干，先进行预冻，预冻温度为-50℃，预冻时间为5小时，然后进行一次干燥，干燥温度依次为-45℃、-35℃、-30℃、-25℃、-20℃、-10℃和0℃，真空度为0.2mbar，干燥时间分别为2小时、6小时、16小时、8小时、2小时和1小时，接着进行二次干燥，干燥温度依次为10℃、20℃和30℃，真空度为0mbar，干燥时间分别为1小时、1小时和3小时，取出，轧铝盖，得到隔山消提取物。
[0338]
2.对羟基苯乙酮质量含量及转移率的检测
[0339]
采用实施例1中的检测方法测得对羟基苯乙酮的质量含量为0.52mg/g，对羟基苯乙酮的转移率为31.23％。
[0340]
3.隔山消提取物的特征图谱的测定方法
[0341]
按照实施例一中的检测方法测定隔山消提取物的特征图谱，其包含五个峰，分别为峰1的相对保留时间为0.76，峰2(s)的相对保留时间为1.00，峰3的相对保留时间为1.27，峰4的相对保留时间为1.71，峰5的相对保留时间为3.28。
[0342]
实施例四共有峰的确定
[0343]
按照实施例一中优化条件后的隔山消提取物的特征图谱的检测方法测定15批隔山消提取物样品和隔山消对照药材的超高效液相色谱图，其中，隔山消对照药材供试品溶液的制备方法如下：取隔山消对照药材(批号为bt2104-1)约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，取适量续滤液过0.22μm微孔滤膜，置于液样品瓶内，得到隔山消对照药材供试品溶液。
[0344]
采用国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2012版)”进行结果分析，选择其共有峰，如图20和表27所示。
[0345]
表27样品测定结果
[0346][0347][0348]
由图20和表27可知，隔山消供试品特征图谱中呈现5个特征峰，并与对照药材供试品色谱中的5个特征峰的保留时间相对应；以峰2为参照峰，15批隔山消提取物特征图谱的其余4个特征峰相对保留时间rsd值在0.05％-0.22％，均小于1.0％，符合隔山消提取物特征图谱的标准要求。
[0349]
实施例五
[0350]
1.隔山消配方颗粒的制备方法
[0351]
(1)取隔山消饮片(yp2104-1)30kg，置多功能提取浓缩机组中，加水煎煮两次，第一次煎煮直接加入到12倍隔山消饮片重量的水中，浸泡30分钟，加热至沸腾保持微沸55min，煎液经200目筛网趁热过滤；第二次煎煮加10倍隔山消饮片重量的水，加热至沸腾保持微沸40min，煎液用200目筛网趁热过滤，合并两次滤液；
[0352]
(2)将滤液转移至浓缩机中，采用减压低温浓缩(温度：65℃；真空度：-0.080～-0.090mpa)至密度为1.05g/cm3(65℃)得到清膏，测量出膏率为12％；
[0353]
(3)将上述清膏加入到配料罐中，升温至60℃，并加入3kg麦芽糊精混合均匀，然后进行喷雾干燥，控制进风温度165-195℃，出风温度100-110℃，收集干膏粉，备用，干燥过程无粘壁现象，无结块现象，容易干燥；
[0354]
(4)称取500g步骤(3)所得干膏粉，粉碎后过80目筛，加入0.5g二氧化硅和0.5g硬脂酸镁混匀，干法制粒，调节进料速度为90r/min，轧辊压轮转速10r/min，液压压力为8mpa，压轮转速7r/min，破碎转速100r/min，终整粒转速80r/min，压轮间距1mm，混合时间30min，混合机转速10r/min，制得隔山消配方颗粒-1。
[0355]
2.隔山消配方颗粒中对羟基苯乙酮质量含量及转移率的检测方法
[0356]
2.1参照物溶液的制备
[0357]
取对羟基苯乙酮对照品适量，精密称定，置于已编号的10ml容量瓶内，加75％乙醇制成每1ml含对羟基苯乙酮10μg对照品溶液，摇匀，即得。
[0358]
2.2供试品溶液的制备
[0359]
取实施例五制得隔山消配方颗粒-1约0.12g，精密称定，置于具塞锥形瓶内，加入25ml75％乙醇，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)60min，放冷，再称定重量，用相应溶剂补足减失的重量，摇匀，过滤，取出滤液，过0.22μm的微孔滤膜，置于液样品瓶内，即得供试品溶液。
[0360]
2.3高效液相色谱分析
