一种用于角膜病变修复的组合产品及其制备方法与流程

本发明属于生物医药材料，具体涉及一种用于角膜病变修复的组合产品。

背景技术：

1、越来越多患者因患角膜疾病而致使角膜浑浊，造成中度至重度的视力损害，然而由于供体角膜的严重不足，仅有少数患者可进行移植治疗。近年来，随着人工角膜材料及角膜组织工程的兴起与发展，通过人工角膜移植或采用种子细胞和支架材料的方式可以原位修复受损角膜，为角膜病盲患者的治疗带来了新的希望。

2、人工角膜移植是目前角膜盲患者恢复视力的主要治疗方法，替代病变角膜的人工角膜植片可帮助患者快速恢复一定的视力。国内以猪角膜脱细胞基质植片为临床上的主流应用，然而此类材料不可避免的会存在抗原、病毒残留等风险，植入后因排异反应大而导致角膜浑浊，且曲率、厚度等不可控，无法实现个性化定制。此外，目前的角膜移植手术均是通过缝线将角膜植片与受损的角膜基质连接，然而，缝合作为一种连接方法不仅耗时且需要较高的技术水平，而且还与角膜移植后的许多潜在并发症有关：①缝合可能导致角膜的再损伤，而引起炎症、瘢痕、形成新生血管等，进而影响角膜透明度；②缝线本身作为异物，可能会引起排异反应而诱发炎症，甚至导致移植失败；③缝合无法保证植入物与受损基质层的充分接触，可能会出现伤口附着不良或表面扭曲，从而损害视觉质量。因此，急需开发一款兼具高透明及高生物相容性的可个性化定制人工角膜，同时引入免缝合技术，为角膜患者实现“无缝”移植。

3、专利(cn114618016a)提供了一种人工角膜及其制备方法，所述的人工角膜的制备方法包括设计定制化电极、改进edp技术组装胶原和化学交联步骤，在电极上获得与角膜形状一致的胶原基人工角膜。胶原基人工角膜材料的特征为：以短程有序取向、且致密排列的胶原微纤维组成，透明度在80％以上，厚度可控，曲率可控。该发明制作过程不需要使用复杂的设备，所获得的胶原基人工角膜材料可以用于替代或者修补天然角膜。

4、专利(cn113637067a)提供了一种重组人源胶原蛋白及其人造角膜，由重组胶原蛋白和壳聚糖制备得到，该发明的人造角膜工艺无需剧烈条件和不安全的原料、试剂，生物相容性好，机械强度适中、适合运用于角膜，透光率高、理化性能良好，不含杂质，成形性良好，可以用于角膜替换、角膜修复支架、适合配戴的角膜接触镜(隐形眼镜)，角膜细胞体外培养及眼部药物缓释载体等相关领域的应用。

5、角膜组织工程作为一种新兴的治疗手段，通过植入搭载活性功能种子细胞的支架材料以修复受损的角膜组织。目前常用的支架材料主要是脱细胞基质组织和水凝胶，然而，受限于原料组成或设计理念的不足，现有的支架材料仍然存在以下问题：①无法模拟天然角膜的形状、厚度或曲率，而这又是影响角膜屈光度的重要因素，对视力恢复效果有着决定性影响；②材料降解速率不可控，无法与所搭载细胞的增殖速率或受损组织的修复速率所匹配，导致治疗效果不佳；③普遍缺乏组织粘附性，无法与受损角膜基质紧密贴合，导致移植物整合缓慢，不利于深板层角膜组织的修复，且易引起散光，影响治疗效果。

6、因此，如何利用人工角膜和角膜组织工程支架，通过两者的优势互补，帮助角膜盲患者，尤其是深板层角膜感染性患者，在治疗初期快速恢复一定视力的同时，又可实现后续角膜组织的深度修复，具有重要的研究和应用价值。

技术实现思路

1、本发明针对现有技术存在的问题，提供一种用于角膜病变修复的组合产品。该组合产品包括高透明胶原基人工角膜和搭载种子细胞的可粘附凝胶支架。其中，人工角膜采用电化学沉积法制得，直径、厚度、曲率可控，透光率可达90％以上，凝胶支架由重组胶原、聚乙二醇和种子细胞组成。具有良好流动性的凝胶前驱液可充分填补角膜伤口，并原位递送种子细胞，经自发化学交联反应原位成胶并粘附，实现角膜植片免缝合移植。同时凝胶支架可随种子细胞的增殖而按需降解，有利于角膜组织的深度修复。本发明提供的组合产品兼顾了手术操作便捷性及术后恢复速度与效果，有望代替目前单一的角膜植片或角膜组织工程支架的治疗手段，具有很好的临床应用前景。

2、为实现上述目的，第一方面，本发明提供了一种用于角膜病变修复的组合产品，所述的组合产品包括：高透明胶原基人工角膜和搭载种子细胞的可粘附凝胶支架。

3、优选地，所述高透明胶原基人工角膜通过电化学沉积法制得；所述高透明胶原基人工角膜所用的原料为i型胶原。所述的高透明胶原基人工角膜的透光率在90％以上，其直径、曲率、厚度等可通过改变电沉积参数或工作电极的形状而进行个性化定制。