[0361]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(菲罗门superlu c18，柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5.0μm)；以乙腈为流动相a，0.1％磷酸水溶液为流动相b，按表28中的规定进行梯度洗脱；柱温为30℃；流速1.0ml/min，检测波长为276nm。理论板数按对羟基苯乙酮峰计算应不低于10000。分别吸取10μl2.1中参照物溶液和2.2中供试品溶液注入高效液相色谱仪中进行分析。
[0362]
表28洗脱梯度
[0363]
时间(分钟)流动相a(％)流动相b(％)0-1510
→
2190
→
7915-1821
→
2179
→
7918-2321
→
9079
→
1023-2790
→
1010
→
9027-3010
→
1090
→
90
[0364]
按照实施例一中的方法测得对羟基苯乙酮的质量含量为0.48mg/g，对羟基苯乙酮的转移率为27.99％。
[0365]
3.隔山消配方颗粒的特征图谱的检测方法
[0366]
3.1参照品溶液的制备
[0367]
取对羟基苯乙酮对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml含对羟基苯乙酮100μg的对照品溶液，摇匀，即得。
[0368]
3.2供试品溶液的制备
[0369]
取实施例五制得隔山消配方颗粒-1约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇10ml，称定重量，超声处理(功率500w，频率40khz)30分钟，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取出滤液，即得。
[0370]
3.3高效液相色谱分析
[0371]
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为150mm,内径为2.1mm，粒径为1.8μm)；以甲醇为流动相a，以0.1％甲酸溶液为流动相b，按表43中的规定进行梯度洗脱；流速为0.3ml/min；柱温为30℃；检测波长为270nm。分别吸取10μl3.1中参照物溶液和3.2中供试品溶液注入超高效液相色谱仪中进行分析。
[0372]
表29梯度洗脱
[0373]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0-723
→
2477
→
767-1124
→
2776
→
7311-1427
→
2973
→
7114-1829
→
3271
→
6818-2032
→
3868
→
6220-2838
→
3862
→
6228-28.138
→
2362
→
7728.1-3023
→
2377
→
77
[0374]
按照上述方法测的隔山消配方颗粒的特征图谱如图21所示，其包含五个峰，分别为峰1的相对保留时间为0.76，峰2(s)的相对保留时间为1.00，峰3的相对保留时间为1.27，峰4的相对保留时间为1.71，峰5的相对保留时间为3.28。
[0375]
4.隔山消配方颗粒休止角的测定
[0376]
采用固定漏斗法进行测定，取整洁的坐标纸平铺在桌面上，将漏斗固定于铁架台上，并与桌面保持水平，漏斗底部距离坐标纸一定的高度(h)；将供试品颗粒缓慢倒入漏斗中，直至颗粒的顶尖接触到漏斗，供试品颗粒形成半径为r的圆锥体，计算休止角：休止角＝arctan(h/r)
[0377]
按照上述方法测得隔山消配方颗粒的休止角为23.1
°
。
[0378]
实施例六
[0379]
1.隔山消配方颗粒的制备方法
[0380]
(1)按照实施例五中的方法制备清膏；
[0381]
(2)将上述清膏加入到配料罐中，升温至100℃，并加入6kg麦芽糊精混合均匀，然后进行喷雾干燥，控制进风温度165-195℃，出风温度100-110℃，收集干膏粉，备用；干燥过程无粘壁现象，无结块现象，容易干燥；
[0382]
(3)称取500g步骤(3)所得干膏粉，粉碎后过80目筛，加入1.5g二氧化硅和1.5g硬脂酸镁混匀，干法制粒，调节进料速度为90r/min，轧辊压轮转速10r/min，液压压力为8mpa，
压轮转速7r/min，破碎转速100r/min，终整粒转速80r/min，压轮间距1mm，混合时间30min，混合机转速10r/min。
[0383]
按照实施例五中的方法测定休止角为22.8
°
。
[0384]
实施例七
[0385]
1.隔山消配方颗粒的鉴定
[0386]
1.1供试品溶液的制备
[0387]
选用不同批次的隔山消饮片(批号yp2104-2和yp2104-3)，按照实施例五的方法制备隔山消配方颗粒-2和隔山消配方颗粒-3，分别称取1g隔山消配方颗粒-1、隔山消配方颗粒-2和隔山消配方颗粒-3，共3份，研细，加10ml水溶解，过滤，加于大孔树脂柱(d101，外径为20mm)上，依次用20ml水，20ml20％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用20ml80％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干收集残渣，加2ml甲醇溶解，作为供试品溶液。
[0388]
1.2隔山消对照品溶液
[0389]
取1g隔山消饮片(yp2104-1)，加20ml水，加热回流30min，过滤，加于大孔树脂柱(d101，外径为20mm)上，依次用20ml水，20ml20％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用20ml80％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干收集残渣，加2ml甲醇溶解，作为隔山消对照品溶液。
[0390]
1.3隔山消配方颗粒阴性样品溶液
[0391]
称取1g麦芽糊精，研细，加10ml水溶解，过滤，加于大孔树脂柱(d101，外径为20mm)上，依次用20ml水，20ml20％乙醇洗脱，弃去洗脱液，再用20ml80％乙醇洗脱，收集洗脱液，蒸干收集残渣，加2ml甲醇溶解，作为阴性样品溶液。
[0392]
1.4显色剂的配制
[0393]
取香草醛0.5g，加10ml98％硫酸溶解即得。
[0394]
1.5薄层色谱条件
[0395]
薄层板为硅胶g薄层板；
[0396]
展开剂为甲苯-乙酸乙酯-甲醇-水(体积比为20:20:1:1)；
[0397]
点样量为10ul；
[0398]
展开方式：采用双槽展开缸，展开距离为8cm，展开两次；
[0399]
检视：喷以5％香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色，在日光下检视，分别吸取1.1供试品溶液、1.2隔山消对照品溶液及1.3隔山消配方颗粒阴性样品各10μl点于同一硅胶g薄层板，按上述薄层色谱条件展开，取出，晾干，喷以5％香草醛硫酸溶液，105℃加热至斑点显色，在日光下检视，薄层色谱图如图22所示。
[0400]
由图22可见，按照实施例五中方法制备的不同批次隔山消配方颗粒色谱均与隔山消对照药材色谱的对应位置上呈相同颜色斑点，说明隔山消配方颗粒的薄层鉴别符合规定。
[0401]
对比例一
[0402]
和实施例五的区别在于，干法制粒时不加入二氧化硅和硬脂酸镁，按照实施例五中的方法测得休止角为25.4
°
。
[0403]
综上所述，本发明采用将隔山消加水煎煮，进行过滤得到滤液，将滤液进行浓缩干燥得到隔山消提取物，所制得隔山消提取物的出膏率为11.2-14.64％，将所制备得到的隔山消提取物使用高效液相色谱分析进行对羟基苯乙酮质量含量及转移率的检测，其结果
为：对羟基苯乙酮的质量含量为0.52-0.68mg/g，对羟基苯乙酮的转移率为31.23-45.61％。并且采用的检测方法精密度高，重复性好，24小时内供试品溶液的稳定性良好。
[0404]
本发明采用超高效液相色谱法测定15批隔山消提取物的特征图谱和对照药材的特征图谱，所述隔山消提取物中包含5个特征峰，并与对照药材参照物色谱中的5个特征峰的保留时间相对应，分别为峰1的相对保留时间为0.76，峰2(s)的相对保留时间为1.00，峰3的相对保留时间为1.27，峰4的相对保留时间为1.71，峰5的相对保留时间为3.28。各特征峰的相对保留时间的相对偏差在1％之内。所用检测方法精密度高，重复性好，24小时内供试品溶液的稳定性良好。
[0405]
最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其做出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。