4、优选地，所述的可粘附凝胶支架由重组胶原蛋白多肽、活性酯化的聚乙二醇和种子细胞组成；所述的重组胶原蛋白多肽由基因发酵技术制得，包括重组i型人源胶原、重组iii型人源胶原中的一种或两种，更优选为重组iii型人源胶原蛋白；所述的活性酯化聚乙二醇选自聚乙二醇琥珀酰亚胺琥珀酸酯和/或聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯，更优选为活性酯化聚乙二醇为聚乙二醇琥珀酰亚胺戊二酸酯(peg-sg)和琥珀酰亚胺琥珀酸酯(peg-ss)的组合，peg-sg与peg-ss的质量比为(1-10)：1。

5、优选地，所述的活性酯化聚乙二醇中的聚乙二醇结构包括直链双端聚乙二醇，三臂聚乙二醇，四臂聚乙二醇，六臂聚乙二醇，八臂聚乙二醇中的一种或多种，更优选为四臂聚乙二醇。所述活性酯化聚乙二醇的分子量优选为5-40kda。

6、优选地，所述的种子细胞选自角膜内皮细胞、间充质干细胞、角膜缘干细胞中的一种或多种。

7、优选地，所述的种子细胞的来源包括细胞原代培养、细胞传代培养、已冻存细胞复苏中的一种或多种。

8、优选地，所述的种子细胞悬浮于凝胶的前驱液中，原位递送至角膜受损区域。

9、第二方面，本发明提供了一种用于角膜病变修复的组合产品的制备方法，制备过程包括：高透明胶原基人工角膜的制备、可粘附凝胶支架的制备；

10、其中，高透明胶原基人工角膜的制备包括如下步骤：

11、(1)电沉积装置的搭建：采用电沉积的三电极体系，将一定曲率的钛板作为工作电极，ag/agcl为参比电极，铂丝为对电极；

12、(2)胶原溶液的配置：以醋酸为溶剂配置胶原溶液，并向所述的胶原溶液中加入过氧化氢至浓度为0.5m，搅拌混匀后离心除去气泡，待用；

13、(3)电化学沉积的过程：将步骤(1)中的三电极浸入步骤(2)所得酸性胶原蛋白溶液中，在电极上施加恒定电流密度，电沉积一段时间后在工作电极表面获得具有一定厚度的高透明胶原角膜；

14、(4)交联固定：将步骤(3)制得的角膜在265nm的紫外光下照射1-4h。

15、优选地，步骤(1)中所述钛板的曲率为7.8-8.4、三电极体系为chi660e；步骤(2)中所述醋酸的浓度为1-2％；所述胶原溶液浓度为0.5-1％w/v；步骤(3)中所述的电沉积时间为10-30min，电流密度为3.33ma/cm2；步骤(4)照射2h。

16、其中，可粘附凝胶支架的制备包括如下步骤：

17、(1)将磷酸缓冲液滴加至装有重组胶原冻干粉的样品槽中，使用搅拌棒搅拌均，得重组胶原溶液；

18、(2)用滴管吸取步骤(1)中的重组胶原溶液至装有种子细胞的试管中，缓慢吹打，以此悬浮细胞，得细胞悬液；

19、(3)将生理盐水滴加至装有活性酯化聚乙二醇的样品槽中，使用搅拌棒搅拌均匀，用滴管吸取聚乙二醇溶液至步骤(2)的试管中，缓慢吹打均匀后即得。

20、优选地，步骤(1)中所述重组胶原溶液的质量体积浓度为5-20％w/v；步骤(2)所述细胞悬液的细胞浓度为104至106个细胞每毫升；

21、第三方面，本发明提供了上述组合产品在制备角膜病变修复产品中的应用。

22、本发明适用于角膜结构已不可逆破损，导致视力下降或丧失，需要进行角膜移植的感染性角膜炎患者。将高透明胶原基人工角膜作为植入物以代替或修补病变的角膜，并利用凝胶支架原位递送角膜缘干细胞，同时紧密粘合角膜植片和受损角膜组织，实现免缝合移植，同时促进角膜自内皮层开始的深度修复。

23、本发明的有益效果：

24、①相较于使用单一的角膜组织工程支架或角膜植片进行治疗的手段，本发明中的组合产品，以可个性化定制的角膜植片替代病变的角膜组织，帮助患者快速恢复一定的视力，同时凝胶支架可促进角膜深层组织的修复，提升后期的视觉质量，在两者的优势互补下，可有效提升术后修复效果，为角膜盲患者提供了一种新的治疗手段。

25、②相较于传统的脱细胞基质组织工程支架，本发明中的凝胶支架以合成原料为成胶组分，杜绝了免疫原性风险，同时，该凝胶支架具备原位成胶及粘附的能力，凝胶前驱液流动性佳，可充分填补缺损部位，保证角膜植片与受损基质层的充分接触，并实现免缝合移植，避免了缝合操作所带来的损伤风险及可能引起的系列并发症，可有效减少结疤、炎症和新血管等的形成，降低了手术操作难度，节约了手术时间。

26、③相较于传统的水凝胶组织工程支架，本发明中的凝胶支架以高生物活性的重组胶原和特殊设计的聚乙二醇衍生物为成胶组分，在具备良好细胞黏附性的同时，又具备可控的降解速率，可伴随细胞的增殖而按需降解，为其提供足够的生长空间，从而提升组织修复的速度及质量。

27、④相较于主流的猪角膜脱细胞基质植片，本发明中的人工角膜以i型胶原为原料，通过电化学沉积的方法制得，制备周期短，且无须使用交联剂或其他助剂；同时，本产品中的人工角膜可通过凝胶支架实现免缝合移植，因此可采用弱交联，牺牲一定力学性能以换取更高的透明度、生物活性及安全性，以此提升修复效果。